Summary
Um den mehrstufiger Prozess der Peritonealdialyse Verbreitung von Ovarialkarzinomen klären, die aktuelle Studie stellt eine murine experimentellen Modell der ursprünglichen Tumorentstehung und Metastasierung Peritonealdialyse über orthotoper Impfung mit diesen Tumorzellen.
Abstract
Epithelial Ovarialkarzinom (EOC) mit einer schlechten Prognose verbunden, weil es Peritonealdialyse Verbreitung zeigt. Um die Vorhersage zu verbessern, ist es wichtig, peritoneal Verbreitung zu steuern. Es ist jedoch noch unklar, wie Tumorzellen von primären Läsionen lösen und an die Mesothel befestigen. Die Einrichtung eines geeigneten Tiermodell wird benötigt , um ein Verständnis des Mechanismus der Peritonealdialyse Verbreitung in vivo zu gewinnen. In der vorliegenden Studie, führen wir den Prozess von der lokalen Injektion von EOC Zellen in die murine ovarian Oberfläche zur Entwicklung von Metastasen, einschließlich des Peritoneums und der entfernten Organen. Weibliche Nacktmäuse (Balb / c nu / nu) bei 8 Wochen alt verwendet wurden. Unter einem mikroskopischen Gesichtsfeld, EOC - Zellen (1 × 10 5 Zellen / ul Medium-extrazellulären Matrix (ECM) -basierte Hydrogel / einseitige Ovar / Maus) in murine Ovarien durch eine retroperitoneale Ansatz von der dorsalen Flanke injiziert. Dieses vorgeschlagene Verfahren ist ein less-invasive Verfahren für die Maus und minimiert Schäden an den Ovarien. Hier beschreiben wir die methodischen Schritte in der Entwicklung des ursprünglichen und des metastasierenden Tumorbildung von EOC.
Introduction
Epithelial Ovarialkarzinom (EOC) ist für die höchste Rate der durch Krebs verursachten Todesfälle bei gynäkologischen Malignomen 1. EOC ist mit einer schlechten Prognose verbunden, in erster Linie wegen seiner späten Symptomatologie und wird oft mit mehreren intraperitoneale Disseminationen und Fernmetastasen 2-4 verbunden. Peritoneal Verbreitung ist ein mehrstufiger Prozess. Erstens lösen Tumorzellen von den primären Läsionen und in die Bauchhöhle wandern. Wenn die Tumorzellen in die Bauch Mesothelium befestigen, beginnen sie Gewebe durch die Mesothel 5,6 einzudringen. Um die Tumorbiologie (zB Tumorprogression und therapeutische Reaktion), Maus - Modelle bieten eine Fülle von Informationen besser zu verstehen. A Xenotransplantat mit menschlichen Krebszellen ist für Mausmodelle, bei denen menschliche Krebszellen werden subkutan, intraperitoneal, intravenös und orthotop weit verbreitet. Ein Tiermodell mit einem orthotop grafted Tumor kann effizienter und die Ergebnisse genau zu erzeugen, das die Tumorumgebung beim Menschen im Vergleich zu einem Tiermodell mit einem heterotop gepfropft Tumor widerspiegeln. Daher ist für viele menschliche Tumore haben orthotoper Transplantationsmodellen wurden 7-11 etabliert.
Hier beschreiben wir die orthotoper Inokulation von menschlichen EOC Zellen durch einen retroperitonealen Zugang von der dorsalen Flanke, die Invasivität im Vergleich zu ventralen Impfung begrenzt ist. Diese Technik kann eine Vielzahl von nützlichen Informationen über EOC bereitzustellen, insbesondere der Mechanismus der intraperitoneale Verbreitung.
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Protocol
Das Behandlungsprotokoll folgt den Richtlinien für Tierversuche von Nagoya University angenommen.
1. Herstellung von Zellsuspensionen
- Menschliche ovarian klarzelligen Karzinom-Zelllinie.
- Pflegen ES-2 - Zellen 12 in RPMI-1640 - Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und Penicillin / Streptomycin (Penicillin 100 Einheiten / ml, Streptomycin: 0,1 mg / ml). Kulturzellen bei 37 ° C in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator.
- Sammeln Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase in 0,05% Trypsin / 0,02% EDTA-Lösung (Trypsin / EDTA).
- Entfernen Sie zuerst die alten Medien aus dem Zellkulturgefäß, dann die Zellen waschen einmal mit PBS (PBS ohne Ca 2+ / Mg 2+, 3 bis 4 ml pro 25 cm 2).
- Als Nächstes fügen Sie 1 ml pro 25 cm 2 von Trypsin / EDTA. Drehen Sie den Zellkulturgefäß die Zellschicht mit Trypsin / EDTA zu decken. Nach dem Entfernen und Trypsin / EDTA zu verwerfen, Rückkehr in die ZelleKulturgefäß in den Inkubator 3 - 5 min oder bis die Zellen abgelöst werden.
- Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, werden die Zellen von der Oberfläche der Zellkulturschale abgelöst und schwebend.
- Frisches Serum - Wachstumsmedium enthält , um das Trypsin (5 ml pro 25 cm 2) zu inaktivieren, und die Zellen erneut zu suspendieren. Übertragen resuspendierten Zellen zu einer 15 ml konischen Röhrchen.
- Zentrifuge bei 300 xg für 5 min. Führen Zentrifugierung entweder bei 4 ° C oder Raumtemperatur. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Zellen mit Wachstumsmedium (5 ml pro 25 cm 2).
- Zählen von Zellen (beispielsweise durch Trypan-Blau - Ausschluß) , dann resuspendieren in Wachstumsmedium bei einer Dichte von 2 x 10 8 Zellen / ml. Legen Sie die suspendierten Zellen auf Eis.
- Tauen gefrorenen extrazellulären Matrix (ECM) -basierte Hydrogel-Aliquots in einem Eisbad.
- Fügen Sie die Zellsuspension auf ECM-basierten Hydrogel Aliquots bei einem Verhältnis von 1: 1 (letzte Zelle cONZENTRATION: 1 x 10 5 Zellen / ul Medium-ECM-basierten Hydrogel) und gründlich mischen. Legen Sie die vorbereiteten Zellsuspensionen in einem Eisbad bis zur Verwendung.
2. Orthotopische Inokulation mit Zellsuspensionen
HINWEIS: Chirurgie keine eigene Suite benötigen. Die Operation kann in einem Bereich des Raumes auf einem Labortisch durchgeführt werden, die getrennt ist und eine minimale Aktivität. Eine laminare Haube kann ebenfalls verwendet werden. Sterile chirurgische Instrumente verwendet werden müssen und Schere sollte nicht verwendet werden, um Hautschnitte zu machen.
- Verwenden weibliche Nacktmäuse (Balb / c nu / nu) bei 8 Wochen alt für dieses orthotoper Impfung Modell.
- Zunächst betäuben die Maus mit Isofluran mit Inhalation (2-4%). Überprüfen Narkosetiefe durch einen Mangel an Rückzug auf festen Zehe Prise zu überprüfen. Nachdem die Maus betäubt, eine milde sterile Augensalbe für die Augen gelten als notwendig, um zu verhindern Trocknen.
- Legen Sie die narkotisierten Maus auf einem operating Bühne Bauchseite nach unten. Desinfizieren Sie die OP-Bereich mehrmals sowohl mit Alkohol und einem Jod-basierte oder Chlorhexidin-basierten Gestrüpp.
- Machen Sie eine ~ 2 cm lange Inzision vertikal in der Nähe der Wirbelsäule zwischen dem rechten Rippenbogen und Oberschenkelknochen. Verwenden Sie eine sterile Operationstuch um die Einschnittstelle. Befestigen Sie die eingeschnittenen Hautoberflächen mit Klammern um die Öffnung zu halten.
Hinweis: Retraktoren können anstelle von Klemmen verwendet werden. - Als nächstes wird ein zweiter Schnitt machen (ca. 1 cm) an der parietalen Peritoneum unter dem ersten Einschnitt in die Bauchhöhle zu öffnen. Klemmen Sie die eingeschnitten Bauchoberflächen. Clip das Fettgewebe, das die ipsilateral Ovar und Eileiter mit einer Klemme umgibt den Ovar aus der Bauchhöhle zu entfernen. Legen Sie das Ovar und Eileiter auf Gaze. Dann setzen Sie die Maus Bauchseite nach unten unter dem Binokular.
- Legen Sie die Zellsuspension in einer Insulinspritze (1/2 ccm, 29 G) kurz vor der Injektion. Sorgfältig injizieren, um die vorbereiteten Zellsuspension (1- 2 & mgr; l) in den Eierstöcken. Mehrere sec, behalten im Ovar die Nadel Gelierung des ECM-basierten Hydrogel zu gewährleisten. Nach dem Gelieren, bleiben die injizierten Tumorzellen innerhalb des Ovars.
- Rückkehr vorsichtig das Ovar in den Körper. Vernähen den zweiten Schnitt mit sterilen medizinischen Seide, und dann versiegeln die Haut mit Wundklammern.
- Nach der Operation werden die Mäuse eine Analgesie (beispielsweise Meloxicam, intramuskulär (im) oder subkutan (sc), 0,2 mg / kg) für eine anfängliche 24 - Stunden - Zeitraum verabreicht.
3. Post-chirurgische Behandlung
- Platzieren Sie jede Maus in einem separaten Käfig auf sauberes Papier mit einer heißen Packung mit der Maus warm zu halten, bis es genügend Bewusstsein zu halten Brustlage wiedergewonnen hat. Dann kehren die Tiere in ihre Käfige für die Aufzucht und Überwachung. Überwachen Sie die Mäuse täglich für 3 bis 7 Tage nach der chirurgischen Behandlung.
- Die Überwachung der postoperativen Mäuse
- Bei Anzeichen von Schmerzen, zu verwalten Analgetäglich SICS (zB Meloxicam, im oder sc, 0,2 mg / kg).
- Wenn Mäuse Anzeichen einer Infektion (zB, Rötung, Schwellung, Entladung), verabreichen tägliche Injektion mit einem anti-infektiösen Reagenz (zB Penicillin, im, 100.000 IU / kg).
- Entfernen Sie die Haut Verschlussmaterialien 10 bis 14 Tage nach der postoperativen Behandlung.
4. Analyse von Tumoren und Metastasen
HINWEIS: Der Tumor wird bei den injizierten Ovar 2 gebildet werden - 3 Wochen nach der Impfung.
- Opfern , um die Mäuse durch Kohlendioxid, und dann sammeln die Proben (zB Tumoren, Metastasen, Organe) 13-15 für die weitere Analyse 14,16-20.
HINWEIS: Wenn eine in vivo - Bildgebungssystem zur Verfügung steht, Enzyme tragenden Zellen , die in diesem Protokoll Biolumineszenz (zB Luciferase) oder fluoreszierendes Protein (beispielsweise GFP) produzieren verwendet werden kann. Dieses modifizierte Protokoll wird nützliche Informationen fürdie Dynamik der Ausbreitung von Krebszellen aus dem Primärtumor.
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Representative Results
Sechs nackte Mäuse hatten ihre Ovarien mit dem menschlichen klarzelligen Karzinom-Zelllinie beimpft ES-2, wie in diesem Protokoll beschrieben. Als nach 2 Wochen in 1A gezeigt ist , 5 der 6 Mäuse hatten einen Tumor im Eierstock mit ES-2 - Zellen überimpft, aber es gab in der kontralateralen Ovar kein Tumor ohne Inokulierung (als Kontrolle verwendet). Außerdem 2 der 5 Mäuse zeigten multiple peritoneal Disseminationen mit Aszites. Zellen metastasieren in die Leber (1B). Die Ovarien, die beide mit der Tumormasse an der Impfstelle und auf der Steuerseite, wurden seziert, geschnitten, gefärbt mit Hämatoxylin-Eosin (HE), und unter einem Mikroskop (2) analysiert. Eine große Anzahl von Eierstockkrebszellen wurden in dem inokulierten Ovar beobachtet, aber nicht auf der kontralateralen Seite. Die Zellmorphologie war die gleiche wie die des parentalen Tumors.
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Abbildung 1: Tumorbildung durch Orthotopische Inokulation mit Menschen Klar Cell Carcinoma Cells ES-2. A und B, die BALB / c nu / nu - Maus unterzog orthotope Inokulation mit ES-2 - Zellen. Nach 2 Wochen wurde die Maus für die Obduktion geopfert. B, metastasieren Zellen in die Leber (wie durch Pfeile angedeutet). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Hämatoxylin-Eosin - Färbung von Ovar mit Orthotopische Inokulation mit Menschen Klar Cell Carcinoma Cells ES-2. A und B, Ovar mit der Impfung von ES-2 - Zellen, gefärbt mit Hämatoxylin-Eosin (HE). Ähnliche Färbung wurde Karzinom gesehen im Vergleich zu der klarzelligenin menschlichen Eierstock. C und D, Färbung HE der Ovarien ohne Impfung als Kontrolle. Maßstabsbalken 100 & mgr; m (A, C), 20 & mgr; m (B, D). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Tiermodelle sind wichtig, die Mechanismen der Tumorentstehung, Progression, Metastasierung und Wirksamkeit von Medikamenten gegen Krebszellen zu analysieren. Mäuse menschlichen Zellen Eierstockkrebs haben Lager auch als Tiermodell verwendet. Hier beschreiben wir ein weniger invasives Verfahren zur Verabreichung von Eierstocktumorzellen in einem orthotopischen Ort. Unter Verwendung dieses Verfahrens Inokulation in den Ovarien durch einen retroperitonealen Zugang von der dorsalen Flanke bietet erhebliche Vorteile gegenüber anderen üblicherweise verwendeten Techniken. Erstens kann orthotope Inokulation effizientere und genauere Ergebnisse liefern, die die Tumorumgebung beim Menschen 13,21 reflektieren. Zweitens diese retroperitonealen Zugang von der dorsalen Flanke benötigt nur einen kleinen Dissektion (<1 - 2 cm), so ist es ein schnelles Verfahren im Vergleich zu der Bauchansatz. Daher ist dieser Ansatz weniger invasive retroperitonealen für Mäuse. Drittens ist die murine Ovar sehr klein, und so nicht in der Lage, eine große Menge von rea zu akzeptierenHerren. In diesem dargestellten Verfahren verwenden wir hochkonzentrierte Zellsuspensionen (1 x 10 5 Zellen / ul) und eine niedrige Inokulation Volumen (1 - 2 & mgr; l / Injektion) als einziger Schuss; daher minimiert es Schäden an den Ovarien. Es vermeidet auch die Leckage von beimpften Zellen aus den Ovarien. Obwohl weitere Forschung notwendig ist, kann die beschriebene murine orthotoper Impfung ein nützlicher Ansatz sein, um in der Zukunft für die Behandlung von EOC neue Therapien zu entwickeln.
Es gibt zwei kritische Punkte in diesem Protokoll. Zunächst werden die Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase verwendet. Zweitens suspendiert die Zellen mit ECM-basierten Hydrogel werden auf Eis bis zum Gebrauch gegeben. Wenn das ECM-basierten Hydrogel zu erwärmen beginnt, wird das Gelieren beginnen. Um die Gelierung des ECM-basierten Hydrogel Zellen resuspendiert mit dem ECM-basierten Hydrogel und Instrumente (beispielsweise Schläuche, Spritzen und Nadeln) vermieden werden auf Eis bis zum Gebrauch aufbewahrt. Es gibt eine Einschränkung dieser Technik.Das Injektionsvolumen der Zellsuspension weniger als 3 & mgr; l, weil die Maus Ovar nicht ein großes Volumen des Inokulums annehmen kann.
Dieses Protokoll kann in einigen Punkten modifiziert werden. Wenn ein in vivo - Bildgebungssystem zur Verfügung steht, tragenden Zellen Enzyme , die Biolumineszenz (zB Luciferase) oder fluoreszierendes Protein (beispielsweise GFP) erzeugen kann , in diesem Protokoll verwendet werden. Dieses modifizierte Protokoll wird für die Dynamik der Ausbreitung von Krebszellen aus dem Primärtumor nützliche Informationen liefern. Auch dieses Protokoll verwendet, ES-2-Zellen zur Inokulation mit Maus Ovars. ES-2-Zellen werden aus klarzelligen Karzinoms abgeleitet, und diese Zelllinie zeigt aggressives Wachstum in Nacktmaus. Andere Zelllinien (zB serösen Karzinomen) können auch anstelle von ES-2 - Zellen dieses Protokoll verwendet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren danken den Mitgliedern der Abteilung für Geburtshilfe und Gynäkologie und Krebsbiologie für ihre hilfreichen Diskussionen und technische Hilfe. Diese Studie wurde von einer japanischen Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaft (JSPS) Zuschuss-in-Aid for Scientific Research unterstützt (15K15604; H. Kajiyama).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel matrix | BD | 354234 | ECM-based hydrogel |
| Insulin syringe | TERUMO | SS-05M2913 | 1/2 cc, 29 G x 1/2" |
| Suturing needle with suture | 11 mm, 3/8, Nylon6-0 | ||
| Reflex 7 mm Wound Clip Applier | CellPoint Scientific | 204-1000 | |
| Reflex 7 mm wound clips | CellPoint Scientific | 203-1000 |
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