Abstract
Il tumore al pancreas rimane uno dei tumori per i quali la sopravvivenza non è migliorata notevolmente negli ultimi decenni. Solo il 7% dei pazienti diagnosticati sopravviverà più di cinque anni. Al fine di comprendere e imitare il microambiente dei tumori pancreatici, abbiamo utilizzato un modello murino ortotopico di cancro al pancreas che permette l'imaging non invasivo di progressione del tumore in tempo reale. Le cellule tumorali pancreatiche che esprimono la proteina fluorescente verde (PANC-1 GFP) sono state sospese in matrice di membrana basale, ad alta concentrazione, (ad esempio, Matrigel HC) con mezzi privi di siero e poi iniettate nella coda del pancreas attraverso laparotomia. La sospensione cellulare nella matrice alta concentrazione membrana basale diventa una sostanza gelatinosa, una volta raggiunta la temperatura ambiente; Pertanto, si gelifica quando entra in contatto con il pancreas, creando un'occlusione sito di iniezione e da evitare fuoriuscite cellule. la crescita del tumore e metastasi ad altri organi sono monitorati in tempo realeanimali utilizzando la fluorescenza. È fondamentale utilizzare i filtri appropriati per l'eccitazione e l'emissione di GFP. La procedura per l'impianto ortotopico sono descritti in questo articolo per cui i ricercatori possono facilmente replicare la procedura in topi nudi. Le fasi principali di questo protocollo sono preparazione della sospensione cellulare, impianto chirurgico, e tutto il corpo fluorescente imaging in vivo. Questo modello ortotopico è stato progettato per valutare l'efficacia di nuove terapie per i tumori primari e metastatici.
Introduction
Il tumore al pancreas viene diagnosticato con maggior frequenza rispetto ad altri tipi di cancro ed è la 4 ° causa principale di decessi correlati al cancro negli Stati Uniti. Dal momento della diagnosi, oltre il 90% dei pazienti muoiono entro cinque anni 1,2. Attualmente, la rimozione del tumore chirurgica è l'unica cura per il cancro al pancreas, ma meno del 20% dei pazienti hanno diritto a sottoporsi ad intervento chirurgico soprattutto perché al momento della diagnosi della malattia è in fase avanzata e ha metastatizzato 3,4. La mancanza di sintomi specifici rende cancro al pancreas una malattia silenziosa; alcuni dei sintomi includono dolore addominale, mal di schiena, perdita di appetito, ittero e nausea; che può essere facilmente interpretato come malattie digestive comuni 4. Per questo motivo, è importante sviluppare nuovi strumenti farmacologici per aiutare nella diagnosi e nel trattamento del cancro pancreatico.
L'uso di modelli animali ci permette di capire la biologia del Pancrécancro e ATIC fornisce una panoramica di applicare questa conoscenza per gli esseri umani. Xenotrapianto modelli ortotopici del cancro del pancreas sono realistici, perché i tumori crescono nell'organo di origine 5. A differenza dei modelli eterotopici, in cui le linee di cellule o frammenti di tumore vengono impiantati per via sottocutanea, la modellazione ortotopico permette per la ricreazione del microambiente tumorale e imita l'interazione delle cellule tumorali con l'ambiente circostante 6. Il modello di xenotrapianto descritto qui deriva tumori dal pancreas linea di cellule umane di cancro PANC-1 GFP, che è geneticamente per esprimere la proteina fluorescente verde (GFP). Rilevamento GFP permette di imaging e monitoraggio della crescita tumorale e metastasi 7 non invasivo. Lo sviluppo del tumore avviene rapidamente, spontaneamente, e assomiglia molto a quello dei tumori primari di umani malati di cancro del pancreas 8. modelli ortotopico fornire una previsione più accurata della efficacia del farmaco in risposta ad agenti terapeutici, mentreimitando il microambiente tumorale.
Come accennato in precedenza, questo modello animale permette la rilevazione fluorescente della crescita tumorale e metastasi in tempo reale. rilevazione fluorescente consente una formazione immagine più diretta / dal vivo rispetto a luminescenza. Con la fluorescenza della luce emessa è il risultato di una eccitazione da un'altra luce di una lunghezza d'onda; mentre in luminescenza, la luce emessa è il risultato di una reazione chimica e non può avere forti emissioni 9. Inoltre, tutto il corpo imaging in vivo fluorescente non è dannoso per l'animale e permette ai ricercatori di monitorare la crescita del tumore nel tempo in risposta a trattamenti terapeutici.
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Protocol
Il protocollo descritto di seguito viene eseguito sotto la guida e l'approvazione del Comitato di cura e l'uso di animali di Western University. Tutti gli esperimenti sono eseguiti in conformità con tutte le linee guida, dei regolamenti e agenzie di regolamentazione.
Cultura 1. cellulare
- Preparazione del terreno completo
- Utilizzando una cappa di sicurezza biologica Classe II, preparare terreno completo aggiungendo asetticamente siero fetale bovino (FBS) e la penicillina streptomicina (P / S) ad una bottiglia da 500 ml di terreno RPMI. Mescolare delicatamente agitando. La concentrazione finale di ogni supplemento è del 10% FBS e 1% P / S (v / v). Ad esempio, integrare 500 ml di media con 56 ml di FBS e 6 ml P / S.
- Posizionare terreno completo in un bagno d'acqua a 37 ° C.
- Scongelamento e cellule di moltiplicazione
- Recupera le cellule PANC-1 GFP da azoto liquido. Scongelare il flacone delicatamente l'agitazione in un bagno d'acqua a 37 ° C.
Nota:Scongelamento dovrebbe essere rapida (circa 2 - 3 min). - Label T-75 palloni da utilizzare con (a) nome di cella-line, la data (b) il numero di passaggio, (c), e le iniziali (d), del ricercatore.
- Pulire la fiala con il 70% di etanolo e il trasferimento fiala di un armadio biosicurezza.
- Per propagare le cellule, aggiungere 9,0 ml di mezzo completo in un tubo da 15 ml. Usando una pipetta 1,0 ml, trasferire accuratamente la sospensione cellulare e sospenderlo in 9 ml di mezzo completo.
- Centrifugare a 125 xg per 8 minuti a temperatura ambiente. Trasferire la fiala conica di un armadio biosicurezza e aspirare il surnatante senza disturbare il pellet.
- Sospendere il pellet in 10 ml di mezzo fresco completa pipettando delicatamente la sospensione su e giù.
- Contare le cellule con un emocitometro e piastra in T-75 flaconi ad una densità di 2,1 x 10 6 cellule / fiasco. Inserire pallone in un incubatore a 37 ° C e 5% CO 2.
- Monitorare le cellule giornaliera a occhio e al microscopio. Se l'influenzaid è necessario il rinnovo, in modo asettico aspirare il mezzo di crescita completo dal pallone e scartare. Aggiungere uguale volume di mezzo fresco completa.
- Recupera le cellule PANC-1 GFP da azoto liquido. Scongelare il flacone delicatamente l'agitazione in un bagno d'acqua a 37 ° C.
- propagazione Cells
- Asetticamente rimuovere media dal pallone. Aggiungere 5 ml di tampone fosfato salina Dulbecco (DPBS) per lavare le cellule e scartare.
- Staccare le cellule dal pallone con l'aggiunta di 3 ml di 0,25% tripsina. Incubare pallone contenente tripsina a 37 ° C e 5% CO 2 per 5 a 10 min.
- Osservare le cellule al microscopio (ingrandimento 10x) e assicurarsi che sono rotondi e sloggiato.
- Neutralizzare tripsina aggiungendo un volume uguale di mezzo completo e rompere i grumi delicatamente pipettando su e giù.
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro e trasferire il volume di sospensione cellulare opportuno nuovi palloni alla densità cellulare di cui al 1.2.7; aggiungere abbastanza mezzi freschi in modo che il volume finale è di 10 ml per pallone.
- Suspens cellulariione Preparazione per l'iniezione
Nota: Dal momento che la matrice di membrana basale, ad alta concentrazione, solidifica a temperatura ambiente, conservare i materiali sul ghiaccio. Mettere tutti puntali sterili e fiale nel congelatore durante la notte, e tenere in ghiaccio mentre si lavora sulla sospensione.- Tenere una bottiglia di RPMI mezzi senza additivi su ghiaccio. Scongelare la matrice di membrana basale, ad alta concentrazione, seguendo le istruzioni del produttore. Preferibilmente, aliquota in fiale piccole per evitare più cicli di gelo-disgelo 10.
- supporti Aspirare da tutti i palloni, e risciacquare con 5 ml di DPBS. Ripetere tutti i passaggi nella sezione precedente, fino al punto 1.3.4.
- Trasferire contenuto in una provetta conica da 15 ml e centrifugare a 125 xg per 8 minuti a temperatura ambiente. Trasferimento fiala conica all'armadietto biosicurezza e risospendere pellet con 10 ml di DPBS.
- pipettare delicatamente la sospensione su e giù per rompere il pellet. Contare le cellule utilizzando un emocitometro.
- ancora Centrifugare come indicato in sTep 1.4.3. Aspirare il surnatante e in funzione del numero di cellule, aggiungere diluente appropriato produrre 3 x 10 6 cellule in un volume di 50 microlitri. Il diluente sarà una miscela di siero media liberi e alta concentrazione membrana matrice interrato in 1: (v / v) rapporto 1.
- Agitare la sospensione delicatamente e tenere in ghiaccio in ogni momento. La sospensione è ora pronto per l'iniezione.
- impianto chirurgico
Nota: Assicurarsi che tutti i materiali e gli strumenti chirurgici sono sterili. Pratica tecniche asettiche in ogni momento.- Posizionare una piastra elettrica sul tavolo e coprire con un telo sterile. Impostare la macchina per anestesia e garantire tutte le forniture sono a portata di mano.
- Posizionare muso dell'animale nella maschera anestesia e impostare l'anestesia a 1 L / min di ossigeno e 2,5% isoflurano.
- Pulire delicatamente il fianco dell'animale con iodio, e risciacquare con il 70% di etanolo. Ripetete tre volte.
- confermare laanimale è completamente anestetizzato pizzicando la zampa posteriore. L'animale è completamente anestetizzato e pronta per la chirurgia se non si osserva alcuna risposta. Tuttavia, se l'animale indietreggia, assicurarsi che ci sia sufficiente l'anestesia vaporizzatore e permettere all'animale più tempo per andare completamente sotto anestesia.
- Caricare circa 200 ml di sospensione cellulare in una siringa 1,0 ml TB con un ago da 18 G (precedentemente raffreddato). Sostituire l'ago con un ago G 27 e tornare al ghiaccio fino al momento dell'uso.
- Individuare l'area generale della milza (quadrante superiore sinistro dell'addome) e l'utilizzo di pinze pizzicare la pelle sulla parte superiore di quella regione. Utilizzando le forbici chirurgiche fare un'incisione di circa 1,0 centimetri per creare una tasca. Analogamente, pizzicare la muscolatura liscia sulla parte superiore della milza e tagliare per accedere alla cavità peritoneale.
- afferrare delicatamente l'estremità caudale della milza e tirarlo fuori dal corpo. Il pancreas verrà allegato alla milza. Stendere il pancreas con una st bagnatoerile Q-tip e individuare la coda del pancreas.
- Fornire l'iniezione di 50 ml nella coda del pancreas, lasciare l'ago dentro per 10 secondi e ruotare lentamente l'ago del pancreas. Un impianto di successo sarà simile a una bolla superficiale, senza perdite.
- Ritorno il pancreas e la milza alla cavità peritoneale. In primo luogo racchiudere il muscolo e quindi racchiudere la pelle separatamente. Utilizzare una sutura 6-0 o fiocco per chiudere l'incisione. Per evitare il dolore negli animali, amministrare ketoprofene per via sottocutanea (SC) (5 mg / kg) oltre 24 ore. In alternativa, amministrare buprenorfina sc (0,05 - 0,1 mg / kg) ogni 12 ore in un periodo di 36 ore.
- Recuperare l'animale dall'anestesia e restituirlo alla sua gabbia. monitorare anche per il dolore. Gli animali devono essere dotati di sollievo dal dolore al momento della (o anche prima - preventiva) un intervento chirurgico. sollievo dal dolore supplementare deve essere fornita agli animali che soffrono di dolore in base alla IACCUC-protocollo o come prescritto dal altendente veterinario o designato.
- Imaging in vivo
Nota: la cattura immagine è stata effettuata utilizzando un sistema di imaging commerciale dotato di una camera oscura ei filtri adeguati per l'imaging GFP. acquisizione delle immagini è stato realizzato con una telecamera CCD e un sistema ottico composto da lenti intercambiabili di eccitazione / emissione (eccitazione: 455-495 nm di emissione: 513-557 nm). immagini in campo chiaro sono stati catturati senza un filtro 1 x 1 binning per ogni punto di tempo. Eccitazione di GFP utilizzata una sorgente di luce multispettrale allo xeno. Gli animali sono stati mantenuti in anestesia durante il processo di imaging collegando la macchina anestesia per un collettore anestesia gas integrato nella camera oscura del sistema di imaging.- Anestetizzare l'animale come indicato nel 1.5.2. Una maschera anestesia è all'interno della camera oscura del sistema di imaging commerciale al fine di mantenere l'animale in anestesia durante l'imagingProcesso.
- Impostare i corretti filtri eccitazione e di emissione.
- Iniziare ottenendo un'immagine iniziale utilizzando solo la luce bianca. Mantenere la stessa posizione dell'animale per tutta la sessione di imaging e passare ai filtri GFP prendere una seconda immagine.
- Per ottenere i migliori risultati si sovrappongono due immagini. Analizzare l'immagine per l'area fluorescenti e intensità.
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Representative Results
Il metodo descrive un impianto ortotopico chirurgica delle cellule tumorali pancreatiche umane fluorescenti, concentrandosi sulla preparazione della sospensione cellulare iniettabile, anestesia adeguata per roditori, la consegna di sospensione cellulare tramite laparotomia, e l'uso di fluorescenza in vivo piccola dell'imaging animali. Il rilevamento di un segnale verde di fluorescenza (segnale GFP) tra due e tre settimane dopo l'impianto, fornisce ai ricercatori un segnale visivo per confermare la presenza di un tumore cancro pancreatico sviluppo (Figura 1). La Figura 1 è costituito da tre immagini di un mouse con PANC-1 GFP tumore fluorescente. La prima è preso sotto la luce bianca (Figura 1A); la seconda immagine è presa sotto luce fluorescente blu (eccitazione: 455-495 nm; emissione: 513-557 nm) per l'immagine del fluorescenza verde emessa dalla PANC-1 tumore pancreatico (Figura 1B); il terzo è un composto dii primi due e mostra la posizione del tumore all'interno del corpo del mouse (Figura 1C). Gli animali che non sviluppano tumori non mostrano segnale GFP (figura 2). Inoltre, le immagini rappresentative della progressione tumorale nel tempo potrebbe non invasivo monitorata, registrando il segnale GFP a tempi diversi (Figura 3). Figura 3 mostra vari compositi di segnali GFP nel tempo. Come il passare del tempo e l'aumentare della dimensione del tumore, il segnale GFP aumenta. Venti giorni dopo l'impianto, il tumore appare come un puntino verde, e 50 giorni dopo l'impianto, l'aumento delle dimensioni del tumore in modo significativo. La figura 4A mostra metastasi alla milza, del fegato e del tratto gastrointestinale, che può essere confermata dopo che l'animale è stato sacrificati e gli organi sono rimossi per ex vivo l'imaging fluorescente (Figura 4B).
Figura 2: impianto risoluzione dei problemi, la mancanza di fluorescenza Rappresentazione di un topo in un momento in cui il tumore non si era ancora sviluppato:. (A) L'immagine è stata ottenuta conluce bianca e nessun filtro. (B) immagine è stata ottenuta usando la luce blu e filtri specifici per GFP. (C) Una immagine composita di A e B. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: In vivo tempo reale Fluorescent Imaging tenere traccia di crescita del tumore primario. Imaging in vivo di PANC-1 GFP progressione del cancro al pancreas in vari momenti post-impianto. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Descriviamo un modello murino ortotopico di cancro pancreatico che esprime GFP, consentendo così il monitoraggio non invasivo della crescita tumorale mediante intero corpo imaging fluorescente vivo (Figura 1). Questa tecnica permette di monitorare lo sviluppo del tumore in tempo reale (figura 3); può essere uno strumento importante per i ricercatori di studiare l'efficacia terapeutica dei nuovi farmaci contro il cancro al pancreas. Un altro aspetto importante di questo modello è che la fluorescenza GFP fornisce un segnale visivo che indica l'impianto e la crescita del cancro al pancreas di successo; che altrimenti sarebbe difficile da misurare in animali vivi. Coerentemente con l'impostazione clinica, questo modello offre una panoramica sulle metastasi. Essa mostra metastasi agli organi circostanti: la milza, linfonodi mesenterici, fegato, e del tratto gastrointestinale (Figura 4). Abbiamo osservato metastasi fin da 7 settimane dopo il trapianto. PANC-1 metastasi sono stati reported nell'intervallo 10 - 18 settimane 11. Il momento in cui si osserva metastasi può dipendere dal numero di cellule impiantate, impiantazione e tecniche di visualizzazione. In questo studio, abbiamo scelto una linea verde fluorescente cellulare, PANC-1 GFP, che è disponibile in commercio. Il modello qui descritto è riproducibile e le metastasi può essere facilmente visualizzato perché hanno fluorescenza. Una limitazione di xenotrapianto nudo modelli murini ottenuti da linee di cellule di cancro stabiliti è la possibilità di ridurre l'eterogeneità tumorale rispetto a un tumore umano originale 12; tuttavia, il modello è riproducibile, facile da sviluppare e seguire i progressi di animali vivi. Inoltre, modelli di topi xenotrapianto continuano ad essere ampiamente utilizzato nella ricerca sul cancro.
Le cellule fluorescente devono essere pellettizzato e ri-sospese in ghiaccio freddo terreno privo di siero mescolato con un volume uguale di ghiacciata membrana basale 8. La sospensione cellulare deve essere maintained sul ghiaccio in ogni momento per evitare la gelificazione o di solidificazione. È importante caricare le siringhe con un ago da 18 gauge per evitare la lisi delle cellule. Se le cellule sono lisate, la sospensione cellulare è reso inutile, e nessuna crescita tumorale sarà raggiunta (figura 2). Subito dopo l'iniezione, permettono di circa 10 secondi per la sospensione cellulare per solidificare prima di rimuovere l'ago dal sito di iniezione. Le proprietà di solidificazione della sospensione ci ha permesso di iniettare le cellule senza perdite dal sito di iniezione. Perdita di cellule può portare a metastasi come artefatto piuttosto che dalla diffusione delle cellule. Abbiamo ottimizzato questo impianto ortotopico di PANC-1 linea di cellule GFP con 3 x 10 6 cellule per 50 ml di iniezione; altri implantations linee cellulari devono essere determinati empiricamente. I maggiori volumi di iniezione fino a 100 microlitri contenenti 500.000 cellule sono state riportate in letteratura 12. I principali parametri di ottimizzazione taken in considerazione hanno avuto successo la crescita del tumore e di imaging ortotopico tumore positivo tramite fluorescenza GFP entro tre settimane dopo l'impianto.
La crescita tumorale e lo sviluppo non solo è influenzata dal numero di cellule iniettate, ma anche dalla età dei topi utilizzati. Abbiamo usato topi nudi atimici e determinato che l'uso di topi giovani di età compresa tra 6 a 8 settimane tra i rendimenti dei risultati più riproducibili rispetto ai topi più anziani. Poiché questi topi di età, iniziano a recuperare un po 'immunità che può comportare il rigetto delle cellule pancreatiche umane. Le tecniche di imaging qui descritte non sono limitati a uso ortotopico; possono essere utilizzati anche per l'impianto eterotopico di tumori. Si deve prestare attenzione per evitare auto-fluorescenza che possono oscurare il segnale del tumore GFP. Alcuni materiali plastici utilizzati per le tubazioni anestesia possono produrre artefatti di auto-fluorescente.
Fluorescente di imaging del corpo intero permette una rapida analisi della crescita tumorale e la progressione 13. Uno dei principali vantaggi di utilizzare la fluorescenza è la possibilità di monitorare il cancro senza le tradizionali procedure ingombranti di esame istopatologico o di immunoistochimica 14. Questo modello ha fluorescenza e consente l'acquisizione immagine senza bisogno di lembi cutanei o altre manipolazioni. Fluorescenza differisce da bioluminescenza in quanto non crea luce sulla base di una reazione chimica; assorbe semplicemente luce e riemette è ad una frequenza inferiore. modelli di xenotrapianto ortotopico di fornire conoscenze preziose e la comprensione della biologia del tumore al pancreas, che può essere tradotto in nuove terapie per uso umano.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI media 1640 | Caisson Labs | RPL03-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-077 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Ficher Sci | 15140-122 | |
| Matrigel HC basement membrane, high concentration | Corning | 354248 | |
| SutureVet PGA 6-0 PGA | Henry Schein | 39010 | |
| Alcare or Foamed Antiseptic Handrub | Steris | 639680 | |
| DPBS (Dubelcco's Phosphate-Buffered saline) | Thermo Ficher Sci | 21300025 | |
| TB Syringe 27 G 1/2 | Becton Dickinson | 305620 | |
| Isoflurane | Blutler Schein | 50562 | |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | ||
| Surgical Scissors, 5.5" straight mayo | Henry Schein | 22-1600 | |
| PANC-1 GFP cell line | Anticancer, Inc | ||
| Small Animal Imaging System: iBox Scientia | UVP, LLC. Upland, CA. | Small Animal Imaging System to observe the fluorescent tumor in live animals |
References
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- Frese, K. K., Tuveson, D. A.
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