Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

الإثارة الخارجية من الخلايا العصبية باستخدام المجالات الكهربائية والمغناطيسية في واحدة والثقافات ثنائي الأبعاد

Published: May 7, 2017 doi: 10.3791/54357
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 3
1Laboratory of Genetics, The Salk Institute for Biological Studies, 2Department of Physics and SEAS, Harvard University, 3Department of Physics of Complex Systems, Weizmann Institute of Science

Summary

الثقافات العصبية هي نموذج جيد لدراسة تقنيات تحفيز الدماغ الناشئة عن طريق تأثيرها على الخلايا العصبية واحدة أو عدد من الخلايا العصبية. تظهر هنا طرق مختلفة لتحفيز الثقافات العصبية منقوشة من حقل كهربائي تنتج مباشرة من أقطاب حمام أو التي يسببها المجال المغناطيسي متغير الوقت.

Abstract

وهناك الخلايا العصبية النار إمكانات العمل عندما تتجاوز إمكانات الغشاء عتبة معينة. في النشاط نموذجي من الدماغ، ويحدث هذا نتيجة المدخلات الكيميائية لنقاط الاشتباك العصبي في. ومع ذلك، الخلايا العصبية ويمكن أيضا أن ولع حقل كهربائي المفروضة. على وجه الخصوص، والتطبيقات السريرية الأخيرة تنشيط الخلايا العصبية عن طريق تهيئة المجال الكهربائي خارجيا. ولذلك من مصلحة لمعرفة كيف تستجيب الخلايا العصبية إلى الميدان الخارجي وما يتسبب في إمكانات العمل. لحسن الحظ، التطبيق الدقيق ورقابة من حقل كهربائي خارجي ممكن للخلايا العصبية الجنينية التي يتم رفعه، فصلها وتزرع في الثقافات. وهذا يسمح للتحقيق في هذه المسائل في نظام تكرار للغاية.

في هذه الورقة يتم مراجعة بعض التقنيات المستخدمة لتطبيق رقابة من الحقل الكهربائي الخارجي على الثقافات العصبية. يمكن للشبكات أن تكون إما واحدة الأبعاد، نمط أي في الخطأشكال ص أو سمحت أن ينمو على متن الطائرة كلها من الركيزة، وبالتالي ثنائية الأبعاد. وعلاوة على ذلك، فإن الإثارة يمكن أن تنشأ عن طريق التطبيق المباشر لحقل كهربائي عبر الأقطاب الكهربائية مغمورة في السائل (أقطاب حمام) أو عن طريق حفز الحقل الكهربائي باستخدام إنشاء البعيد من نبضات مغناطيسية.

Introduction

التفاعل بين الخلايا العصبية والمجالات الكهربائية الخارجية له آثار الأساسية فضلا عن تلك العملية. في حين أنه من المعروف منذ زمن فولتا أن الحقل الكهربائي تطبيقها خارجيا يمكن أن تثير الأنسجة، والآليات المسؤولة عن إنتاج إمكانات العمل الناتجة في الخلايا العصبية فقط تبدأ في الآونة الأخيرة إلى أن انحلت 1، 2، 3، 4. وهذا يشمل إيجاد أجوبة على أسئلة بخصوص الآلية التي تسبب الاستقطاب من غشاء المحتملة، ودور خصائص الغشاء ومن القنوات الأيونية، وحتى المنطقة في الخلايا العصبية التي تستجيب لمجال كهربائي 2 و 5. تحفيزا عصبيا 6، 7، 8، 9 العلاجية،

قياس التفاعل داخل الجسم الحي في الدماغ يضيف عنصرا هاما لهذا الفهم، ولكن يعوقها عدم الدقة والتحكم المنخفض للقياسات داخل الجمجمة. في المقابل، القياسات في الثقافات يمكن بسهولة أن يؤديها في ارتفاع حجم بدقة عالية، إشارة ممتازة لأداء الضوضاء ودرجة عالية من استنساخ والسيطرة. باستخدام الثقافات مجموعة كبيرة ومتنوعة من خصائص الخلايا العصبية من سلوك الشبكة الجماعي يمكن توضيحها 11، 12، 13، 14، 15 و 16. وبالمثل، يتوقع هذا النظام تسيطر عليها بشكل جيد للغاية أن تكون فعالة في توضيح الآلية التي تعمل وسائل التحفيز الأخرى، على سبيل المثال كيفية قناة الافتتاح خلال التحفيز البصري في الخلايا العصبية نشطة optogenetically 17 و 18 و 19 هو المسؤول عن خلق إمكانات العمل.

هنا يتم التركيز على وصف تطوير وفهم من الأدوات التي يمكن أن تثير كفاءة الخلايا العصبية عن طريق المجال الكهربائي الخارجي. في هذه الورقة وصفنا إعداد ثنائي الأبعاد والثقافات الحصين المزخرفة ذات بعد واحد، والتحفيز باستخدام أشكال مختلفة واتجاه الحقل الكهربائي تطبيقها مباشرة من قبل أقطاب حمام، وأخيرا تحفيز ثنائية الأبعاد ونقوش الثقافات ذات بعد واحد من قبل الحقل المغناطيسي، والذي يدفع حقل كهربائي زمنية متفاوتة5 ، 20 ، 21 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

بيان األخالقيات: تم تنفيذ اإلجراءات التي تشمل التعامل مع الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية) إاكوك (لمعهد وايزمان للعلوم، والقانون اإلسرائيلي المالئم. وقد تم اعتماد معهد وايزمن من قبل جمعية لتقييم واعتماد المختبر رعاية الحيوان الدولية (ألاك). وقد وافقت لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في فايزمان هذه الدراسة، التي أجريت مع الخلايا العصبية الحصين.

1. إعداد ثنائي الأبعاد (2D) وثنائية الأبعاد (1D) الثقافات الحصين

  1. إعداد كوفرسليبس للثقافات 2D.
    1. إعداد وسط الطلاء (بيإم) تتألف من: 0.9 مل الحد الأدنى من وسائل الإعلام الأساسية (ميم) + الجيل الثالث 3G، 0.05 مل مصل العجل الجنين (فس)، 0.05 مل الحرارة المصل الحصان المعطل (هاي هس) و 1 ميكرولتر من الملحق B27. ملاحظة: ميم + 3G يحتوي على كل 500 مل من ميم × 1، 1 مل من الجنتاميسين، 5 مل من مستقر L- الجلوتامين 100X (انظر
    2. إعداد العازلة بورات تتألف من: 1.9 ز البوراكس (تيترابوريت الصوديوم ديكاهيدرات) في 200 مل مزدوج الماء المقطر (دو) (مزيج في 60 درجة مئوية) و 1.24 غ حمض البوريك في 200 مل دو. الحل النهائي المعايرة لدرجة الحموضة 8.5 باستخدام 1 M حمض الهيدروكلوريك. ملاحظة: الحل النهائي هو 400 مل 0.1 م بورات العازلة.
    3. تزج الزجاج كوفرسليبس في 65٪ حمض النتريك لمدة 2 ساعة. شطف ثلاث مرات في دو تليها ثلاثة يشطف مع كاشف التحليلي المطلق (عبس أر) الإيثانول.
    4. تمرير كل ساترة لفترة وجيزة من خلال لهب الموقد بنسن مرتين أو ثلاث مرات لمدة 1 - 2 ثانية، ومن ثم ترك لاحتضان بين عشية وضحاها في 24 لوحات جيدا مع 1 مل بولي L- يسين 0.01٪ محلول مخفف 1: 5 في العازلة بورات 0.1 م، ودرجة الحموضة 8.4). ثم شطف كوفرسليبس في دو ثلاث مرات وترك مع 1 مل بيإم لكل بئر في 37 درجة مئوية القياسية، 5٪ كو 2 حاضنة بين عشية وضحاها.
  2. إعداد كوفرسليبس ل 1 D الثقافات.
    1. تنظيف gcoverslips معشوقة عن طريق الغمر في محلول قاعدة سمكة البيرانا تتكون من 75 مل DDW، 25 مل 25٪ محلول الأمونيا و 25 مل 30٪ بيروكسيد الهيدروجين. مكان حل مع الزجاج coverslips على طبق من التدفئة في ~ 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ثم تجفيف coverslips الزجاج مع النيتروجين.
    2. coverslips معطف لأول مرة مع طبقة رقيقة من الكروم (99.999٪) من سماكة 6 Å تليها طبقة 30 Å من الذهب (99.999٪)، وذلك باستخدام إما بخار أو تفل ترسب.
      1. لتحقيق معدل الاخرق من ،05-1 A / S استخدام آلة الاخرق مع 2 الحزم الإلكترونية ونظام فراغ من 260 لتر / ثانية مع الهدف الأحجام 2 "و 4". استخدام مرحلة التناوب التي يمكن أن تذهب 0-100 طلقة في الدقيقة الواحدة (RPM). استخدام التيار المباشر (DC) تفل قوة 0-750 واتس.
      2. استخدام التناوب من 30 دورة في الدقيقة والأرجون 99.999٪ للحصول على البلازما في 10 ضغط mTorr في الغرفة.
      3. تشغيل إمدادات الطاقة من المدافع الاخرق في 40 W DC قوة تفل للالكروم، مما يؤدي إلى ~ 0.12 Å / ثانية معدل التغطية وفي 10 W DC تفل السلطة عن الذهب، مما يؤدي إلى ~ 0.28 Å / ثانية.
    3. حل 0.1 غرام 1-octadecanethiol في 100 مل ايثانول ABS AR باستخدام الموجات فوق الصوتية لمدة 30 دقيقة. وضع الكروم، الاتحاد الافريقي coverslips المغلفة لمدة 2 ساعة في هذا الحل، ثم تغسل مع AR الإيثانول ABS والجافة مع النيتروجين.
    4. يعد حل من 100 الفوسفات المالحة مل Dulbecco ومخزنة (D-PBS) و 3.5 غرام من ثلاثي كتلة البوليمر المشترك (انظر جدول المواد / الكواشف) من خلال التحريك لمدة 1-2 ساعات في 600-700 دورة في الدقيقة. ضع coverslips في حل لمدة 1 ساعة. coverslips الجافة مع النيتروجين.
    5. حفر ميكانيكيا النمط المطلوب من قبل خدش طبقة رفض الحيوي 22. القيام بذلك باستخدام راسمة القلم، حيث يتم استبدال القلم قبل إبرة الحفر. اخدش نمط من خلال طبقات معدنية للوصول إلى الزجاج الأساسي. التحكم في هذه العملية من خلال جهاز كمبيوتر لتحقيق نمط المطلوب تكرارها. أنماط تشكلها هذه العملية هي إظهار د في الشكل (2) والشكل (3).
    6. إعداد طبقة الحيوية متوافق من 100 مل D-PBS، 3.5 غرام ثلاثي كتلة البوليمر المشترك، 35.7 ميكرولتر / مل فبرونيكتين و 29 ميكرولتر / مل laminin.
      1. تعقيم coverslips في الأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقيقة على الأقل. احتضان coverslips في إعداد الحل بين عشية وضحاها الحيوية متوافق.
        ملاحظة: الطبقة الحيوية متوافق تشكل فقط حيث تم محفورا طبقة الرفض الحيوي قبالة في الخطوة السابقة.
      2. على غسل اليوم التالي coverslips مرتين مع P-DBS. احتضان coverslips في ليلة وضحاها PM. Coverslips هي الآن جاهزة للطلاء الخلية.
  3. أداء تشريح وفقا للإجراءات القياسية التي تم نشرها على نطاق واسع من قبل 23 و 24.
    1. في قصيرة، واستخراج الحصين أو قشرة من أجنة الفئران، وعادة في يوم E19، أو من الفئران، وعادة في يوم E17 23،كلاس = "كريف"> 24.
    2. فصل الخلايا أولا في حل غراء لمدة 20 - 30 دقيقة، تليها تريتشوراتيون الميكانيكية 24 مع ماصات الزجاج التي النصائح هي مصقول النار.
      ملاحظة: إذا كانت الخلايا تأتي من الفئران المعدلة وراثيا ثم الأنسجة من كل جنين ينبغي الحفاظ عليها في أنبوب بلاستيكي 1.5 مل منفصلة خلال العملية برمتها.
    3. عد الخلايا مع الأزرق التريبان قبل البذر.
      ملاحظة: بالنسبة للحيوانات المعدلة وراثيا العد ينبغي أن يتم بشكل منفصل لكل جنين.
    4. لثقافات 2D، والخلايا العصبية الماوس البذور في 750،000 والخلايا العصبية الفئران في 850،000 خلية لكل بئر. ل 1 D، البذور في 650،000 خلية لكل بئر. هزة لوحة قليلا مباشرة بعد البذر لضمان تغطية متجانسة ساترة.
  4. صيانة الثقافات العصبية.
    1. إعداد المتوسطة المتغيرة (سم) تتألف من (لكل مل): 0.9 مل ميم + 3G، 0.1 مل هاي هس، 10 ميكرولتر 5 فلورو -2'- ديوكسيوريدين (فودر) مع أوريدين 100X. </ لى>
    2. إعداد المتوسطة النهائي (FM) تتكون من (لكل مليلتر): 0.9 مل MEM + 3G و 0.1 مل مرحبا HS.
    3. استبدال PM مع 1-1.5 مل CM بعد 4 أيام في المختبر (DIV). في 6 DIV، استبدال 50٪ من CM مع CM الطازجة. في DIV 8، تغيير المتوسط ​​إلى 1.5 مل FM، يعقبه تغيير 50٪ من FM كل يوم 2. بعد حوالي أسبوع واحد يظهر النشاط متزامن من تلقاء أنفسهم.
  5. التصوير من النشاط العفوي أو طرحه عام الثقافات العصبية مع الأصباغ الفلورية.
    1. يعد حل 50 ميكروغرام الكالسيوم صبغة الفلورسنت حساسة (انظر جدول المواد / الكواشف) في 50 ميكرولتر DMSO (سلفوكسيد ثنائي ميثيل).
    2. يعد حل تسجيل خارج الخلية (EM) تحتوي على (مم) 10 HEPES، 4 بوكل، 2 CaCl 2، 1 MgCl 2، 139 كلوريد الصوديوم، و 10 D-الجلوكوز، والسكروز 45 (7.4 درجة الحموضة).
    3. احتضان ثقافة العصبية في 2 مل EM مع 8 ميكرولتر من الكالسيوم حساسة حل صبغة الفلورسنت لمدة 1 ساعة. بعيدا عن الضوء وتناوب بلطف لضمان homogenانتشار الأوس من الصبغة إلى الخلايا.
    4. استبدال حل مع EM جديدة قبل التصوير. وأظهر التصوير فلوري في الشكل (4).
    5. الصورة في مضان المجهر مع المرشحات الضوئية للتصوير مضان الكالسيوم (ذروة الإثارة في 488 نانومتر، وذروة الانبعاثات في 520 نانومتر)، وذلك باستخدام كاميرا والبرامج القادرة على قياس كثافة من أي منطقة من الفائدة (ROI) ضمن مجال الرؤية من المجهر.

2. تحفيز كهربائي الثقافات

ملاحظة: يتم عرض الإعداد الأساسي لتحفيز كهربائي في الشكل 1. يتم وضع زلة تغطية على الذي قد نمت ثقافة العصبية لمدة 14 يوما في طبق بيتري تحت المجهر مضان. وتصوير النشاط الكهربائي من الخلايا العصبية باستخدام الكالسيوم الأصباغ الحساسة في حين يتم تطبيق الجهد عن طريق اثنين من أزواج من أقطاب حمام أن يتم وضعه خارج الثقافة. هي التي تحرك الأقطاب بنسبةمولد ignal الذي يتم تضخيمه من قبل مكبر للصوت قناة الانتاج المزدوج. ويفضل السيطرة على الجهد للتحفيز على الرقابة الحالية أكثر القياسية 25 و 26 ليتم تحديد ناقلات الحقل الكهربائي مباشرة، وبالتالي تمكين واضحة بالإضافة ناقلات والجمع. هذا لا يتطلب الاختيار الدقيق للتوحيد الحقل الكهربائي، والتي يمكن أن يؤديها على عينة كاملة للقضية السيطرة على الجهد. متى يجب أن تؤخذ باستخدام الرعاية السيطرة على الجهد لتجنب أي حلقات الأرض، وينبغي التحقق منها تجانس الحقل الكهربائي (انظر 2.2 أدناه).

  1. لتحفيز كهربائي مع الحقل الكهربائي متجانسة استخدام زوج من الأسلاك الكهربائي موازية.
    1. استخدام أقطاب كهربائية مصنوعة من البلاتين مع سمك في حدود 0.005 '' (127 ميكرون). عندما تستخدم مع لل coverslips 13 ملم، تأكد من أن المسافة بين القطبين حوالي 11 ملم، ووضع القطبالصورة 1 مم فوق الثقافة.
      ملاحظة: لجعل حامل القطب (أرقام 5A و6A) استخدام تترافلوروإيثيلين (PTFE). حفر ثقوب ضيقة من خلال PTFE لإدراج الأقطاب. يجب أن يكون الجهاز أعلى من حل خارج الخلية بحيث الطرف العلوي، حيث يتعرض الأقطاب، لن يأتي في اتصال مع الحل. للعزل، استخدام الغراء الايبوكسي على أي جزء من يقود الكهربائي التي يمكن أن يتعرض لها.
    2. استخدام شكل نبض مربع مع دورة عمل 50٪، مع عدم وجود عنصر DC لتجنب التحليل الكهربائي. تختلف نبض مدة تتراوح بين 10 ميكرو ثانية و 4 مللي ثانية إلى يسبب التحفيز الفعال دون حرق الثقافة. تأكد من أن السعة هي في حدود ± 22 V (انظر الشكل 5). نبض مربع يمكن ملاحظتها على الذبذبات متصلة على التوازي لالأقطاب.
      ملاحظة: للحصول على برمجة سهلة في أي الموجي المطلوب، واستخدام برامج تحرير الموجي التجاري (انظر قائمة المواد
  2. لاختبار التجانس الميداني استخدام القطب التحقيق. استخدام شبكة لا يقل عن 1 مم × 1 مم للسماح للتحقيق في نقلها في المنطقة بين الأقطاب وقياس القدرة الكهربائية.
    1. قياس القدرات الكهربائية. استعمال المعادلة 1 لحساب المجال الكهربائي. استخدام واحد من الأقطاب كقطب مرجعي. قياس المجال الكهربائي مع فترات نبض متفاوتة بين 100 μs إلى 4 مللي ثانية (انظر الشكل 5B لمثال 100 μs مدة النبض) للتحقق من أن الحقل متجانسة ضمن مجموعة من فترات تحفيز.
      ملاحظة: انظر الشكل 5D لمثال تجانس المجال الكهربائي المقيس عندما كانت مدة النبضة 1 مللي ثانية.
  3. استخدام 2 أزواج عمودي من أقطاب حمام لإنتاج أكثر تعقيدا أشكال المجال الكهربائي، وإلىتكون قادرة على توجيه المجال في اتجاهات مختلفة (انظر الشكل 6B). الجهاز مع 2 أزواج من الأقطاب الكهربائية سيتم استخدامها، وسيتم لاحظ إشارة على كل زوج من الأقطاب الكهربائية على اثنين من الذبذبات منفصلة.
    1. ضع الأقطاب 1 مم فوق الثقافة وعلى مسافة من 10-11 ملم من بعضها البعض. تأكد من أن كلا الزوجين القطب تطفو (لا علاقة الأرض)، وليس لديهم أي أرضية مشتركة من خلال قياس المقاومة بين أي مجموعة من الأقطاب الكهربائية والتأكد من عدم وجود الدارات القصيرة بين أي من الأقطاب الكهربائية. التحقق من أن جميع المعدات المستخدمة، وهذا مرتبط إلى الأقطاب (مثل الذبذبات، ومكبرات الصوت، ومولدات إشارة، وما إلى ذلك) يعوم فيما يتعلق أرض الواقع من خلال التأكد من أن جميع المعدات يعوم وأن أيا من أقطاب المرجعية لمس أي معدات على الارض.
    2. لتغيير اتجاه المجال، تختلف السعة من الجهد لتغذية أزواج القطب مع اثنين من الدقةpect لبعضها البعض (انظر الشكل 7A). على سبيل المثال، ل0 درجة استخدام ± 22 V على الزوج الكهربائي التي هي عمودي على نمط و0 V لالقطب الآخر. 45 °، استخدم ± 15.6 V على كل زوج من الأقطاب الكهربائية مع عدم وجود مرحلة متخلفة، مقابل مبلغ ناقلات سعة 15.6 2 +15.6 2 = 22 2.
    3. لتطبيق حقل الدورية استخدام الموجي واحد من نبض الجهد شرط والموجي واحد من نبض جيب التمام الجهد لاثنين من أزواج من الأقطاب الكهربائية لإنتاج السعة ثابتة الدورية الحقل الكهربائي (انظر الشكل 6B).
      ملاحظة: كما يمكن أن ينظر إليها في الشكل 6B، عند استخدام دورة واحدة من موجة جيبية مع ± 22 V في القطب واحد ودورة واحدة من موجة جيب التمام مع ± 22 V في القطب الآخر، ومجموع ناقلات هو الحقل الكهربائي بالتناوب مع مدة دورة نفس الجيب وجيب التمام الموجات، ومع اتساع ± 22 V.
  4. لقياس وحساب كرونaxie وقرارة التيار من المحاور في ثقافة العصبية مقابل التشعبات في نفس الثقافة بتنفيذ الخطوات التالية.
    1. استخدام الكالسيوم صبغة الفلورسنت حساس للتصوير الكالسيوم كما هو موضح في جدول المواد / الكواشف وفي 1.5) مع ثقافة 1D على نمط رقيقة (170 ميكرون)، طويلة (10 مم) خطوط. سيتم تطبيق الكالسيوم صبغة حساسة للثقافة، وحضنت لمدة 45 دقيقة. سيتم غسل الصبغة عن طريق استبدال بمحلول تسجيل جديد.
    2. افصل الشبكة لتحقيق الإحصاءات السكانية للاستجابة مباشرة لالتحفيز الكهربائي، من دون تأثير من انتقال متشابك. للقيام بذلك، وتطبيق مجموعة من 40 ميكرومتر من bicuculline، الذي يمنع العمل المثبطة من أشعة غاما الغاما حمض-A (GABA A) المستقبلات، 10 ميكرومتر من 6 cyano-7-nitroquinoxaline-2،3-ديون (CNQX) ، لمنع α-الأمينية-3-هيدروكسي-5-ميثيل-4-isoxazolepropionic (أمبا) ومستقبلات kainate و 20 ميكرومتر (2R) -amino-5-phosphonovaleحمض ريك (APV)، الذي يمنع N-ميثيل-D اسبارتاتي (NMDA) مستقبلات. سيتم إضافة حاصرات إلى حل التسجيل.
    3. تطبيق نبض مربع كما هو موضح في 2.1 و 2.3 مع اختلاف فترات الزمنية بين 100 ميكرو ثانية و 4 مللي ثانية. إشارة يمكن ملاحظتها على الذبذبات.
    4. استخدام المجهر مضان مع برنامج الحصول على الصور (انظر 1.5) لمراقبة كثافة العابرين الكالسيوم في العديد رويس، تحتوي كل منها على بضعة مئات من الخلايا العصبية. الحصول على صور باستخدام كاميرا EMCCD الحساسة (انظر قائمة المواد)، قادرة على معدل الحصول على الصور لا يقل عن 20 لقطة في الثانية. التغير في شدة الضوء يتناسب مع كمية الخلايا العصبية التي تحفز. تقدير جزء من الخلايا العصبية حفز باستخدام التغير النسبي في كثافة.
    5. لكل مدة النبضة (100 ميكرو ثانية إلى 4 مللي ثانية)، وتغيير السعة من الجهد المطبق على الأقطاب بدءا من الجهد حيث يعتبر أي تغيير في كثافة (بضعة فولت)، إلى thالجهد ه حيث التغيرات في شدة بسبب الجهد التطبيقي والمشبعة (حتى ± 22 V).
      ملاحظة: سيتم توزيع تغير كثافة بوصفها جاوس 5 التراكمي فيما يتعلق الجهد التطبيقية لتحفيز لكل المدة الزمنية للنبض الجهد.
    6. تناسب توزيع جاوس التراكمي لشدة مقابل الجهد المطبق على كل مدة واستخراج المتوسط ​​الضبابي من هذا مناسبا.
      ملاحظة: هذا يعني هو الجهد التمثيلي التي وردت في الخلايا العصبية.
    7. في نهاية هذه العملية الحصول على كل مدة التحفيز وسيلة الجهد الذي استجابت الخلايا العصبية. استخدام هذه الأزواج من المدد والقوة لرسم منحنيات القوة المدة (انظر الشكل 7).

3. تحفيز المغناطيسي الثقافات

ملاحظة: يتم عرض الإعداد الأساسي لتحفيز المغناطيسي في الشكل 2. في أعلى اليمين هو مبينالمجهر مضان مقلوب التي تستخدم لالأصباغ الحساسة صورة الكالسيوم في الخلايا العصبية. لفائف المغناطيسي (الدوائر الزرقاء) يتم وضع حوالي 5 ملم بتكثف فوق ثقافة حلقة العصبية، (المخطط الأزرق). لفائف صغيرة (الدائرة الحمراء) على محيط طبق بيتري تراقب التيار الكهربائي الناجم عن النبض المغناطيسي. في أعلى يسار يظهر ديناميات قياس لفائف مشجعا المغناطيسي (MS) مع حمولة مكثف الجهد من 5000 كيلو فولت، كجزء لا يتجزأ من لفائف صغيرة. وصفت الحقل الكهربائي الناجم (يحسب لدائرة نصف قطرها حلقة من 14 ملم) باللون الأخضر في حين وصفت الحقل المغناطيسي للأرض في الزرقاء. في الجزء السفلي وتظهر الصور من ثقافة العصبية. في الجزء السفلي الأيسر هو صورة حقل مشرق من منقوشة ساترة 24 ملم. المناطق البيضاء هي الخلايا العصبية. ويتكون نمط تصويرها الثقافات حلقة متحدة المركز مع أنصاف أقطار مختلفة. في أسفل اليمين هو التكبير على قطعة قصيرة من الحلقات، والتي تبين الخلايا العصبية الفردية. لنطاق، دور المرأة في التنمية حلقات "عشر حوالي 200 ميكرون.

  1. تنمو الخلايا العصبية في نمط حلقة دائرية (محفورا كما هو موضح في 1.2.5) لتحفيز ثقافة 1D. استخدام الكالسيوم صبغة الفلورسنت حساس للتصوير الكالسيوم (كما هو موضح في القسم 1.5) مع ثقافة 1D على نمط رقيقة (170 ميكرون)، طويلة (10 مم) خطوط.
    1. استخدام لفائف مغناطيسية دائرية ووضع طبق بتري حوالي 5 ملم أدناه ومتحدة مع الملف. استخدام لفائف عادة ما يقرب من 30 ملم (القطر الداخلي، وقطره الخارجي 46 ملم) لفائف مع الحث من L = 90 MH يقودها MS محلية الصنع أو تجارية محملة الجهد القصوى من 5 كيلو فولت.
    2. تصريف الجهد العالي والحالي من خلال لفائف إجراء باستخدام مفتاح عالية الحالية عالية الجهد لتحفيز مغناطيسيا الثقافات العصبية. منشط المغناطيسي (MS) يمكن أن يبنى كما هو موضح في 21 باستخدام المكثفات الكبيرة، بناء على أمر من 100 MF، للحصول على الجهد العالي من 1-5 كيلو فولت. بدلا من ذلك استخدام تجاريامتاح مس (انظر جدول المواد / الكواشف ).
      ملاحظة: استخدام الأسلاك النحاسية المستطيلة البوليستر المغلفة بسمك 0.254 مم و 6.35 مم لتفريق لفائف محلية الصنع 21 . تحويل الأسلاك على إطارات حسب الطلب، معزول مع الألياف الزجاجية ويلقي في الايبوكسي (انظر جدول المواد / الكواشف ). بدلا من ذلك استخدام لفائف المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد / الكواشف ).
  2. استخدام الدوارة المجالات المغناطيسية لتحفيز الثقافات 2D.
  3. الآن، استخدم المجالات المغناطيسية الدورية لتحفيز الثقافات 2D. النار تمس مع عدم وجود ثقافة في الطبق، في شدة مختلفة، لإظهار الارتباط الخطي للقراءة لفائف مع شدة.
  4. المقبل، في حين تسجيل العابرين الكالسيوم مع ثقافة الخلايا العصبية، بدء اطلاق تمس في زيادة كثافة أثناء تسجيل كل من العابرين الكالسيوم والملف. في البداية، لاحظت رشقات شبكة كما العابرين الكالسيوم كبيرة، شويونيتبول لا يتزامن مع التقاط المسامير لفائف TMS. الاستمرار في زيادة كثافة، في مرحلة ما، يبدأ العابرين الكالسيوم لتصبح متزامنة مع ارتفاع TMS. بدلا من ذلك، أو بالإضافة، بعد تحقيق استجابة متزامنة، تبدأ خفض شدة حتى يتم إلغاء التزامن، لتحديد عتبة TMS.
    ملاحظة: يجب أن تكون شروط الحفاظ ثابتة بدقة لكل من الاجهزة، وذلك باستخدام حجم المحدد في كل مرة، ونفس السفن ومواقف لفائف الدقيق والتوجهات.
    1. جبل لفائف صغيرة على قاعدة الطبق تسجيل بحيث يكون في طائرة وبالتوازي مع ثقافة العصبية وفي وضع ثابت فيما يتعلق الثقافة.
      ملاحظة: هذا يضمن أن اعتماد المواقع من لفائف صغيرة فيما يتعلق المغناطيس هو وفيا لموقف الثقافة وأن أي تباينات في تحديد المواقع ستكون يذكر على قراءات بيك اب لفائف.
      1. استخدام ملفين المستقلة التي هيوضع عمودي على بعضها البعض (الشكل 8B) لإنشاء الدورية المجال الكهربائي المغناطيسي والتي يسببها. ربط كل ملف إلى MS الخاصة. تأكد من أن التحفيز والتشجيع تصريف تيارات مماثلة في تأخر مرحلة 90 درجة (الشكل 10A)، مما أدى إلى الحقل المغناطيسي بالتناوب الذي يمسح 270 درجة من الفضاء الحقيقي في حقل الحد الأقصى ل~ 270 V / م (الشكل 10B).
      2. ضع ثقافة العصبية داخل وعاء زجاجي كروية مليئة حل تسجيل خارجي (EM).
      3. مراقبة التحفيز (التغير في كثافة مضان من الخلايا العصبية) مع الكاميرا كما هو موضح في الخطوة 2.4.4.
      4. في حالة لفائف عبر (الشكل 8B)، ضع بالتوازي بيك اب لفائف وعلى مسافة محددة دون ثقافة العصبية. بعناية الحفاظ على هذا التكوين في جميع أنحاء التجارب.
  5. حساب تحليلي الحقل الكهربائي لconfigura 1D( E ماكس = k 1 بر) حيث E ماكس هو السعة القصوى للمجال الكهربائي المستحث، ويتم توجيهه على طول المماس للحلقات ذات نصف القطر r . B هو اتساع نبض المغناطيسي و ك 1 هو ثابت التناسب الأبعاد التي يمكن قياسها باستخدام لفائف صغيرة ( الشكل 8A ).
  6. استخدام حزمة المحاكاة العددية (انظر قائمة المواد) لمحاكاة العددي المجال الكهربائي 21 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بروتوكول المعروضة يسمح للالزخرفة سهلة من الثقافات العصبية. عندما يتم دمجها مع العديد من الطرق التي قمنا بتطويرها لتحفيز، فإنه تمكن من إجراء قياسات بعض خصائص الخلايا العصبية الذاتية مثل الزمنة وقرارة التيار 5، مقارنة خصائص الخلايا العصبية السليمة والمريضة 27، لإيجاد السبل المثلى لتحفيز الثقافات بوصفها وظيفة من هيكلها والعديد من النهج الرواية. يتم عرض بعض الأمثلة في الأرقام التالية.

ويبين الشكل 3 1D نمط التكوينات التي حفرت في الطبقة الرفض الحيوي. وعادة ما يتم نقش خطوط رقيقة من حوالي 170 ميكرون العرض التي يمكن، على سبيل المثال، تكون حلقات متحدة المركز مع اختلاف نصف قطر (الشكل 3A) أو خطوط متوازية، وعادة ~ 11 مم لونغ (الشكل 3B).

نت "فو: كيب-together.within-بادج =" 1 "> تظهر اللوحة العلوية من الشكل 4 صورة نموذجية لنشاط الفلورسنت في الثقافة، التي تم التقاطها باستخدام جهاز مشحون بالرسوم (كسد)، وتعرض صورة من فلوريسنتلي المسمى الخلايا العصبية في ثقافة 2D. في هذا المثال يتم عرض ثلاثة روي مختلفة، ملحوظ باللون الأسود والأخضر والأحمر.تظهر آثار كثافة مضان المتكاملة في اللوحة السفلية من الشكل 4 ، ويقاس في هذه الثلاثة روي مختلفة (آثار هي في اللون المقابل من عوائد الاستثمار) .و كما تظهر أقحم، في غضون 200 مللي ثانية من زمن اكتساب الإطار الذي تم أخذ هذه البيانات معينة، جميع الخلايا العصبية في ثلاثة روي مختلفة انفجر في وقت واحد.

ويظهر الجهاز الأساسي المستخدمة للتحفيز من قبل أحادية الاتجاه، المجال الكهربائي المستمر في الشكل 5A . الأسلاك مغمورة في وسط التسجيل، حوالي 1 ملم فوق ثقافة الخلايا العصبية.ويظهر على شكل نبض الأساسية المستخدمة في التحفيز الكهربائي في الشكل 5B. عندما يتم تطبيق هذا الجهد نبض يخلق حقل كهربائي ثابت أن تقلب التوجه من خلال 180 درجة بعد نصف دورة. يستخدم هذا التغيير في الاتجاه الملعب بعد نصف دورة لتجنب التحليل الكهربائي والأضرار التي لحقت الأقطاب. الفولتية نموذجية تطبق على الأقطاب هي ± 22 V، ومدة النبضة نموذجية لتحفيز الثقافات 2D هي في حدود 100-500 ميكرو ثانية.

للسيطرة على أي تباين في نمو neurites التي، تحققنا من التحفيز من الثقافات 2D موحد الخواص. بواسطة يدويا الدورية الأقطاب في كل درجة 360 في 15 درجة قرار (الشكل 5C) يتضح أن ليس هناك تفضيل التوجه للتحفيز. كل لون في الشكل 5C يمثل تحفيز ثقافة مختلفة. المسافة من أصل تمثل الحد الأدنى من دوالتموينية اللازمة لتحفيز مع السعة ثابتة. ومن الواضح أنه من أجل تقريب جيد والثقافات 2D لم يكن لديك التوجه المفضل للتحفيز الكهربائي.

منذ زوج واحد من الأقطاب الكهربائية يقتصر في وجود اتجاه واحد يعرف لحقل (على الرغم من أنه يمكن أن انقلبت)، قمنا بتطوير جهاز لتحفيز كهربائي مع اثنين من أزواج من الأقطاب الكهربائية (الشكل 6A). رسم تخطيطي للثقافة (خلفية دائرية رمادية، والبقع الداكنة هي أجسام الخلايا) ومن الأقطاب الكهربائية (خطوط سميكة الموازية) في الشكل 6B. عندما الطول الموجي، كما هو موضح إدراج الأزرق والأخضر في الشكل 6B، وجيب التمام وموجات الجيب وتطبق معا ثم يتم إنتاج الدورية حقل شعاعي E. عندما تكون نبضات الجهد مربع، لديها سعة مختلفة والصفر مرحلة متخلفة بينهما بعد ذلك إنشاء حقل مستمر مع الاتجاه المطلوب الذي تحدده صالسعة elative بين اثنين من أزواج من الأقطاب الكهربائية. هذا التناوب الكهربائي تحسنا واضحا على دليل التناوب، والميكانيكية التي تم استخدامها للحصول على التوزيع الزاوي من نقاط القوة التحفيز في الشكل 5C. بطبيعة الحال، كما يبين الشكل 6C، فمن الممكن أيضا استخدام هذا التكوين لإثارة واحد فقط اتجاه ثابت، ويحتمل أن تحكم، من خلال تفعيل زوج واحد فقط من الأقطاب الكهربائية.

واستخدمت هذه التكوينات لإثارة 2D الثقافات العصبية مع أي حقل الدورية أو حقل زاوية ثابتة، مع نفس الجذر يعني مربع (RMS) الجهد ومن ثم مقارنة مدة النبضة حاجة لإثارة ثقافة عندما يتم إصلاح السعة. لقد وجدنا أنه عند استخدام حقل كهربائي بالتناوب مع السعة ثابتة من ± 22 V، ومتوسط ​​مدة 150 ± 14 ميكرو ثانية كانت هناك حاجة لتحقيق التحفيز، بينما مع اتجاه المجال الكهربائي واحد في المتوسط ​​مدة هناك حاجة 290 ± 30 ميكرو ثانية. ول0.53 ± 0.02 النسبة بين المدد اللازمة لإثارة الثقافة مع الدورية مقابل حقل الزاوية الثابتة هو.

منذ ذلك الحين في ثقافة 2D المحاور تمتد في كل الاتجاهات، الحقل الدورية قادر على إثارة العديد من المحاور. في المقابل، مع مجال توجيه واحد هناك محاور عدة الوحيدة الموجهة في هذه الزاوية محددة ولم يتحقق الإثارة محور عصبي. عندما يتم زيادة المدة، وهناك إمكانية أجزاء أخرى مثيرة من الخلايا العصبية أيضا، ولا سيما التشعبات. ويفسر هذا أيضا أدناه في وصف القياسات الزمنة. حقيقة أن هناك حاجة إلى فترات أقصر من ذلك بكثير لإثارة نفس الثقافة عند استخدام حقل الدورية له أهمية عالية عند استخدام الحقول الخارجية لتحفيز المخ، لأن هناك قيود في كثير من الأحيان التقنية على فترات النبض.

يبدأ -page = "1"> وهناك نقطة مهمة هي أنه في شبكة متصلة (لا حاصرات متشابك تطبيقها) الإثارة من قبل نسبة صغيرة من الخلايا العصبية التي تثير ثم بقية الشبكة عن طريق الاتصالات المشبكية. وهذا يعني أن عدد قليل من الخلايا العصبية تسيطر على القياس. للحصول على قياسات متكررة وكمية من الضروري مراقبة الإحصاءات السكانية الكاملة في الشبكة، والتي تم قطع باستخدام حاصرات متشابك. وسيتم عرض الخطط لتكوين المستخدمة لرصد استجابة السكان خلال الإثارات محور عصبي مقابل تلك الجذعية في الشكل 7. في الشكل 7A يتم تحفيز شبكة قطع 1D مع الحقل الكهربائي إما على طول الخط للثقافة (في 0 درجة لتحفيز محور عصبي) أو عمودي على خط الثقافة (عند 90 درجة لتحفيز شجيري) من قبل اثنين من أزواج من الأقطاب الكهربائية. كما يتم زيادة الجهد، وسيتم حفز المزيد من الخلايا العصبية، وهذا ينعكس من الانفلونزاكثافة orescence، الذي يتناسب مع عدد من الخلايا العصبية حفز (انظر الشكل 7B). تستخدم زيادة سعة الجهد لتحفيز تدريجيا ثقافة بأكملها. كل الخلايا العصبية لديها الحد الأدنى من عتبة الجهد (لمدة النبضة محددة) أنه سوف نرد، وقانون الأعداد الكبيرة، ومن المتوقع أن يكون التمويه توزيع هذه العتبات. لذلك، إذا نظرنا إلى عدد من الخلايا العصبية التي استجابت ومؤامرة ضد الجهد المطبق، فإن التوزيع يكون توزيع جاوس التراكمي، وهي وظيفة خطأ (ERF) 5. عدد الخلايا العصبية التي تستجيب لسعة محددة من الحقل الكهربائي لديها ما يقرب من توزيع جاوس، وبالتالي فإن مضان يوصف بشكل جيد من قبل لا يتجزأ لها - وظيفة خطأ من اتساع مجال تحفيز (الشكل 7C).

يستخدم الشكل 7C إلى البريدxtract معلمة واحدة، وتوقع (يعني) للتوزيع. ويتم ذلك عن طريق تركيب توزيع جاوس التراكمي والحصول على أفضل مناسبا. هذا التوقع هو الجهد التطبيقية التي 50٪ من الخلايا سوف تستجيب. يتم تكرار هذه العملية لعدة فترات النبض (تتراوح بين 100 ميكروثانية إلى 4 مللي ثانية). يتم رسم متوسط ​​الجهد الذي ردت الثقافة مقابل مدة النبضة للحصول على منحنى القوة المدة. أجريت على مجموعتين من القياسات. في البداية كان مجال مواز للنمط، وفي الثانية كان عمودي على ذلك. ولقد ثبت سابقا 15 و 23 أن محاور تتماشى مع نمط، في حين تنمو التشعبات في كل الاتجاهات. وهذا يعطي مختلفين منحنيات القوة المدة، التي هي مفيدة جدا للحصول على فرق واضح بين محور عصبي والإثارة الجذعية. ويتم تحقيق الفصل الكامل للمساهمات شجيري ومحور عصبي من المعروف أن محور عصبيآل ثابت الوقت للإثارة هو أقصر بكثير من تلك الجذعية 2 ، 3 ، 4 .

منحنيات القوة المدة هي ثم يصلح لمعادلة تسوس كروناكسي المعادلة 2 ، حيث V ر هو الجهد ريوباس و C هو كروناكسي. في فترات النبضة من t <1ms هو المحاور التي هي متحمس أولا وتسبب الخلايا العصبية لاطلاق النار، وجود قيمة أقل للجهد الإثارة في منحنى القوة-المدة. تم حساب أكسون كروناكسي ليكون 110 μs. على النقيض من ذلك، لالإثارة على فترات طويلة (ر> 1 مس) المقصورة الجذعية هو مصدر الإثارة للخلايا العصبية مع كروناكسي التشجيري المحسوبة في 900 μs.

المبادئ الكامنة وراء تحفيز 2D و 1D الثقافات مع الدوائرموصوفة لفائف cular في الشكل 8. للحصول على فهم أفضل للوضع المادي، ويتم إنتاج المحاكاة العددية من الحقول الكهربائية والمغناطيسية التي يسببها استخدام حزمة COMSOL. لتحفيز الثقافات 1D يستخدم لفائف مغناطيسية دائرية المتمركزة بتكثف فوق طبق بيتري. تزرع الخلايا العصبية في حلقات دائرية على ساترة الجولة التي يتم وضعها داخل طبق بيتري للتسجيل. في هذه الحالة يمكن حساب الحقل الكهربائي الناجم عن التحليلية وتساوي E الحد الأقصى = ك 1 برازيلي، حيث E max غير أقصى اتساع المجال الكهربائي الناجم عن وتوجه على طول المماس من الحلقات مع دائرة نصف قطرها ص. B هو اتساع النبض المغناطيسي وك 1 هو ثابت التناسب الأبعاد التي يمكن قياسها باستخدام لفائف صغيرة.

حساب COMSOL العددي للمجال المغناطيسي جreated بواسطة لفائف في الثقافة 1D يظهر في اللوحة العلوية في الشكل 8A (يبسط الحمراء). في لوحة أسفل الشكل 8A يتم تقديم الحساب للحقل الكهربائي المستحث. ويرد تحفيز ثقافة 2D مع تكوين لفائف عبرت في الشكل 8B. لتحفيز الثقافات 2D كانت تستخدم لفائف عبر أن تنتج الدورية المجالات المغناطيسية المتمركزة مع ثقافة العصبية 2D داخله، وضعت في وعاء زجاجي كروية مليء المتوسطة تسجيل (EM). في هذه الحالة لم يعد من الممكن حساب الحقل الكهربائي الناجم عن التحليلية. وصفت لفائف الصليب في أعلى لوحة من الشكل 8B، مع الحاوية كروية وضعت داخل اثنين من لفائف وساترة الزجاج دعم ثقافة 2D وضعت في قاع الإناء. على نطاق والقطر الداخلي للفائف الداخلي هو 65mm و. وأظهرت المحاكاة العددية باستخدام COMSOL مع ايدي نموذج التيارات 3D في لوحة أسفل،تصوير المجال الكهربائي يتسبب في السطح الداخلي للحاوية كروية. ويظهر صورة مجهر حقل مشرق من الزجاج ساترة مع الثقافات العصبية 1D المعتادة المستخدمة في التحفيز في الشكل 8C. خطوط بيضاء تظهر الخلايا العصبية على الخطوط المنقوشة، والتي هي موجهة على حد سواء بشكل عرضي وشعاعيا للمقارنة التجريبية والضابطة على أثر الاتجاهية.

هندسة ثقافة 1D تلعب دورا كبيرا في تحديد ما إذا كانت الثقافة والنار ردا على التحفيز المغناطيسي. وردت 22٪ فقط من الثقافات حلقة 1D لتحفيز المغناطيسي. تعتمد نسبة الإثارة الناجح بقوة على طول خطي الثقافة، وكما يبين الشكل 9A، وأكثر من 60٪ من الثقافات التي تكون أطول من 80mm والاستجابة لتحفيز المغناطيسي. وهذا يعني أن الشروط الخاصة ضرورية للاستجابة المغناطيسية. للتحقيق في هذه الثقافات الاعتماد هندسية ثنمت في التكوينات التي هي أجزاء من حلقات - وجود نصف قطرها نفسه ولكن أطوال مختلفة عن طريق الزخرفة عليها على أقواس وليس على الدوائر كاملة (انظر الشكل 8C )

ويرد التحقيق الشامل للعتبات المجال المغناطيسي بوصفها وظيفة من دائرة نصف قطرها من الثقافات حلقة 1D في الشكل 9B . الدوائر البيضاء تمثل قياسات تجريبية من عتبات التحفيز، في حين أن الترميز اللون يدل على احتمال محسوب لقياس عتبة الإثارة. يتم تعريف عتبة التحفيز على أنها أضعف مجال لا يزال يثير استجابة لثقافة الخلايا العصبية معين.

الشكل 9B يؤكد الاتجاه أن حلقات أكبر لديها عتبات التحفيز أقل، مع وجود علاقة عكسية واضحة بين دائرة نصف قطرها من الحلقات وعتبة التحفيز. على سبيل المثال، متوسط ​​حلقة 14 ملم يستجيب إلى ماغنيالبقول ETIC مع سعة 1.5 T في حين أن متوسط ​​حلقة 7 ملم يستجيب فقط إلى 3 T أو أكثر. ومن المتوقع هذا من الحساب النظري للمجال الكهربائي التي يسببها، والتي وصفت باعتبارها ونا مميزا توقع احتمال لاطلاق النار. وبالفعل، فإن المجال الكهربائي الناجم عن 3T في دائرة نصف قطرها 7MM يساوي التي يسببها 1.5 T في ضعف نصف قطر. وباختصار، فإن متوسط عتبة الحقل الكهربائي هو 301 ± 128 (الانحراف المعياري) V / م، مستقل عن دائرة نصف قطرها من الثقافات الحلبة.

وعلى النقيض من لفائف دائري واحد، والتي لا يمكن أن تبدي استجابة في الثقافات 2D، 15 من 30 2D الثقافات التي تحفزها الدورية التحفيز المغناطيسي المجال ردوا انفجار الإثارة العصبية. لفائف مستقلة اللذين يتم وضع عمودي على بعضها البعض (الشكل 8B) تولد الدورية المجالات الكهربائية والمغناطيسية التي يسببها. يتم توصيل كل ملف إلى MS الخاصة به، وكلاهما ديشالدو تيارات مماثلة في تأخر مرحلة 90 درجة. يتم رسم اتساع المجال الكهربائي الناجم عن كل من لفائف اثنين في تكوين لفائف عبر في الشكل 10A، ويتم تمثيل نفس آثار في الشكل 10B قبل التمثيل القطبي لاتجاه واتساع المجال الكهربائي فرضه كل من لفائف . المجال الكهربائي الناجم الناتجة بفحص 270 درجة من الفضاء الحقيقي في حقل الحد الأقصى ل~ 270 V / م.

شكل 1
الشكل 1: رسم تخطيطي لإعداد المستخدمة لتحفيز الكهربائية الثقافات العصبية. ويتم إنتاج الإشارة المطلوبة من قبل مولد إشارة مع اثنين من النواتج التي ليس لها أرضية مشتركة. وتتضخم هذه الإشارات لتعطي انتاج التيار الكهربائي لمدة تصل إلى ± 30 V. ثم يتم تغذية الإشارات الكهربائية من خلال اثنين من أزواج منفصلة من الأقطاب الكهربائية، وتحفيز ثقافة العصبية في TWس متعامد والاتجاهات مستقلة. تحفيز الخلايا العصبية يمكن أن ينظر إليها ومراقبتها من قبل الأصباغ الكالسيوم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: رسم تخطيطي لإعداد المستخدمة لتحفيز المغناطيسي الثقافات العصبية. A. في أعلى يظهر لفائف المغناطيسي (الدوائر الزرقاء)، والذي يقع على بعد 5 مم بتكثف فوق ثقافة حلقة العصبية، وضعت في طبق بتري (المخطط الأزرق). لفائف صغيرة (الدائرة الحمراء) وضعه على محيط طبق بيتري يقيس الجهد الناجم عن النبض المغناطيسي. في أسفل يظهر ديناميات قياس لفائف مشجعا المغناطيسي (باستخدام تحميل مكثف الجهد MS من 5000 كيلو فولت)، ومتكاملة من لفائف صغيرة. التي يسببها الحقل الكهربائي (calculatوصفت اد لدائرة نصف قطرها حلقة من 14 ملم) باللون الأخضر في حين وصفت الحقل المغناطيسي للأرض في الزرقاء B. إن الصور مجهر مقلوب فلوري الأصباغ حساسة للالعابرين الكالسيوم من الخلايا العصبية ردا على نبضات مغناطيسية. C. الخلايا العصبية المزروعة في وجود نمط من حلقات متحدة المركز، وتستخدم لتحفيز فعالة من قبل مشجعا المغناطيسي الحلبة. D. صورة مجهر حقل مشرق من الخلايا العصبية نمت على سطر واحد من النمط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): أمثلة من أنماط الثقافات 1D العصبية تستخدم لتوجيه المجال الكهربائي مع اتجاه محور عصبي النمو. يستخدم ألف نمط دائري لفائف مغناطيسية دائرية، وعندما ايلى التي يسببها الحقل ctric لديه التوجه دائري. وتستخدم أنماط B. الخط عندما يكون الحقل الكهربائي الناجم أو مباشرة توجه واحد.

الشكل (4)
الشكل 4: مثال على آثار العابرون الكالسيوم تصويرها خلال متزامن رشقات نارية الشبكة. A. صورة من الخلايا العصبية التي كانت مصبوغة سابقة على التجربة مع صبغة الكالسيوم. B. يتتبع كثافة مقابل وقت رويس في A مع لون التتبع يمثل لون الحدود من العائد على الاستثمار في A. زيادة كبيرة في كثافة متزامنة داخل رويس ثلاث يمثل انفجار الشبكة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

54357fig5.jpg "/>
الشكل 5: الإعداد الأساسي للتحفيز الكهربائي، وذلك باستخدام زوج واحد من أقطاب حمام موازية لتحديد أن الثقافات 2D ليس لديهم التوجيه المفضل لتحفيز كهربائي. ألف جهاز يستخدم لتحفيز الثقافة. وينتج الحقل الكهربائي من خلال تطبيق الجهد لأقطاب سلك البلاتين. المسافة بين السلكين هي 13 ملم. B. مثال على إشارة الجهد ليتم تطبيقها على الأقطاب في A. شكل ثنائي القطب من نبض يساعد على منع الكهربائي من الحل تسجيل في الأقطاب. C. عندما تحفيز ثقافة 2D في دورات مختلفة من الأقطاب، وهناك توحد الخواص للاستجابة الخلايا العصبية. D. مثال على قياس الحقل الكهربائي باستخدام المسبار هو موضح في الخطوة 2.2. المجال الكهربائي هو موحد لخطأ تصل إلى 10٪. تم تعديل هذا الرقم من 5.أوبلود / 54357 / 54357fig5large.jpg "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6
الشكل 6: التحفيز الكهربائي مع اثنين من أزواج من الأقطاب يسمح لدوران المجال الكهربائي والتحفيز في أي زاوية المطلوب. A. لإنتاج أكثر تعقيدا الأشكال من المجال الكهربائي، وهناك حاجة اثنين من أزواج القطب مستقل. B. تطبيق نبض الجهد على شكل جيب التمام إلى القطب واحد ونبضة جيبية إلى القطب الثاني يخلق الحقل الكهربائي الدورية مع السعة المستمرة. ج. تطبيق نبض الجهد مربع إلى زوج واحد من الأقطاب يخلق مجال كهربائي موحد أحادي الاتجاه. تم تعديل هذا الرقم من 5 . يرجى كلإك هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7
الرقم 7: انقطاع الشبكة عن طريق عرقلة ومتشابك المدخلات (كما هو موضح في 2.4.2) تمكن المراقبة من إجمالي السكان من خلايا مفردة التي مدفوعا حقل كهربائي وبالنظر. A. من خلال تطبيق سعة مختلفة من البقول الجهد لاثنين من أزواج من الأقطاب الكهربائية، المجال الكهربائي يمكن أن يكون موجها إلى كل زاوية من دون الحاجة إلى تغيير ثقافة يدويا. تسجيلات B. مثال على العابرين الكالسيوم مع التحفيز الكهربائي في الفولتية التطبيقية المختلفة. وتظهر أربعة آثار، تحولت قليلا عموديا للسماح المشاهدة. مكتوبة القيم الجهد تحت آثار الزرقاء. C. عند تطبيق مدة ثابتة الحقل الكهربائي، وعدد من الخلايا العصبية التي سوف النار ردا على الحقل الكهربائي لديه شعبة نظم التراكميوظيفة ribution (CDF) هذا هو التوزيع التراكمي جاوس (أو دالة ERF) بوصفها وظيفة من اتساع الجهد (والذي يتناسب مع شدة المجال). D. مثال على منحنى القوة المدة التي تم الحصول عليها في حين تستخدم هذا البروتوكول. تم تعديل هذا الرقم من 5. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 8
الشكل 8: تكوين لفائف المغناطيسي وحساب الحقل الكهربائي الناتج عن. A. في القمة هو ملف دائري (الدوائر الزرقاء) يتم وضع 5 مم فوق أحادية البعد الثقافات حلقة العصبية (القرص الأزرق). الحلقات هي موازية لومتحدة مع الملف، مما يخلق النبض المغناطيسي الذي يكون موجها على طول خطوط حمراء. بواسطة قانون فاراداي، المجال الكهربائي الناجم تقع على الطائرات التي تكون موازية لفائف طول الحلقات المركزية معها. في أسفل هو المقطع العرضي الأفقي على طول الطائرة من الثقافات الحلبة. القيمة النسبية للمجال الكهربائي هي مرمزة، مع الاتجاه يصور السهام. حلقات أكبر أرفق مساحة أكبر من تدفق وبالتالي يتسبب الحقل الكهربائي هناك أعلى. B. صورة مشجعا عبر لفائف المغناطيسي (أعلى) ومحاكاة للمجال الكهربائي الذي يتسبب به. C. نمط المستخدمة لزراعة الخلايا العصبية التي يمكن حفز مع أي حقل كهربائي دائري أو حقل كهربائي شعاعي. تم تعديل هذا الرقم من 21 و 28. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

9 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 54357 / 54357fig9.jpg "/>
الشكل 9: استجابة الثقافات الدائري إلى المجال المغناطيسي. A. نسبة النجاح من التحفيز ينمو مع دائرة نصف قطرها من الثقافة. تمثل أشرطة الخطأ الخطأ المعياري (SE). ويصور B. العلاقة بين حجم الحلقة وقوة المجال المغناطيسي. احتمال لإثارة ثقافة هو لون مشفرة. في الواقع الإثارات أنجح الثقافات تكمن في تداخل بين الفضاء للوصول تجريبيا المرحلة (المستطيل الأبيض) والمنطقة عالية الاحتمال (الحمراء). تم تعديل هذا الرقم من 21. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 10
الشكل 10: تدوير المغناطيسي الإعداد الميدان الميدان. </ قوي> A. من أجل إحداث مجال كهربائي الدورية عندما حفز مع منشط المغناطيسي عبر لفائف، هناك حاجة إلى مرحلة التحول من 90 درجة بين لفائف اثنين. أظهرت هو الحقل الكهربائي يتسبب في لفائف صغيرة متوضعة على 2 الأجنحة المجاورة لفائف أوراق البرسيم. طردوا لفائف بشكل منفصل من قبل 2 التحفيز والتشجيع التجارية. B. A إعادة الإعمار، وذلك باستخدام المنحنيات هو مبين في A، من الناتجة سعة الحقل الكهربائي والتوجه أثناء نبضة من لفائف أوراق البرسيم. تم تعديل هذا الرقم من 21 و 28. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

1D الزخرفة هو أداة هامة التي يمكن استخدامها لمجموعة متنوعة من التطبيقات. على سبيل المثال، استخدمنا 1D الزخرفة لخلق بوابات منطقية من الثقافات العصبية 29 ومؤخرا لقياس كروناكسي و ريوباس من الخلايا العصبية قرن آمون الفئران 5 ، وتباطؤ سرعة انتشار إشارة النشاط اطلاق النار في متلازمة داون الخلايا العصبية قرن آمون مقارنة مع نوع البرية (وت) الخلايا العصبية الحصين 27 . بروتوكول المقترح ل 1 D الزخرفة هو قوي وأنه من السهل تشكيل أي نمط المطلوب. نقترح مراقبة ثقافة 1D قبل القياسات لتكون على علم بأي انقطاع ممكن للشبكة، والتي قد تؤثر على وظيفتها.

الزخرفة الكيميائية من تكوينات الخلايا العصبية لديها تاريخ مميز 30 ، 31 ، 32 . وجدنا أن نتيجتنا النهجق نتائج مماثلة إلى الزخرفة الكيميائية، إلا أنهم أكثر قوة وأسهل للتحقيق. مؤخرا أصبح خيار الزخرفة ميكروفلويديك من الخلايا العصبية بديلا للاهتمام أن النهج التي نقدمها، مع البساطة وسهولة الاستخدام 33 و 34 مماثلة. يتم استخدام نهج ميكروفلويديك في مختبرنا بالتوازي مع طريقة النقش هو موضح هنا.

كما أظهرنا 5 والثقافات 2D ليس لديها التوجه المفضل وتنبيهها موحد الخواص، ولا تعتمد على اتجاه المجال التطبيقي. وهناك حاجة إلى فترات أقصر لتحفيز الثقافات 2D عندما يكون الحقل يدور. في المقابل، الثقافات 1D تعتمد جدا على اتجاه المجال. عندما توجه الميدان مع نمط (وبالتالي مع اتجاه نمو محور عصبي)، ومدة-السعة الثابتة الحقل اللازمة لتحفيز أقصر بكثير مما كانت عليه عندما كان الحقل توجيهإد عمودي على النمط. وبالمثل، إذا ما بقيت مدة ثابت ثم الحقل حاجة لإثارة ثقافة أصغر إذا كان الحقل ونمط موازية. عندما تحفيز عموديا، نبض المجال يحتاج إلى أن تكون أطول من ذلك بكثير (في أمر من ميلي ثانية واحدة عندما الشبكة غير متصل)، ومن ثم يتم تحفيز أساسا التشعبات. عندما تستخدم المجالات الكهربائية (إما مباشرة أو الناجمة عن المجال المغناطيسي) لتحفيز المخ، وهذا هو من أهمية بالغة. إذا كانت المنطقة في المخ ومن المعروف تستهدف ديها حزم من المحاور، وهذه المحاور يمكن متحمس بتوجيه الحقل في اتجاههم ثم تحتاج طاقة أقل أو مدة أقصر من مجال لتحفيز. إذا كانت المنطقة المستهدفة الدماغ لا كان يفضل التوجه، ثم حقل الدورية أكثر كفاءة لتحفيز. إذا التشعبات هي الهدف من التحفيز والبقول تعد أكثر فعالية.

الحقول المغناطيسية يمكن أن تحفز نشاط الخلايا العصبية عندما نبضات مغناطيسية طnduces المجال الكهربائي الذي يثير الخلايا العصبية. لأن نبضات مغناطيسية يمكن تحقيقها حاليا هي ميكروثانية في المدة، والتشعبات، الذي هو من أجل من ميلي ثانية زمن الاستجابة، من غير المتوقع أن تكون حساسة لتحفيز المغناطيسي. في المقابل، المحاور، الذي هو أسرع زمن الاستجابة، هي الهدف من التحفيز 2، 3. رد المحاور إلى الإثارة الكهربائية هي القصوى عندما تكون موازية للالحقل الكهربائي ويقلل عندما تكون عمودية عليه 1، 35؛ لذلك، في الإثارة المغناطيسية، ونحن نسعى إلى إقامة نظم حيث يوجه الحقل الكهربائي الناجم موازية للمحاور المستهدفة. لذلك، عندما تحفيز حلقة 1D، هذا المجال يجب ان يكون موجها موازية للمحاور، وحجم الخاتم يحدد عتبة التحفيز. مماثلة لالتحفيز المباشر من قبل أقطاب حمام، لتحفيز ثقافة 2D، الدورية الإلكترونية التي يسببهاالمجال الكهربائي هو أكثر كفاءة بكثير.

مزيج من الزخرفة من الخلايا العصبية والإثارة الخارجية مع المجال الكهربائي أو المغناطيسي هو تقنية قوية مع العديد من التطبيقات المستقبلية الممكنة. كروناكسي و ريوباس، فضلا عن عتبة لتفعيل وتنشيط ديناميات الانتشار والسرعات هي كل المعلمات التي تعبر عن الخصائص الجوهرية للثقافة العصبية. على وجه الخصوص، والعلاجات العلاجية وتأثير الأدوية أو العلاج الدوائي يمكن اختبارها مباشرة مباشرة على الخلايا العصبية. وهذا من شأنه أن يسمح مسح فعال من كل من الخلايا العصبية نموذج المرض وبروتوكولات لتحفيز تمس. على اتجاه أكثر مفاهيمية، والقدرة على تحفيز الثقافات الخلايا العصبية يؤدي على وجه التحديد إلى إمكانيات جديدة فيما يتعلق بجوانب معالجة المعلومات من التكوينات العصبية، وتسمح لنا تصور الدوائر المطبوعة الصغيرة التي تجمع بين التحفيز الإلكتروني مع شبكات الخلايا العصبية الحية لتوفير حساب جديدأجهزة القاعدة والأجهزة الدماغ التواصل الرواية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

الكتاب أشكر أوفر فينرمان، فريد ولف، مناحيم سيغال، أندرياس نيف وإيتان ريوفيني لإجراء مناقشات مفيدة جدا. الكتاب أشكر إيلان بريسكين وجوردي سوريانو لتطوير الإصدارات القديمة من هذه التكنولوجيا. الكتاب أشكر تسفي تلوستي وجان بيير إيكمان للمساعدة في المفاهيم النظرية. وأيد هذا البحث من قبل مؤسسة منيرفا، وزارة العلوم والتكنولوجيا، وإسرائيل، ومنحة مؤسسة العلوم اسرائيل 1320-1309 ومنحة مؤسسة ثنائية القومية للعلوم 2008331.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APV Sigma-Aldrich A8054 Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
B27 supp Gibco 17504-044 Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1
bicuculline Sigma-Aldrich 14343 Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
Borax (sodium tetraborate decahydrate) Sigma-Aldrich S9640 Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2
Boric acid Frutarom LTD 5550710 Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2
CaCl2 , 1 M Fluka  21098 Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
CNQX Sigma-Aldrich C239 Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
COMSOL COMSOL Inc Multiphysics 3.5 Numerical simulation. Mentioned in Section 3.5.2
D-(+)-Glucose, 1 M Sigma-Aldrich 65146 Plating medium, Extracellular recording solution. Mentioned in Sections 1.1.1 and 1.5.2
D-PBS Sigma-Aldrich D8537 Cell Cultures. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6
FCS (FBS) Gibco 12657-029 Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141 Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6
Fluo4AM Life technologies F14201 Imaging of spontaneous or evoked activity. Mentioned in Sections 1.5.1, 1.5.3, and 1.5.5
FUDR Sigma-Aldrich F0503 Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1
Gentamycin Sigma-Aldrich G1272 Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1
GlutaMAX 100x Gibco 35050-038 Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1
Hepes, 1 M Sigma-Aldrich H0887 Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
HI HS BI 04-124-1A Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Sections 1.1.1, 1.4.1, and 1.4.2
KCl,  3 M Merck 1049361000 Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Laminin  Sigma-Aldrich L2020 Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6
MEM x 1 Gibco 21090-022 Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.4.1    1.4.2
MgCl2 , 1 M Sigma-Aldrich M1028 Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
NaCl, 4 M Bio-Lab 19030591 Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Octadecanethiol Sigma-Aldrich 01858 Cleaning Cr-Au coated coverslips (1D cultures). Mentioned in Section 1.2.3
Pluracare F108 NF Prill BASF Corparation  50475278 Bio-Rejection Coating, Bio Coating. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6
Poly-L-lysine 0.01% solution  Sigma-Aldrich  P47075 Promote cell division. Mentioned in Section 1.1.4
Sucrose, 1 M Sigma-Aldrich S1888 Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Thiol  Sigma-Aldrich 1858 Bio-Rejection Coating. Mentioned in Section 1.2.3
URIDINE Sigma-Aldrich U3750 Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1
Sputtering machine AJA International, Inc ATC Orion-5Series  coating glass with thin layers of metal. Mentioned in Section 1.2.2
Pen plotter  Hewlett Packard  HP 7475A Etching of pattern to the coated coverslip. Mentioned in Section 1.2.5
Electrodes wires  A-M Systems, Carlsborg WA 767000 Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Sections 2.1, 2.2, 2.3, and 2.4.5
Signal generator BKPrecision 4079 Shaping of the electric signal. Mentioned in Section 2.3
Amplifier Homemade Voltage amplification of the signal from the signal generator to the electrodes. Mentioned in Section 2.3
Power supply Matrix  MPS-3005 LK-3  Power supply to the sputtering machine. Mentioned in Section 1.2.2.3
Transcranial magnetic stimulation Magstim, Spring Gardens, UK Rapid 2 Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Sections 3.1, 3.3, and 3.4
Epoxy Cognis Versamid 140 Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4
Epoxy Shell EPON 815  Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4
Platinum wires 0.005'' thick; A-M Systems,   Carlsborg WA  767000 Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1
Circular magnetic coil Homemade Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.3
WaveXpress SW B&K Precision  Waveform editing software. Mentioned in Section 2.1.32
Xion Ultra 897 Andor Sensitive EMCCD camera. Mentioned in Section 2.4.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nagarajan, S. S., Durand, D. M., Warman, E. N. Effects of induced electric fields on finite neuronal structures: a simulation study. IEEE Trans Biomed Eng. 40 (11), 1175-1188 (1993).
  2. Nowak, L. G., Bullier, J. Axons but not cell bodies, are activated by electrical stimulation in cortical gray matter. II. Evidence from selective inactivation of cell bodies and axon initial segments. Exp Brain Res. 118 (4), 489-500 (1998).
  3. Ranck, J. B. Which elements are excited in electrical stimulation of mammalian central nervous system: a review. Brain Res. 98 (3), 417-440 (1975).
  4. Rattay, F. The basic mechanism for the electrical stimulation of the nervous system. Neuroscience. 89 (2), 335-346 (1999).
  5. Stern, S., Agudelo-Toro, A., Rotem, A., Moses, E., Neef, A. Chronaxie Measurements in Patterned Neuronal Cultures from Rat Hippocampus. PLoS One. 10 (7), e0132577 (2015).
  6. Brunelin, J., et al. Examining transcranial direct-current stimulation (tDCS) as a treatment for hallucinations in schizophrenia. Am J Psychiatry. 169 (7), 719-724 (2012).
  7. Cruccu, G., et al. EFNS guidelines on neurostimulation therapy for neuropathic pain. Eur J Neurol. 14 (9), 952-970 (2007).
  8. Kennedy, S. H., et al. Canadian Network for Mood and Anxiety Treatments (CANMAT) Clinical guidelines for the management of major depressive disorder in adults. IV. Neurostimulation therapies. J Affect Disord. 117, Suppl 1. S44-S53 (2009).
  9. Minzenberg, M. J., Carter, C. S. Developing treatments for impaired cognition in schizophrenia. Trends Cogn Sci. 16 (1), 35-42 (2012).
  10. Vaidya, N. A., Mahableshwarkar, A. R., Shahid, R. Continuation and maintenance ECT in treatment-resistant bipolar disorder. J ECT. 19 (1), 10-16 (2003).
  11. Bartlett, W. P., Banker, G. A. An electron microscopic study of the development of axons and dendrites by hippocampal neurons in culture. II. Synaptic relationships. J Neurosci. 4 (8), 1954-1965 (1984).
  12. Bartlett, W. P., Banker, G. A. An electron microscopic study of the development of axons and dendrites by hippocampal neurons in culture. I. Cells which develop without intercellular contacts. J Neurosci. 4 (8), 1944-1953 (1984).
  13. Beggs, J. M., Plenz, D. Neuronal avalanches in neocortical circuits. J Neurosci. 23 (35), 11167-11177 (2003).
  14. Breskin, I., Soriano, J., Moses, E., Tlusty, T. Percolation in living neural networks. Phys Rev Lett. 97 (18), (2006).
  15. Feinerman, O., Moses, E. Transport of information along unidimensional layered networks of dissociated hippocampal neurons and implications for rate coding. J Neurosci. 26 (17), 4526-4534 (2006).
  16. Soriano, J., Rodriguez Martinez,, Tlusty, M., T,, Moses, E. Development of input connections in neural cultures. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (37), 13758-13763 (2008).
  17. Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
  18. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu Rev Neurosci. 34, 389-412 (2011).
  19. Williams, S. C., Deisseroth, K. Optogenetics. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16287 (2013).
  20. Rotem, A., Moses, E. Magnetic stimulation of curved nerves. IEEE Trans Biomed Eng. 53 (3), 414-420 (2006).
  21. Rotem, A., Moses, E. Magnetic stimulation of one-dimensional neuronal cultures. Biophys J. 94 (12), 5065-5078 (2008).
  22. Feinerman, O., Moses, E. A picoliter 'fountain-pen' using co-axial dual pipettes. J Neurosci Methods. 127 (1), 75-84 (2003).
  23. Feinerman, O., Segal, M., Moses, E. Signal propagation along unidimensional neuronal networks. J Neurophysiol. 94 (5), 3406-3416 (2005).
  24. Papa, M., Bundman, M. C., Greenberger, V., Segal, M. Morphological analysis of dendritic spine development in primary cultures of hippocampal neurons. J Neurosci. 15 (1 Pt 1), 1-11 (1995).
  25. Bikson, M., et al. Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro. J Physiol. 557 (1), 175-190 (2004).
  26. Rahman, A., et al. Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects. J Physiol. 591 (10), 2563-2578 (2013).
  27. Stern, S., Segal, M., Moses, E. Involvement of Potassium and Cation Channels in Hippocampal Abnormalities of Embryonic Ts65Dn and Tc1 Trisomic Mice. EBioMedicine. 2 (9), 1048-1062 (2015).
  28. Rotem, A., et al. Solving the orientation specific constraints in transcranial magnetic stimulation by rotating fields. PLoS One. 9 (2), e86794 (2014).
  29. Feinerman, O., Rotem, A., Moses, E. Reliable neuronal logic devices from patterned hippocampal cultures. Nat Phys. 4 (12), 967-973 (2008).
  30. Kleinfeld, D., Kahler, K. H., Hockberger, P. E. Controlled outgrowth of dissociated neurons on patterned substrates. J Neurosci. 8 (11), 4098-4120 (1988).
  31. Bugnicourt, G., Brocard, J., Nicolas, A., Villard, C. Nanoscale surface topography reshapes neuronal growth in culture. Langmuir. 30 (15), 4441-4449 (2014).
  32. Roth, S., et al. Neuronal architectures with axo-dendritic polarity above silicon nanowires. Small. 8 (5), 671-675 (2012).
  33. Peyrin, J. M., et al. Axon diodes for the reconstruction of oriented neuronal networks in microfluidic chambers. Lab Chip. 11 (21), 3663-3673 (2011).
  34. Renault, R., et al. Combining microfluidics, optogenetics and calcium imaging to study neuronal communication in vitro. PLoS One. 10 (4), e0120680 (2015).
  35. Roth, B. J., Basser, P. J. A model of the stimulation of a nerve fiber by electromagnetic induction. IEEE Trans Biomed Eng. 37 (6), 588-597 (1990).

Tags

علم الأعصاب، العدد 123، شبكات الخلايا العصبية، التحفيز الكهربائي، التحفيز المغناطيسي، كروناكسي، ريوباس، والتصوير الكالسيوم، والثقافات نمط
الإثارة الخارجية من الخلايا العصبية باستخدام المجالات الكهربائية والمغناطيسية في واحدة والثقافات ثنائي الأبعاد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stern, S., Rotem, A., Burnishev, Y., … More

Stern, S., Rotem, A., Burnishev, Y., Weinreb, E., Moses, E. External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures. J. Vis. Exp. (123), e54357, doi:10.3791/54357 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter