Abstract
Ett förfarande beskrivs varvid kvant prick (QD) nanopartiklar kan användas för korrelativa immuncytokemiska studier av human patologi vävnad med användning av widefield fluorescens Ijusmikroskopi och transmissionselektronmikroskopi (TEM). För att demonstrera det protokoll vi har immunolabeled ultratunna epoxi snitt av human somatostatinoma tumör med användning av en primär antikropp till somatostatin, följt av en biotinylerad sekundär antikropp och visualisering med streptavidin konjugerat 585 nm kadmium-selen (CdSe) kvantprickar (QDs). Sektionerna är monterade på en TEM prov rutnät placerades därefter på ett objektglas för observation genom widefield fluorescens Ijusmikroskopi. Ljusmikroskopi avslöjar 585 nm QD märkning som ljust orange fluorescens bildar en granulär mönster inom tumörcellens cytoplasma. Vid låga till förstoring mellannivå genom ljusmikroskop märkningsmönstret kan lätt att känna igen och graden av icke-specifik eller bakgrunds märkning bedömas. Detta är ett kritisktsteg för efterföljande tolkning av immunomärkning mönstret genom TEM och utvärdering av den morfologiska sammanhang. Samma avsnitt sedan blottas torr och ses av TEM. QD prober ses att fästas till amorft material ingår i separata sekretoriska granuler. Bilderna förvärvas från samma region av intresse (ROI) ses av ljusmikroskop för korrelat analys. Motsvarande bilder från varje modalitet kan sedan blandas för att överlagra fluorescensdata på TEM ultra av den berörda regionen.
Introduction
Korrelat ljus- och elektronmikroskopi (CLEM) är en kraftfull metod för analys av transienta dynamiska händelser 1, sällsynta händelser 2, 3 och komplexa system 4. Det finns många olika tekniska varianter finns fem beroende på den fråga som ställdes dock ett vanligt krav är att samma struktur i ett enda prov 6 avbildas av flera mikroskopi metoder. Vår särskilt förhållningssätt till CLEM utvecklades för att studera arkiv mänsklig patologi vävnad och fallet används här har väl karakteriserats och tidigare publicerats 7. Syftet var dels att maximera de analytiska data från en enda biopsi eller kirurgiskt prov och för det andra att använda fluorescens ljusmikroskop för att klargöra samband med immuncytokemiska märkningsmönstret sett på ultra nivå.
Quantum prick nanokristaller (QDs) erbjuder möjligheten att en universell markörsystem able för att ses av båda, fluorescens Ijusmikroskopi och elektronmikroskopi 8, 9, 10. Deras kristallina kärnstruktur tillåter QDs av olika storlek för att generera ett brett spektrum av fluorescensemissionstoppar när den exciteras av ljus vid våglängder långt från deras emissionsspektra 11. Deras atomvikt är tillräcklig för att ge elektrontäthet som är detekterbar med hjälp av transmissionselektronmikroskopi, skanning transmissionselektronmikroskopi (STEM) eller för fältemission svepelektronmikroskopi. De är särskilt lämpade för immuncytokemiska studier även enstaka QDs kan observeras ge en ultimat känslighet en QD per målmolekyl 12. Dessutom, beroende på QD använde de kan ha en individuell elementär signatur lämplig för kartläggning.
Mänskliga patologi prover erbjuder betydande fördelar för translationell biomedicinsk forskning. Kirurgisk vävnads och biopsiprov rutinmässigt lämnas för biobank och med appropriate etik spelrum kan nås för forskarstudier. Mänsklig vävnad har inte frågor av betydelse eller tolkning som kan uppstå i djur eller in vitro-modeller av sjukdomen. Det är dock extraktion av patologiprover ofta inte optimalt. Det kan vara fördröjning i vävnad placeras i fixativ används olämpligt fixativ såsom formalin snarare än glutaraldehyd för TEM och olämpligt provtagning. Clem metoder har potential att optimera diagnostisk och prognostisk information från en enda mänsklig prov. Men vissa nyutvecklade korrelativa metoder såsom de som använder mini Singlet Oxygen Generator (miniSOG) är inte tillgänglig för användning i patologi på grund av behovet av taggen för att vara genetiskt kodas in i cellen av intresse 13. Av denna anledning har vi undersökt nyttan av QD märkning av rutinmässigt beredd TEM vävnad för korrelat immuncytokemiska studier. QDs tillämpas på etsad epoxi eller akryl sektioner harts från lightly aldehyd fasta biopsi och vävnadsprover erbjuder möjligheten att erhålla korrelat fluorescens ljusmikroskopi och TEM-data från ett enda prov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vävnads Dissektion och Fixering
- vävnads Dissection
- Dissekera vävnadsbitar från en kirurgiskt opererande tumör prov eller vävnadsbiopsi.
Obs: vävnad som används i denna studie var rutinmässigt fixerades i formalin, men färsk vävnad är också lämplig. Vi valt ett område bekräftas och rapporterats av en anatomisk patolog för att innehålla somatostatinoma tumör efter rutinmässig histologisk färgning och anti-somatostatin immunofärgning (ej visad). - Använd vävnadsbitar inte större än cirka 1,0 mm 3.
- Dissekera vävnadsbitar från en kirurgiskt opererande tumör prov eller vävnadsbiopsi.
- Kakodylatbuffert Framställning
- Bered en stambuffertlösning (1 M) genom att tillsätta 21,4 g natriumkakodylat (se Material List) och 3,0 ml 1% kalciumkloridlösning till 90 ml destillerat vatten och sedan påfyllning av lösningen till en slutlig volym av 100 ml. Rör lösningen och låt den stå över natten så att den kristallina reagens löses helt.
- Fixative Beredning och användning
- Lägga en 10 ml ampull med 50% glutaraldehydlösning till 20 ml natriumkakodylat stamlösning (1 M). Fyll på med destillerat vatten till 190 ml. Kontrollera pH och justera till 7,4 genom tillsats av 1 - 4 droppar av 3% saltsyra (HCl) vid behov.
- Fyll på med destillerat vatten till en slutvolym av 200 ml.
- Sänk ned vävnaden i fixativ innehållande 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M natriumkakodylatbuffert pH 7,4 under 24 h vid 4 ° C i en glasprovröret. Kassera oanvänd fixativ efter en vecka.
2. Vävnadsbearbetning och Inbäddning
- osmium TetroXide Färgning
- Efter fixering är klar, sänk vävnaden i natriumkakodylatbuffert (0,1 M) under 20 min sedan upprepa för en annan 20 min.
- Bered en 2% vattenlösning av osmiumtetraoxid (OSO4) arbetslösning genom att tillsätta 8,0 ml av en 5% OSO4 stamlösning till 2,0 ml av natriumkakodylatbuffert stamlösning (1 M) och 10,0 ml destillerat vatten till en slutvolym av 20,0 ml.
- Avlägsna bufferten fördjupa sedan vävnaden i 2% OSO4 vid pH 7,4 under 4 h vid rumstemperatur.
VARNING! Var försiktig när dekantering och förbereda OSO4 lösningar, bära lämplig personlig skyddsutrustning och arbeta i ett dragskåp vid alla tidpunkter.
- Uranylacetat Färgning
- Efter vävnads osmication är klar, ta bort OSO4 lösning och fördjupa vävnad i 2% natriumacetat under 10 minuter. Ta bort 2% natriumacetat fördjupa sedan i 2% uranylacetat under 1 h vidrumstemperatur.
- dehydrering
- Torka vävnad genom graderade alkoholer. Använda 50% etanol under 10 minuter, 70% etanol under 10 min, 95% etanol under 10 min och två byten av 100% etanol under 20 min vardera vid rumstemperatur.
- Utför två byten av 100% aceton under 30 minuter vardera.
- Hartsimpregnering och Härdning
- Blanda med låg viskositet epoxiharts i en engångspolyetenbägare. Lägg 10,0 g vinylcyklohexendioxid (ERL 4221) epoximonomer, 6 g diglycidyleter av polypropylenglykol (DER 732) och 26,0 g nonenyl bärnstenssyraanhydrid (NSA). Rör om ordentligt för hand med träpinnar under 2 minuter.
- Lägg femton droppar 2-dimetylaminoetanol (DMAE) epoxy accelerator och rör om igen under 2 min. Var noga med att helt blanda ERL, DER och NSA komponenter innan du lägger till DMAE gaspedalen.
- Starta hartsimpregnering av vävnaden genom att ersätta 100% aceton med 1: 1 harts tillaceton under 1 timme, sedan ersätta med 6: 1 harts till aceton under 3 timmar, och slutligen 100% harts natten.
- Överför vävnaden i färskt harts i 8 mm micromoulds. Härdning vid 70 ° C över natten. Harts bör vara svårt men inte spröd efter härdning.
3. Ultramicrotomy
- Kniv, skärning Parametrar och snittjocklek
- Placera en halvtunn diamantkniv i ultramicrotome och skär sektioner från vävnaden vid en tjocklek av 500 nm.
- Flyta sektionerna på vattenbadet bakom kniveggen. Plocka upp sektionerna på ett objektglas och torka ner dem för 10 till 20 sekunder med hjälp av en värmeplatta vid ca 110 ° C
- Etsa sektioner med natriumetoxidlösning under 20 sekunder och sedan tvätta bort med 100% etanol sedan destillerat vatten. Stain med 2% metylenblått i 1% borax för 20 sek på plattan, skölj med rinnande kranvatten i 5 sekunder och torka på kokplattan i 5 sek. därefter stain med 1,5% grund fuksin på kokplattan i 5 sek sedan torka på kokplattan för 20 sek.
- Undersök med ljusfält Ijusmikroskopi och bekräfta att tumörceller och en region av intresse (ROI) är närvarande i sektionen.
- Ändra halvtunn diamantkniv på en ultratunn diamantkniv och ställa in rätt kniv vinkel och skärhastighet som rekommenderas av knivtillverkaren.
- Skär ultratunna sektioner på 90 nm tjocklek. Observera guld färgning av sektionerna när flyter på vattenbadet.
- Sträck och platta sektionerna genom att vifta med kloroform ånga från en 1 cm 2 bit filterpapper inom några millimeter av sektionerna. Se till att inte få kloroform indränkt papper i kontakt med vattenytan.
- Ultratunn avsnitt Grid Montering
- Lyft upp ultratunna sektioner från vattenytan med hjälp av en 300-mesh tunna bar nickel TEM galler som har doppats i avsnitt adhesive-lösning. Leta sektionerna på tråkig sida av nätet. Gallren har en matt eller matt yta på ena sidan och en polerad eller glänsande yta på den andra sidan. Ingen stödfilm krävs. Obs: Det är nödvändigt att hantera dessa nät med anti-magnetiska pincett för att undvika nät fastnar på tången.
- Förbered avsnittet limmet genom att placera 20 cm klar tejp i en 5 ml injektionsflaska med 2,0 ml aceton. Locket och skaka flaskan, låt stå i 10 minuter sedan bort tejpen lämnar bindemedelslösningen.
4. immunomärkning
- antigen demaskering
- Förbereda 1 ml färsk mättad natriummetaperjodat etsningslösning i destillerat vatten och använda den omedelbart. Placera droppar av etsningslösningen på en ren labfilm yta.
- Placera helt torra galler med sektioner ner på droppar av natriummetaperjodat-lösning vid rumstemperatur under 30 min. Överför gallren till destillerat vatten droplets för 60 sek av tvätt.
- Antikropp Inkubation och QD Probe Labeling
- Utför alla inkubationer och märkning av droppar av lösningen placeras på en ren Parafilm yta.
- Placera gallret på en droppe av 0,05 M glycin i PBS under 10 min för att blockera kvarvarande aldehyd i sektion. Ta aldehyden blocket genom att kort läsk kanten av nätet.
- Placera gallret på en droppe av 1% normalt getserum (NGS) och 1% BSAC (10%) i PBS under 10 min. Förbereda den blockerande lösningen genom att tillsätta 10 | il av NGS och 100 pl av BSAC till 890 pl av PBS för att ge en slutlig volym på 1000 | j, l.
- Konditionera sektionerna genom att placera på en droppe av antikroppsspädningsmedel för 10 min.
- Utför immunomärkning inkubation med användning av anti-somatostatin polyklonal antikropp spädd 1:10 med antikropp utspädningsmedel som ger en koncentration av 3,47 g / L. Obs: Antibody inkubation görs genom att placera galler på droppar under 1 timme vid rumstempure i en fuktig kammare.
- Avlägsna antikroppreagens från steg 4.2.5 genom blotting kanten av gallret sedan tvätta sektioner på spädningsmedel för 2 x 5 min.
- Inkubera i en sekundär antikropp (biotinylerat get-anti-kanin-polyklonal) utspädd 1:10 i 1 h vid rumstemperatur. Ta bort den sekundära antikroppslösningen. Tvätta i spädningsmedel för 2 x 5 min.
- Inkubera i streptavidin konjugerade QDs (585 nm) späddes 1:10 i 1 h vid rumstemperatur. Täck med aluminiumfolie för att minska ljusexponering under inkubationen.
- Tvätta galler i färskt destillerat vatten under 2 min. Blot kanterna av galler torr.
5. Fluorescens ljusmikroskopi
- Ljuskälla och filter kuber
- Använd 365 nm lysdiod (LED) belysning för brett fält fluorescens ljusmikroskop. Sätt ett filter kub med följande egenskaper: (Ex G 365 nm, BS FT 395 och EM LP 420 nm).
Obs: Detta filter kub will tillåta emissionsspektra för alla QDs storlekar som skall visualiseras samtidigt under samma exciteringsvåglängden.
- Använd 365 nm lysdiod (LED) belysning för brett fält fluorescens ljusmikroskop. Sätt ett filter kub med följande egenskaper: (Ex G 365 nm, BS FT 395 och EM LP 420 nm).
- Visa och Imaging avsnitten
- Placera immunfärgat snitt nätet ned på en glasskiva i en droppe vatten och täck med ett glas täckglas (tjocklek nummer 1,5). Använd ljusmikroskop för att utvärdera märkningsmönster, graden av icke-specifik märkning och fastställa att negativa kontroller är tydliga märkning.
- Identifiera ROI i förhållande till gallerstänger. Finder galler kan vara till hjälp för att fastställa koordinaterna för målstrukturer.
- Förvärva bilder av positiv märkning på behållaren med en fyrfärg digitalkamera med kameran inställningen "FL auto färg" och "White Balance" inställd på 3,200K. Använd kameran i "Automatisk exponering" läge med en "Gamma" inställningen mellan 0,45 och 1,00 för att optimera utseendet på bilderna och "Analog Gain" inställd på 1x.Klicka på kameraikonen i Zen 2 Lite programvara grafiskt gränssnitt för att "Live", fokusera bilden klicka på "Snap" för att fånga bilden till ramlager sedan.
- Spara bilderna som .tif-filer för att undvika kompression och pixele blir uppenbar.
- Förbered en utskrift som visar läget för ROI i förhållande till gallerstänger eller andra viktiga landmärken vävnad. Dessa utskrifter kommer att vara användbart för efterföljande navigering av sektionen och åter hitta ROI genom transmissionselektronmikroskop (TEM).
- Ta bort gallret från bilden, tvätta i destillerat vatten och försiktigt torka kanterna torr.
Obs: Använd inte alltför intensiv belysning för att förvärva fluorescensbilder. Den foto av QDs tillåter avbildningstider på upp till ett par sekunder men se till att inte förlänga exponeringen som släckning av QD signalen kan ske efter ca 1 min i vatten. Utökad eller permanent foto endast erhålls när QD märkt sektioner är uttorkad med toluen ochinbäddade i täck enligt tillverkarens specifikationer. Dock kommer denna process sedan utesluta möjligheten att korrelat undersökning av samma avsnitt av TEM.
6. Transmissionselektronmikroskopi
- TEM Konfigurera och visning
- Överför nätet till TEM för undersökning med en accelererande spänning på 100 kV. Använd låg förstoring av cirka 1,400X att navigera runt i nätet och hitta ROI som korrelerar med de åsikter ljusmikroskop. Titta på kluster av QDs vid förstoringar runt 50,000X.
- Observera enskilda QDs på 70,000X förstoring eller högre. Beakta QDs som oregelbundna kristallstrukturer med måttlig elektrondensitet.
- imaging
- Använd en digital kamera för TEM avbildning. En monokrom 1392 x 1040 pixel sensor är tillräcklig.
- Hämta bilder genom att klicka på "Camera" -ikonen på "On" i MICRoscope grafiskt gränssnitt av bildbehandlingsprogram, sedan till "Av" för att lagra bilden i ramlager. Notera: dessa operationer kommer att variera beroende på mikroskopsystemet som används. Använd kameran i automatiskt exponeringsläge med en inställning "Gamma" på 1,00.
- Spara bilderna som .tif filer.
7. CLEM Imaging
- Lokalisera en Fluorescence ROI med TEM
- Använd en utskrift från ljusmikroskop bilden för att lokalisera motsvarande ROI med TEM. Vävnads arkitektoniska funktioner såsom blodkärl och luminala strukturer är användbara för navigering runt sektionen med TEM.
- Ta en bild av motsvarande ROI med TEM.
- CLEM Bildöver
- Se till att TEM bilden är korrekt orienterad med Ijusmikroskopi bilden och korrigera utvidgningen av var och en, så att samma struktur sett i varje modalitet är av samma storlek.
- orienteraåt ljusmikroskop och TEM bilder och visa dem sida vid sida eller över att markera de ultra funktionerna i immunolabeled ROI.
- Skapa en överlagring bild med Photoshop CS2. Först förstora fluorescens bilden till samma förstoring som en låg effekt TEM bild. Orientera båda bilderna och sedan klistra in dem sida vid sida på en duk.
- Platta bilden.
- Skapa fluorescens overlay från denna sammansatta bilden. Klicka på "rektangulära markeringsramen", välj fluorescens bild och skapa en kopia lager från den.
- Justera "Layer Style / Blandning alternativ" till 30-40% transparens.
- Klicka på "Move Tool" och dra fluorescens täckskiktet över motsvarande TEM bilden. Rikta bilderna.
- Efter att ha uppnått inriktningen "Platta" lagren för att producera den slutliga overlay image.
- Använd "rektangulära markeringsramen" för att välja den nya överlägg avbilda ennd kopiera den till en ny duk. Spara denna som en TIFF-fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De somatostatinoma tumörprov som används för denna studie omfattade tumörceller bildar duktala strukturer blandat med kollagen stomivävnaden. Genom fluorescens ljusmikroskopi, individuella tumörceller som innehöll rikligt sekretoriska granuler visade positiv märkning för somatostatin hormon. Kärnor verkade som mörka hål med minimal icke-specifik märkning detekteras (figur 1). Vid låga förstoringar, var variabelt intensiv granulär orange fluorescens ses i cytoplasman i dessa väl karakteriserade tumörceller. Den orange färgen på fluorescens bestämdes av storleken på QD används. För denna studie har vi använt 585 nm QDs som avger en orange signal när den exciteras med 365 nm ljus.
CLEM analys av samma cell var möjligt (fig 2). Genom att använda samma rutnät som ses av ljusmikroskop för TEM undersökning tillåts ROI skall erkännas och imlagras i båda formerna. Samma vävnad arkitektur i förhållande till gallerstänger som sett genom Ijusmikroskopi observerades genom TEM och användas för navigering. ROI befanns genom att hänvisa till en 20X ljusmikroskop bilden och notera vävnads funktioner i förhållande till gallerstänger.
TEM visade cytoplasman av somatostatin positiva celler att innehålla rikliga runda korn av varierande elektrondensitet. Granulat av olika diametrar var närvarande i enskilda celler och QD immunomärkning densitet över granulerna var också variabel. Överdrogos fluorescensdata på TEM-bilder föreslog starkt positiv märkning motsvarade granuler innehållande måttligt elektrontätt material inom vesikeln begränsande membran (Figur 3).
Vid högre förstoring måttligt elektrontäta granuler kan ses att intensivt immunolabeled med QD nanokristaller ( 
Figur 1:. Ljusmikroskopi Vy över en ultratunn avsnitt med Somatostatinoma celler märkta för somatostatin hormon ultratunna avsnitt monterades på en TEM galler, immunolabeled, placerades sedan på en glasskiva i vatten under ett täckglas. Somatostatinoma celler (pilar) visar runda kärnor och riklig somatostatin hormon positiva granuler i cytoplasman. Stor variation i märkning densitet ses i somatostatinoma cellpopulationen (200X). Klicka här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 2: CLEM Composite View from en ultratunn sektion genom somatostatin oma Tissue Labeled för Somatostatin A) Somatostatinoma celler genom widefield fluorescensmikroskopi (120X);. B) Samma celler som omger en lumen (L) ses av TEM vid låg förstoring (570X); C) Högre effekt TEM visar starkt fluorescerande cellen från ( A) med kärnan (N) (2,000X);. D) Detalj av cytoplasmiska granuler visar intensiv märkning med QDs över det amorfa materialet som finns i granulat (asterisk) (20.000) klicka här för att se en större version av denna siffra . 
Figur 3:. CLEM Overlay Bild En genomskinlig bild från fluorescensmikroskopi blandas med en TEM bild av motsvarande område (2,000X)./ftp_upload/54307/54307fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 4: Transmissionselektronmikroskopi (TEM) Vy över somatostatin Positiv Granulat från Somatostatinoma cellens cytoplasma Somatostatin hormon positiva granuler i cytoplasman (pilar) visar QD lokalisering över amorfa innehållet till stor del inom den begränsande membran.. Omgivande cytoplasma bakgrund är ren med några QD sonder uppenbar. Några icke-specifik nukleär märkning ses. Vesikler membran som omger granulerna (pilar) är fortfarande synliga (50,000X). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna studie har visat den potentiella nyttan av QDs som universella prober för Clem studier. De 585 nm QD nanopartiklar som används visade ljusa och stabil fluorescens när ses av Vidvinkel ljusmikroskop och var lätt observeras av TEM. En tidigare studie av en av de föreliggande författare har visat QDs också vara lämpliga för superupplösning Ijusmikroskopi 7. Deras foto var särskilt användbart för längre visningstider och långa avbildningsexponeringar. QDs kan också användas för multiplex immunohistokemi med olika stora prober samtidigt avger olika färgade spektra under samma exciteringsvåglängden.
QDs har tillräcklig atomvikt som skall visualiseras genom TEM, men detta befanns vara utmanande beroende på storleken av nanopartikeln som används. För ljusmikroskop, har vi funnit att 525 nm QDs (grön) producerar mindre bakgrund märkning jämfört med större 585 nm (orange) och 655 nm (röd) former. Vi valde dock att använda större 585 nm QD i denna studie för att möjliggöra enklare visualisering av märkningen av TEM. De mindre 525 nm QDs är dimensionerade ungefär 3-5 nm, medan de större 585 nm former är cirka 6-8 nm och 655 nm QDs cirka 8-10 nm. De 585 nm QDs hade en oregelbunden kristallform med måttlig elektrondensitet när den betraktas av TEM. De var inte så rund eller som elektron tät som de mer traditionella kolloidalt guld immuncytokemiska sonder. Emellertid har QDs visats ge upp till 10X mer effektiv märkning än kolloidalt guld 9 och vi har bekräftat här att en hög märkningstäthet var lätt att uppnå, i synnerhet med de biotin-streptavidin sond bindningssystemet. CdSe QDs har också en karakteristisk elementärt signatur som kan möjliggöra detektion och kartläggning med hjälp av energidispersiv spektroskopi (EDS), elektronenergiförlustspektroskopi (EELS) eller energi filtreras transmissionselektronmikroskopi (EFTEM) 8. Sveptransmissionselektronmikroskop (STEM) system kan också användas på grund av deras utnyttjande av Z-kontrast eller atomnummer avbildning som skulle öka kontrasten mellan nanopartiklar och biologiska material med lägre atomnummer 14. Stort område kartläggning och visualisering av 3D-informationsdistribution 15 med fältemission svepelektronmikroskop bör också vara möjligt.
Ett kritiskt steg i vår metod är antigenet avslöjande eller avsnitt etsning förfarande. Vi använder en enda behandling med natriummetaperjodat under 30 minuter vid rumstemperatur. Längre än så och aggregering av strukturer eller förlust av membran definition kan förekomma. Andra har använt en två-stegsmetod som involverar deplasticizing med natriummetoxid följt av de-osmication med natriumperjodat och detta kan ge mer kontroll över processen om så är nödvändigt 16.
CLEM var möjligt genom att använda ljusmikroskop för att carey logga strukturella drag av ROI i förhållande till gallerstänger. Samma galler placeras sedan i TEM och orienteras så att de gallerstänger och landmärken motsvarar den Ijusmikroskopi vy. En låg förstoring av ungefär 1,400X är mest lämplig för detta. Vävnadsstrukturer såsom duktala formationer och mönster av kärnorna visade sig vara mest användbara för re-finding ROI i vävnaden. Emellertid kan noggrann korrelation med samma cell upplösning vara utmanande. Care måste tas med orientering av nätet för att återspegla samma orientering ses av ljusmikroskop. Vi har uppnått någorlunda korrekt subcellulär spatial korrelation mellan formerna med overlay bilder som produceras med hjälp av Photoshop. Fluorescens överlägg bild blandades med TEM bakgrundsbild men vissa förskjutning kunde påvisas. Detta kan bero på de olika bildsystem som används av varje modalitet eller strålningsskador på våra stöds ultratunna sektioner i TEM. Automatiserade system för storing koordinaterna för ROI ses av ljusmikroskop och överföra dessa till elektronmikroskop nu marknadsförs och skulle förenkla denna procedur.
Nyttan av den strategi CLEM vi har presenterat för immuncytokemiska studier är med nödvändighet begränsat av provberedningsmetod som används, det vill säga, heavy metal färgning och epoxiharts inbäddning oundvikligen maskering tillgängliga epitoper. Men gör tekniken tillåter betydande fördel att få fluorescens och TEM data från patologiprover. Erhålla strukturell och funktionell information från olika mikroskopi formerna med hjälp av ett enda prov är något som inte har i allmänhet varit tillgängliga för studier av mänskliga patologi celler och vävnader som bearbetades i första hand för diagnostiska ändamål.
Det skulle förväntas att mer känsliga immuncytokemiska lokalisering kan erhållas från en frysfixerings strategi snarare än ett protokoll Bvisar därmed kemisk fixering. Antagande av cryofixation principer 17 för biobank av mänsklig vävnad följt av cryoultramicrotomy och rumstemperatur QD-baserad immunmärkningen som i den klassiska Tokuyasu teknik 18, 19 skulle underlätta känsliga och specifika korrelat immunocytokemiska studier av den mänskliga sjukdomen patogenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium cacodylate | Proscitech | C0205 | Harmful chemical |
| Osmium tetroxide | Proscitech | C010 | Use only in fume hood |
| Uranyl acetate | Univar-Ajax | 569 | Hazardous chemical |
| Ethanol 100% | Fronine | JJ008 | |
| Acetone 100% | Fronine | JJ006 | |
| ERL 4221 | Proscitech | C056 | |
| DER 732 | Proscitech | C047 | |
| NSA | Proscitech | C059 | |
| DMAE | Proscitech | C050 | |
| Sodium metaperiodate | Analar BDH | 10259 | |
| anti-somatostatin antibody | Dako | A0566 | |
| Antibody diluent | Dako | S3022 | |
| Qdot 585 Streptavidin Conjugate | Invitrogen | Q10113MP | |
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody | Sigma | B7389-1ML | |
| Glutaraldehyde 50% | EMS | 16320 | |
| Normal goat serum | Invitrogen | PCN5000 | |
| PBS "Dulbecco A" | Oxoid | BR0014G | |
| BSAc (10%) | Aurion | 900.022 | |
| Parafilm | Pechiney PP | M | |
| pH indicator strips (pH 2.0 - 9.0) | Merck | 1.09584.0001 | |
| Micromoulds | Proscitech | RL063 | |
| Diamond knife | Diatome | Ultra 45 | |
| Transmission electron microscope | FEI | Morgagni 268D | |
| Fluorescence light microscope | Carl Zeiss | Axioscope A1 | |
| Grids 300 mesh nickel (thin bar) | Agar Scientific | G2740N | |
| Ultramicrotome | RMC | Powertome | |
| TEM camera control software | Soft Imaging System | AnalySIS | Version 3.0 |
| Image processing software | Adobe Systems Incorporated | Photoshop CS2 |
References
- Kukulski, W., Schorb, M., Welsch, S., Picco, A., Kaksonen, M., Briggs, J. A. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
- Introduction to correlative light and electron microscopy. Methods Cell Biol. Müller-Reichert, T., Verkade, P. , (2012).
- De Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up! Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
- Faas, F. G., et al. Localization of fluorescently labeled structures in frozen-hydrated samples using integrated light electron microscopy. J Struct Biol. 181 (3), 283-290 (2013).
- Redemann, S., Müller-Reichert, T. Correlative light and electron microscopy for the analysis of cell division. J Microsc. 251 (2), 109-112 (2013).
- Spiegelhalter, C., et al. From dynamic live cell imaging to 3D ultrastructure: novel integrated methods for high pressure freezing and correlative light-electron microscopy. PLoS One. 5 (2), e9014 (2010).
- Killingsworth, M. C., Lai, K., Wu, X., Yong, J. L., Lee, C. S. Quantum dot immunocytochemical localization of somatostatin in somatostatinoma by widefield epifluorescence, super-resolution light, and immunoelectron microscopy. J Histochem Cytochem. 60 (11), 832-843 (2012).
- Nisman, R., Dellaire, G., Ren, Y., Li, R., Bazett-Jones, D. P. Application of quantum dots as probes for correlative fluorescence, conventional, and energy-filtered transmission electron microscopy. J Histochem Cytochem. 52 (1), 13-18 (2004).
- Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using quantum dots. Nat Methods. 2 (10), 743-749 (2005).
- Kuipers, J., de Boer, P., Giepmans, B. N. Scanning EM of non-heavy metal stained biosamples: Large-field of view, high contrast and highly efficient immunolabeling. Exp Cell Res. 337 (2), 202-207 (2015).
- Barroso, M. M.
- Michalet, X., et al. Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics. Science. 5, 538-544 (2005).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues and organisms. PLoS Biol. 9 (4), e1001041 (2011).
- Thomas, J. M., Midgley, P. A. High-resolution transmission electron microscopy: the ultimate nanoanalytical technique. Chem Commun. , 1253-1267 (2004).
- Loussert Fonta, C., Humbel, B. M.
- Marc, R. E., Liu, W. Fundamental GABAergic amacrine cell circuitries in the retina: nested feedback, concatenated inhibition, and axosomatic synapses. J Comp Neurol. 425 (4), 560-582 (2000).
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochem Cell Biol. 130 (5), 877-889 (2008).
- Tokuyasu, K. T.
- Loussert Fonta, C., et al. Analysis of acute brain slices by electron microscopy: a correlative light-electron microscopy workflow based on Tokuyasu cryo-sectioning. J Struct Biol. 189 (1), 53-61 (2015).
