Summary
For å klargjøre den flertrinnsprosess peritoneal formidling av ovarialcancer, denne studien presenterer en murine eksperimentell modell av opprinnelige svulsten utvikling og peritoneal metastase via orthotopic inokulering med disse tumorceller.
Abstract
Epitelovarialcancer karsinom (EOC) er assosiert med en dårlig prognose fordi det viser peritoneal formidling. For å bedre prognose, er det viktig å kontrollere peritoneal formidling. Men det er fortsatt uklart hvordan kreftceller løsner fra primære lesjoner og feste til mesothelium. Etableringen av en passende dyremodell er nødvendig for å få en forståelse av mekanismen for peritoneal formidling in vivo. I denne studien, innfører vi prosessen fra lokal injeksjon av EOC celler inn i den murine ovarial overflaten til utvikling av metastaser, herunder peritoneum og fjerntliggende organer. Hunn nakne mus (BALB / c nu / nu) ved 8 ukers alder ble anvendt. Under en mikroskopisk synsfelt, EOC-celler (1 x 10 5 celler / mL mellom ekstracellulære matriks (ECM) -baserte hydrogel / unilateral eggstokk / mus) ble injisert inn i murine eggstokkene gjennom en retroperitoneal tilnærming fra ryggkanten. Denne foreslåtte metode er en less invasiv prosedyre for mus og minimaliserer skade på eggstokken. Her beskriver vi de metodiske skritt i utviklingen av den opprinnelige og metastatisk tumor dannelse av EOC.
Introduction
Epitelial ovarialcancer (EOC) står for den høyeste frekvensen av kreft-relaterte dødelighet blant gynekologiske kreftformer 1. EOC er assosiert med dårlig prognose, hovedsakelig på grunn av den sene symptomer, og er ofte forbundet med flere intraperitoneal disseminations og fjernmetastaser 2-4. Peritoneal formidling er en flertrinnsprosess. For det første, tumorceller løsner fra de primære lesjoner, og migrere inn i bukhulen. Når kreftceller fester seg til peritoneal mesothelium, begynner de å invadere vev gjennom mesothelium 5,6. For bedre å forstå tumorbiologi (f.eks kreft progresjon og terapeutisk respons), musemodeller gir et vell av informasjon. En xenograft med humane kreftceller er mye brukt for musemodeller i hvilke humane kreftceller blir inokulert subkutant, intraperitonealt, intravenøst, og orthotopically. Et dyr modell med orthotopically gfløt svulst kan mer effektivt og nøyaktig skape resultater som gjenspeiler svulsten miljø hos mennesker sammenlignet med en dyremodell med en heterotopically podet svulst. Derfor, for mange menneskelige svulster, er det etablert ortotopiske transplantasjons modeller 7-11.
Her beskriver vi orthotopic inokulering av menneskelige EOC celler gjennom en retroperitoneal tilnærming fra ryggsiden, som har begrenset invasivitet i forhold til ventral vaksinasjonen. Denne teknikken kan gi en rekke nyttig informasjon om EOC, særlig mekanismen av intraperitoneal formidling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Behandlingsprotokollen følger retningslinjene for dyreforsøk vedtatt av Nagoya University.
1. Utarbeidelse av cellesuspensjoner
- Menneskelig eggstokkene klarcellet karsinom cellelinje.
- Opprettholde ES-2-celler 12 i RPMI-1640 medium med 10% føtalt bovint serum (FBS) og penicillin / streptomycin (penicillin: 100 enheter / ml, streptomycin: 0,1 mg / ml). Kultur celler ved 37 ° C i en 5% CO2 fuktet inkubator.
- Samle-celler i logaritmisk vekstfase i 0,05% trypsin / 0,02% EDTA-løsning (trypsin / EDTA).
- Først, fjern de gamle media fra cellekultur fartøy, deretter vaske cellene gang med PBS (PBS uten Ca 2+ / Mg 2+, 3 - 4 ml per 25 cm 2).
- Deretter tilsett 1 ml per 25 cm 2 av trypsin / EDTA. Rotere cellekulturbeholderen for å dekke cellemonolaget med trypsin / EDTA. Etter å ha fjernet og forkaster trypsin / EDTA, tilbake til cellendyrkings-beholderen til inkubatoren i 3 - 5 minutter, eller inntil cellene er frittliggende.
- Undersøke cellene under et mikroskop for å sikre at cellene er frigjort fra overflaten av cellekulturen fartøyet og flytende.
- Legg frisk serum inneholdende vekstmedium for å inaktivere trypsin (5 ml per 25 cm 2), og re-suspendere cellene. Overfør resuspenderes cellene til en 15 ml konisk rør.
- Sentrifuger ved 300 xg i 5 minutter. Utføre sentrifugering enten ved 4 ° C eller romtemperatur. Fjern forsiktig supernatanten og re-suspendere celler med vekstmedium (5 ml per 25 cm 2).
- Telle-celler (for eksempel ved trypan-blå eksklusjon) deretter re-suspen i vekstmedium ved en tetthet på 2 x 10 8 celle / ml. Sett suspenderte cellene på is.
- Tine frossen ekstracellulære matriks (ECM) -baserte hydrogel alikvoter i et isbad.
- Legg til cellesuspensjonen til ECM-baserte hydrogel alikvoter ved et forhold på 1: 1 (endelig celle concentration: 1 x 10 5 celler / mikroliter mellom ECM-baserte hydrogel) og bland godt. Plasser de fremstilte cellesuspensjoner i et isbad inntil bruk.
2. ortotopiske Inoculation med cellesuspensjoner
MERK: Kirurgi krever ikke et eget utvalg. Kirurgi kan utføres på en laboratoriebenkeplaten i et område av rommet som er atskilt og har minimal aktivitet. En laminær hette kan også anvendes. Sterile kirurgiske instrumenter må brukes og saks bør ikke brukes til å gjøre huden snitt.
- Bruk kvinnelig naken mus (BALB / c nu / nu) ved 8 ukers alder for denne orthotopic vaksinasjon modell.
- Først bedøve mus ved hjelp av inhalasjon med isofluran (2-4%). Sjekk anestesidybden ved å bekrefte manglende uttak på fast tå klype. Etter at musen er bedøvet, bruke en blid steril oftalmisk salve til øynene for å hindre uttørking etter behov.
- Plasser bedøvet musen på en driftsing scenen magen siden ned. Desinfisere den kirurgiske området flere ganger med både alkohol og en jod-basert eller klorheksidin basert skrubb.
- Lag en ~ 2 cm snittet vertikalt nær ryggraden mellom høyre costal buen og femur. Bruk en steril kirurgisk drapere rundt innsnitt området. Fest radert hudområder med klemmer for å opprettholde åpningen.
Merk: retraktorer kan brukes i stedet for klemmer. - Deretter lage en andre snitt (ca. 1 cm) på parietal peritoneum under første innsnitt for å åpne bukhulen. Klemme radert mage overflater. Klem fettvev som omgir ipsilaterale eggstokk og eggleder med en klemme for å fjerne eggstokken fra bukhulen. Plasser forsiktig eggstokken og egglederen på gasbind. Deretter plasserer du muse magen siden ned under dissekere mikroskop.
- Plasser cellesuspensjonen i en insulinsprøyte (1/2 cc, 29 G) like før injeksjon. injisere forsiktig forberedt cellesuspensjon (1- 2 mL) i eggstokken. Til flere sekunder, holde nålen i eggstokken for å sikre gelering av ECM-baserte hydrogel. Etter gelering, de injiserte tumorcellene forblir inne i eggstokken.
- Forsiktig tilbake eggstokken inn i kroppen. Sy andre såret med sterilt medisinsk silke, og deretter forsegle huden med sår klipp.
- Etter operasjonen vil musene gis en analgesi (f.eks meloksikam, intramuskulær (im) eller subkutan (sc), 0,2 mg / kg) for første 24-timers periode.
3. Post-kirurgisk behandling
- Plasser hver mus i et eget bur på rent papir med en varm pakke å holde musen varme til den har gjenvunnet nok bevissthet til å opprettholde sternal recumbency. Deretter går du tilbake dyrene til deres bur for oppdrett og overvåkning. Overvåke mus daglig i 3 - 7 dager etter kirurgisk behandling.
- Overvåking av postoperative mus
- Ved tegn til smerte, administrere analgeSICS daglig (f.eks meloksikam, im eller sc, 0,2 mg / kg).
- Hvis mus har tegn på infeksjon (f.eks, rødhet, hevelse, utflod), administrere daglig injeksjon med en anti-infeksiøs reagens (f.eks penicillin, im, 100 000 IE / kg).
- Fjern skinnet nedleggelse materialer 10 - 14 dager etter post-kirurgisk behandling.
4. Analyse av svulster og metastaser
MERK: Svulsten blir dannet ved de injiserte eggstokk 2 - 3 uker etter vaksinasjon.
- Ofre musene av karbondioksid, og deretter samle prøvene (f.eks svulster, metastaser, organer) 13-15 for videre analyse 14,16-20.
MERK: Hvis en in vivo bildesystem er tilgjengelig, celler som bærer enzymer som produserer bioluminescens (f.eks luciferase) eller fluorescerende protein (f.eks GFP) kan brukes i denne protokollen. Denne modifiserte protokollen vil gi nyttig informasjon fordynamikken i spredning av kreftceller fra den primære tumor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Seks nakne mus hadde eggstokkene inokulert med den humane klare celle carcinoma cellelinje ES-2, som beskrevet i denne protokollen. Som vist i figur 1A, etter 2 uker, 5 av de 6 musene hadde en svulst i eggstokken inokulert med ES-2-celler, men det var ingen svulst i den kontralaterale eggstokk uten inokulering (anvendt som en kontroll). Videre er to av de 5 mus viste multiple peritoneal disseminations med ascites. Celler metastasere til leveren (figur 1B). Eggstokkene, både med tumormassen ved inokulering stedet og på kontrollsiden, ble dissekert, seksjonert, farget med hematoksylin-eosin (HE), og analysert under et mikroskop (figur 2). Det ble observert et stort antall eggstokkreft celler i det inokulerte eggstokk, men ikke på den kontralaterale siden. Cellen morfologi var den samme som den til foreldre tumoren.
"Figur 1" src = "/ files / ftp_upload / 54353 / 54353fig1.jpg" />
Figur 1: Tumor Dannelse av ortotopiske Inoculation med menneskelige Clear cell carcinoma celler ES-2. A og B, den BALB / c nu / nu mus gikk ortotopisk inokulering med ES-2-celler. Etter 2 uker ble mus ofret for obduksjon. B, Celler metastasere til leveren (som indikert ved pilene). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Hematoxylin-eosin Farging av eggstokk med ortotopiske Inoculation med menneskelige Clear cell carcinoma celler ES-2. A og B, eggstokk med inokulering av ES-2-celler, farget med hematoksylin-eosin (HE). Lignende farging ble sett sammenlignet med klarcellet karsinomi den menneskelige eggstokk. C og D, HE farging av eggstokk uten inokulering som en kontroll. Skala barer, 100 mikrometer (A, C), 20 mikrometer (B, D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dyremodeller er avgjørende for å analysere mekanismer for tumorutvikling, progresjon, metastase, og legemidlets effekt mot kreftceller. Mus med menneskelige eggstokkreft celler også ha blitt brukt som en dyremodell. Her beskriver vi et mindre inngrep for administrasjon av ovarietumorceller på en orthotopic stedet. Ved hjelp av denne fremgangsmåten, inokulering inn i eggstokken gjennom en retroperitoneal tilnærming fra den dorsale flanke gir betydelige fordeler i forhold til andre vanlig brukte teknikker. For det første kan orthotopic vaksinasjon gi mer effektive og nøyaktige resultater som gjenspeiler svulsten miljø hos mennesker 13,21. For det andre, det retroperitoneale tilnærming fra den dorsale flanke trenger bare en liten disseksjon (<1 - 2 cm) slik at det er en rask prosedyre i forhold til peritoneal tilnærming. Derfor er dette retroperitoneal tilnærmingen mindre invasiv for mus. For det tredje er det muse-ovarie-meget liten, og så ute av stand til å ta imot en stor mengde av reaherrer. I denne fremgangsmåten presentert, bruker vi svært konsentrerte cellesuspensjon (1 x 10 5 celler / mL) og en lav volum inokulering (1 - 2 ul / injeksjon) som en enkelt skudd; derfor, det minimerer skade på eggstokken. Det unngår også lekkasje av inokulerte celler fra eggstokken. Selv om videre forskning er viktig, kan den beskrevne murine orthotopic vaksinasjon være en nyttig tilnærming for å bidra til å utvikle nye behandlingsformer for behandling av EOC i fremtiden.
Det er to viktige punkter i denne protokollen. For det første blir cellene benyttet i den logaritmiske vekstfase. For det andre, blir cellene suspendert med ECM-baserte hydrogel plassert på is inntil bruk. Når ECM-baserte hydrogel begynner å varme, vil geleringsprosessen begynne. For å unngå gelering av ECM-baserte hydrogel, cellene resuspendert med ECM-baserte hydrogel og instrumenter (for eksempel rør, sprøyter og nåler) blir holdt på is inntil bruk. Det er en begrensning av denne teknikken.Injeksjonsvolumet på cellesuspensjonen er mindre enn 3 ul, fordi mus eggstokk ikke kan ta imot et stort volum av inokulum.
Denne protokollen kan modifiseres på noen punkter. Ved en in vivo bildesystem er tilgjengelig, celler som bærer enzymer som produserer bioluminescens (f.eks luciferase) eller fluorescerende protein (f.eks GFP) kan brukes i denne protokollen. Denne modifiserte protokollen vil gi nyttig informasjon for dynamikken i spredning av kreftceller fra den primære svulsten. Dessuten bruker denne protokollen ES-2-celler for inokulering med musen eggstokk. ES-2-celler er avledet fra klar celle karsinom, og denne cellelinjen utviser aggressiv vekst i nakne mus. Andre cellelinjer (f.eks serøs karsinom) også kan brukes til denne protokollen i stedet for ES-2-celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker medlemmene av Department of Obstetrics and Gynecology og kreft biologi for sine nyttige diskusjoner og teknisk assistanse. Denne studien ble støttet av en Japan Society for Promotion of Science (JSP) Grant-i-Aid for Scientific Research (15K15604, H. Kajiyama).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel matrix | BD | 354234 | ECM-based hydrogel |
| Insulin syringe | TERUMO | SS-05M2913 | 1/2 cc, 29 G x 1/2" |
| Suturing needle with suture | 11 mm, 3/8, Nylon6-0 | ||
| Reflex 7 mm Wound Clip Applier | CellPoint Scientific | 204-1000 | |
| Reflex 7 mm wound clips | CellPoint Scientific | 203-1000 |
References
- Jemal, A., et al.
- Kajiyama, H., et al. Long-term clinical outcome of patients with recurrent epithelial ovarian carcinoma: is it the same for each histological type. Int J Gynecol Cancer. 22 (3), 394-399 (2012).
- Kikkawa, F., et al. Advances in treatment of epithelial ovarian cancer. Nagoya J Med Sci. 68 (1-2), 19-26 (2006).
- Yoshikawa, N., et al. Clinicopathologic features of epithelial ovarian carcinoma in younger vs. older patients: analysis in Japanese women. J Gynecol Oncol. 25 (2), 118-123 (2014).
- Kajiyama, H., et al. Involvement of SDF-1alpha/CXCR4 axis in the enhanced peritoneal metastasis of epithelial ovarian carcinoma. Int J Cancer. 122 (1), 91-99 (2008).
- Terauchi, M., et al. Possible involvement of TWIST in enhanced peritoneal metastasis of epithelial ovarian carcinoma. Clin Exp Metastasis. 24 (5), 329-339 (2007).
- Bronstein, L., Zechner, C., Koeppl, H. Bayesian inference of reaction kinetics from single-cell recordings across a heterogeneous cell population. Methods. 85, 22-35 (2015).
- Guo, W., Zhang, S., Liu, S. Establishment of a novel orthotopic model of breast cancer metastasis to the lung. Oncol Rep. 33 (6), 2992-2998 (2015).
- Lewis-Tuffin, L. J., et al. Src family kinases differentially influence glioma growth and motility. Mol Oncol. , (2015).
- Saar, M., et al. Orthotopic tumorgrafts in nude mice: A new method to study human prostate cancer. Prostate. 75 (14), 1526-1537 (2015).
- Zou, Y., et al. miR-29c suppresses pancreatic cancer liver metastasis in an orthotopic implantation model in nude mice and affects survival in pancreatic cancer patients. Carcinogenesis. 36 (6), 676-684 (2015).
- Lau, D. H., Lewis, A. D., Ehsan, M. N., Sikic, B. I. Multifactorial mechanisms associated with broad cross-resistance of ovarian carcinoma cells selected by cyanomorpholino doxorubicin. Cancer Res. 51 (19), 5181-5187 (1991).
- Bao, L., Matsumura, Y., Baban, D., Sun, Y., Tarin, D. Effects of inoculation site and Matrigel on growth and metastasis of human breast cancer cells. Br J Cancer. 70 (2), 228-232 (1994).
- Huang, M. J., et al. Epidemiological investigation on major depressive disorder in the most heavily damaged areas from Wenchuan earthquake in 2008. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 31 (2), 167-170 (2010).
- Ma, L., et al. Mortality of neonatal respiratory failure related to socioeconomic factors in Hebei province of China. Neonatology. 100 (1), 14-22 (2011).
- Lin, Z., et al. Serum levels of FGF-21 are increased in coronary heart disease patients and are independently associated with adverse lipid profile. PLoS One. 5 (12), e15534 (2010).
- Liu, B., et al. Lumbar interspinous non-fusion techniques: comparison between Coflex and Wallis. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 30 (11), 2455-2458 (2010).
- Zhang, Y., et al. Wave intensity analysis of carotid artery: a noninvasive technique for assessing hemodynamic changes of hyperthyroid patients. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci. 30 (5), 672-677 (2010).
- Song, G. S., et al. Comparative transcriptional profiling and preliminary study on heterosis mechanism of super-hybrid rice. Mol Plant. 3 (6), 1012-1025 (2010).
- Wan, L., et al. The analysis of variation of Han female adolescent bone development in Henan and Zhejiang province. Fa Yi Xue Za Zhi. 26 (2), 97-99 (2010).
- Wang, H. B., et al. Excitation-emission fluorescence characterization study of the three phenolic compounds. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 30 (5), 1271-1274 (2010).
