Summary
Per chiarire il processo a più fasi di diffusione peritoneale del carcinoma ovarico, questo studio presenta un modello sperimentale murino di sviluppo del tumore originale e metastasi peritoneali tramite inoculazione ortotopico con queste cellule tumorali.
Abstract
carcinoma ovarico epiteliale (EOC) è associato ad una prognosi infausta perché mostra disseminazione peritoneale. Per migliorare la prognosi, è importante controllare la diffusione peritoneale. Tuttavia, non è ancora chiaro in che modo le cellule tumorali si staccano da lesioni primarie e attaccano al mesotelio. La creazione di un modello animale adeguato è necessario per acquisire una comprensione del meccanismo di diffusione peritoneale in vivo. In questo studio, si introduce il processo dalla iniezione locale di cellule EOC nella superficie ovarica murino allo sviluppo di metastasi, compreso il peritoneo e organi distanti. Nudo femminile topi (BALB / c nu / nu) a 8 settimane di età sono stati utilizzati. In un campo di vista microscopico, cellule EOC (1 x 10 5 cellule / ml di matrice medio extracellulare (ECM) a base di idrogel / ovaio unilaterale / topo) sono stati iniettati in ovaie murine attraverso un approccio retroperitoneale sulla fascia dorsale. Questo metodo proposto è un leprocedura invasiva ss per il mouse e riduce al minimo i danni per l'ovaio. Qui, descriviamo i passi metodologici nello sviluppo della formazione del tumore originale e metastatico di EOC.
Introduction
Epiteliale carcinoma ovarico (EOC) rappresenta il più alto tasso di mortalità per cancro-correlata tra neoplasie ginecologiche 1. EOC è associato ad una prognosi sfavorevole, dovuto principalmente alla sua fine la sintomatologia, ed è spesso associata a più disseminations intraperitoneali e metastasi a distanza 2-4. diffusione peritoneale è un processo multi-step. In primo luogo, le cellule tumorali si staccano dalle lesioni primarie, e migrano nella cavità addominale. Quando le cellule tumorali attribuiscono al mesotelio peritoneale, cominciano a invadere i tessuti attraverso il mesotelio 5,6. Al fine di comprendere meglio la biologia del tumore (per esempio, la progressione del cancro e la risposta terapeutica), modelli murini offrono una ricchezza di informazioni. Un xenotrapianto con cellule tumorali umane è ampiamente usato per modelli murini in cui le cellule tumorali umane vengono inoculati per via sottocutanea, intraperitoneale, per via endovenosa, e ortotopicamente. Un modello animale con una ortotopicamente gtumore rafted può più efficiente e preciso generare risultati che riflettono l'ambiente del tumore negli esseri umani rispetto ad un modello animale con un tumore heterotopically innestato. Pertanto, per molti tumori umani, modelli di trapianto ortotopico sono stati stabiliti 7-11.
Qui, descriviamo l'inoculazione ortotopico di cellule EOC umane attraverso un approccio retroperitoneale sulla fascia dorsale, che ha limitato l'invasività rispetto alla inoculazione ventrale. Questa tecnica può fornire una varietà di informazioni utili su EOC, in particolare il meccanismo di diffusione intraperitoneale.
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Protocol
Il protocollo di trattamento segue le linee guida per la sperimentazione animale adottato da Nagoya University.
1. Preparazione di sospensioni cellulari
- linea umana ovarico chiaro carcinoma delle cellule.
- Mantenere ES-2 celle 12 in terreno RPMI-1640 con siero 10% fetale bovino (FBS) e penicillina / streptomicina (penicillina: 100 unità / ml, streptomicina: 0,1 mg / ml). Cellule di coltura a 37 ° C in un incubatore umidificato CO 2 5%.
- Raccogliere cellule in fase di crescita logaritmica in 0,05% tripsina / 0.02% soluzione di EDTA (tripsina / EDTA).
- In primo luogo, rimuovere i vecchi media dal recipiente di coltura cellulare, poi lavare le cellule una volta con PBS (PBS senza Ca 2 + / Mg 2+, 3 - 4 ml per 25 cm 2).
- Successivamente, aggiungere 1 ml per 25 cm 2 di tripsina / EDTA. Ruotare il recipiente di coltura cellulare per coprire il monostrato cellulare con tripsina / EDTA. Dopo aver rimosso e scartando tripsina / EDTA, restituire il cellularecultura nave per l'incubatore per 3-5 minuti o fino a quando le cellule sono staccato.
- Esaminate le cellule al microscopio per assicurare le cellule vengono staccate dalla superficie del recipiente di coltura cellulare e galleggianti.
- Aggiungere siero fresco contenente terreno di crescita per inattivare la tripsina (5 ml ogni 25 cm 2), e risospendere le cellule. Trasferire le cellule risospese in un tubo da 15 ml.
- Centrifugare a 300 xg per 5 min. Eseguire centrifugazione sia a 4 ° C oa temperatura ambiente. Rimuovere con cautela il surnatante e cellule con terreno di coltura risospendere (5 ml ogni 25 cm 2).
- Contare le cellule (ad esempio, per esclusione trypan blu) poi risospendere in terreno di crescita ad una densità di 2 x 10 8 cellule / ml. Mettere le cellule sospese in ghiaccio.
- Scongelare congelati matrice extracellulare (ECM) a base di aliquote idrogel in un bagno di ghiaccio.
- Aggiungere la sospensione cellulare per aliquote idrogel ECM basati con un rapporto di 1: 1 (finale cella concentration: 1 x 10 5 cellule / ml di idrogel di medio-ECM-based) e mescolare accuratamente. Posizionare le sospensioni cellulari preparate in un bagno di ghiaccio fino al momento dell'uso.
2. ortotopico inoculazione con sospensioni cellulari
NOTA: La chirurgia non richiede una suite dedicata. La chirurgia può essere eseguita su un banco di laboratorio in una zona della camera che è separata e ha attività minima. Una cappa laminare può anche essere usato. strumenti chirurgici sterili devono essere utilizzati e forbici non devono essere usati per fare incisioni cutanee.
- Utilizzare femminile topi nudi (BALB / c nu / nu) a 8 settimane di età per questo modello inoculazione ortotopico.
- Innanzitutto, anestetizzare il mouse utilizzando inalazione con isoflurano (di 2 - 4%). Controllare la profondità anestetico verificando la mancanza di recesso su pizzico punta ferma. Dopo il mouse è anestetizzato, applicare una blanda pomata oftalmica sterile agli occhi per prevenire l'essiccazione, se necessario.
- Posizionare il mouse anestetizzato su un operating fase ventre rivolto verso il basso. Disinfettare l'area chirurgica più volte sia con l'alcol e uno scrub a base di clorexidina a base di iodio o.
- Fare un ~ 2 cm incisione verticale vicino alla colonna vertebrale tra l'arco costale destra e del femore. Utilizzare un telo chirurgico sterile intorno al sito di incisione. Fissare le superfici cutanee incise con morsetti per mantenere l'apertura.
Nota: Retrattori possono essere utilizzati al posto dei morsetti. - Successivamente, una seconda incisione (circa 1 cm) al peritoneo parietale sotto la prima incisione per aprire la cavità addominale. Bloccare le superfici addominali incise. Agganciare il tessuto grasso che circonda il tubo ovaio e Falloppio omolaterale con un morsetto per rimuovere l'ovaio dalla cavità addominale. posizionare con cura il ovaio e tube di Falloppio in garza. Poi, posizionare il mouse ventre rivolto verso il basso sotto il microscopio da dissezione.
- Posizionare la sospensione cellulare in una siringa da insulina (1/2 cc, 29 G) appena prima dell'iniezione. iniettare con cautela la sospensione cellulare preparato (1- 2 ml) nel ovaio. Per molti sec, trattenere l'ago all'interno dell'ovaio garantire gelificazione della idrogel ECM-based. Dopo gelificazione, le cellule tumorali iniettate rimangono all'interno dell'ovaio.
- tornare con attenzione l'ovaio nel corpo. Suturare la seconda incisione con la seta medici sterili, e quindi sigillare la pelle con clip ferita.
- Dopo l'intervento chirurgico, i topi saranno somministrati una analgesia (per esempio, meloxicam, intramuscolare (IM) o sottocutanea (SC), 0,2 mg / kg) per iniziale periodo di 24 ore.
Il trattamento post-chirurgico 3.
- Mettere ogni topo in una gabbia separata su carta pulita con un impacco caldo per mantenere il caldo del mouse fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale. Poi, tornare gli animali ai loro gabbie per l'allevamento e il monitoraggio. Monitorare i topi al giorno per 3 - 7 giorni dopo il trattamento chirurgico.
- Il monitoraggio di topi post-operatoria
- In caso di segni di dolore, somministrare analgesiaSICS giornaliero (es, meloxicam, im o sc, 0,2 mg / kg).
- Se i topi hanno segni di infezione (ad esempio, arrossamento, gonfiore, scarico), amministrare iniezione giornaliera con un reagente anti-infettivi (ad esempio, la penicillina, im, 100.000 UI / kg).
- Rimuovere i materiali di chiusura della pelle 10 - 14 giorni dopo il trattamento post-chirurgico.
4. Analisi dei tumori e delle metastasi
NOTA: Il tumore si formerà alle iniettati ovaio 2 - 3 settimane dopo l'inoculazione.
- Sacrificare i topi dal biossido di carbonio, e quindi raccogliere i campioni (ad esempio, tumori, metastasi, organi) 13-15 per ulteriori analisi 14,16-20.
NOTA: Se un sistema di imaging in vivo è disponibile, cellule che producono enzimi che bioluminescenza (ad esempio, luciferasi) o la proteina fluorescente (ad esempio, GFP) possono essere utilizzati in questo protocollo. Questo protocollo modificato fornire informazioni utili perla dinamica della diffusione delle cellule tumorali dal tumore primario.
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Representative Results
Sei topi nudi avevano le loro ovaie inoculati con la chiara linea di cellule di carcinoma delle cellule umane ES-2, come descritto in questo protocollo. Come mostrato in figura 1A, dopo 2 settimane, 5 dei 6 topi aveva un tumore dell'ovaio inoculato con ES-2 cellule, ma non c'era tumore nell'ovaio controlaterale senza inoculazione (usato come controllo). Inoltre, 2 dei 5 topi hanno mostrato più disseminazione peritoneale con ascite. Cellule metastatizzano al fegato (Figura 1B). Le ovaie, sia con la massa tumorale nel punto di inoculo e sul lato di comando, sono stati sezionati, sezionati, colorati con ematossilina-eosina (HE), ed analizzate al microscopio (Figura 2). Un gran numero di cellule tumorali ovariche sono stati osservati nelle ovaie inoculata, ma non sul lato controlaterale. La morfologia cellulare era lo stesso di quello del tumore parentale.
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Figura 1: Tumore rosa per ortotopico inoculazione con Clear umana di cellule di carcinoma cellule ES-2. A e B, la / c del mouse nu / nu BALB sottoposti inoculazione ortotopico con ES-2 cellule. Dopo 2 settimane, il mouse è stato sacrificato per necroscopia. B, cellule metastasi al fegato (come indicato dalle frecce). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: ematossilina-eosina dell'ovaio con ortotopico inoculazione con Clear umana di cellule di carcinoma cellule ES-2. A e B, dell'ovaio con l'inoculazione di cellule ES-2, colorati con ematossilina-eosina (HE). colorazione simile è stato osservato rispetto a quello del carcinoma a cellule chiarenell'ovaio umano. C e D, HE colorazione delle ovaie senza inoculazione come controllo. Barre di scala, 100 micron (A, C), 20 micron (B, D). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I modelli animali sono essenziali per analizzare i meccanismi di sviluppo del tumore, la progressione, metastasi, e l'efficacia dei farmaci contro le cellule tumorali. I topi recanti cellule tumorali ovariche umane essere già stati utilizzati come modello animale. Qui, descriviamo una procedura meno invasiva per la somministrazione di cellule tumorali ovariche in un sito ortotopico. Utilizzando questa procedura, inoculazione in ovaio attraverso un approccio retroperitoneale sulla fascia dorsale offre notevoli vantaggi rispetto ad altre tecniche comunemente utilizzate. In primo luogo, l'inoculazione ortotopico in grado di fornire risultati più efficienti e precisi che riflettono l'ambiente del tumore nell'uomo 13,21. In secondo luogo, questo approccio retroperitoneale sulla fascia dorsale bisogno solo di una piccola dissezione (<1 - 2 cm) ed è quindi una procedura rapida rispetto all'approccio peritoneale. Pertanto, questo approccio retroperitoneale è meno invasivo per topi. In terzo luogo, l'ovaio murino è molto piccolo, e quindi in grado di accettare una grande quantità di reasignori. In questo procedimento presentata, usiamo sospensioni cellulari ad alta concentrazione (1 x 10 5 cellule / mL) e basso volume inoculazione (1 - 2 ml / iniezione) come un unico colpo; Pertanto, si riduce al minimo i danni al ovaio. Si evita inoltre la perdita di cellule inoculate dall'ovaio. Sebbene ulteriore ricerca è essenziale, l'inoculazione ortotopico murino descritto può essere un metodo utile per aiutare a sviluppare nuove terapie per il trattamento della EOC in futuro.
Ci sono due punti critici in questo protocollo. In primo luogo, le cellule sono utilizzati nella fase di crescita logaritmica. In secondo luogo, le cellule sospese con idrogel ECM basati sono poste in ghiaccio fino al momento dell'uso. Quando l'idrogel ECM-based inizia a riscaldarsi, il processo di gelificazione avrà inizio. Per evitare la gelificazione del idrogel ECM-based, cellule risospese con l'idrogel e strumenti (per esempio, tubi, siringhe e aghi) basata su ECM sono tenuti in ghiaccio fino al momento dell'uso. Vi è un limite di questa tecnica.Il volume di iniezione di sospensione cellulare è inferiore a 3 microlitri, perché l'ovaio mouse non può accettare un grande volume di inoculo.
Questo protocollo può essere modificato in alcuni punti. Se un sistema di imaging in vivo è disponibile, cellule che producono enzimi che bioluminescenza (ad esempio, luciferasi) o la proteina fluorescente (ad esempio, GFP) può essere utilizzato in questo protocollo. Questo protocollo modificato fornirà informazioni utili per la dinamica della diffusione delle cellule tumorali dal tumore primario. Inoltre, questo protocollo utilizza ES-2 cellule per l'inoculazione con ovaio mouse. ES-2 le cellule sono derivate da carcinoma a cellule chiare, e questa linea cellulare esibisce crescita aggressiva nel topo nudo. Altre linee cellulari (ad esempio, il carcinoma sieroso) può anche essere utilizzato questo protocollo invece di ES-2 cellule.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano i membri del Dipartimento di Ostetricia e Ginecologia e Cancer Biology per i loro utili discussioni e assistenza tecnica. Questo studio è stato sostenuto da una società giapponese per la promozione della Scienza (JSP) Grant-in-Aid per la ricerca scientifica (15K15604, a H. Kajiyama).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel matrix | BD | 354234 | ECM-based hydrogel |
| Insulin syringe | TERUMO | SS-05M2913 | 1/2 cc, 29 G x 1/2" |
| Suturing needle with suture | 11 mm, 3/8, Nylon6-0 | ||
| Reflex 7 mm Wound Clip Applier | CellPoint Scientific | 204-1000 | |
| Reflex 7 mm wound clips | CellPoint Scientific | 203-1000 |
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