私たちは、 カタユウレイボヤにマイクロインジェクションやエレクトロポレーション技術を使用して、脊椎動物への脊索動物の姉妹グループを、一過性遺伝子導入および遺伝子ノックダウンを提示します。このような方法は、脊索とヘッド感覚上皮、およびヒト疾患関連遺伝子の多くのオルソログを含む脊椎動物の基本的な特性を備えています。この単純な無脊椎動物における機能ゲノミクスを容易にします。
Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.
最近では、ゲノム配列および転写遺伝子レパートリーは、モデル生物の数がアクセス可能となっています。しかし、遺伝子機能のリンクを決定し、これらの接続は、胚の時間と空間全体の転写活性を実行するためのDNAにハードワイヤードされているか、特に脊椎動物では、主要な課題のまま。特に脊椎動物における規制の相互作用の複雑さとゲノム1,2の複雑さは、in vivoでの DNAレベルで特に効率的な機能解析を、スローダウン。確かに、何GRNは、現在開発生物の最後の、最終分化状態に受精から分析されていません。
ホヤC.腸管は、そのような完全なGRNは可能かもしれない解析モデル生物を表します。これは、少しの遺伝子の冗長性と無脊椎動物の典型的な重複しないゲノムを持っています。脊椎動物では、対照的に、肝炎ゲノム重複の2ラウンドを受けましたeは、より大きな遺伝子ファミリーと機能の多様化だけでなく、パラログ間の冗長性を生成しました。 C.のコンパクトなシス -regulatoryシーケンス(GRNsの制御ユニット) 腸管 、および少数の細胞で不変の胚系統は、Cを連想させますエレガンス 。さらに、脊索動物内の脊椎動物への無脊椎動物の姉妹グループとして独自の系統学的位置が形成脊索動物のボディープラン3-6で、セルラー解像度で、発達の観察を可能にします。
モデル生物における機能ゲノミクスの将来の成功を保証する重要な問題は、定量的なin vivoでの摂動のための胚の多数の生成です。 Ciona卵 7におけるマイクロインジェクション技術の開発、および迅速Ciona接合体8,9の何百ものin vivoエレクトロポレーションにより多くの一過性トランスジェニック動物を得る可能性がで突破口となっています<em> Ciona機能ゲノミクス。ここでは、まず、特に母性転写産物の、モルホリノ(MO)媒介遺伝子ノックダウンのための選択の方法のまま個々の遺伝子を標的とするため、より面倒なマイクロインジェクション技術を提示します。 MOオリゴは、典型的には、イニシエーターATGまたはRNAのスプライス部位をターゲットにしてタンパク質翻訳を妨害します。私たちは、その後、このように、 生体内および組織特異的gain-または関数アプローチ喪失の促進剤の効率的な解析の道を開く、Cionaの受精卵でのエレクトロポレーションは、定量的な方法で分析することが胚の多数を可能にする方法を示しています同時操作および分析のための可能性。我々はさらにCionaコミュニティツールが調節領域および発現ベクターで完全なオープンリーディングフレーム(ORF)の効率的なクローニングのインシリコ予測にするために利用される方法を示します。最後に、タグ付けされた蛍光の差動細胞内の局在化を実証しますまたはエレクトロポレーションによって過剰発現時にタンパク質を標識しました。
RNAまたはDNAのマイクロインジェクションおよびDNAのエレクトロポレーション:トランスジェニックCionaの胚を生成するための2つの主要な技術があります。 Ciona胚における遺伝子摂動のためのこれらの技術は、最初の7,8、1990年代に、その後に連続的に改善され、現在、世界Ciona(および他のホヤ属)20で利用から使用されました。
プロトコルにおける重要なステップ
簡単に大人の動物から採取されたCionaの配偶子に成功した遺伝子導入は重要な要素の数によって異なります。配偶子の品質は(大人2〜4週間健康維持、正しい塩分で)水族館で海の水質で、(水温や酸素とともに変化し、北部大西洋で、一般的に月〜12月)産卵期に依存します、そして最終的に大人からの抽出時の配偶子の正しい取り扱い上、のさまざまなステップについては、以下に詳述するようにプロトコル。
準備段階中に、水道水でパスツールピペットをインキュベートすると、アガロースから放出された有害物質を除去するアガロースでコーティングされたペトリ皿の水のプレインキュベーションを貼付し、海から胚を防ぐことができます。一般に、皿は、細菌の増殖を防ぐために4℃で保存し、使用前に2週間までに調製されてもよいし、使用前に新たにすすぎました。生後1日、小皿は、注射のために最善のようです。
dechorionationの効率性と長さは、開発に悪影響を与えるだろう卵/胚の長期の治療などのプロトコルにおける重要なステップです。 (1週間まで4℃で)慎重な準備(なし振とう)し、正しいストレージdechorionationソリューションの品質を維持。いずれかの混合あまりにも激しく準備時または時間をかけた場合、溶液中のプロテアーゼは長い時間/日間室温に保たれ、特に場合は、効率を失います。私たちは便利な新鮮dechorionation溶液を用いて、この重要なステップを最適化しました20×ストック溶液の凍結アリコートから調製しました。
ピペッティングが有害になりながら、壊れやすいdechorionated卵/胚の正しい取り扱いが不可欠とせん断または胚の刺すようです。ピペッティング、胚は、懸濁液中の水平方向の位置ではなく、縦にガラスピペットを保持しながら、(軽く滑らかなしかし迅速なピペッティングに続いてそれらを旋回する液体を「吹く」による)を可能な限り維持されている場合。このようなケアは、固定前と後、洗浄、再懸濁およびチューブ、キュベットまたはプレートの内と外の卵/胚を転送するためのすべてのピペッティング操作に適用されます。固定時には、特別なケアはまた、固定剤の遺跡から任意の毒性を回避するために、固定された胚に対して、ライブ用に別々のピペット装置に取られるべきです。
マイクロインジェクションはそのサイズが小さいと卵黄膜の弾力性に起因するCionaの卵/胚にかなりトリッキーであると批判の最適化された先端サイズに依存します注射針、注射の完全な角度(卵の半径に沿って1ラインの針の動き、)と(前の注射のための吸引に吸引によって)卵黄膜の微調整、手動の破壊。気泡が完全に吸引/注入圧力を平滑化するための鉱油を含有する注入チューブから除去される場合、後者のみが可能です。また、ほこりや卵破片の最小ピースが針を詰まらせるだろう、と簡単にきれいな労働条件と注入皿に移す前に卵のためのすすぎ工程によって回避されます。ポスト噴射は、新鮮な皿に卵の転送は、注入手順を生き延びた死んでいない胚からの毒性作用を避けることができます。
トラブルシューティング
手順の潜在的な問題は、以下の解決策によって対処することができます。低受精率が不十分な精子活性化、低卵の清浄度や大きな受精・ボリュームから生じる可能性があります。 freshl使用yはプールし、少ない精子を希釈しました。活性化の際に精子の動きを確認してください。ステップ4.2で説明したように、受精前にASWHで卵を洗います。水量を減らし、/よく受精皿当たりの卵の量を減らします。製造工程中の胚を失うことは、より効率的にundechorionated卵/胚下遠心分離機にdechorionation溶液の滴を添加することによって回避することができます。 Dechorionation時間がない堆積物と延長dechorionationは、有毒である胚を爆発させるだろう、部分的にdechorionated卵のように最適化されるべきです。
非同期開発は解剖の際に放出残留精子から生じ得ます。制御不能なクロス受精を回避するために、異なる動物から分離された卵のバッチを保管してください。異常な発達は、さまざまな原因が考えられます。冒頭シーズンの終わりに、分離された別の個体由来の胚を保持した後、最高のバッチを選択してもよいです。以下のための胚を乱す避けます彼らの卵細胞質の分離との干渉を避けるために受精に従って10分。ピペッティングは、部分的な胚における姉妹割球と結果を分離として転送されながら胚を除起動しなかったことを確認してください。多精子受精を回避するために、dechorionated卵のためのより少ない精子を使用してください。新たに調製したが、すすぎアガロース料理をご使用ください。ピペット装置は、固定剤自由であることを確認してください。 dechorionatedないと破壊されたステップの開発で検出するために、エレクトロポレーションされていなかった対照胚を保管してください。汚染や分解が発生した場合、抗生物質との胚を補います。
注入装置は、「目詰まり、 'ている場合、注射針の開口部は、染色されたコンテンツの一部を排出することによって確認することができます。目詰まり物質は慎重にアガロースを介して針の先端をドラッグすることで拭き取ることができます。空気が注入チューブ内の気泡および/または針を削除する必要があります。旧姓のように注入量のより良好な制御のための針を変更DLE先端が破損したり、注射に沿って詰まることがあります。卵をすすぎ、破片が皿の中で蓄積してきた場合は、クリーン注入皿に配置します。どんな小さな粒子または結晶を沈殿させるために、新鮮な針を充填する前に注射液を遠心。また、役立つだけで生体色素の注射を実践されています。注入および非注入卵を受精することによって注入技術を確認します。最後に、経験豊富な同僚と相談すると、注入技術を改善するのに役立つことができます。
オフターゲット効果を制御するために第二の非重複忠実Cionaで非特異的表現型効果を除外することができたMOによって認識されていない変更されたmRNAとMOと救助を。
マイクロインジェクション:意義と限界
Cionaにおけるマイクロインジェクションは、脊索動物11で全胚遺伝子調節ネットワーク(GRN)の最初の青写真を生成するために利用されました。しかしながら、このようなREMAにもかかわらずCiona胚におけるrkable達成、マイクロインジェクションが原因Cionaの卵の比較的小さいサイズ(直径0.14ミリメートル)に、制限があります。外来DNA / mRNAを微量注入によって導入された他の脊索動物種のものと比較すると、Cionaの卵は、取り扱いが比較的困難であり、実験当たりの注射Ciona胚の割合は、定量分析を妨げる、(実験あたりの平均30〜50の胚に)低いまま。それにもかかわらず、Cionaに母体の要因を摂動するために、MOSのマイクロインジェクションは、16〜32細胞期15から開発の接合体発症への関与を研究するために選択される方法です。また、はるかに難しいが、16から32細胞期までの個々の割球を顕微注入するためにかかわらず可能です。最後に、マイクロインジェクションはの完全optimi、Ciona以外のホヤの種で(mRNAまたはDNAの注射による)トランスジェニック胚を生成するための最も効率的な技術のままZEDエレクトロポレーションプロトコルは存在しません。
エレクトロポレーション:意義と限界
それはツェラーらによって開発され、最適化され、標準化されたプロトコルとして公開されて以来の低い数字およびマイクロインジェクションの他の制約を克服するために、Cionaコミュニティのほとんどは、プラスミドDNAのエレクトロポレーションを使用しています。2004年9で。確かに、トランスジェニックCiona胚の数千人同時に16ミリ秒の単一の50 Vのパルスを使用して、1つのキュベットにエレクトロ最大500の胚を用いて1時間以内に生成することができます。トランスジェニック胚の膨大な数を生成するアプローチは、依然として脊索動物のモデル生物の中でユニークです。すぐに生体内で実行するための強力なモデルシステムとして認識されるように、ここで例示したようにこれは、潜在的なシス -regulatory領域および細胞内/細胞内局在の解析Cionaを率いていました。
electroporatiが、Ciona接合体で基本的に脊索動物GRNの研究分野に革命をもたらした上で、技術はそれにもかかわらず、いくつかの限界に直面しています。まず、プラスミドを一過Cionaの胚に導入され、最も可能性の高い投機的なエレクトロポレーションプラスミドDNAの安定性を作り、染色体外アレイとして継承されます。また、このようにして表現型の変動を生じ、接合体あたりに取り込まれるエレクトロプラスミドのコピーを制御するために、おそらく不可能な、非常に困難です。エレクトロポレーションの結果を解釈することを困難にさらなる問題は、我々はモザイクを呼ぶ現象です。エレクトロポレーションのプラスミドDNAは、1細胞期胚の異なる位置に取り込まれ得ます。その子孫割球によって継承されるようにすると、接合体の各方面がプラスミドを受け取る方法を決定します。このような変形例は明らかに、定量的な効果の解釈をより難しくします。しかし、ほとんどの問題electroporaが付属していますション変動性はカウントし、単一のバッチで容易に入手されたLacZ(またはGFP)陽性細胞の統計で、生物学的サンプルの適切な量によって解決されます。
遺伝子工学のためのエレクトロポレーションの多様性と潜在的な
エレクトロポレーションは、最終的には潜在的なシス -regulatory地域と一度レポーターまたは発現プラスミドにクローニングされた遺伝子機能の定量分析の中間スループットスクリーニングを可能にします。コンパクトCionaゲノムに、識別し、潜在的な調節領域のクローニングは、3非常に簡単です。コミュニティの豊富なデータを使用するための戦略は、 図2Aに示されています。レポーター遺伝子をコードするプラスミドのクローニングをさらにCionaの発生により適応促進され、GATEWAY適合性ベクタースイート19と互換性のある完全長ORFライブラリー18。どちらのツールは、コミュニティに利用可能であり、図2Bに示すように、規制ドライバおよびコード領域の効率的な、制限酵素を含まない組換えを可能にします。
近年では、エレクトロポレーションが正常組織固有のドライバ21,22の制御下にCRISPR / Cas9コンポーネントのような遺伝子編集ツールを発現するプラスミドを持つ組織標的遺伝子操作を実現するようになりました。このようなアプローチは、迅速GRNsのダイナミクスと組織形成及び多能性から段階的に終了に関与する転写因子コードを含む潜在的に保存されたシグナル伝達機構の理解を進めます。さらに、エレクトロポレーションを用いて、組織特異的loss-がまたは(CRISPR / Cas9によって、または過剰発現による)機能獲得型のアプローチは、ヒト疾患関連遺伝子のCionaオルソログを研究する手段になります。実際、ヒトの疾患遺伝子のCionaオルソログのカタログとその全長ORFをコードクローンは容易にご利用できますされていますルCiona 1 8での分析のために。脊椎動物のゲノムワイド重複のために、ほとんどのヒト遺伝子は、遺伝子機能1の分析を複雑に機能的に重複パラログを有している。Cionaは 、このような重要なことは、多くの場合、機能的に保存された遺伝子の基本的な役割を明らかにする必要があります幼虫における典型的な脊索動物の組織に構成されたシンプルなシステムです。
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the University of Innsbruck, Austria, and the Austrian Academy of Sciences (ÖAW).
Lab with constant temp. (~ 18°C) | For embryo work | ||
Ciona intestinalis adults | UPMC – Station Biologique, Roscoff, France |
For collecting gametes | |
NaCl | Roth | 3957.1 | For ASWH |
KCl | Roth | 6781.1 | For ASWH |
CaCl2x2H2O | Roth | A119.1 | For ASWH |
MgCl2x6H2O | Roth | 2189.1 | For ASWH |
MgS04x7H2O | Roth | P027.2 | For ASWH |
NaHCO3 | Roth | 6885.1 | For ASWH |
Hepes | Roth | HN78.3 | For ASWH |
Sodium thioglycolate | Sigma | MZ-6 | For Dechorionation |
Pronase | Sigma | T0632-100G | For Dechorionation |
D-Mannitol | Sigma Aldrich | M9546-250G | For electroporation |
Plasmid DNA (prep >1µg/µl) | Macherey-Nagel | 740410.100 | For electroporation or microinjection |
Agarose | any supplier | For coating embryo culture dishes | |
Plastic petri dishes | VWR | 612-2079 | Coated with 1% Agarose in ASWH, covered with ASWH |
Small scissors | any supplier | For dissecting gametes | |
NaOH | Roth | 6771.1 | For activating dechorionation solution |
Tris | Roth | 5429.3 | 1M pH9.5, for sperm activation |
Pasteur pipettes | VWR | 612-1701 | Treated by immersion in tap water for at least 12h |
Hand centrifuge | Hettich Zentrifugen | 1011 | Use glass centrifuge tubes |
1.5ml Eppendorf tubes | Sigma | T3406-250EA | |
2ml Eppendorf tubes | Sigma | T3531-200EA | |
Square electroporator | Bio Rad Gene Pulser Xcell | ||
Electroporation cuvettes 4 mm | Eurogentec | CE-0004-50 | |
Coverslips | Sto Premium | PR248212600 | |
Glass slides | VWR | ECN 613-1551 | |
Glutaraldehyde | Sigma | G6257-10ML | For fixation in LacZ staining |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148-500G | For fixation of fluorescent samples |
Vectashield | Vector | H-1000 | For mounting of fluorescent samples |
X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-Galactopyranoside) | Roth | 2315.2 | LacZ substrate; stock in 40mg/ml DMF (Dimethylformamide) |
K5Fe(CN)6 | Merck | 4984 | For LacZ staining buffer |
K3Fe(CN)6 | Merck | 4973 | For LacZ staining buffer |
Na22HPO4 | Roth | 4984.2 | For PBT |
KH2PO4 | Roth | 3904.2 | For PBT |
Tween | Sigma | SLBJ5103V | For PBT |
Mineral Oil | Sigma | M8410 | Embryo culture tested |
Green Vital Dye | Fast Green Sigma | F7251 | for microinjection; 10µg/µl |
Micropipette Puller (Flaming/Brown) | Sutter Instruments | Model P-97 | For pulling injection needles |
Borosilicate glass capillaries GC100TF-10 | Harvard Apparatus Ltd. UK | 30-0038 | 1.0mm O.D. x0.78mm I.D., containing filament, for microinjection |
Micromanipulator | Narishige | MWS-2 | Three-axis Oil Hydraulic System; for 3D fine movement during injection |
Injection holder | Narishige | 1M-H1 | For holding injection needles, entire system filled with mineral oil |
All Glass Syringe | Walter Graf & Co GmbH & Co. KG | No. 95199.10427A4 | 10ml FortunaOptima; filled with mineral oil, for fine tuning of microinjection pressure |
Morpholinos | GeneTools LLC, Pilomath, OR, USA | Injection at 0.25-0.5mM | |
Capped mRNA | Ambion mMessage mMashine kit | Injection at 0.05-0.5µg/µl | |
Plasmid DNA | Injection at 20 ng/µl | ||
Recombination cloning kit | Gateway BP Clonase Enzyme Mix Invitrogen | 11789-013 | |
Recombination cloning kit | Gateway LR Clonase Enzyme mix Invitrogen | 11791-019 |