Wir präsentieren vorübergehende Transgene und Knock-Down in Schlauchseescheide, eine chordate Schwestergruppe der Wirbeltiere, mit Mikroinjektions und Elektroporation Techniken. Solche Methoden erleichtern die funktionelle Genomik in diesem einfachen wirbellos, die rudimentäre Eigenschaften der Wirbeltiere verfügt, einschließlich notochord und Kopf Sinnesepithelien und viele Orthologe der menschlichen Gene Krankheit.
Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.
Vor kurzem haben sich Genomsequenz und transkribierten Gen-Repertoires zugänglich in einer Reihe von Modellorganismen. Die Bestimmung Gen funktionelle Verbindungen, aber, und wie diese Verbindungen in der DNA fest verdrahtet sind, bleiben die Transkriptionsaktivität im gesamten embryonalen Zeit und Raum auszuführen, eine große Herausforderung, vor allem bei Wirbeltieren. Die Komplexität der regulatorischen Interaktionen und die Komplexität der Genome 1,2, insbesondere bei Wirbeltieren, verlangsamen effiziente Funktionsanalysen, insbesondere auf der Ebene der DNA in vivo. Tatsächlich ist kein GRN derzeit von der Befruchtung bis zur endgültigen, terminal differenzierten Zustand des sich entwickelnden Organismus analysiert.
Die ascidian C. intestinalis stellt ein Modellorganismus , wo solche vollständige GRN – Analysen möglich. Es verfügt über einen unduplicated Genom typisch für wirbellose Tiere mit wenig Gen Redundanz. Vertebrates im Gegensatz haben zwei Runden Genom Vervielfältigungen unterzogen, die have erzeugt größere Genfamilien und funktionelle Diversifizierung, sondern auch Redundanz zwischen Paralogen. Die kompakten cis Aufsichtsrechtliche Sequenzen (die Steuereinheiten von KNS) von C. intestinalis und eine unveränderliche embryonale Linie mit wenigen Zellen erinnern an C. elegans. Darüber hinaus seine einzigartige phylogenetische Position als wirbellosen Schwestergruppe Wirbeltiere innerhalb Chordaten ermöglicht Entwicklungs Beobachtung, auf zellulärer Auflösung des chordate Körperplan bildet 3-6.
Die zentrale Frage, die den zukünftigen Erfolg der funktionellen Genomik in Modellorganismen gewährleistet , ist die Erzeugung einer großen Anzahl von Embryonen für die quantitative in vivo Störungen. Die Entwicklung der Mikroinjektionstechnik in Ciona Eier 7, und die Möglichkeit, schnell viele transient transgenen Tieren durch in vivo Elektroporation in Hunderten von Ciona erhalten Zygoten 8,9 wurde ein Durchbruch in der <em> Ciona funktionelle Genomik. Hier stellen wir zuerst die mühsamer Mikroinjektionstechnik für das Targeting einzelne Gene, die die Methode der Wahl für Morpholino- (MO) -vermittelte Knock-Down, insbesondere maternaler Transkripte bleibt. MO Oligos Ziel typischerweise den Initiator ATG oder die Spleißstellen der RNA und stören Proteintranslation. Wir zeigen dann , wie Elektroporation in befruchtete Eier von Ciona für eine große Anzahl von Embryonen erlaubt in einer quantitativen Art und Weise analysiert werden, so dass Wege der effizienten Analyse von Verstärkern in vivo und von gewebespezifischen Verstärkungs- oder Verlust der Funktion Ansätze zu öffnen, mit der Möglichkeit zur gleichzeitigen Manipulationen und Analysen. Wir zeigen weiterhin , wie Ciona Community – Tools für in Expressionsvektoren in silico Vorhersage von regulatorischen Regionen und effiziente Klonierung der vollständigen offenen Leserahmen (ORFs) genutzt werden. Schließlich zeigen wir, von fluoreszenz subzellulären Lokalisierungen Differential getaggtoder Proteine auf die Überexpression durch Elektroporation markiert.
Es gibt zwei Haupttechniken transgenes Ciona Embryonen zu erzeugen: Mikroinjektion von RNA oder DNA und Elektroporation von DNA. Diese Techniken für die Gen – Störung in Ciona Embryonen wurden zum ersten Mal in den 1990er Jahren 7,8 und von da an sukzessive verbessert und jetzt verwendet in Ciona (und andere ascidian Gattungen) 20 weltweit im Einsatz.
Kritische Schritte in dem Protokoll
Erfolgreiche Transgenese in Ciona Gameten , die leicht von erwachsenen Tieren gesammelt werden , hängt von einer Anzahl von kritischen Faktoren. Die Qualität der Gameten, hängt von der Laichzeit (in der Regel von Mai bis Dezember im Nordatlantik, mit Wassertemperatur und Sauerstoffversorgung zu ändern), auf dem Meer Wasserqualität in den Aquarien (bei korrekter Salinität, Erwachsene für 2-4 Wochen gesund zu bleiben) und schließlich auf korrekte Handhabung von Gameten bei der Extraktion von den Erwachsenen, wie weiter unten für die verschiedenen Schritte in der detailliertenProtokoll.
Während Vorbereitungsschritte, Pasteur Inkubation Pipetten mit Leitungswasser wird verhindert, dass Embryonen kleben und Meerwasser Präinkubation von Agarose-beschichteten Petrischalen werden giftige Substanzen aus der Agarose freigesetzt entfernen. Bakterienwachstum zu verhindern und gespült vor Gebrauch frisch Allgemeinen Geschirr kann bis zu 2 Wochen vor der Verwendung bei 4 ° C hergestellt werden. Eines Tages alt, scheinen kleine Gerichte am besten für Injektionszwecke.
Effizienz und Länge von dechorionation ist ein entscheidender Schritt im Protokoll als eine längere Behandlung von Eiern / Embryonen Entwicklung schaden. Eine sorgfältige Vorbereitung (kein Wackeln) und korrekte Lagerung (bei 4 ° C für bis zu einer Woche), um die Qualität der dechorionation Lösung zu erhalten. Proteasen in der Lösung Effizienz verlieren, wenn entweder zu heftig bei der Vorbereitung oder im Laufe der Zeit gemischt, vor allem, wenn für längere Stunden / Tage bei Raumtemperatur gehalten. Wir haben diesen kritischen Schritt optimiert durch die Verwendung frischer dechorionation Lösung bequemhergestellt aus gefrorenen Aliquots von 20x Stammlösung.
Der richtige Umgang mit fragilen dechorionated Eier / Embryonen ist wesentlich und Scher oder stechend von Embryonen beim Pipettieren schädlich sein wird. Beim Pipettieren, Embryonen werden so viel wie möglich in Suspension (durch sanftes "bläst" flüssige sie durch glatte, aber schnelle Pipettieren gefolgt aufzuwirbeln) gehalten, während die Glaspipette in vertikalen Halte statt horizontaler Position. Solche Versorgung gilt Eier / Embryonen in die und aus der Röhrchen, Küvetten oder Platten vor und nach der Fixierung an alle Pipettierschritte zum Waschen, Resuspendieren und zu übertragen. Nach Fixierung sollte besondere Sorgfalt auch auf separaten Pipettiervorichtungen genommen werden live im Vergleich zu festen Embryonen jede Toxizität von Überresten von Fixierungen zu vermeiden.
Mikroinjektions ist recht schwierig , in Ciona Eier / Embryonen aufgrund ihrer geringen Größe und der Elastizität der Vitellinmembran und kritisch , hängt von einer optimierten Spitze Größedie Injektionsnadel, eine perfekte Winkel der Injektion (Nadelbewegung in einer Linie, entlang dem Ei Radius) und eine fein abgestimmte, manuelle Brechen der Vitellinmembran (durch Absaugen vor dem Streben nach der Injektion). Letzteres ist nur möglich, wenn Luftblasen vollständig aus dem Injektionsschlauch eliminiert werden, die zur Glättung der Saug- / Spritzdruck Mineralöl enthält. Darüber hinaus wird verstopfen die kleinsten Stücke von Staub oder Ei Trümmer der Nadel und durch saubere Arbeitsbedingungen und Spülschritte für Eier vor der Übertragung auf der Injektion Gericht leicht zu vermeiden. Nacheinspritzung, die Übertragung von Eiern auf frische Gerichte werden toxische Wirkungen von toten Embryonen verhindern nicht das Injektionsverfahren überlebt haben.
Fehlerbehebung
Potenzielle Probleme in dem Verfahren können durch die folgenden Lösungen behandelt werden. Niedrige Befruchtungsraten von unzureichender Spermien Aktivierung, niedrige Ei Sauberkeit oder große Mengen Befruchtung entstehen können. Verwenden Sie freshly vereinigt und weniger verdünnten Spermien. Überprüfen Sie die Spermienbewegung bei Aktivierung. Waschen Sie die Eier mit ASWH vor der Befruchtung, wie in Schritt 4.2 beschrieben. Reduzieren Sie die Wassermenge und reduzieren die Menge der Eier pro Befruchtung Gericht / gut. Der Verlust Embryonen während der Herstellungsschritte kann durch Zugabe eines Tropfen dechorionation Lösung effizienter Zentrifuge nach unten die undechorionated Eier / Embryonen vermieden werden. Dechorionation Zeit sollte als teilweise dechorionated Eier optimiert werden nicht sedimentieren und verlängert dechorionation ist giftig, so dass die Embryonen zu explodieren.
Asynchrone Entwicklung kann aus Rest Spermien entstehen bei der Präparation freigegeben. Halten Sie die Eigelege von unterschiedlichen Tieren getrennt zu unkontrollierten Kreuzbefruchtung zu vermeiden. Abnorme Entwicklung kann verschiedene Ursachen haben. Am Anfang und am Ende der Saison, nachdem der Embryo von verschiedenen Individuen getrennt zu halten, sind die besten Chargen gewählt werden. Vermeiden Sie die Embryonen Stören für die10 min, die Befruchtung folgen mit ihren Ooplasma Segregation nicht zu stören. Stellen Sie sicher, dass die Embryonen nicht gestartet Teilung während übertragen werden wie Pipettieren die Schwester Blastomeren und führt zu einer teilweisen Embryonen trennt. Verwenden Sie weniger Spermien für dechorionated Eier Polyspermie zu vermeiden. Verwenden Sie frisch zubereitet aber gespült Agarose-Gerichte. Stellen Sie sicher, dass die Pipettiervorrichtung Fixiermittel frei ist. Behalten Sie die Kontrolle Embryonen, die nicht dechorionated wurden und nicht durch Elektroporation bei zu erkennen, die Entwicklungsschritt gestört wurde. Ergänzen Sie die Embryonen mit Antibiotika, wenn eine Kontamination und Zersetzung auftritt.
Wenn das Injektionsgerät "verstopft" hat, kann die Injektionsnadel Öffnung durch Austreiben einige seiner gefärbten Inhalt überprüft werden. Verstopfungsmaterial durch sorgfältig sein kann Ziehen mit der Nadelspitze durch die Agarose abgewischt. Luftblasen in den Injektionsschlauch und / oder die Nadel entfernt werden sollte. Ändern Sie die Nadel für eine bessere Kontrolle des Injektionsvolumens als neeDLE Spitze entlang Injektion brechen oder verstopfen können. Spülen Sie die Eier und legen Sie sie in einem sauberen Injektions Gericht, wenn Schmutz in der Schale angesammelt hat. Zentrifugieren Sie die Injektionslösung vor dem Befüllen frischen Nadeln, um irgendwelche kleinen Teilchen oder Kristalle zu sedimentieren. Ebenfalls hilfreich praktiziert Injektion nur mit Vitalfarbstoff. Überprüfen Sie die Injektionstechnik aus injiziert und nicht injizierten Eier befruchten. Schließlich kann mit einem erfahrenen Kollegen Beratung hilfreich sein Injektionstechnik zu verbessern.
Zu steuern , um Nebeneffekte eine zweite nichtüberlappende MO und Rettungs mit einer modifizierten mRNA, die von den MOs nicht erkannt wird , kann getreu unspezifische phänotypischen Effekte in Ciona auszuschließen.
Mikroinjektions: Bedeutung und Grenzen
Mikroinjektions in Ciona wurde der erste Entwurf für eine ganze Embryo Genregulationsnetz (GRN) in einer chordate 11 zu erzeugen , verwendet werden . Doch trotz einer solchen REMArkable Leistung, die Mikroinjektion in Ciona Embryonen hat seine Grenzen, aufgrund der relativ geringen Größe (0,14 mm Durchmesser) von Ciona Eier. Im Vergleich zu denen von anderen Chordaten Spezies , bei denen fremde DNA / mRNA durch Mikroinjektion eingeführt wird, sind Ciona Eier vergleichsweise schwierig zu handhaben und die Geschwindigkeit der injizierten Ciona Embryonen pro Experiment bleibt gering (im Durchschnitt 30 bis 50 Embryonen pro Versuch), quantitative Analysen zu behindern. Dennoch ist für störender mütterliche Faktoren in Ciona, Mikroinjektion von MOs ist die Methode der Wahl auch deren Einbindung in zygotischen Beginn der Entwicklung von der 16 bis 32 Zellstufen 15 zu studieren. Darüber hinaus ist es möglich, wenn auch viel schwieriger bis zum 16-32-Zellen-Stadium einzelnen Blastomeren zu microinject. Schließlich bleibt Mikroinjektions die effizienteste Technik zur Herstellung von transgenen Embryonen zu erzeugen (durch mRNA oder DNA – Injektion) in ascidian andere Arten als Ciona, für die vollständig optimized Elektroporationsprotokolle gibt es nicht.
Elektroporation: Bedeutung und Grenzen
Um die niedrigen Zahlen und anderen Einschränkungen der Mikroinjektion zu überwinden, hat die meisten der Ciona Gemeinschaft Elektroporation von Plasmid – DNA verwendet , da es entwickelt und wurde als ein optimiertes und standardisiertes Protokoll von Zeller et al. 2004 9. In der Tat Tausende von transgenen Ciona Embryonen mit bis zu 500 Embryonen können in einer Küvette in einer Stunde erzeugt werden unter Verwendung eines einzelnen 50 V Impuls von 16 msec gleichzeitig elektroporiert. Der Ansatz der Erzeugung massive Anzahl von transgenen Embryonen ist unter chordate Modellorganismen wie vor einzigartig. Dies hatte Ciona führte schnell als ein leistungsfähiges Modellsystem erkannt werden für Analysen potentieller cis Aufsichtsrechtliche Regionen und zelluläre / subzelluläre Lokalisierung in vivo durchgeführt wird , wie hier beispielhaft.
Obwohl electroporatiauf in Ciona Zygoten grundsätzlich steht vor der Chordaten GRN Forschungsfeld, die Technik dennoch gewisse Grenzen revolutioniert hat. Zunächst werden Plasmide transient in Ciona Embryonen eingeführt und werden höchstwahrscheinlich als extrachromosomale Arrays geerbt, spekulativ die Stabilität von Plasmid – DNA durch Elektroporation zu machen. Des Weiteren ist es sehr schwer, vielleicht sogar unmöglich, die Kopien von Plasmiden durch Elektroporation zu steuern, die pro Zygote aufgenommen wird, wodurch in phänotypischen Schwankungen führt. Ein weiteres Problem, das es schwierig macht, die Elektroporation Ergebnisse zu interpretieren ist ein Phänomen, das wir mosaicism nennen. Elektroporiert Plasmid-DNA kann an verschiedenen Positionen der Bühne embryo eint Zelle aufgenommen werden; die bestimmt, welche und wie viele Viertel der Zygote wird Plasmid erhalten von den Abkömmling Blastomeren vererbt werden. Solche Variationen machen deutlich die Interpretation der quantitativen Effekte erschwert. Allerdings sind die meisten Probleme, die kommen mit electroporation Variabilität werden durch eine entsprechende Menge an biologischen Proben, mit dem Zählen und Statistiken von LacZ (oder GFP) positive Zellen gelöst, die in einer einzigen Charge leicht erhältlich ist.
Vielseitigkeit und das Potential der Elektroporation für die Gentechnik
Die Elektroporation ermöglicht schließlich für den Mitteldurchsatz – Screening von potentiellen cis Aufsichtsrechtliche Regionen und quantitative Analysen von Genfunktionen einmal kloniert in Reporter oder Expressionsplasmide. Aufgrund der kompakten Genom Ciona, ist die Identifizierung und Klonierung von potentiellen regulatorischen Regionen recht unkompliziert 3. Eine Strategie für die Verwendung der Fülle von Community – Daten ist in 2A gezeigt. Klonierung von Reporter und Gen – kodierenden Plasmide wird weiter durch die Erzeugung von Ciona erleichtert angepasst, GATEWAY kompatiblen Vektor Suiten 19 und ein kompatibles voller Länge ORF Bibliothek 18. Beide Tools stehen zur Verfügung für die Gemeinschaft undermöglichen eine effiziente, Restriktionsenzym freie Rekombination von regulatorischen Treiber und codierende Regionen, wie in 2B dargestellt.
In den letzten Jahren wurde die Elektroporation erfolgreich angepasst Gewebe gezielte Genmanipulation mit Plasmiden zu erreichen , die Gen – Editing – Tools wie die CRISPR / Cas9 Komponenten unter der Kontrolle von gewebespezifischen Treiber 21,22 auszudrücken. Solche Ansätze werden unser Verständnis der Dynamik von KNS und die potenziell konservierten Signalmechanismen, einschließlich der Transkriptionsfaktor-Codes beteiligt in der Gewebebildung und der schrittweisen Ausstieg aus Pluripotenz schnell vorantreiben. Weiterhin gewebsspezifische Verlust- oder gain-of-function Ansätze (durch CRISPR / Cas9 oder durch Überexpression) unter Verwendung von Elektroporation wird instrumental Ciona Orthologe der humanen krankheitsassoziierten Genen zu untersuchen. Tatsächlich Kataloge für Ciona Orthologe menschlicher Krankheitsgene und ihre Klone voller Länge ORF Codierung sind leicht available für die Analyse in Ciona 1 8. Aufgrund der genomweiten Doppelungen bei Wirbeltieren, besitzen die meisten menschlichen Gene funktionell redundante Paraloge , die Analysen von Genfunktionen 1 erschweren. Ciona ein einfacheres System mit dem typischen chordate Gewebe Anordnung in Larven sein sollten grundlegende Rollen so wichtiger, oft funktionell konservierte Gene aufzudecken.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the University of Innsbruck, Austria, and the Austrian Academy of Sciences (ÖAW).
Lab with constant temp. (~ 18°C) | For embryo work | ||
Ciona intestinalis adults | UPMC – Station Biologique, Roscoff, France |
For collecting gametes | |
NaCl | Roth | 3957.1 | For ASWH |
KCl | Roth | 6781.1 | For ASWH |
CaCl2x2H2O | Roth | A119.1 | For ASWH |
MgCl2x6H2O | Roth | 2189.1 | For ASWH |
MgS04x7H2O | Roth | P027.2 | For ASWH |
NaHCO3 | Roth | 6885.1 | For ASWH |
Hepes | Roth | HN78.3 | For ASWH |
Sodium thioglycolate | Sigma | MZ-6 | For Dechorionation |
Pronase | Sigma | T0632-100G | For Dechorionation |
D-Mannitol | Sigma Aldrich | M9546-250G | For electroporation |
Plasmid DNA (prep >1µg/µl) | Macherey-Nagel | 740410.100 | For electroporation or microinjection |
Agarose | any supplier | For coating embryo culture dishes | |
Plastic petri dishes | VWR | 612-2079 | Coated with 1% Agarose in ASWH, covered with ASWH |
Small scissors | any supplier | For dissecting gametes | |
NaOH | Roth | 6771.1 | For activating dechorionation solution |
Tris | Roth | 5429.3 | 1M pH9.5, for sperm activation |
Pasteur pipettes | VWR | 612-1701 | Treated by immersion in tap water for at least 12h |
Hand centrifuge | Hettich Zentrifugen | 1011 | Use glass centrifuge tubes |
1.5ml Eppendorf tubes | Sigma | T3406-250EA | |
2ml Eppendorf tubes | Sigma | T3531-200EA | |
Square electroporator | Bio Rad Gene Pulser Xcell | ||
Electroporation cuvettes 4 mm | Eurogentec | CE-0004-50 | |
Coverslips | Sto Premium | PR248212600 | |
Glass slides | VWR | ECN 613-1551 | |
Glutaraldehyde | Sigma | G6257-10ML | For fixation in LacZ staining |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148-500G | For fixation of fluorescent samples |
Vectashield | Vector | H-1000 | For mounting of fluorescent samples |
X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-Galactopyranoside) | Roth | 2315.2 | LacZ substrate; stock in 40mg/ml DMF (Dimethylformamide) |
K5Fe(CN)6 | Merck | 4984 | For LacZ staining buffer |
K3Fe(CN)6 | Merck | 4973 | For LacZ staining buffer |
Na22HPO4 | Roth | 4984.2 | For PBT |
KH2PO4 | Roth | 3904.2 | For PBT |
Tween | Sigma | SLBJ5103V | For PBT |
Mineral Oil | Sigma | M8410 | Embryo culture tested |
Green Vital Dye | Fast Green Sigma | F7251 | for microinjection; 10µg/µl |
Micropipette Puller (Flaming/Brown) | Sutter Instruments | Model P-97 | For pulling injection needles |
Borosilicate glass capillaries GC100TF-10 | Harvard Apparatus Ltd. UK | 30-0038 | 1.0mm O.D. x0.78mm I.D., containing filament, for microinjection |
Micromanipulator | Narishige | MWS-2 | Three-axis Oil Hydraulic System; for 3D fine movement during injection |
Injection holder | Narishige | 1M-H1 | For holding injection needles, entire system filled with mineral oil |
All Glass Syringe | Walter Graf & Co GmbH & Co. KG | No. 95199.10427A4 | 10ml FortunaOptima; filled with mineral oil, for fine tuning of microinjection pressure |
Morpholinos | GeneTools LLC, Pilomath, OR, USA | Injection at 0.25-0.5mM | |
Capped mRNA | Ambion mMessage mMashine kit | Injection at 0.05-0.5µg/µl | |
Plasmid DNA | Injection at 20 ng/µl | ||
Recombination cloning kit | Gateway BP Clonase Enzyme Mix Invitrogen | 11789-013 | |
Recombination cloning kit | Gateway LR Clonase Enzyme mix Invitrogen | 11791-019 |