Vi præsenterer forbigående transgenese og gen knockdown i Ciona intestinalis, en chordate søster gruppe til vertebrater, ved hjælp mikroinjektion og elektroporeringsteknikker. Sådanne metoder lette funktionel genomforskning i denne enkle hvirvelløse at funktioner rudimentære karakteristika hvirveldyr, herunder notochord og hoved sensoriske epithel, og mange ortologer af humane sygdom forbundet gener.
Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.
For nylig er genomsekvens og transskriberede genrepertoirer bliver tilgængelige i en række modelorganismer. Bestemmelse gen funktionelle links, dog, og hvordan disse forbindelser er hardwired i DNA til at udføre transkriptionsaktivitet hele embryonale tid og rum, er fortsat en stor udfordring, især i hvirveldyr. Kompleksiteten af regulatoriske interaktioner og kompleksiteten af genomer 1,2, navnlig i hvirveldyr, bremse effektive funktionelle analyser, især på DNA-niveau in vivo. Faktisk er ingen GRN øjeblikket analyseret fra befrugtning til den endelige, terminalt differentieret tilstand udvikle organisme.
Den søpung C. intestinalis repræsenterer en model organisme, hvor en sådan fuldstændig GRN analyser kan være muligt. Det har en duplikeret genom typisk for hvirvelløse dyr med lille gen redundans. Hvirveldyr i modsætning har gennemgået to runder af genom gentagelser, der have genereret større gen familier og funktionelle diversificering, men også redundans mellem paraloger. De kompakte cis reguleringsmyndigheder sekvenser (styreenhederne af GRNs) af C. intestinalis, og et ufravigeligt embryonale afstamning med få celler minder om C. elegans. Endvidere sin enestående fylogenetiske position som en hvirvelløse søster gruppe hvirveldyr inden chordater tillader udviklingsmæssige observation, ved cellulær opløsning, den danner chordate krop plan 3-6.
Det centrale spørgsmål, der sikrer den fremtidige succes for funktionel genomforskning i modelorganismer er dannelsen af et stort antal embryoner til kvantitative in vivo forstyrrelser. Udviklingen af mikroinjektion teknik i Ciona æg 7, og muligheden for hurtigt at opnå mange transient transgene dyr ved in vivo elektroporation i hundredvis af Ciona zygoter 8,9 har været et gennembrud i <em> Ciona funktionel genomik. Her, vi først præsentere den mere arbejdskrævende mikroinjektion teknik til målretning individuelle gener, forbliver den foretrukne metode til morpholino (MO) -medieret gen knockdown, navnlig af maternelle transkripter. MO oligoer typisk målrette initiator ATG eller splejsningsstederne af RNA og forstyrre proteintranslation. Vi viser så hvordan elektroporation i befrugtede æg af Ciona muliggør et stort antal embryoner, der skal analyseres i en kvantitativ måde, dermed åbne muligheder for en effektiv analyse af forstærkere in vivo og vævsspecifik GAIN- eller tab af funktion tilgange, med mulighed for samtidige manipulationer og analyser. Vi viser yderligere, hvordan Ciona fællesskabsredskaber er brugt til in silico forudsigelse af regulatoriske regioner og effektiv kloning af fuldstændige åbne læserammer (ORF'er) i ekspressionsvektorer. Endelig har vi demonstrere differentiale subcellulære lokaliseringer af fluorescens-mærkedeeller mærket proteiner upon overekspression ved elektroporation.
Der er to store teknikker til at danne transgene Ciona embryoner: mikroinjektion af RNA eller DNA og elektroporation af DNA. Disse teknikker til gen-forstyrrelse i Ciona embryoer blev først brugt i 1990'erne 7,8 og fra da af successivt forbedret, og nu udnyttes i Ciona (og andre søpung slægter) 20 på verdensplan.
Kritiske trin i protokollen
Vellykket transgenese i Ciona kønsceller, som er let indsamlet fra voksne dyr afhænger af en række kritiske faktorer. Kvaliteten af kønsceller afhænger af gydeperioden (generelt fra maj til december i det nordlige Atlanterhav, skiftende med vand temperatur og iltning), på havet vandkvaliteten i de akvarier (ved korrekt saltholdighed, voksne forblive sunde i 2-4 uger) og endelig på korrekt håndtering af kønsceller upon udtræk fra voksne, som beskrevet nedenfor for de forskellige trin iprotokol.
Under forberedelse trin, vil inkubere Pasteur-pipetter med postevand forhindre embryoner fra stikning og havvand præ-inkubering af agarose belagt petriskåle vil fjerne giftige stoffer frigives fra agarose. Generelt kan retter fremstilles op til 2 uger før anvendelse, opbevaret ved 4 ° C for at undgå bakterievækst og skylles umiddelbart før anvendelse. En dag gammel, små retter synes bedst for injektioner.
Effektivitet og længden af dechorionation er et afgørende skridt i protokollen, som forlænget behandling af æg / embryoner vil skade udviklingen. Omhyggelig forberedelse (ingen rystning) og korrekt opbevaring (ved 4 ° C i op til en uge) bevare kvaliteten af den dechorionation opløsning. Proteaser i løsningen mister effektivitet, hvis enten blandet alt for voldsomt på forberedelse eller over tid, især hvis de opbevares ved stuetemperatur i længere timer / dage. Vi har optimeret denne kritiske skridt ved at bruge frisk dechorionation løsning bekvemtfremstillet ud fra frosne alikvoter af 20x stamopløsning.
Korrekt håndtering af skrøbelige dechorionated æg / embryoner er afgørende, og klipning eller stikkende af embryoner mens pipettering vil være skadelig. Når pipettering, er embryoner opretholdes så meget som muligt i suspension (ved forsigtigt "blæse" flydende til at hvirvle dem op efterfulgt af glat men hurtig pipettering), mens du holder glaspipette i lodret snarere end vandret. Sådan pleje gælder for alle pipetteringstrin til vask, resuspension og overførsel æg / embryoner i og ud af rør, skåle eller plader, før og efter fiksering. Efter fiksering, bør særlig forsigtighed også tages til separate Afpipetteringsudstyr til levende versus faste embryoer for at undgå enhver toksicitet fra resterne af fikseringsmidler.
Mikroinjektion er temmelig tricky i Ciona æg / embryoner på grund af deres lille størrelse og modstandsdygtighed vitellinmembranen og kritisk afhængig af en optimeret spids størrelseinjektionsnålen, en perfekt vinkel på injektion (nålens bevægelse i en linje, langs radius æg) og en fintunet, manuel brydning af vitellinmembranen (ved sugning før aspiration til injektion). Sidstnævnte er kun mulig, hvis der helt fjernet luftbobler fra injektion rør, som indeholder mineralolie til udjævning af suge- / injektionstrykket. Desuden vil de mindste stykker af støv eller æg snavs tilstoppe nålen, og er let undgås ved rene arbejdsforhold og skylletrin for æg før overførsel af injektion skålen. Indlæg injektion, vil overførslen af æg på friske retter undgå toksiske virkninger fra døde fostre ikke har overlevet injektionsproceduren.
Fejlfinding
Potentielle problemer i proceduren kan løses ved følgende løsninger. Lave befrugtning priserne kan skyldes utilstrækkelig sperm aktivering, lav æg renlighed eller store befrugtning mængder. Brug freshly samlet og mindre fortyndede sæd. Kontroller sperm bevægelse ved aktivering. Vask æg med ASWH før befrugtning som beskrevet i trin 4.2. Reducer vandmængde og reducere mængden af æg pr befrugtning fad / brønd. Mister embryoner under trinnene forberedelse kan undgås ved at tilsætte en dråbe dechorionation løsning mere effektivt centrifugeres ned undechorionated æg / embryoner. Dechorionation tid bør optimeres som delvist dechorionated æg vil ikke sediment og langvarig dechorionation er giftigt, hvilket får embryoner til at eksplodere.
Asynkron udvikling kan skyldes resterende sperm frigivet under dissektion. Hold ægget batches adskilt fra forskellige dyr for at undgå ukontrolleret krydsbefrugtning. Unormal udvikling kan have forskellige årsager. Ved begyndelsen og slutningen af sæsonen, efter ophold embryonet fra forskellige individer adskilte, kan udvælges de bedste batches. Undgå forstyrrende embryoner til10 min, der følger befrugtning for at undgå at forstyrre deres ooplasmic adskillelse. Sørg for, at embryoner ikke startede dividere mens der overføres som pipettering adskiller søster blastomeres og resultater i delvise embryoner. Brug mindre sæd til dechorionated æg for at undgå polyspermi. Der benyttes frisk fremstillede, men skyllet agarose retter. Sørg for, at pipettering enheden er fiksativ gratis. Holde kontrol embryoer, der ikke blev dechorionated og ikke elektroporerede at detektere, på hvilket trin udvikling blev afbrudt. Supplere embryoner med antibiotika, hvis forurening og nedbrydning finder sted.
Hvis injektionen enheden har "tilstoppet" kanylen åbning kan kontrolleres ved at udstøde nogle af sine farvede indhold. Tilstopning materiale kan tørres af ved forsigtigt at trække nålespidsen gennem agarose. Luftbobler i injektion slanger og / eller nål bør fjernes. Skift nålen for bedre kontrol af injektionen volumen som den needle tip knækker, eller tilstoppe langs injektion. Skyl æggene og læg dem i en ren indsprøjtning skål, hvis der er støv i fadet. Centrifugere før fyldning friske nåle for at sedimentere alle små partikler eller krystaller injektionsvæsken. Også nyttigt øver injektion med vital farvestof. Kontroller injektionsteknik ved gødskning injicerede og ikke-injicerede æg. Endelig kan rådføre sig med en erfaren kollega være nyttigt at forbedre injektionsteknik.
For at kontrollere for off-target effekter en anden ikke-overlappende MO og redning med en modificeret mRNA, der ikke er anerkendt af MOS kan trofast udelukke uspecifikke fænotypiske effekter i Ciona.
Mikroinjektion: betydning og begrænsninger
Mikroinjektion i Ciona blev anvendt til at generere den første plan for en hel embryo gen regulatoriske netværk (GRN) i en chordate 11. Men på trods af en sådan remarkable præstation, mikroinjektion i Ciona embryoer har begrænsninger på grund af den relativt lille størrelse (0,14 mm i diameter) af Ciona æg. Sammenlignet med de andre chordate arter, hvor fremmed DNA / mRNA indført ved mikroinjektioner, Ciona æg er forholdsvis vanskelige at håndtere, og hastigheden af injicerede Ciona embryoner pr eksperiment fortsat lav (i gennemsnit 30 til 50 embryoner pr eksperiment), hvilket hæmmer kvantitative analyser. Ikke desto mindre, for forstyrrende maternelle faktorer i Ciona, mikroinjektion af MOS den foretrukne metode også for at studere deres involvering i zygotisk indsættende udvikling fra 16-32 celle iscenesætter 15. Desuden er det muligt, selvom meget vanskeligere at microinject individuelle blastomerer op til 16-32 celle stadiet. Endelig mikroinjektion fortsat den mest effektive teknik til frembringelse af transgene embryoner (ved mRNA eller DNA-injektion) i andre end Ciona søpung arter, for hvilke fuldt optimized elektroporation protokoller ikke eksisterer.
Elektroporation: betydning og begrænsninger
For at overvinde de lave numre og andre begrænsninger mikroinjektion, har de fleste af de Ciona samfund anvendte elektroporation af plasmid-DNA, da det blev udviklet og udgivet som en optimeret og standardiseret protokol ved Zeller et al. I 2004 9. Faktisk tusindvis af transgene Ciona embryoner kan genereres inden for en time med op til 500 embryoner samtidigt elektroporeret i en kuvette ved anvendelse af en enkelt 50 V puls på 16 msek. Tilgangen til at generere massive antal af transgene embryoner er stadig unik blandt chordate modelorganismer. Dette havde ført Ciona at blive hurtigt anerkendt som en kraftfuld model system til at udføre in vivo analyser af potentielle cis reguleringsmyndigheder regioner og cellulære / subcellulære lokalisering, som eksemplificeret her.
selvom electroporatipå i Ciona zygoter har fundamentalt revolutioneret chordate GRN forskningsfelt, ikke desto mindre står teknikken nogle grænser. Først plasmider transient indføres i Ciona embryoner og er mest sandsynligt nedarves som ekstrakromosomale arrays, hvilket gør stabiliteten af elektroporerede plasmid-DNA spekulative. Desuden er det meget vanskeligt, måske endda umuligt, at kontrollere kopier af elektroporerede plasmider der vil blive taget op pr zygote, hvilket resulterer i fænotypiske udsving. Et yderligere problem, som gør det vanskeligt at fortolke elektroporation resultater er et fænomen, som vi kalder mosaicisme. Elektroporeret plasmid-DNA kan optages i forskellige positioner af den ene-celle stadium foster; som bestemmer, hvilke og hvor mange kvartaler af zygote vil modtage plasmid skal arves af de efterkommer blastomeres. Sådanne variationer klart gøre fortolkningen af kvantitative virkninger vanskeligere. Men de fleste problemer, der kommer, med electroporation variabilitet løses ved en passende mængde af biologiske prøver, med optælling og statistik LacZ (eller GFP) positive celler, som er let tilgængelige i ét parti.
Alsidighed og potentiale elektroporation for genteknologi
Elektroporation sidst giver mulighed for mid-throughput screening af potentielle cis reguleringsmyndigheder regioner og kvantitative analyser af genfunktion engang klonet ind reporter eller ekspressionsplasmider. På grund af den kompakte Ciona genom, identificere og kloning af potentielle regulatoriske regioner er forholdsvis ligetil 3. En strategi for at bruge den rigdom af fællesskab data demonstreres i figur 2A. Kloning af reporter og genkodende plasmider lettes yderligere ved at danne Ciona tilpasset, GATEWAY kompatible vektor suites 19 og et kompatibelt ORF af fuld længde bibliotek 18. Begge værktøjer er tilgængelige for samfundet ogmulighed for effektiv, restriktionsenzym-fri rekombination af regulatoriske drivere og kodende regioner, som vist i figur 2B.
I de senere år blev elektroporation held tilpasset for at opnå væv målrettet genmanipulation med plasmider, der udtrykker gen redigeringsværktøjer ligesom CRISPR / Cas9 komponenter under kontrol af væv specifikke drivere 21,22. Sådanne tilgange vil hurtigt fremme vores forståelse af dynamikken i GRNs og de potentielt bevarede signalsystemer mekanismer, herunder transskription faktor koder er involveret i dannelse væv og den trinvise exit fra pluripotens. Desuden vil vævsspecifik underskudsgivende eller få af funktion tilgange (efter CRISPR / Cas9 eller ved overekspression) under anvendelse af elektroporation være medvirkende til at studere Ciona orthologer af humane sygdomsassocierede gener. Faktisk kataloger for Ciona orthologer af humane sygdomsgener og deres fulde længde ORF kodning kloner er let tilgængle til analyse i Ciona 1 8. På grund af de genomet brede gentagelser i hvirveldyr, de fleste menneskelige gener besidder funktionelt overflødige paraloger som komplicerer analyser af genfunktion en. Ciona være et enklere system med den typiske chordate væv arrangement i larver skal afdække grundlæggende roller så vigtige, ofte funktionelt bevarede gener.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the University of Innsbruck, Austria, and the Austrian Academy of Sciences (ÖAW).
Lab with constant temp. (~ 18°C) | For embryo work | ||
Ciona intestinalis adults | UPMC – Station Biologique, Roscoff, France |
For collecting gametes | |
NaCl | Roth | 3957.1 | For ASWH |
KCl | Roth | 6781.1 | For ASWH |
CaCl2x2H2O | Roth | A119.1 | For ASWH |
MgCl2x6H2O | Roth | 2189.1 | For ASWH |
MgS04x7H2O | Roth | P027.2 | For ASWH |
NaHCO3 | Roth | 6885.1 | For ASWH |
Hepes | Roth | HN78.3 | For ASWH |
Sodium thioglycolate | Sigma | MZ-6 | For Dechorionation |
Pronase | Sigma | T0632-100G | For Dechorionation |
D-Mannitol | Sigma Aldrich | M9546-250G | For electroporation |
Plasmid DNA (prep >1µg/µl) | Macherey-Nagel | 740410.100 | For electroporation or microinjection |
Agarose | any supplier | For coating embryo culture dishes | |
Plastic petri dishes | VWR | 612-2079 | Coated with 1% Agarose in ASWH, covered with ASWH |
Small scissors | any supplier | For dissecting gametes | |
NaOH | Roth | 6771.1 | For activating dechorionation solution |
Tris | Roth | 5429.3 | 1M pH9.5, for sperm activation |
Pasteur pipettes | VWR | 612-1701 | Treated by immersion in tap water for at least 12h |
Hand centrifuge | Hettich Zentrifugen | 1011 | Use glass centrifuge tubes |
1.5ml Eppendorf tubes | Sigma | T3406-250EA | |
2ml Eppendorf tubes | Sigma | T3531-200EA | |
Square electroporator | Bio Rad Gene Pulser Xcell | ||
Electroporation cuvettes 4 mm | Eurogentec | CE-0004-50 | |
Coverslips | Sto Premium | PR248212600 | |
Glass slides | VWR | ECN 613-1551 | |
Glutaraldehyde | Sigma | G6257-10ML | For fixation in LacZ staining |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148-500G | For fixation of fluorescent samples |
Vectashield | Vector | H-1000 | For mounting of fluorescent samples |
X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-Galactopyranoside) | Roth | 2315.2 | LacZ substrate; stock in 40mg/ml DMF (Dimethylformamide) |
K5Fe(CN)6 | Merck | 4984 | For LacZ staining buffer |
K3Fe(CN)6 | Merck | 4973 | For LacZ staining buffer |
Na22HPO4 | Roth | 4984.2 | For PBT |
KH2PO4 | Roth | 3904.2 | For PBT |
Tween | Sigma | SLBJ5103V | For PBT |
Mineral Oil | Sigma | M8410 | Embryo culture tested |
Green Vital Dye | Fast Green Sigma | F7251 | for microinjection; 10µg/µl |
Micropipette Puller (Flaming/Brown) | Sutter Instruments | Model P-97 | For pulling injection needles |
Borosilicate glass capillaries GC100TF-10 | Harvard Apparatus Ltd. UK | 30-0038 | 1.0mm O.D. x0.78mm I.D., containing filament, for microinjection |
Micromanipulator | Narishige | MWS-2 | Three-axis Oil Hydraulic System; for 3D fine movement during injection |
Injection holder | Narishige | 1M-H1 | For holding injection needles, entire system filled with mineral oil |
All Glass Syringe | Walter Graf & Co GmbH & Co. KG | No. 95199.10427A4 | 10ml FortunaOptima; filled with mineral oil, for fine tuning of microinjection pressure |
Morpholinos | GeneTools LLC, Pilomath, OR, USA | Injection at 0.25-0.5mM | |
Capped mRNA | Ambion mMessage mMashine kit | Injection at 0.05-0.5µg/µl | |
Plasmid DNA | Injection at 20 ng/µl | ||
Recombination cloning kit | Gateway BP Clonase Enzyme Mix Invitrogen | 11789-013 | |
Recombination cloning kit | Gateway LR Clonase Enzyme mix Invitrogen | 11791-019 |