Abstract
Es wird ein Verfahren beschrieben, wobei Quantenpunkt (QD) Nanopartikel können für die korrelative immunzytochemische Studien der menschlichen Pathologie Gewebe unter Verwendung von Weitfeldfluoreszenzlichtmikroskopie und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) verwendet werden. Um zu demonstrieren, das Protokoll haben wir ultradünnem epoxy Abschnitte des menschlichen Somatostatinom Tumor immunmarkierten einen primären Antikörper gegen Somatostatin verwendet, gefolgt von einem biotinylierten sekundären Antikörper und Sichtbarmachung mit Streptavidin konjugiert ist 585 nm Cadmium-Selen (CdSe) Quantenpunkte (QD). Die Abschnitte werden auf einem TEM Objektgitter montiert dann durch Mikroskopie Weitfeld- Fluoreszenzlicht auf einen Glasträger zur Beobachtung angeordnet. Die Lichtmikroskopie zeigt 585 nm QD Kennzeichnung als leuchtend orange Fluoreszenz ein körniges Muster innerhalb der Tumorzelle Zytoplasma bilden. Bei niedrigen bis mittleren Bereich Vergrößerung durch Lichtmikroskopie die Markierungsmuster leicht erkannt werden kann, und die Höhe der nicht-spezifische oder Hintergrundmarkierung bewertet. Dies ist ein kritischerSchritt für die anschließende Interpretation der Immunomarkierung Musters durch TEM und Bewertung des morphologischen Kontext. Der gleiche Abschnitt wird dann trocken getupft und mit TEM betrachtet. QD Sonden gesehen in einzelnen sekretorischen Granula enthalten amorphes Material angebracht werden. Die Bilder werden aus der gleichen Region von Interesse (ROI) gesehen durch Lichtmikroskopie für die korrelative Analyse erworben. können Bilder von jeder Modalität entspricht, dann vermischt werden Fluoreszenzdaten auf TEM Ultrastruktur des entsprechenden Bereichs zu überlagern.
Introduction
Korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM) ist ein leistungsfähiges Verfahren für die Analyse von transienten dynamischen Ereignissen 1, seltene Ereignisse 2, 3 und komplexe Systeme 4. Es gibt viele verschiedene technische Permutationen verfügbar 5 je nach Fragestellung jedoch aufgefordert, eine häufige Anforderung ist , dass die gleiche Struktur in einer einzigen Probe 6 durch mehrere Mikroskopie Modalitäten abgebildet wird. Unsere besondere Herangehensweise an Clem wurde für das Studium der Archiv menschlichen Pathologie Gewebe und den Fall entwickelt hier verwendet wurde , gut charakterisiert und bisher 7 veröffentlicht. Ziel war es zunächst, die analytischen Daten aus einer einzigen Biopsie oder chirurgische Probe und zum anderen zu maximieren, Fluoreszenzlichtmikroskopie verwenden, um den Kontext des immunzytochemischer Markierungsmuster auf ultrastruktureller Ebene gesehen zu helfen, zu klären.
Quantenpunkt-Nanokristalle (QD) bieten das Potenzial eines universellen Markersystem able von beiden betrachtet werden, Fluoreszenzlichtmikroskopie und Elektronenmikroskopie 8, 9, 10. ihrer kristallinen Kernstruktur ermöglicht QD unterschiedlicher Größe eine Vielzahl von Fluoreszenzemissionsspitzen zu erzeugen , wenn 11 durch Licht bei Wellenlängen weit von ihren Emissionsspektren angeregt. Deren Atomgewicht reicht Elektronendichte zu ergeben, die durch Transmissionselektronenmikroskopie, Rastertransmissions-Elektronenmikroskopie (STEM) oder Feldemissionsrasterelektronenmikroskopie detektierbar ist. Sie eignen sich besonders für immunzytochemische Studien geeignet , da auch einzelne QDs beobachtet werden kann eine ultimative Empfindlichkeit eines QD pro Ziel geben Molekül 12. Weiterhin verwendet auf der QD je können sie eine einzelne Elementar Signatur geeignet für die Zuordnung besitzen.
Menschliche Pathologie Proben bieten erhebliche Vorteile für die translationale biomedizinische Forschung. Chirurgische Gewebe und Biopsieproben werden routinemäßig für Biobanken vorgelegt und mit geeignet friate Ethik Abstände können für Forschungsstudien zugegriffen werden. Menschliches Gewebe nicht über Fragen von Bedeutung oder Interpretation , die in tierischen oder in vitro - Modellen der Krankheit auftreten können. Jedoch die Probenvorbereitung der Pathologie Proben oft nicht optimal ist. Es kann in Fixiermittel verwendet unangemessen Verzögerung im Gewebe platziert Fixiermittel wie Formalin statt Glutaraldehyd für TEM und unangemessene Probenahme. Clem Methoden haben das Potenzial, die diagnostische und prognostische Informationen aus einer einzigen menschlichen Probe zu optimieren. Allerdings sind einige neu entwickelte Korrelat Ansätze , wie sie unter Verwendung von Mini - Singlet Sauerstoff - Generator (miniSOG) für den Einsatz in der Pathologie nicht verfügbar , da die Notwendigkeit für das Tag genetisch in die Zelle von Interesse 13 codiert werden. Aus diesem Grund haben wir die Nützlichkeit von QD Kennzeichnung von routinemäßig vorbereitet TEM Gewebe für die korrelative immunzytochemische Studien untersucht. QP angewandt geätzten Epoxid- oder Acrylharz-Abschnitte von lightly Aldehyd fixiert Biopsie und Gewebeproben bieten die Möglichkeit, Korrelat Fluoreszenzlichtmikroskopie und TEM-Daten aus einer einzigen Probe zu erhalten.
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Protocol
1. Die Gewebe Dissection und Fixation
- Tissue Dissection
- Präparieren Gewebestücke aus einem chirurgisch reseziert Tumorprobe oder Gewebebiopsie.
Hinweis: Das Gewebe in dieser Studie verwendet wurde routinemäßig in Formalin fixiert, aber frisches Gewebe ist ebenfalls geeignet. Wir wählten eine Fläche von einem anatomischen Pathologe bestätigt und berichtet Somatostatinom Tumor nach histologischen Routinefärbung und Anti-Somatostatin Immunfärbung (nicht gezeigt) enthalten. - Verwenden Sie Gewebestücke nicht größer als etwa 1,0 mm 3.
- Präparieren Gewebestücke aus einem chirurgisch reseziert Tumorprobe oder Gewebebiopsie.
- Cacodylatpuffer Vorbereitung
- Vorbereitung einer Stammpufferlösung (1 M) durch Zugabe von 21,4 g Natriumcacodylat (siehe Materialliste) und 3,0 ml 1% ige Calciumchloridlösung zu 90 ml destilliertem Wasser und danach Auffüllen der Lösung auf ein Endvolumen von 100 ml. Rühren Sie die Lösung und lassen Sie es über Nacht stehen, so dass das kristalline Reagenz vollständig auflöst.
- Fixative Herstellung und Verwendung
- In einem 10 ml-Ampulle von 50% Glutaraldehyd-Lösung zu 20 ml Natriumcacodylat Stammlösung (1 M). Füllen Sie mit destilliertem Wasser auf 190 ml. Den pH-Wert einzustellen und auf 7,4 durch Zugabe von 1 bis 4 Tropfen 3% ige Salzsäure (HCl), falls erforderlich.
- Füllen Sie mit destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 200 ml zu erhalten.
- Eintauchen des Gewebes in Fixiermittel 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumkakodylat - Puffer pH 7,4 für 24 h bei 4 ° C in einer Glasprobenröhrchens enthält. Nicht verwendete Fixiermittel nach 1 Woche.
2. Gewebeverarbeitung und Embedding
- Osmium TetroXide Anfärben
- Nach der Fixierung abgeschlossen ist, tauchen für weitere 20 Minuten in das Gewebe in Natriumcacodylatpuffer (0,1 M) für 20 min dann wiederholen.
- Bereiten Sie eine 2% ige wässrige Osmiumtetroxid (OsO 4) Arbeitslösung von 8,0 ml einer 5% OsO 4 Stammlösung zu 2,0 ml Natriumcacodylatpuffer Stammlösung (1 M) und 10,0 ml destilliertem Wasser zugegeben wird ein endgültiges Volumen zu machen 20,0 ml.
- Entfernen der Puffer dann das Gewebe in 2% OsO 4 tauchen bei pH 7,4 für 4 Stunden bei Raumtemperatur.
ACHTUNG! Seien Sie vorsichtig beim Umfüllen und OsO 4 Herstellung von Lösungen, tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung und Arbeit in einem Abzug zu allen Zeiten.
- Uranylacetat Anfärben
- Nach Gewebe osmication abgeschlossen ist, die OsO 4 -Lösung zu entfernen und für 10 min Gewebe in 2% Natriumacetat eintauchen. Entfernen Sie die 2% Natriumacetat dann in 2% Uranylacetat für 1 Stunde tauchen aufZimmertemperatur.
- Entwässerung
- Entwässern Gewebe durch abgestufte Alkohole. Verwenden 50% Ethanol für 10 Minuten, 70% Ethanol für 10 min, 95% Ethanol für 10 min und zwei Wechsel von 100% Ethanol für jeweils 20 min bei Raumtemperatur.
- Führen Sie zwei Änderungen von 100% Aceton für jeweils 30 min.
- Harzimprägnierung und Härtung
- Mischen Sie mit niedriger Viskosität Epoxidharz in einem Einweg-Polyethylenbecher. Hinzufügen, 10,0 g Vinylcyclohexendioxid (ERL 4221) Epoxymonomer, 6 g Diglycidylether von Polypropylenglykol (DER 732) und 26,0 g Nonenyl Bernsteinsäureanhydrid (NSA). Rühren Sie gründlich von Hand mit Holzstäbchen für 2 min.
- In fünfzehn Tropfen 2-Dimethylaminoethanol (DMAE) Epoxy-Beschleuniger und rühren Sie wieder für 2 min. Achten Sie darauf, in vollem Umfang die ERL, DER und NSA Komponenten mischen, bevor die DMAE-Beschleuniger Zugabe.
- Beginnen Harzimprägnierung des Gewebes durch Austauschen 100% Aceton mit 1: 1 Harz zu1 Harz zu Aceton für 3 Stunden und schließlich 100% über Nacht Harz: Aceton für 1 Stunde, dann mit 6 ersetzen.
- Übertragen Sie das Gewebe in frischem Harz in 8 mm micromoulds. Heilung bei 70 ° C über Nacht. Harz sollte hart sein, aber nicht spröde nach der Aushärtung.
3. Ultramikrotomie
- Messer, Schneidparameter und Abschnitt Stärke
- Legen Sie ein Semidünndiamantmesser in der Ultramikrotom und Zuschnitte aus dem Gewebe mit einer Dicke von 500 nm.
- Float Abschnitte auf dem Wasserbad hinter der Messerkante. Pick - up die Abschnitte auf einem Glasträger und trocknen Sie sie nach unten für 10 bis 20 Sekunden unter Verwendung einer Heizplatte bei etwa 110 o C
- Etch die Abschnitte mit Natriumethylat-Lösung für 20 Sekunden und dann mit 100% Ethanol dann destilliertes Wasser abwaschen. Stain mit 2% Methylenblau in 1% Borax für 20 Sekunden auf der Heizplatte, Spülen mit Leitungswasser für 5 Sekunden und trocken auf der Heizplatte 5 Sekunden läuft. Dann stain mit 1,5% Basisfuchsinlösung auf der Heizplatte für 5 Sekunden dann trocken auf der Heizplatte für 20 Sekunden.
- Untersuchen von Hellfeld-Lichtmikroskopie und bestätigen, dass Tumorzellen und eine Region of Interest (ROI) sind in dem Abschnitt.
- Ändern Sie den Semidünndiamantmesser zu einer ultradünnen Diamantmesser und stellen Sie die richtige Messerwinkel und Schnittgeschwindigkeit, wie durch die Messerhersteller empfohlen.
- Schneiden Sie ultradünne Schnitte bei 90 nm Dicke. Beachten Sie die Goldfärbung der Abschnitte, wenn sie auf dem Wasserbad schwimmen.
- Dehnen und glätten die Abschnitte durch Winken Chloroform Dampf aus einem 1 cm 2 Stück Filterpapier innerhalb von wenigen Millimetern der Abschnitte. Achten Sie darauf, nicht das Chloroform getränkten Papier in Kontakt mit der Wasseroberfläche zu bringen.
- Ultradünnes Abschnitt Grid Montage
- Heben Sie die ultradünne Schnitte von der Wasseroberfläche bis unter Verwendung eines 300-Mesh-Dünn bar Nickel TEM-Gitter, die in Abschnitt Adhäsiv getaucht wurdee Lösung. Suchen Sie die Abschnitte auf der stumpfen Seite des Gitters. Die Gitter haben eine stumpfe oder matte Oberfläche auf der einen Seite und einer polierten oder glänzende Oberfläche auf der anderen Seite. Kein Trägerfolie ist nicht erforderlich. Hinweis: Es ist notwendig, diese Gitter mit antimagnetische Pinzette zu behandeln Gitter zu vermeiden, auf die Zange kleben.
- Bereiten Sie den Abschnitt Klebstoff von 20 cm klar Klebeband in einem 5-Platzierung ml mit 2,0 ml Aceton Fläschchen. Cap und schütteln Sie das Fläschchen, lassen Sie für 10 Minuten ruhen lassen, dann entfernen Sie das Band verlässt die Klebstofflösung.
4. Immunmarkierung
- Antigen Demaskierung
- Bereiten Sie 1 ml frischem gesättigten Natriummetaperiodat Ätzlösung in destilliertem Wasser und verwenden Sie es sofort. Ort Tröpfchen der Ätzlösung auf einer sauberen Oberfläche labfilm.
- Platzieren vollständig trocken Gitter mit Abschnitten nach unten auf Tröpfchen Natriummetaperiodat-Lösung bei Raumtemperatur für 30 min. Übertragen Sie die Gitter zu destilliertem Wasser droPletts für 60 sec Waschen.
- Antikörperinkubation und QD Sondenmarkierung
- Führen Sie alle Inkubationen und Kennzeichnung auf Tröpfchen Lösung auf eine saubere Oberfläche Parafilm gelegt.
- Legen Sie das Gitter auf einem Tröpfchen von 0,05 M Glycin in PBS für 10 min Restaldehyd im Abschnitt zu blockieren. Entfernen Sie den Aldehydblock durch kurzes Drücken der Kante des Gitters Blotting.
- Platzieren Sie die Gitter auf einem Tropfen 1% normalem Ziegenserum (NGS) und 1% BSAC (10%) in PBS für 10 min. Bereiten Sie die Blockierungslösung durch Zugabe von 10 ul NGS und 100 ul BSAC bis 890 & mgr; l PBS auf ein Endvolumen von 1000 & mgr; l zu ergeben.
- Voraussetzung für die Abschnitte von 10 min auf einem Tropfen Antikörperverdünnung platzieren.
- Führen Sie die Immunmarkierung Inkubation mit Anti-Somatostatin-polyklonalen Antikörper verdünnt 1:10 mit Antikörper Verdünnungsmittel mit einer Konzentration von 3,47 g / L zu geben. Hinweis: Antikörper-Inkubation wird durchgeführt durch Gitter auf Tröpfchen für 1 h bei Raum temperat Plazierenure in einer feuchten Kammer.
- Entfernen Antikörperreagens aus Schritt 4.2.5 durch Blotten der Kante des Gitters dann waschen Abschnitte über Verdünnungsmittel für 2 x 5 min.
- Inkubieren in sekundären Antikörper (biotinylierter Ziege-anti-Kaninchen-polyklonal) 01.10 für 1 h bei Raumtemperatur verdünnt. Entfernen Sie die sekundäre Antikörperlösung. Waschen Sie in Verdünnungsmittel für 2 x 5 min.
- Inkubieren in Streptavidin konjugierten QD (585 nm) 01.10 für 1 h bei Raumtemperatur verdünnt. Mit Alufolie abdecken, um Lichtexposition während der Inkubation zu reduzieren.
- Waschen Sie Gitter in frischem destilliertem Wasser für 2 min. Blot, der die Kanten des Gitters trocken.
5. Die Fluoreszenzlichtmikroskopie
- Lichtquelle und Filterwürfel
- Verwenden Sie 365-nm-Licht emittierende Diode (LED) Beleuchtung für Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie. Legen Sie eine Filterwürfel mit den folgenden Merkmalen: (Ex G 365 nm, BS FT 395 und EM LP 420 nm).
Hinweis: Dieser Filterwürfel wkrank erlauben die Emissionsspektren aller QD gleichzeitig unter der gleichen Anregungswellenlänge visualisiert werden Größen.
- Verwenden Sie 365-nm-Licht emittierende Diode (LED) Beleuchtung für Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie. Legen Sie eine Filterwürfel mit den folgenden Merkmalen: (Ex G 365 nm, BS FT 395 und EM LP 420 nm).
- Anzeigen und Imaging Bereiche
- Platzieren Sie den immunhistochemisch Gitterabschnitt nach unten auf einem Glasträger in einem Tropfen Wasser geben und mit einem Deckglas (Dicke Nummer 1.5). Verwenden Sie die Lichtmikroskopie die Markierungsmuster, das Niveau von jedem nicht-spezifische Markierung zu bewerten und festzustellen, dass die negativen Kontrollen klar der Markierung sind.
- Identifizieren Sie ROI in Bezug auf Gitterstäben. Finder Gitter können hilfreich sein für die Festlegung Koordinaten von Zielstrukturen.
- Erwerben Sie Bilder von positiven Kennzeichnung auf dem Abschnitt eines Vollfarbdigitalkamera mit der Kameraeinstellung auf "FL Auto-Farbe" und "Weißabgleich" eingestellt bei 3.200K verwenden. Verwenden Sie die Kamera in "Automatische Belichtung" Modus mit einem "Gamma" Einstellung zwischen 0,45 und 1,00, das Aussehen der Bilder und "Analog Gain" auf 1x eingestellt zu optimieren.Klicken Sie auf das Kamera-Symbol in der Zen 2 Lite Software grafische Schnittstelle zu "Live", das Bild scharf und klicken Sie auf "Snap" das Bild in den Bildspeicher zu erfassen.
- Speichern Sie die Bilder als TIF-Dateien Kompression und pixelation zu vermeiden, zeichnet sich ab.
- Vorbereiten eines Druck die Position des ROI in Bezug auf die Gitterstäbe oder andere bedeutende Teilpunkte zeigt. Diese Drucke werden für nachfolgende Navigations des Abschnitts und Wiederfindungs ROIs durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) nützlich sein.
- Entfernen Sie das Gitter aus der Folie, waschen in destilliertem Wasser und sanft die Kanten trocken tupfen.
Hinweis: Nicht allzu intensive Beleuchtung verwenden, um Fluoreszenzbilder zu erwerben. Die Photostabilität von QD ermöglicht Aufnahmezeiten von bis zu ein paar Sekunden, aber darauf achten, nicht zu verlängern Exposition als Abschreckung des QD-Signal nach ca. 1 min in Wasser auftreten können. Extended oder dauerhafte Photo wird nur dann erhalten, wenn QD markierten Abschnitte dehydriert sind mit Toluol undunter Deckgläser gemäß den Vorgaben des Herstellers eingebettet. Allerdings wird dieser Prozess dann die Möglichkeit ausschließen, von Korrelat Prüfung des gleichen Abschnitts durch TEM.
6. Transmissionselektronenmikroskopie
- TEM - Set Up und Viewing
- Übertragen, um das Raster zu dem TEM zur Untersuchung einer Beschleunigungsspannung von 100 kV verwendet wird. Verwenden geringer Vergrößerung von etwa 1,400X um das Netz zu navigieren und finden ROIs, die mit den Lichtmikroskopie Ansichten korrelieren. Ansicht Cluster von QD bei Vergrößerungen um 50.000-.
- Beachten Sie einzelne QDs bei 70,000X Vergrößerung oder höher. Beachten Sie die QD als irreguläre Kristallstrukturen mit mäßiger Elektronendichte.
- Imaging
- Verwenden Sie eine Digitalkamera für TEM-Aufnahmen. Eine monochrome 1.392 x 1.040 Pixelsensor ist ausreichend.
- Erwerben Sie Bilder durch die "Kamera" Symbol klicken auf "On" in der MICROscope grafische Oberfläche der Bildgebungssoftware, dann auf "Aus", um das Bild in dem Bildspeicher zu speichern. Anmerkung: Diese Vorgänge unterscheiden sich auf dem Mikroskopsystem abhängig eingesetzt. Verwenden Sie die Kamera in automatischen Belichtungsmodus mit einer "Gamma" Einstellung von 1,00.
- Speichern Sie die Bilder als TIF-Dateien.
7. CLEM Imaging
- Auffinden eines Fluoreszenz - ROI durch TEM
- Verwenden Sie einen Druck aus dem Lichtmikroskop Bild zu lokalisieren ROIs durch TEM entspricht. Tissue architektonischen Merkmale wie Blutgefäße und luminalen Strukturen sind für die Navigation um den Abschnitt nützlich TEM.
- Aufnehmen eines Bildes des entsprechenden ROI durch TEM.
- Clem Bild - Overlay
- Stellen Sie sicher, dass das TEM-Bild korrekt mit dem Lichtmikroskop Bild und korrigieren Sie die Erweiterung von jedem, so dass die gleiche Struktur gesehen in jeder Modalität die gleiche Größe orientiert ist.
- Orientsie aßen die Lichtmikroskopie und TEM-Aufnahmen und zeigen Sie die Seite an Seite oder als Overlays die ultrastrukturelle Merkmale von immun ROIs zu markieren.
- Erstellen Sie ein Overlay-Bild mit Photoshop CS2. Zunächst vergrößern die Fluoreszenzbild auf der gleichen Vergrößerung als Low-Power-TEM-Aufnahme. beide Bilder Orientieren und dann seitlich auf einer Leinwand an Seite einfügen.
- Flatten das Bild.
- Erstellen Sie die Fluoreszenz-Overlay von diesem zusammengesetzten Bild. Klicken Sie auf das "Auswahlrechteck", wählen Sie das Fluoreszenzbild und erstellen daraus eine doppelte Schicht.
- Stellen Sie die "Ebenenstil / Blending Optionen", um 30 - 40% Transparenz.
- Klicken Sie auf das "Move Tool" und ziehen Sie die Fluoreszenz-Overlay-Schicht über dem entsprechenden TEM-Aufnahme. Richten Sie die Bilder.
- Nach der Ausrichtung zu erreichen "Flatten" die Schichten der endgültigen Overlay-Bild zu erzeugen.
- Verwenden Sie die "Auswahlrechteck", um das neue Overlay-Bild ein zu wählennd kopieren Sie sie auf eine neue Leinwand. Speichern Sie diese als Tiff-Datei.
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Representative Results
Die Somatostatinom Tumorprobe für diese Studie verwendet wurde, umfasste Tumorzellen duktalen Strukturen gemischt mit kollagenen Stoma-Gewebe zu bilden. Durch Fluoreszenzlichtmikroskopie, einzelne Tumorzellen, die reichlich Sekretgranula enthielten, zeigten eine positive Markierung für das Somatostatin-Hormon. Nuclei erschien als dunkle Löcher mit minimalen unspezifische Markierung nachweisbar (Abbildung 1). Bei niedrigen Vergrößerungen variabel intensive körnige Orangen Fluoreszenz wurde in das Zytoplasma dieser gut charakterisierten Tumorzellen gesehen. Die orange Farbe der Fluoreszenz wurde verwendet, um die Größe von QD bestimmt. Für diese Studie haben wir 585 nm QD, die ein orangefarbenes Signal aussenden, wenn sie mit Licht von 365 nm angeregt wird.
Clem Analyse derselben Zelle möglich war (Abbildung 2). Mit dem gleichen Raster betrachtet wie durch Lichtmikroskopie für TEM-Untersuchung erlaubt ROIs erkannt und im zuin beiden Modalitäten gealtert. Die gleiche Gewebearchitektur in Bezug auf die Gitterstäbe, wie durch Lichtmikroskopie beobachtet wurde für die Navigation durch TEM und verwendet beobachtet. Der ROI wurde unter Bezugnahme auf eine 20X lichtmikroskopische Aufnahme und der Feststellung Gewebemerkmale in Bezug auf Gitterstäbe gefunden.
TEM zeigte das Zytoplasma der Somatostatin-positive Zellen reichlich Rundgranulat enthalten Elektronendichte variiert. Granulate verschiedener Durchmesser waren in einzelnen Zellen und QD Immunmarkierungsdichte über dem Granulat war variabel. Die Überlagerung der Fluoreszenzdaten auf TEM - Bilder vorgeschlagen starke positive Markierung zu Granulat entsprach mäßig elektronendichten Material innerhalb der Vesikel begrenzenden Membran (3) enthält.
Bei höherer Vergrößerung könnte die mäßig elektronendichten Granula gesehen werden intensiv mit QD-Nanokristallen zu Immunmarkierung ( 
Abb . 1: Lichtmikroskopie Blick auf eine ultradünne Abschnitt mit Somatostatinom Zellen markiert für Somatostatin - Hormon Ultradünner Abschnitt auf einem TEM - Gitter montiert war, immun, dann auf einem Glasträger in Wasser unter einem Deckglas platziert. Somatostatinom Zellen (Pfeile) zeigen, runden Kernen und reichlich Somatostatin Hormon positive Granula im Zytoplasma. Erhebliche Unterschiede in Markierungsdichte ist in der Somatostatinom Zellpopulation (200X) zu sehen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 
Abbildung 2: Clem Composite - Ansicht von einem ultradünnen Schnitt durch Somatostatin oma Tissue Beschriftete für Somatostatin A) Somatostatinom Zellen durch Weitfeld- Fluoreszenzmikroskopie (120X);. B) Gleiche umgebenden Zellen ein Lumen (L) durch TEM gesehen bei geringer Vergrößerung (570X); C) Höhere Leistung TEM - Ansicht zeigt hell fluoreszierende Zelle aus ( A) mit Kern (N) (2,000X . ), D) Detail der zytoplasmatischen Granula intensive Markierung mit QD über das amorphe Material innerhalb der Körnchen (Stern) (20.000facher) enthalten zeigt Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen . 
Abbildung 3:. Clem Overlay - Bild ein transparentes Bild von Fluoreszenzmikroskopie mit einem TEM - Aufnahme des entsprechenden Bereichs gemischt (2,000X)./ftp_upload/54307/54307fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 
Abbildung 4: Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) Ansicht von Somatostatin Granula aus Somatostatinom Zellzytoplasmas Somatostatin Hormon positive Granula im Zytoplasma (Pfeile) zeigen QD Lokalisation über den amorphen Inhalt weitgehend innerhalb der Grenzmembran.. Zytoplasma-Hintergrund Umgebung ist sauber und mit wenigen QD Sonden evident. Einige nicht-spezifische Kern Kennzeichnung zu sehen ist. Die Vesikelmembran das Granulat (Pfeile) umgibt , ist noch sichtbar (50.000 - ). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Diese Studie hat das Potenzial, Nutzen von QD als universelle Sonden für CLEM Studien nachgewiesen. Die 585 nm QD verwendeten Nanopartikel zeigten helle und stabile Fluoreszenz, wenn sie durch Weitfeld- Lichtmikroskopie betrachtet und wurden durch TEM leicht beobachtet. Eine frühere Studie von einem der Autoren dieses hat auch QD gezeigt für superauflösende Lichtmikroskopie 7 geeignet zu sein. Ihre Photo war besonders nützlich für längere Betrachtungszeiten und lange Abbildungs Belichtungen. QD kann auch mit unterschiedlich großen Sonden gleichzeitig emittieren verschiedenfarbige Spektren unter dem gleichen Anregungswellenlänge für Multiplex-Immunhistochemie eingesetzt werden.
QD besitzen ausreichende Atomgewicht durch TEM visualisiert werden, aber dies wurde festgestellt, auf die Größe des Nanopartikels zu schwierig sein, abhängig eingesetzt. Für die Lichtmikroskopie haben wir, dass 525 nm QD (grün) produzieren Kennzeichnung im Vergleich weniger Hintergrund gefunden auf den größeren 585 nm (orange) und 655 nm (rot) bildet. Allerdings haben wir uns für das größere 585 nm QD in der vorliegenden Studie zu verwenden bequemer Visualisierung der Kennzeichnung von TEM zu ermöglichen. Die kleineren 525 nm QD sind so bemessen, etwa 3 bis 5 nm, während die größeren 585 nm Formen sind etwa 6 - 8 nm und die 655 nm QD ca. 8 - 10 nm. Die 585 nm QD besaß eine irreguläre Kristallform mit mäßiger Elektronendichte, wenn sie durch TEM betrachtet. Sie waren nicht so rund oder als Elektronen dicht wie die traditionellen kolloidalem Gold immunzytochemischer Sonden. Allerdings wurden QD zu 10X effizienter Kennzeichnung als kolloidales Gold 9 zu ergeben , bis gezeigt und wir haben hier bestätigt , dass eine hohe Markierungsdichte war leicht erreichbar, vor allem mit der Biotin-Streptavidin - Sonde Verbindungssystem. CdSe QD auch eine charakteristische elementares Signatur besitzen, die Detektion und Kartierung zulassen energiedispersive Spektroskopie (EDS) verwendet, Elektronenenergieverlustspektroskopie (EELS) oder Energie gefilterten Transmissionselektronenmikroskopie (EFTEM) 8. Raster - Transmissions - Elektronenmikroskopie (STEM) Systeme können auch aufgrund ihrer Nutzung von Z-Kontrast oder Ordnungszahl Bildgebung eingesetzt werden , die Kontrast zwischen Nanopartikel und biologische Material geringerer Ordnungszahl 14 erhöhen würde. Großflächige Kartierung und Visualisierung von 3D - Verteilungsinformation 15 mit Feldemissionsrasterelektronenmikroskopie sollte auch möglich sein.
Ein entscheidender Schritt in unserem Verfahren ist das Antigen Demaskierung oder Abschnitt Ätzverfahren. Wir verwenden eine einzige Behandlung mit Natriummetaperiodat 30 min bei Raumtemperatur. Länger als diese und Aggregation von Strukturen oder Verlust der Membran Definition kann auftreten. Andere haben ein zweistufiges Verfahren , das die deplasticizing mit Natriummethoxid , gefolgt von de-osmication mit Natriumperiodat verwendet und dieser eine bessere Kontrolle über den Prozess liefern kann , wenn notwendig , 16.
Clem war möglich durch Lichtmikroskopie zu carefully log die Strukturmerkmale von ROIs in Bezug auf Gitterstäben. Das gleiche Gitter wird dann in der TEM angeordnet und so ausgerichtet, dass die Gitterstäbe und Sehenswürdigkeiten an die Lichtmikroskopie Ansicht entsprechen. Eine geringe Vergrößerung von etwa 1,400X ist besonders geeignet. Gewebestrukturen, wie beispielsweise duktalen Formationen und Muster der Kerne erwiesen nützlichsten sein für die Wiederfindungs ROIs in das Gewebe. Allerdings kann eine genaue Korrelation mit derselben Zelle Auflösung schwierig sein. Care hatte Orientierung des Gitters aufgenommen werden, um die gleiche Orientierung durch Lichtmikroskopie gesehen zu reflektieren. Wir haben einigermaßen genaue subzellulären räumlichen Korrelation zwischen Modalitäten mit Overlay-Bilder erreicht Photoshop hergestellt werden. Die Fluoreszenz-Overlay-Bild wurde mit dem TEM-Hintergrundbild gemischt jedoch eine gewisse Fehlausrichtung nachweisbar war. Dies kann durch jede Modalität oder Strahlungsschäden in unseren ungestützten Ultradünnschnitten im TEM verwendet aufgrund der unterschiedlichen Abbildungssysteme sein. Automatisierte Systeme für stwobei vermarktet werden gesehen Koordinaten von ROIs oring durch Lichtmikroskopie und übertragen diese an das Elektronenmikroskop jetzt und würde dieses Verfahren erheblich vereinfachen.
Die Nützlichkeit des CLEM Ansatz , den wir für das immunzytochemische Studien vorgestellt haben , ist die Notwendigkeit von durch die Probenvorbereitungsverfahren beschränkt verwendet, das heißt, Schwermetallfärbung und Epoxidharz Einbettung unweigerlich zur Verfügung Epitope maskieren. Allerdings ist die Technik, um die erheblichen Nutzen zu erhalten, Fluoreszenz und TEM-Daten aus der Pathologie Proben erlauben. Beziehen strukturelle und funktionelle Informationen aus unterschiedlichen Mikroskopie Modalitäten einer einzelnen Probe mit etwas, das auf Studien der menschlichen Pathologie Zellen und Gewebe im Allgemeinen nicht zur Verfügung gestanden hat, die in erster Linie für diagnostische Zwecke verarbeitet wurden.
Es wäre zu erwarten, dass empfindlichere immunzytochemische Lokalisierung von einer Gefriertfixierungsansatz erhalten werden konnte, anstelle einer Protokoll basierend auf chemische Fixierung. Annahme von Kryofixation Grundsätze 17 für Biobanken von Menschen durch cryoultramicrotomy gefolgt Gewebe und Raumtemperatur QD-basierten Immunmarkierung , wie in der klassischen Technik Tokuyasu 18 würde 19 erleichtern empfindliche und spezifische Korrelat immunzytochemische Untersuchungen an menschlichen Pathogenese der Erkrankung.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium cacodylate | Proscitech | C0205 | Harmful chemical |
| Osmium tetroxide | Proscitech | C010 | Use only in fume hood |
| Uranyl acetate | Univar-Ajax | 569 | Hazardous chemical |
| Ethanol 100% | Fronine | JJ008 | |
| Acetone 100% | Fronine | JJ006 | |
| ERL 4221 | Proscitech | C056 | |
| DER 732 | Proscitech | C047 | |
| NSA | Proscitech | C059 | |
| DMAE | Proscitech | C050 | |
| Sodium metaperiodate | Analar BDH | 10259 | |
| anti-somatostatin antibody | Dako | A0566 | |
| Antibody diluent | Dako | S3022 | |
| Qdot 585 Streptavidin Conjugate | Invitrogen | Q10113MP | |
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody | Sigma | B7389-1ML | |
| Glutaraldehyde 50% | EMS | 16320 | |
| Normal goat serum | Invitrogen | PCN5000 | |
| PBS "Dulbecco A" | Oxoid | BR0014G | |
| BSAc (10%) | Aurion | 900.022 | |
| Parafilm | Pechiney PP | M | |
| pH indicator strips (pH 2.0 - 9.0) | Merck | 1.09584.0001 | |
| Micromoulds | Proscitech | RL063 | |
| Diamond knife | Diatome | Ultra 45 | |
| Transmission electron microscope | FEI | Morgagni 268D | |
| Fluorescence light microscope | Carl Zeiss | Axioscope A1 | |
| Grids 300 mesh nickel (thin bar) | Agar Scientific | G2740N | |
| Ultramicrotome | RMC | Powertome | |
| TEM camera control software | Soft Imaging System | AnalySIS | Version 3.0 |
| Image processing software | Adobe Systems Incorporated | Photoshop CS2 |
References
- Kukulski, W., Schorb, M., Welsch, S., Picco, A., Kaksonen, M., Briggs, J. A. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
- Introduction to correlative light and electron microscopy. Methods Cell Biol. Müller-Reichert, T., Verkade, P. , (2012).
- De Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up! Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
- Faas, F. G., et al. Localization of fluorescently labeled structures in frozen-hydrated samples using integrated light electron microscopy. J Struct Biol. 181 (3), 283-290 (2013).
- Redemann, S., Müller-Reichert, T. Correlative light and electron microscopy for the analysis of cell division. J Microsc. 251 (2), 109-112 (2013).
- Spiegelhalter, C., et al. From dynamic live cell imaging to 3D ultrastructure: novel integrated methods for high pressure freezing and correlative light-electron microscopy. PLoS One. 5 (2), e9014 (2010).
- Killingsworth, M. C., Lai, K., Wu, X., Yong, J. L., Lee, C. S. Quantum dot immunocytochemical localization of somatostatin in somatostatinoma by widefield epifluorescence, super-resolution light, and immunoelectron microscopy. J Histochem Cytochem. 60 (11), 832-843 (2012).
- Nisman, R., Dellaire, G., Ren, Y., Li, R., Bazett-Jones, D. P. Application of quantum dots as probes for correlative fluorescence, conventional, and energy-filtered transmission electron microscopy. J Histochem Cytochem. 52 (1), 13-18 (2004).
- Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using quantum dots. Nat Methods. 2 (10), 743-749 (2005).
- Kuipers, J., de Boer, P., Giepmans, B. N. Scanning EM of non-heavy metal stained biosamples: Large-field of view, high contrast and highly efficient immunolabeling. Exp Cell Res. 337 (2), 202-207 (2015).
- Barroso, M. M.
- Michalet, X., et al. Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics. Science. 5, 538-544 (2005).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues and organisms. PLoS Biol. 9 (4), e1001041 (2011).
- Thomas, J. M., Midgley, P. A. High-resolution transmission electron microscopy: the ultimate nanoanalytical technique. Chem Commun. , 1253-1267 (2004).
- Loussert Fonta, C., Humbel, B. M.
- Marc, R. E., Liu, W. Fundamental GABAergic amacrine cell circuitries in the retina: nested feedback, concatenated inhibition, and axosomatic synapses. J Comp Neurol. 425 (4), 560-582 (2000).
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochem Cell Biol. 130 (5), 877-889 (2008).
- Tokuyasu, K. T.
- Loussert Fonta, C., et al. Analysis of acute brain slices by electron microscopy: a correlative light-electron microscopy workflow based on Tokuyasu cryo-sectioning. J Struct Biol. 189 (1), 53-61 (2015).
