Summary
澄清卵巢癌的腹膜传播的多步骤的过程，目前的研究提出了原发肿瘤的发展和腹膜转移通过原位接种这些肿瘤细胞的鼠实验模型。
Abstract
上皮性卵巢癌（EOC）与预后不良，因为它表明腹膜转移有关。改善预后，以控制腹膜是重要的。然而，目前还不清楚的肿瘤细胞是如何从原发病灶分离并附着到间皮。适当的动物模型的建立需要获得体内腹膜的机制的理解。在目前的研究中，我们介绍从局部注射EOC细胞进入鼠卵巢表面向转移的发展，包括腹膜及远处器官的过程。在8周龄雌性裸鼠（BALB / c小鼠NU / NU）被使用。下的视显微镜视野，EOC细胞（1×10 5细胞/中细胞外基质（ECM）的微升为基础的水凝胶/单侧卵巢/小鼠）通过从背侧面腹膜后途径注射到鼠卵巢。这种方法是一种乐为鼠标SS侵入性的程序，最大限度地减少对卵巢的伤害。在这里，我们描述了在原始和转移性肿瘤的形成的EOC的发展的方法步骤。
Introduction
上皮性卵巢癌（EOC）占癌症相关死亡率的妇科恶性肿瘤1中的最高速度。 EOC与预后较差，主要是由于其后期症状，并经常与多个浸染腹腔及远处转移有关2-4。腹膜传播是一个多步骤的过程。首先，肿瘤细胞从原发病灶脱落，并迁移进入腹腔。当肿瘤细胞附着到腹膜间皮后，便开始通过间皮5,6-侵入组织。为了更好地理解肿瘤生物学（ 如癌症进展和治疗反应），小鼠模型提供了丰富的信息。与人癌细胞的异种移植物被广泛用于其中将人癌细胞皮下接种，腹膜内，静脉内，以及原位小鼠模型。与原位克动物模型筏肿瘤可以更有效地和精确地生成反映在人类肿瘤环境中与一个异位接枝肿瘤的动物模型中比较结果。因此，对许多人类肿瘤，原位移植模型已经建立7-11。
这里，我们描述通过从背侧面，这限制了侵袭性相比腹侧接种腹膜后途径的人类EOC细胞的原位接种。这种技术可提供各种对EOC有用的信息，特别是腹膜内传播的机制。
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Protocol
该治疗方案遵循由名古屋大学通过动物实验的指导方针。
1.悬浮细胞的制备
- 人卵巢透明细胞癌的细胞系。
- 维持ES-2细胞12中，用10％胎牛血清（FBS）和青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基（青霉素：100单位/ ml，链霉素：0.1毫克/毫升）。在一个5％CO 2的加湿培养箱中培养细胞在37℃。
- 收集在对数生长期的细胞在0.05％胰蛋白酶/ 0.02％EDTA溶液（胰蛋白酶/ EDTA）。
- 首先，从细胞培养容器中删除旧的介质，然后用PBS洗涤细胞一次（PBS不含Ca 2+ / Mg 2+离子 ，3 -第4毫升，每为25cm 2）。
- 接下来，添加每25厘米胰蛋白酶/ EDTA的2 1毫升旋转细胞培养容器以覆盖与胰蛋白酶/ EDTA的细胞单层。拆除和丢弃胰蛋白酶/ EDTA后，返回小区培养容器的孵化器3 - 5分钟或直至细胞被分离。
- 在显微镜下检查细胞以确保将细胞从细胞培养容器中，浮动的表面脱离。
- 添加含有生长培养基以灭活胰蛋白酶（5毫升，每为25cm 2），并重新悬浮细胞新鲜血清。传送再悬浮细胞至15ml锥形管中。
- 离心在300×g离心5分钟。在4℃或室温下进行离心任。小心取出上清，重新暂停与生长培养基细胞（每为25cm 2 5ml）中。
- 计数细胞（ 例如 ，通过台盼蓝排除），然后在生长培养基中以2×10 8个细胞/ ml的密度重新悬浮。把悬浮细胞冰上。
- 解冻冷冻的细胞外基质（ECM）为基础的水凝胶的等分试样在冰浴中。
- 添加细胞悬浮液，以基于ECM的水凝胶的等分试样在1：1的比例（终小区concentration：1×10 5细胞/基于中等的ECM的水凝胶的微升）并充分混合。放置制备的细胞悬浮液在冰浴中直至使用。
2.原位接种悬浮细胞
注意：手术不需要专用的套件。手术可以在实验室台式在是单独的，并具有最小的活动房的区域来执行。层流罩也可被使用。无菌手术器械必须使用剪刀不应该被用来使皮肤切口。
- 使用8周龄的雌性裸鼠（BALB / c小鼠NU / NU）此原位接种模型。
- 首先，麻醉用吸入异氟烷鼠标（2 - 4％）。通过验证后，缺乏坚定的脚趾捏撤回检查麻醉深度。鼠标麻醉后，将一个平淡无菌眼药膏的眼睛，以防止干燥是必要的。
- 放置鼠标麻醉上OPERATING阶段腹侧下来。消毒手术区数次酒精和一个基于洗必泰碘基或擦洗。
- 使靠近垂直右肋弓与股骨之间的脊椎1〜2厘米的切口。使用切口周围部位的无菌手术盖布。用夹子固定修复皮肤切表面，以保持开放。
注意：拉钩可被用来代替夹具。 - 接着，使一第二切口（大约1厘米）在壁层腹膜第一切口下，打开腹腔。夹紧阴刻腹部表面。夹与夹子围绕患侧卵巢和输卵管从腹腔取出卵巢的脂肪组织。小心地放在纱布卵巢和输卵管。然后，将鼠标腹侧下解剖显微镜下。
- 将细胞悬液中胰岛素注射器（1/2毫升，29克）刚刚注射前。小心注入所制备的细胞悬浮液（1- 2微升）进卵巢。几秒，保留卵巢内的针，以确保基于ECM的水凝胶的凝胶化。凝胶化后，注入肿瘤细胞保持卵巢内。
- 仔细返回卵巢到体内。缝合无菌医疗丝绸第二切口，然后用密封夹伤皮肤。
- 手术后，将小鼠施用初始24小时的时间内的镇痛（ 例如 ，美洛昔康，肌内（IM）或皮下（sc），0.2毫克/千克）。
3.手术后的治疗
- 将在干净的纸单独的笼子每只小鼠用热敷，以保持温暖鼠标，直到它已经恢复了足够的意识，以保持胸骨斜卧。然后，返回的动物笼子里饲养和监控。每天监控小鼠3 - 7日之后进行手术治疗。
- 术后小鼠监控
- 在疼痛的迹象的情况下，管理analgeSICS每天（ 如美洛昔康，IM或SC，0.2毫克/千克）。
- 如果小鼠有感染（ 如发红，肿胀，放电）的迹象，每天给药注射抗感染剂（ 如青霉素，即时通讯，10 IU /公斤）。
- 手术后的治疗后14天 - 取下皮肤缝合材料10。
4.肿瘤和转移的分析
注意：肿瘤会在注射子房2形成 - 3周接种后。
- 牺牲由二氧化碳的小鼠，然后收集样品（ 例如 ，肿瘤，转移瘤，器官）13-15作进一步的分析14,16-20。
注：如果在体内成像系统是可用的，轴承产生生物发光（ 如萤光素酶）或荧光蛋白（ 例如 ，GFP）的酶的细胞可以在这个协议中使用。这个修改后的协议将提供有用的信息癌细胞从原发肿瘤扩散的动力学。
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Representative Results
六裸鼠接种了与人类透明细胞癌细胞系ES-2自己的卵巢，如本协议所述。如在图1A中所示，2周后，将6只小鼠的5例中具有ES-2细胞接种卵巢肿瘤，但有在对侧卵巢肿瘤无无接种（用作对照）。此外，5只小鼠的2显示腹水多腹膜浸染。细胞转移到肝脏（ 图1B）。卵巢，都与在接种部位和在控制侧上的肿瘤块，进行解剖，切片，用苏木精-曙红（HE）染色，并在显微镜（ 图2）下进行分析。在接种卵巢观察大量的卵巢癌细胞，但不能在对侧。细胞形态的相同亲本肿瘤。
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图1： 肿瘤形成由原位接种人用透明细胞癌ES-2。 A和B，在BALB / c小鼠NU / NU小鼠进行原位接种具有ES-2细胞。 2周后，老鼠被牺牲了尸检。 B，细胞转移到肝脏（由箭头指示）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：HE 染色卵巢染色原位接种人用透明细胞癌ES-2。 A和B，子房具有ES-2细胞接种，用苏木精-曙红（HE）染色。相比于透明细胞癌相似的染色可见在人类卵巢。 C和D，HE染色卵巢未经接种作为对照。 比例尺，100微米（A，C），20微米（B，D）。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
动物模型是分析肿瘤的发展，进展，转移，和药物疗效的机理对癌细胞是必不可少的。荷人卵巢癌细胞也已用作动物模型。这里，我们描述在原位的网站卵巢肿瘤细胞的给药的微创过程。通过从背侧面腹膜后方法使用这一步骤，接种到卵巢优于其它常用的技术提供显著优点。首先，原位接种可以提供反映在人类13,21肿瘤环境更有效和准确的结果。其次，从背侧此腹膜后方法只需要一个小的解剖（<1 - 2厘米），以便它是相比于腹膜方法快速的过程。因此，这种腹膜后途径是小鼠创伤小。第三，鼠卵巢非常小，所以无法接受的大量REA的男厕所。在此提出的过程中，我们使用高度浓缩的细胞悬浮液（1×10 5个细胞/微升）和一个低接种量（1 - 2微升/注射），为单次;因此，最大限度地减少对卵巢损伤。它还避免从卵巢接种细胞的泄漏。虽然进一步的研究是必不可少的，所描述的小鼠接种正位可能是一个有用的方法，以帮助开发新疗法为今后治疗EOC的。
有此协议中的两个关键点。首先，将细胞在对数生长期中。其次，暂停基于ECM的水凝胶将细胞置于冰上直至使用。当基于ECM的水凝胶开始预热，凝胶化过程将开始。为了避免基于ECM的水凝胶的凝胶化，将细胞重新悬浮在基于ECM的水凝胶和仪器（ 例如 ，管，注射器和针头）都保持在冰上直到使用。有这种技术的一个限制。细胞悬浮液的注射量小于3微升，因为鼠标卵巢不能接受大体积的接种物。
这种协议可以在某些点进行修改。如果体内成像系统是可用的，细胞的轴承产生生物发光（ 如萤光素酶）或荧光蛋白（ 例如 ，GFP）可以在这个协议中使用的酶。该修改协议将提供癌细胞从原发肿瘤扩散的动力学的有用信息。此外，该协议使用ES-2细胞接种小鼠卵巢。 ES-2细胞来源于透明细胞癌导出，该细胞系具有裸鼠积极增长。其他细胞系（ 例如 ，浆液性癌），也可以使用该协议而不是ES-2细胞。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
作者感谢妇产科系的成员和癌症生物学为他们有益的讨论和技术援助。 （;到H梶山15K15604）这项研究是由日本学术振兴会（JSPS）赠款在资助科学研究的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel matrix | BD | 354234 | ECM-based hydrogel |
| Insulin syringe | TERUMO | SS-05M2913 | 1/2 cc, 29 G x 1/2" |
| Suturing needle with suture | 11 mm, 3/8, Nylon6-0 | ||
| Reflex 7 mm Wound Clip Applier | CellPoint Scientific | 204-1000 | |
| Reflex 7 mm wound clips | CellPoint Scientific | 203-1000 |
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