Summary
cultivos neuronales son un buen modelo para el estudio de las técnicas de estimulación del cerebro emergentes a través de su efecto sobre las neuronas individuales o una población de neuronas. Aquí se presentan los diferentes métodos para la estimulación de cultivos neuronales estampadas por un campo eléctrico producido directamente por los electrodos de baño o inducida por un campo magnético variable en el tiempo.
Abstract
Una neurona se disparará un potencial de acción cuando su potencial de membrana supera un cierto umbral. En actividad típica del cerebro, esto ocurre como resultado de insumos químicos a sus sinapsis. Sin embargo, las neuronas pueden también ser excitados por un campo eléctrico impuesto. En particular, las aplicaciones clínicas recientes activan las neuronas mediante la creación de un campo eléctrico externo. Por tanto, es de interés para investigar cómo la neurona responde al campo externo y lo que hace que el potencial de acción. Afortunadamente, la aplicación precisa y controlada de un campo eléctrico externo es posible para las células neuronales embrionarias que son extirpados, disociados y crecer en cultivos. Esto permite la investigación de estas preguntas en un sistema altamente reproducible.
En este trabajo algunas de las técnicas utilizadas para la aplicación controlada de campo eléctrico externo en cultivos neuronales se revisan. Las redes pueden ser de una sola dimensión, es decir, modelado en lineaformas R o dejaron crecer en todo el plano del sustrato, y por lo tanto de dos dimensiones. Además, la excitación puede ser creado por la aplicación directa de campo eléctrico a través de electrodos sumergidos en el fluido (electrodos de baño) o induciendo el campo eléctrico usando la creación remota de pulsos magnéticos.
Introduction
La interacción entre las neuronas y los campos eléctricos externos tiene implicaciones fundamentales, así como los prácticos. Aunque se conoce desde los tiempos de Volta que un campo eléctrico aplicado externamente puede excitar el tejido, los mecanismos responsables de la producción de un potencial de acción resultante en las neuronas sólo se están empezando recientemente a ser desenredado 1, 2, 3, 4. Esto incluye la búsqueda de respuestas a las preguntas sobre el mecanismo que causa la despolarización del potencial de membrana, el papel de propiedades de la membrana y de los canales iónicos, e incluso la región en la neurona que responde al campo eléctrico 2, 5. Therapeutic neuroestimulación 6, 7, 8, 9, La medición de la interacción dentro del cerebro in vivo añade un componente importante para esta comprensión, pero se ve obstaculizada por la imprecisión y baja capacidad de control de las mediciones dentro del cráneo. En contraste, las mediciones en cultivos fácilmente se pueden realizar en gran volumen con alta precisión, excelente señal al rendimiento de ruido y un alto grado de reproducibilidad y de control. Utilizando cultivos una gran variedad de propiedades neuronales del comportamiento de la red colectiva se puede elucidar 11, 12, 13, 14, 15, 16. Del mismo modo, se espera que este sistema bien controlado ser altamente eficiente en elucidar el mecanismo por el cual otros métodos de estimulación trabajo, por ejemplo cómo la apertura del canal durante la estimulación óptica en las neuronas optogenetically activas 17, 18, 19 es responsable de crear potencial de acción. Aquí la atención se centra en describir el desarrollo y la comprensión de las herramientas que pueden excitar de manera eficiente la neurona a través de un campo eléctrico externo. En este trabajo se describe la preparación de dos dimensiones y unidimensional cultivos de hipocampo estampadas, la estimulación utilizando diferentes configuraciones y orientación de un campo eléctrico aplicado directamente por los electrodos de baño, y finalmente la estimulación de dos dimensiones y modelado culturas unidimensionales por una variable en el tiempo del campo magnético, que induce un campo eléctrico5, 20, 21.
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Protocol
Ética declaración: Los procedimientos que implican la manipulación de animales se realizaron de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Instituto de Ciencia Weizmann, y la ley israelí apropiado. El Instituto Weizmann está acreditada por la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care International (AAALAC). El Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional Weizmann aprobó este estudio, llevado a cabo con las neuronas del hipocampo.
1. Preparación de dos dimensiones (2D) y unidimensional (1D) cultivos de hipocampo
- Preparación de cubreobjetos para cultivos 2D.
- Preparar medio en placa (PM) compuesta de: 0,9 ml mínimo medio esencial (MEM) + 3G, 0,05 ml de suero de ternera fetal (FCS), 0,05 calor ml de suero de caballo inactivado (HI HS) y 1 l de suplemento B27. Nota: MEM + 3G contiene por cada 500 ml de MEM x 1, 1 ml de gentamicina, 5 ml de estabilizado 100x de L-glutamina (ver
- Prepare tampón de borato compuesta de: 1,9 g de bórax (tetraborato sódico decahidrato) en 200 ml de agua destilada doble (DDW) (de la mezcla a 60 ° C) y 1,24 g de ácido bórico en 200 ml de DDW. Valorar la solución final a pH 8,5 usando HCl 1 M. Nota: La solución final es de 400 ml 0,1 M tampón de borato.
- Sumergir cubreobjetos de vidrio en ácido nítrico al 65% durante 2 h. Enjuague tres veces en DDW, seguido de tres enjuagues con reactivo analítico absoluto (AR ABS) etanol.
- Pase cada cubreobjetos brevemente a través de la llama de un quemador Bunsen dos o tres veces durante 1 - 2 s, y luego dejar incubar durante la noche en placas de 24 pocillos con 1 ml de solución de poli-L-lisina al 0,01% diluido 1: 5 en tampón de borato ( 0,1 M, pH 8,4). A continuación, enjuagar cubreobjetos en DDW tres veces y dejar con 1 ml PM por pocillo en un estándar de 37 ° C, 5% de CO2 durante la noche.
- Preparar medio en placa (PM) compuesta de: 0,9 ml mínimo medio esencial (MEM) + 3G, 0,05 ml de suero de ternera fetal (FCS), 0,05 calor ml de suero de caballo inactivado (HI HS) y 1 l de suplemento B27. Nota: MEM + 3G contiene por cada 500 ml de MEM x 1, 1 ml de gentamicina, 5 ml de estabilizado 100x de L-glutamina (ver
- Preparación de cubreobjetos para cultivos 1D.
- g limpiaLasl cubreobjetos por inmersión en una solución base de piraña consistente en 75 mL de DDW, 25 mL de solución de amoníaco al 25% y 25 mL de peróxido de hidrógeno al 30%. Colocar la solución con los cubreobjetos de vidrio en una placa calefactora a ~ 50 ° C durante 30 min y luego secar los cubreobjetos de vidrio con nitrógeno.
- Cubra los cubreobjetos primero con una fina película de cromo (99,999%) de 6 Å de espesor seguido por una capa de oro de 30 ˚ (99,999%), usando deposición de vapor o de pulverización catódica.
- Para conseguir una velocidad de pulverización catódica de 0,05 - 1 Å / s, utilice una máquina de pulverización con 2 vigas eléctricas y un sistema de vacío de 260 l / s con tamaños de objetivo 2 "y 4". Utilice una etapa de rotación que puede ir de 0 a 100 rondas por minuto (RPM). Utilice una potencia de pulverización de corriente continua (CC) de 0 - 750 vatios.
- Utilice una rotación de 30 rpm y argón 99,999% para obtener plasma a 10 mTorr de presión en la cámara.
- Maneje la fuente de alimentación de las pistolas pulverizadoras a una potencia de pulverización de 40 W DC para el cromo, lo que lleva a ~ 0.12 A / s tasa de cobertura, ya los 10 W de potencia DC pulverización catódica por el oro, lo que lleva a ~ 0,28 Å / s.
- Disolver 0,1 g de 1-octadecanotiol en 100 ml de etanol ABS AR usando ultrasonidos durante 30 min. Coloque cubreobjetos recubiertos Cr-Au durante 2 h en esta solución, después se lava con etanol AR ABS y seco con nitrógeno.
- Preparar una solución de 100 de solución salina de Dulbecco tamponada con fosfato ml (D-PBS) y 3,5 g de un co-polímero tri-bloque (véase la Tabla de Materiales / reactivos) por agitación durante 1 - 2 h a 600 - 700 rpm. Colocar cubreobjetos en la solución durante 1 h. cubreobjetos secos con nitrógeno.
- Mecánicamente grabar el patrón deseado por el rascado de la capa de bio-rechazo 22. Para ello, el uso de un trazador de pluma, donde la pluma se sustituye por una aguja de grabado. Rayar el patrón a través de las capas de metal para alcanzar el vidrio subyacente. Controlar este proceso por un ordenador para lograr un patrón deseado replicado. Los patrones formados por este proceso son demostrar D en la Figura 2 y Figura 3 .
- Preparar una capa biocompatible de 100 ml de D-PBS, 3,5 g de copolímero tribloque, 35,7 μL / ml de fibronectina y 29 μl / ml de laminina.
- Esterilizar cubreobjetos en luz ultravioleta durante al menos 10 min. Incubar cubreobjetos en la solución biocompatible preparada durante la noche.
NOTA: La capa biocompatible sólo se formará cuando la capa de bio-rechazo haya sido grabada en el paso anterior. - Al día siguiente lavar cubreobjetos dos veces con P-DBS. Incube los cubreobjetos en PM durante la noche. Los cubreobjetos ahora están listos para el recubrimiento celular.
- Esterilizar cubreobjetos en luz ultravioleta durante al menos 10 min. Incubar cubreobjetos en la solución biocompatible preparada durante la noche.
- Realizar la disección de acuerdo con los procedimientos estándar que se han publicado extensamente con anterioridad 23 , 24 .
- En resumen, extraer el hipocampo o la corteza de embriones de rata, típicamente el día E19, o de ratones, típicamente al día E17 23 ,class = "xref"> 24.
- Disociar las células primero en solución de papaína para 20 - 30 min, seguido de trituración mecánica 24 con pipetas de vidrio cuyas puntas son pulida al fuego.
NOTA: Si las células provienen de ratones modificados genéticamente entonces el tejido de cada embrión se debe mantener en un tubo de plástico por separado 1,5 ml durante todo el proceso. - Contar las células con azul de tripano antes de sembrar.
NOTA: Para los animales genéticamente modificados el recuento debe hacerse por separado para cada embrión. - Para los cultivos 2D, semillas de neuronas de ratón en 750.000 y neuronas de rata en 850.000 células por pocillo. Para 1D, semilla a 650.000 células por pocillo. Agitar la placa ligeramente inmediatamente después de la siembra para asegurar una cobertura homogénea del cubreobjetos.
- El mantenimiento de los cultivos neuronales.
- Preparar el cambio de medio (CM) compuesto de (por ml):. 0,9 ml MEM + 3G, 0,1 ml HI SA, 10! L 5-fluoro-2'-desoxiuridina (FUDR) con 100x uridina </ Li>
- Preparar medio final (FM) compuesto de (por ml): 0,9 ml de MEM + 3G y 0,1 ml HI SA.
- Reemplazar PM con 1-1,5 ml CM después de 4 días in vitro (DIV). A las 6 DIV, reemplazar el 50% de la CM con CM fresco. A DIV 8, cambiar el medio a 1,5 ml FM, seguido por un cambio de 50% de FM cada 2 días. Después de aproximadamente una semana emerge la actividad sincrónica espontánea.
- Obtención de imágenes de la actividad espontánea o evocada en cultivos neuronales con colorantes fluorescentes.
- Preparar una solución de 50 g de calcio colorante fluorescente sensible (véase la Tabla de Materiales / reactivos) en 50! L de DMSO (dimetil sulfóxido).
- Preparar la solución de registro extracelular (EM) que contiene (en mM) 10 HEPES, 4 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl2, 139 NaCl, 10 D-glucosa, 45 sacarosa (pH 7,4).
- Incubar el cultivo neuronal en 2 ml EM con 8 l de la solución colorante fluorescente sensible al calcio durante 1 h. Proteger de la luz y gire suavemente para asegurar homogenous difusión del colorante a las células.
- Reemplazar solución con EM fresco antes de la imagen. La imagen fluorescente se demuestra en la Figura 4.
- Image en un microscopio de fluorescencia con filtros ópticos para imágenes de fluorescencia de calcio (pico de excitación a 488 nm, pico de emisión a 520 nm), utilizando una cámara y software capaz de cuantificar la intensidad de cualquier región de interés (ROI) dentro del campo de visión de el microscopio.
2. La estimulación eléctrica de las Culturas
NOTA: La configuración básica para la estimulación eléctrica se muestra en la Figura 1. Una hoja de la cubierta en la que el cultivo neuronal se ha cultivado durante aproximadamente 14 días se coloca en una placa de Petri con un microscopio de fluorescencia. La actividad eléctrica de las neuronas se forma la imagen utilizando colorantes sensibles al calcio, mientras que se aplica un voltaje a través de dos pares de electrodos de baño que se colocan fuera de la cultura. Los electrodos son accionados por comogenerador ignal cuya salida es amplificada por un amplificador de canal dual. Control de tensión para la estimulación se prefiere sobre el control de la corriente más estándar 25, 26 debido a que los vectores de campo eléctrico se determinan directamente, permitiendo así que la suma de vectores sencillo y combinación. Esto requiere un cuidadoso control de la uniformidad del campo eléctrico, que puede ser realizada sobre toda la muestra para el caso de control de tensión. Cuando se utiliza el cuidado de control de voltaje se debe tomar para evitar cualquier bucles de tierra y la homogeneidad del campo eléctrico debe ser verificada (ver 2.2 más abajo).
- Para la estimulación eléctrica con un campo eléctrico homogéneo de utilizar un par de hilos de electrodos paralelos.
- Utilice electrodos de platino con un espesor del orden de 0,005 '' (127 m). Cuando se utiliza con los cubreobjetos de 13 mm, asegurar que la distancia entre los dos electrodos es de alrededor de 11 mm, y la posición del electrodos 1 mm por encima del cultivo.
NOTA: Para hacer el soporte del electrodo (figuras 5A y 6A) utilizar politetrafluoroetileno (PTFE). Perforar orificios estrechos a través del PTFE para insertar los electrodos. El dispositivo debe ser más alta que la solución extracelular de manera que el extremo superior, donde se exponen los electrodos, nunca va a entrar en contacto con la solución. Para el aislamiento, el uso de pegamento epoxi en cualquier parte de los conductores de electrodos que podrían estar expuestos. - Utilice una forma de impulso cuadrado con un ciclo de trabajo del 50%, sin componente de corriente continua para evitar la electrólisis. Variar duración de impulso entre 10 microsegundos y 4 ms para causar estimulación efectiva sin quemar la cultura. Asegúrese de que la amplitud es del orden de ± 22 V (véase la Figura 5). El pulso cuadrado se puede observar en un osciloscopio conectado en paralelo a los electrodos.
NOTA: Para facilitar la programación de cualquier forma de onda deseada, utilice un software de edición de forma de onda comercial (véase la lista de materiales
- Utilice electrodos de platino con un espesor del orden de 0,005 '' (127 m). Cuando se utiliza con los cubreobjetos de 13 mm, asegurar que la distancia entre los dos electrodos es de alrededor de 11 mm, y la posición del electrodos 1 mm por encima del cultivo.
- Para la prueba de homogeneidad de campo emplea un electrodo de sonda. Usar una rejilla de al menos 1 mm x 1 mm para permitir que la sonda se puede mover en la zona entre los electrodos y medir el potencial eléctrico.
- Medir el potencial eléctrico. Utilizar
para calcular el campo eléctrico. Utilice uno de los electrodos como un electrodo de referencia. Medir el campo eléctrico con diferentes duraciones de pulso entre 100 mu s a 4 ms (véase la figura 5B para un ejemplo de duración del pulso 100 mu s) para verificar que el campo es homogéneo dentro de la gama de duraciones estimulantes.
NOTA: Véase la Figura 5D para un ejemplo de una homogeneidad del campo eléctrico medido cuando la duración del impulso fue de 1 ms.
- Medir el potencial eléctrico. Utilizar
- Utilice 2 pares perpendiculares de electrodos de baño para producir más complicadas formas de campo eléctrico, y paraser capaz de orientar el campo en diferentes direcciones (véase la Fig. 6B). Se utilizará el dispositivo con 2 pares de electrodos, y se observó la señal en cada par de los electrodos en dos osciloscopios separadas.
- Coloque los electrodos 1 mm por encima de la cultura y a una distancia de 10 - 11 mm uno de otro. Asegúrese de que ambos pares de electrodos son flotantes (no tener conexión a tierra), y no tienen ningún terreno común mediante la medición de la resistencia entre cualquier conjunto de electrodos y verificar la ausencia de cortocircuitos entre cualquiera de los electrodos. Compruebe que todo el equipo usado, que está conectado a los electrodos (tales como los osciloscopios, los amplificadores, los generadores de señales, etc.) está flotando con respecto a tierra mediante la comprobación de que todo el equipo está flotando y que ninguno de los electrodos de referencia está tocando cualquier equipo con conexión a tierra.
- Para cambiar la orientación del campo, variar la amplitud de la tensión alimentado a los dos pares de electrodos con res(Véase la figura 7A ). Por ejemplo, para 0 ° usar ± 22 V en el par de electrodos que son perpendiculares al patrón y 0 V para el otro electrodo. Para 45 °, utilice ± 15,6 V en ambos pares de electrodos sin desfase, para una suma de vector de amplitud de 15,6 2 + 15,6 2 = 22 2 .
- Para aplicar un campo giratorio utilice una única forma de onda de un impulso de tensión senoidal y una única forma de onda de un impulso de tensión coseno a los dos pares de electrodos para producir un campo eléctrico giratorio de amplitud fija (véase la Figura 6B ).
NOTA: Como se puede ver en la Figura 6B , cuando se usa un ciclo de una onda sinusoidal con ± 22 V en un electrodo y un ciclo de una onda coseno con ± 22 V en el otro electrodo, la suma vectorial es un campo eléctrico giratorio con La duración del ciclo igual que las ondas seno y coseno, y con una amplitud de ± 22 V.
- Para medir y calcular ChronAXIe y Reobase de los axones en el cultivo neuronal vs. dendritas en la misma cultura realizan los siguientes pasos.
- Utilizar un colorante fluorescente sensible al calcio para obtener imágenes de calcio como se describe en la Tabla de Materiales / reactivos y en 1,5) con un cultivo 1D modelado en fino (170 m), largo (10 mm) líneas. colorante sensible al calcio se aplicará a la cultura, y se incubó durante 45 minutos. El colorante se lava mediante la sustitución con una solución de grabación fresco.
- Desconectar la red para lograr las estadísticas de población de la respuesta directa a la estimulación eléctrica, sin el efecto de la transmisión sináptica. Para hacerlo, aplicar una combinación de 40 M de bicuculina, la acción inhibidora de ácido gamma-aminobutírico-A (GABA A) receptores que bloquea, 10 mM de 6-ciano-7-nitroquinoxalina-2,3-diona (CNQX) , para bloquear la α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico (AMPA) y kainato y 20? M de (2R) -amino-5-phosphonovaleácido ric (APV), que bloquea la N-metil-D-aspartato (NMDA). Los bloqueadores se añaden a la solución de grabación.
- Aplicar un pulso cuadrado como se describe en 2.1 y 2.3 con diferentes duraciones de tiempo de entre 100 mu s y 4 ms. La señal se puede observar en el osciloscopio.
- Utilice un microscopio de fluorescencia con un programa de adquisición de imágenes (ver 1.5) para supervisar la intensidad de los transitorios de calcio en varios ROIs, conteniendo cada una unos pocos cientos de neuronas. Adquirir imágenes con una cámara EMCCD sensibles (véase la lista de materiales), capaz de una velocidad de adquisición de imagen de al menos 20 fotogramas por segundo. El cambio en la intensidad de la luz es proporcional a la cantidad de neuronas que fueron estimuladas. Estimar la fracción de las neuronas estimuladas utilizando el cambio relativo en la intensidad.
- Para cada duración de impulso (100 mu s a 4 ms), cambiar la amplitud de la tensión aplicada a los electrodos a partir de una tensión, donde no se observa cambio en la intensidad (algunos voltios), a thtensión e donde los cambios en la intensidad debido a la tensión aplicada ha saturado (hasta ± 22 V).
NOTA: El cambio de intensidad se distribuirá como acumulativa gausiana 5 con respecto a la tensión aplicada para la estimulación para cada tiempo de duración del impulso de tensión. - Ajustar una distribución de Gauss acumulativa para la intensidad frente a la tensión aplicada para cada duración y extraer la media de Gauss de esta forma.
NOTA: Este medio es la tensión representativa a la que respondieron las neuronas. - Al final de este proceso de obtener para cada duración de la estimulación de una tensión media a la que respondieron las neuronas. Usar estos pares de duraciones y fortalezas para trazar las curvas de fuerza-duración (véase la Figura 7).
para calcular el campo eléctrico. Utilice uno de los electrodos como un electrodo de referencia. Medir el campo eléctrico con diferentes duraciones de pulso entre 100 mu s a 4 ms (véase la figura 5B para un ejemplo de duración del pulso 100 mu s) para verificar que el campo es homogéneo dentro de la gama de duraciones estimulantes. 3. Estimulación Magnética de culturas
Nota: La configuración básica para la estimulación magnética se muestra en la Figura 2. En la parte superior derecha se muestraun microscopio de fluorescencia invertida que se utiliza para colorantes sensibles imagen de calcio en las neuronas. La bobina magnética (círculos azules) se coloca aproximadamente 5 mm concéntricamente por encima de una cultura anillo neuronal, (contorno azul). Una bobina de recogida (círculo rojo) en la circunferencia de la placa de Petri supervisa la tensión inducida por el pulso magnético. En la parte superior izquierda se muestra la dinámica de medida de la bobina de estimulador magnético (MS) con una carga de tensión del condensador de 5,000 kV, como integrado a partir de la bobina de recogida. El campo eléctrico inducido (calculado para un radio de anillo de 14 mm) se representa en verde, mientras que el campo magnético se representa en azul. En la parte inferior se muestran las imágenes de la cultura neuronal. En la parte inferior izquierda es una imagen de campo brillante de un patrón de 24 mm cubreobjetos. Las áreas blancas son las neuronas. El patrón fotografiado consta de cultivos de anillos concéntricos con diferentes radios. En la parte inferior derecha es un zoom sobre un segmento corto de los anillos, que muestra las neuronas individuales. Para una escala, wid de los anillosº es de aproximadamente 200 m.
- Cultivar las neuronas en un patrón de anillo circular (grabado al agua fuerte tal como se describe en 1.2.5) para la estimulación cultura 1D. Use un calcio colorante fluorescente sensible para la formación de imágenes de calcio (tal como se describe en la sección 1.5) con un cultivo 1D modelado en fino (170 m), (10 mm) líneas largas.
- Utilice una bobina magnética circular y la posición de una placa de Petri de aproximadamente 5 mm por debajo y concéntricos con la bobina. Utilice una bobina costumbre de 30-mm (diámetro interior, 46 mm de diámetro exterior) de la bobina aproximadamente con una inductancia de L = 90 mH impulsado por una MS caseras o comerciales cargados con una tensión máxima de 5 kV.
- Descargar un alto voltaje y la corriente a través de una bobina conductora utilizando un interruptor de alta corriente de alto voltaje para estimular magnéticamente cultivos neuronales. El estimulador magnético (MS) se puede construir como se describe en 21 el uso de grandes condensadores, del orden de 100 mF, para obtener un alto voltaje de de 1 - 5 kV. Alternativamente, puede utilizar un comercialmenteMS disponible (ver Tabla de Materiales / Reactivos ).
NOTA: Utilice un alambre de cobre rectangular recubierto de poliéster de 0,254 mm de espesor y 6,35 mm de ancho para fabricar una bobina hecha en casa 21 . Haga girar los alambres en marcos hechos a la medida, aislados con fibras de vidrio y fundidos en epoxi (ver Tabla de Materiales / Reactivos ). Alternativamente, utilice bobinas disponibles en el mercado (ver Tabla de Materiales / Reactivos ).
- Utilice campos magnéticos giratorios para estimular cultivos 2D.
- Ahora, use los campos magnéticos giratorios para estimular culturas 2D. Disparar el TMS sin cultivo en el plato, a diferentes intensidades, para mostrar la correlación lineal de la lectura de la bobina con las intensidades.
- A continuación, mientras registra transitorios de calcio con un cultivo neuronal, comienza a disparar el TMS a intensidades crecientes mientras se registran tanto los transitorios de calcio como la bobina. Al principio, las ráfagas de la red observadas como grandes transitorios de calcio, shoULD no sincronizar con recoger los picos de bobina de EMT. Continuando para aumentar la intensidad, en algún momento, los transitorios de calcio comienzan a ser sincronizado con los picos de TMS. Alternativamente, o además, después de lograr una respuesta sincronizada, empezar a disminuir las intensidades hasta que se abolió la sincronización, para determinar el umbral de TMS.
Nota: Las condiciones deben mantenerse estrictamente fijan para cada una de las configuraciones, utilizando el volumen exacto cada vez, los mismos vasos y bobina posiciones exactas y orientaciones.- Montar la bobina de recogida en la base del plato de grabación de modo que está en un plano paralelo a la cultura neuronal y en una posición fija con respecto a la cultura.
NOTA: Esto asegura que la dependencia de la colocación de la bobina de captación con respecto al imán es fiel a la posición de la cultura y que cualquier discrepancia en el posicionamiento será insignificante en las lecturas de la bobina captadora.- Utilizar dos bobinas independientes que sonposicionado perpendiculares entre sí (Figura 8B) para generar un campo eléctrico magnético e inducido giratorio. Conectar cada bobina para sus propios MS. Asegúrese de que los estimuladores descargan corrientes similares en un retardo de fase de 90 grados (Figura 10A), lo que resulta en un campo magnético giratorio que escanea 270 grados del espacio real en un campo máximo de ~ 270 V / m (Figura 10B).
- Coloque el cultivo neuronal dentro de un recipiente de vidrio esférico lleno de la solución de registro externa (EM).
- Monitor de estimulación (cambio en la intensidad de fluorescencia de las neuronas) con la cámara como se describe en el paso 2.4.4.
- En el caso de las bobinas cruzadas (Figura 8B), la posición de la bobina captadora paralelo y a una distancia específica por debajo de la cultura neuronal. cuidadosamente mantener esta configuración en todos los experimentos.
- Montar la bobina de recogida en la base del plato de grabación de modo que está en un plano paralelo a la cultura neuronal y en una posición fija con respecto a la cultura.
- Calcular analíticamente el campo eléctrico para Configura 1Dción por E max = k 1 Br, donde E max es la amplitud máxima del campo eléctrico inducido y se dirige a lo largo de la tangente de los anillos con radio r. B es la amplitud del impulso magnético y k 1 es una constante de proporcionalidad dimensional que puede ser medido usando la bobina de recogida (Figura 8A).
- Use un paquete de simulación numérica (véase la lista de materiales) para simular numéricamente el campo eléctrico 21.
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Representative Results
El protocolo presentado permite la fácil patrón de cultivos neuronales. Cuando se combina con varios métodos que hemos desarrollado para la estimulación, que permite hacer mediciones de algunas propiedades de las neuronas intrínsecas tales como cronaxia y Reobase 5, para comparar las propiedades de las neuronas sanas y enfermas 27, para encontrar formas óptimas para estimular las culturas como una función de su estructura y muchos más nuevos enfoques. Algunos ejemplos se presentan en las siguientes figuras.
La Figura 3 muestra la 1D modelada configuraciones que están grabados en la capa de bio-rechazo. Las líneas finas de alrededor de 170 micras de ancho son típicamente inscriben que pueden, por ejemplo, ser anillos concéntricos con radios diferentes (Figura 3A) o líneas paralelas, típicamente ~ 11 mm de largo (Figura 3B).
nt" fo: keep-together.within-page = '1'> El panel superior de la Figura 4 muestra una imagen típica de la actividad fluorescente en el cultivo, tomada con un dispositivo de carga acoplada (CCD) y muestra una imagen de la etiqueta fluorescente neuronas en un cultivo 2D. en este ejemplo se muestran tres regiones de interés diferentes, marcados en. trazas de intensidad de fluorescencia integrados negros, verdes y rojos se muestran en el panel inferior de la Figura 4, medida en estas tres regiones de interés diferentes (huellas están en el color correspondiente de la ROIs). Como muestra la inserción, dentro de la resolución de 200 ms de tiempo de adquisición de fotograma en el que se tomó esta de datos en particular, todas las neuronas de las tres regiones de interés diferentes estallan simultáneamente.El aparato básico utilizado para la estimulación por una uni-direccional, campo eléctrico constante se muestra en la Figura 5A. Los hilos de los electrodos se sumergen en el medio de grabación, de aproximadamente 1 mm por encima de la cultura neuronal.La forma del impulso básico utilizado para la estimulación eléctrica se muestra en la Figura 5B. Cuando se aplica este impulso de tensión que crea un campo eléctrico constante que voltea su orientación de 180 ° después de la mitad del ciclo. El cambio en la dirección del campo después de medio ciclo se utiliza para evitar la electrólisis y el daño a los electrodos. voltajes típicos aplicados a los electrodos son ± 22 V, y la duración del pulso típico para la estimulación de los cultivos 2D es del orden de 100 - 500 mu s.
Para el control de cualquier anisotropía en el crecimiento de neuritas, se verificó que la estimulación de los cultivos 2D es isotrópico. Al girar manualmente los electrodos en los 360 ° a 15 ° resolución (Figura 5C) se ve que no hay preferencia de orientación para la estimulación. Cada color en la Figura 5C representa la estimulación de una cultura diferente. La distancia desde el origen representa el mínimo duración necesario para la estimulación con una amplitud constante. Es evidente que, con una buena aproximación, los cultivos 2D no tienen una orientación preferida para la estimulación eléctrica.
Dado que el único par de electrodos está limitado en que tiene una dirección definida para el campo (aunque puede ser volteado), hemos desarrollado un aparato para la estimulación eléctrica con dos pares de electrodos (Figura 6A). Un esquema de la cultura (fondo circular gris, manchas más oscuras son los cuerpos celulares) y de los electrodos (líneas gruesas paralelas) se muestra en la Figura 6B. Cuando las formas de onda, que se muestran como insertos azul y verde en la Figura 6B, son coseno y ondas sinusoidales y se aplican conjuntamente a continuación, un campo vector E de rotación se produce. Cuando los impulsos de tensión son cuadrados, tienen diferentes amplitudes y tienen retardo de fase cero entre ellos, entonces crean un campo constante con la orientación deseada determinada por el ramplitud elative entre los dos pares de electrodos. Esta rotación eléctrica es una mejora evidente sobre la rotación manual, mecánica que se utilizó para obtener la distribución angular de los puntos fuertes de estimulación en la Figura 5C. Por supuesto, como muestra la figura 6C, también es posible usar esta configuración para excitar una sola dirección fija, posiblemente como un control, mediante la activación de un solo par de electrodos.
Estas configuraciones se utilizaron para excitar cultivos neuronales 2D ya sea con un campo giratorio o un campo de ángulo fijo, con la misma raíz cuadrada media tensión (RMS) y luego comparar la duración de pulso necesaria para excitar la cultura cuando la amplitud es fijo. Hemos encontrado que cuando se utiliza un campo eléctrico giratorio con una amplitud constante de ± 22 V, una duración media de 150 ± 14 mu s se necesitaba para lograr la estimulación, mientras que con un solo campo eléctrico dirección una duración media dese necesitan 290 ± 30 mu s. por lo tanto, 0,53 ± 0,02 La relación entre las duraciones necesarias para excitar el cultivo con un giratorio frente a un campo de ángulo fijo es.
Dado que en un cultivo 2D los axones se extienden en todas las direcciones, el campo giratorio es capaz de excitar muchos de los axones. Por el contrario, con el campo de orientación solo hay sólo unos pocos axones orientado en ese ángulo específico y no se consigue excitación axonal. Cuando se aumenta la duración, existe la posibilidad de excitar otras partes de la neurona y, en particular, las dendritas. Esto se explica más adelante en la descripción de las mediciones cronaxia. El hecho de que se necesitan duraciones mucho más cortos para la excitación de la misma cultura cuando se utiliza un campo de rotación es de gran importancia cuando se utilizan campos externos para la estimulación cerebral, ya que existen limitaciones a menudo técnicas sobre las duraciones de pulso.
la Figura 7. En la figura 7A una red desconectada 1D se estimula con el campo eléctrico, ya sea a lo largo de la línea de la cultura (a 0 ° durante la estimulación axonal) o perpendicular a la línea de la cultura (a 90 ° para la estimulación dendríticas) por dos pares de electrodos. A medida que aumenta la tensión, más neuronas serán estimulados, y esto se refleja por la gripeintensidad orescence, que es proporcional al número de neuronas estimuladas (véase la Figura 7B). El aumento de amplitudes de tensión se utilizan para estimular gradualmente toda la cultura. Cada neurona tiene un voltaje umbral mínimo (para una duración de impulso específico) que va a responder a, y por la ley de los grandes números, se espera que la distribución de estos umbrales para ser Gauss. Por lo tanto, si nos fijamos en el número de neuronas que respondieron y el argumento en contra de la tensión aplicada, la distribución será una distribución de Gauss acumulada, que es una función de error (ERF) 5. El número de neuronas que responden a una amplitud específica de campo eléctrico tiene aproximadamente una distribución de Gauss, y por lo tanto la fluorescencia está bien descrita por su integral - una función de error de la amplitud del campo estimulante (Figura 7C).
La figura 7C se utiliza a eXtract un parámetro, la expectativa (media) de la distribución. Esto se realiza mediante el ajuste de una distribución de Gauss acumulativo y obtener el mejor ajuste. Esta expectativa es la tensión aplicada a las que responderá el 50% de las células. Este proceso se repite para varias duraciones de pulso (que van desde 100 mu s a 4 ms). La tensión media a la que respondió el cultivo se representa frente a la duración del impulso para obtener la curva de fuerza-Duración. Se realizaron dos conjuntos de mediciones. En el primero el campo fue paralelo al del patrón, y en el segundo que era perpendicular a la misma. Se ha demostrado previamente 15, 23 que los axones se alinean con el patrón, mientras que las dendritas crecen en todas direcciones. Esto da dos curvas de fuerza-duración diferente, que son muy útiles para obtener una clara diferencia entre la axonal y la excitación dendrítica. La separación total de las contribuciones dendríticas y axonales se consigue por el hecho conocido que el axónal constante para la excitación de tiempo es mucho más corto que los dendríticas 2, 3, 4.
Las curvas de fuerza-Duración son entonces ajuste a la ecuación de decaimiento cronaxia 
, Donde V es la tensión de rh Reobase y C es la cronaxia. En duraciones de pulso de T <1 ms es los axones que están emocionados primera y causar la neurona al fuego, que tiene un valor más bajo para la tensión de excitación en la curva de fuerza-Duración. Axonal cronaxia se calculó que era 110 mu s. En contraste sorprendente, por excitación a largos períodos de tiempo (T> 1 ms) el compartimiento dendrítica es la fuente de excitación para la neurona con una cronaxia dendríticas calculado en 900 mu s.
Los principios estimulación de cultivos 2D y 1D subyacentes con un cirbobina cular se describen en la Figura 8. Para obtener una mejor comprensión de la situación física, simulaciones numéricas de los campos eléctricos y magnéticos inducidos se producen utilizando el paquete COMSOL. Para estimular las culturas 1D se usa una bobina magnética circular, posicionado concéntricamente por encima de la placa de Petri. Las neuronas se cultivaron en anillos circulares sobre un cubreobjetos redondo que se coloca dentro de la placa de Petri para la grabación. En este caso, el campo eléctrico inducido se puede calcular analíticamente y es igual a E max = k 1 Br, donde E max es la amplitud máxima del campo eléctrico inducido y se dirige a lo largo de la tangente de los anillos con radio r. B es la amplitud del impulso magnético y k 1 es una constante de proporcionalidad dimensional que puede ser medido usando una bobina de recogida.
El cálculo numérico COMSOL del campo magnético created por la bobina en la cultura 1D se muestra en el panel superior de la Figura 8A (líneas de corriente rojo). En el panel inferior de la Figura 8A el cálculo se presenta para el campo eléctrico inducido. La estimulación de una cultura 2D con una configuración de bobina cruzado se muestra en la Figura 8B. Para estimular cultivos 2D se utilizó una bobina transversal que produce campos magnéticos rotativos, situados con un cultivo neuronal 2D en su interior, se coloca en un recipiente de vidrio esférica que se llena con medio de grabación (EM). En este caso, el campo eléctrico inducido ya no puede calcularse analíticamente. La bobina transversal se representa en el panel superior de la Figura 8B, con el recipiente esférico colocado dentro de las dos bobinas y el cubreobjetos de vidrio de soporte del cultivo 2D colocado en el fondo del recipiente. Para escala, el diámetro interior de la bobina interior es de 65 mm. Las simulaciones numéricas utilizando COMSOL con el modelo de Corrientes 3D Eddy se muestran en el panel inferior,retratar el campo eléctrico inducido en la superficie interior del recipiente esférica. Una imagen de microscopio de campo brillante de un cubreobjetos de vidrio con cultivos neuronales 1D típicas utilizadas para la estimulación se muestra en la Figura 8C. Las líneas blancas muestran las neuronas en las líneas estampadas, que están orientados tanto tangencialmente y radialmente para la comparación experimental y el control sobre el efecto de la direccionalidad.
Geometría de la cultura 1D juega un papel importante en la determinación de si una cultura se disparará en respuesta a la estimulación magnética. Sólo el 22% de los cultivos de anillo 1D respondió a la estimulación magnética. La tasa de excitación éxito dependía en gran medida de longitud lineal de la cultura, y como muestra la Figura 9A, más del 60% de los cultivos que son más de 80 mm de responder a la estimulación magnética. Esto implica que las condiciones especiales son necesarios para la respuesta magnética. Para investigar esta dependencia culturas geométricas wERE cultiva en configuraciones que son partes de los anillos - tiene el mismo radio pero diferentes longitudes modelando ellos en los arcos en vez de en círculos completos (ver Figura 8C)
Una investigación exhaustiva de los umbrales de campo magnético como una función del radio de las culturas anillo 1D se muestra en la Figura 9B. Los círculos blancos representan mediciones experimentales de los umbrales de estimulación, mientras que la codificación de color indica la probabilidad calculada para medir un umbral de excitación. Un umbral de estimulación se define como el campo más débil que todavía provoca una respuesta para un cultivo neuronal dada.
La Figura 9B destaca la tendencia de que los anillos más grandes tienen umbrales de estimulación más bajas, con una clara correlación inversa entre el radio de los anillos y el umbral de estimulación. Por ejemplo, el anillo mm promedio 14 responde a Magnpulsos etic con amplitud de 1,5 T mientras que el anillo media 7 mm sólo responde a 3 T o más. Esto se espera a partir del cálculo teórico del campo eléctrico inducido, que se representa como el código de color predijo probabilidad para disparar. De hecho, el campo eléctrico inducido por 3T a un radio de 7 mm es igual a la inducida por 1,5 T a dos veces el radio. En resumen, el umbral medio campo eléctrico es 301 ± 128 (desviación estándar) V / m, independiente del radio de los cultivos de anillo.
En contraste con la bobina circular individual, que no pudo provocar la respuesta en cultivos 2D, 15 de 30 2D culturas que se estimularon mediante la rotación de la estimulación magnética campo respondieron con estallido de excitación neuronal. Las dos bobinas independientes que están posicionados perpendiculares entre sí (Figura 8B) generan giratorio campos eléctricos y magnéticos inducidos. Cada bobina está conectado a su propia MS, ambos de los cuales Discharge corrientes similares en un retardo de fase de 90 grados. La amplitud del campo eléctrico inducido por cada una de las dos bobinas en la configuración de la bobina transversal se representa en la figura 10A, y las mismas huellas están representados en la figura 10B por una representación polar de la dirección y la amplitud del campo eléctrico superpuesto de las dos bobinas . El campo eléctrico inducido resultante escanea 270 grados del espacio real en un campo máximo de ~ 270 V / m.
Figura 1: Representación esquemática de la configuración utilizada para la estimulación eléctrica de neuronales culturas. La señal deseada se produce por un generador de señal con dos salidas que no tienen una base común. Estas señales son amplificadas para dar una tensión de salida de hasta ± 30 V. Las señales eléctricas se alimentan entonces a través de dos pares separados de electrodos, estimulando una cultura neuronal en twO ortogonales y direcciones independientes. La estimulación de las neuronas puede ser visto y supervisado por los tintes de calcio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Representación esquemática de la configuración utilizada para la estimulación magnética de neuronales culturas. A. En la parte superior se muestra la bobina magnética (círculos azules), que está situado a 5 mm concéntricamente por encima de la cultura anillo neuronal, colocado en una placa de Petri (contorno azul). Una bobina de recogida (círculo rojo) colocado en la circunferencia de la placa de Petri mide el voltaje inducido por el impulso magnético. En el fondo se muestra la dinámica de medida de la bobina de estimulador magnético (usando una carga de tensión del condensador MS de 5000 kV), como integrado a partir de la bobina de recogida. Inducida por un campo eléctrico (calculated para un radio de anillo de 14 mm) se representa en verde, mientras que el campo magnético se representa en azul B. Un imágenes microscopio invertido colorantes fluorescentes sensibles a los transitorios de calcio de las neuronas que reaccionan a los pulsos magnéticos. C. Las neuronas cultivadas en un patrón de anillos concéntricos, que se utiliza para una estimulación eficaz por el estimulador magnético anillo. D. imagen de microscopio de campo claro de las neuronas cultivadas en una sola línea del patrón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ejemplos de patrones de culturas 1D neuronales usados para orientar el campo eléctrico con la dirección de axonal Crecimiento. A. patrón circular se utiliza para la bobina magnética circular, cuando el ele inducida campo ctric tiene una orientación circular. Patrones B. de línea se utilizan cuando el campo eléctrico inducido o directo tiene una única orientación.
Figura 4: Ejemplo Las huellas de los transitorios de calcio imágenes se obtienen síncronos de red ráfagas. A. Una imagen de neuronas que fueron teñidos anterior al experimento con un colorante de calcio. B. trazas de intensidad versus tiempo de las ROIs en A con el color de la traza que representa el color de la frontera de la ROI en A. Un gran aumento en la intensidad sincronizado dentro de las tres regiones de interés representa una ráfaga de red. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 5: Configuración básica para la estimulación eléctrica, utilizando un par de electrodos de baño paralelas para determinar que culturas 2D no tienen orientación preferida de la estimulación eléctrica. A. Los aparatos utilizados para la estimulación de cultivo. El campo eléctrico se produce mediante la aplicación de voltaje a los electrodos de alambre de platino. La distancia entre los dos alambres es de 13 mm. B. Un ejemplo de una señal de voltaje a aplicar en los electrodos en A. La forma bipolar del pulso ayuda a prevenir la electrólisis de la solución de grabación en los electrodos. C. Al estimular una cultura 2D en diferentes rotaciones de los electrodos, hay isotropía de la respuesta neuronal. D. Un ejemplo de la medición de campo eléctrico usando la sonda descrita en el paso 2.2. El campo eléctrico es uniforme a un error de hasta el 10%. Esta figura se ha modificado a partir de 5.cargar / 54357 / 54357fig5large.jpg" target = '_ blank'> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Estimulación eléctrica con dos pares de electrodos permite la rotación del campo eléctrico y para la estimulación en cualquier ángulo deseado. A. Para producir formas más complicadas del campo eléctrico, se necesitan dos pares de electrodos independientes. B. La aplicación de un pulso en forma de tensión de coseno a un electrodo y un pulso sinusoidal al segundo electrodo crea un campo eléctrico giratorio con amplitud constante. C. La aplicación de un pulso de voltaje cuadrado a un par de los electrodos crea un campo eléctrico uniforme unidireccional. Esta figura se ha modificado a partir de 5. Por favor, click aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Red de desconexión por bloqueo sinápticas entradas (como se describe en 2.4.2) permite la observación de la población total de células individuales que son estimulados por un campo eléctrico de Dada. A. Mediante la aplicación de diferentes amplitudes de impulsos de tensión a los dos pares de electrodos, el campo eléctrico se puede orientar a cualquier ángulo, sin necesidad de activar manualmente la cultura. B. Ejemplo grabaciones de los transitorios de calcio con estimulación eléctrica a diferentes voltajes aplicados. Cuatro trazas se muestran, ligeramente desplazado verticalmente para permitir la visualización. Los valores de tensión se escriben debajo de las huellas azules. C. Cuando se aplica una duración constante de campo eléctrico, el número de neuronas que se disparará en respuesta al campo eléctrico tiene un dist acumulativofunción ribution (CDF) que es una distribución acumulativa gausiana (o una función erf) como una función de la amplitud de la tensión (que es proporcional a la intensidad de campo). D. Un ejemplo de una curva de fuerza-Duración obtenido al tiempo que emplean este protocolo. Esta figura se ha modificado a partir de 5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Configuración de la bobina magnética y Cálculo del campo eléctrico inducido. A. En la parte superior es una bobina circular (círculos azules) está posicionada 5 mm por encima de las culturas anillo neuronales unidimensionales (disco azul). Los anillos son paralelos y concéntrica con la bobina, lo que crea un impulso magnético que está orientado a lo largo de las líneas rojas. Por la ley de Faraday, el campo eléctrico inducido se encuentra en planos paralelos a lo largo de la bobina de anillos concéntricos con ella. En el fondo es una sección transversal horizontal a lo largo del plano de las culturas de anillo. El valor relativo del campo eléctrico es un código de colores, con la dirección representada por las flechas. anillos más grandes encierran un área mayor de flujo y por lo tanto el campo eléctrico inducido no es más alta. B. Imagen de la estimulador transversal bobina magnética (arriba) y una simulación del campo eléctrico que es inducida por la misma. C. patrón usado para crecer neuronas que pueden ser estimuladas ya sea con un campo eléctrico circular o un campo eléctrico radial. Esta figura se ha modificado a partir de 21, 28. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 9: Respuesta de los cultivos de anillos al campo magnético. A. La tasa de éxito de la estimulación crece con el radio del cultivo. Las barras de error representan el error estándar (SE). B. Se describe la relación entre el tamaño del anillo y la intensidad del campo magnético. La probabilidad de excitar el cultivo está codificada por colores. De hecho, la mayoría de las excitaciones exitosas de las culturas se encuentran en la superposición entre el espacio de fase experimentalmente accesible (rectángulo blanco) y la región de alta probabilidad (rojo). Esta cifra se ha modificado de 21 . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 10: Campo giratorio de configuración del campo magnético. </ strong> A. Con el fin de inducir un campo eléctrico giratorio cuando la estimulación con el estimulador magnético transversal de la bobina, se necesita un desplazamiento de fase de 90 grados entre las dos bobinas. Se muestra es el campo eléctrico inducido en una bobina de recogida posicionada en 2 alas vecinas de la bobina de hoja de trébol. Las bobinas fueron impulsados por separado por 2 estimuladores comerciales. B. Una reconstrucción, utilizando las curvas mostradas en A, de la amplitud del campo eléctrico resultante y dirección durante un pulso de la bobina de hoja de trébol. Esta figura se ha modificado a partir de 21, 28. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
patrón 1D es una herramienta importante que se puede utilizar para una variedad de aplicaciones. Por ejemplo, hemos utilizado 1D patrón para crear puertas lógicas a partir de cultivos neuronales 29 y más recientemente para medir la cronaxia y Reobase de neuronas de hipocampo de rata 5, y la ralentización de la velocidad de propagación de la señal de la actividad de disparo en Down neuronas síndrome del hipocampo en comparación con el de tipo salvaje (WT) neuronas del hipocampo 27. El protocolo sugerido para 1D patrón es robusto y es fácil para formar cualquier patrón deseado. Sugerimos para observar la cultura 1D antes de las mediciones sean conscientes de las posibles desconexiones de la red, que pueden afectar su función.
Modelado químico de configuraciones neuronales tiene una distinguida historia de 30, 31, 32. Hemos encontrado que nuestro rendimiento de enfoques resultados similares a los patrones químicos, sin embargo, son más robustas y más fácil de alcanzar. Recientemente, la opción para los patrones de microfluidos de las neuronas se ha convertido en una alternativa interesante para el enfoque que ofrecemos, con simplicidad comparable y facilidad de uso 33, 34. El enfoque de microfluidos está siendo utilizado en nuestro laboratorio en paralelo con el método de grabado descrito aquí.
Como mostramos 5, los cultivos 2D tienen ninguna orientación preferida y su estimulación es isotrópica y no depende de la orientación del campo aplicado. Se necesitan duraciones más cortas para la estimulación de los cultivos 2D cuando el campo está girando. En contraste, los cultivos 1D son muy dependientes de la orientación del campo. Cuando el campo se orienta con el patrón (y por tanto con la dirección del crecimiento axonal), la duración de una amplitud fija campo necesario para la estimulación es mucho más corto que cuando el campo es orientared perpendicular al patrón. Del mismo modo, si la duración se mantiene constante, entonces el campo necesaria para excitar la cultura es menor si el campo y el patrón son paralelas. Al estimular perpendicularmente, el impulso de campo tiene que ser mucho más largo (en el orden de una milésima de segundo, cuando la red está desconectado) y, a continuación principalmente se estimulan las dendritas. Cuando se utilizan campos eléctricos (ya sea directa o inducidos por un campo magnético) para la estimulación del cerebro, esto es de extrema importancia. Si el área del cerebro que se conoce apuntado para tener haces de axones, estos axones pueden ser excitados mediante la orientación del campo en su dirección y luego necesitar menos potencia o una duración más corta del campo para la estimulación. Si la región del cerebro específica no preferido de orientación, a continuación, un campo giratorio es más eficiente para la estimulación. Si dendritas son el objetivo de la estimulación, los pulsos más largos son más eficaces.
Los campos magnéticos pueden estimular la actividad neuronal cuando un pulso magnético induces un campo eléctrico que excita las neuronas. Debido a pulsos magnéticos actualmente alcanzables son microsegundos de duración, dendritas, cuyo tiempo de respuesta es del orden de milisegundos, no se espera que sean sensibles a la estimulación magnética. Por el contrario, los axones, cuyo tiempo de respuesta es más rápida, son el objetivo de la estimulación 2, 3. La respuesta de los axones a la excitación eléctrica es máxima cuando son paralelas al campo eléctrico y disminuye cuando están perpendicular a ella 1, 35; Por lo tanto, en la excitación magnética, nos esforzamos para establecer sistemas donde el campo eléctrico inducido orienta paralelo a los axones dirigidos. Por lo tanto, cuando la estimulación de un anillo de 1D, el campo debe ser orientado paralelamente a los axones, y el tamaño del anillo determina el umbral para la estimulación. Similares para la estimulación directa por los electrodos de baño, para estimular una cultura 2D, una rotación inducida electric campo es mucho más eficiente.
La combinación de los patrones de las neuronas y de la excitación externa con el campo eléctrico o magnético es una tecnología potente, con muchas aplicaciones futuras posibles. Cronaxia y Reobase, así como umbral para la dinámica de activación y de propagación de activación y las velocidades son todos los parámetros que están diciendo de propiedades intrínsecas de un cultivo neuronal. En particular, los tratamientos terapéuticos y el efecto de las drogas o el tratamiento farmacológico pueden ser inmediatamente ensayaron directamente sobre las neuronas. Esto permitiría a un eficiente control de las neuronas modelo de la enfermedad y de los protocolos de estimulación TMS. En una dirección más conceptual, la capacidad de estimular cultivos neuronales conduce precisamente a nuevas posibilidades en cuanto a los aspectos de procesamiento de información de configuraciones neurales, y nos permite prever circuitos impresos micro que combina la estimulación electrónica con vivir redes neuronales para proporcionar nuevo cálculodispositivos AL y nuevos dispositivos cerebrales de interfaz.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Ofer Feinerman, Fred Wolf, Menahem Segal, Andreas Neef y Eitan Reuveny de discusiones muy útiles. Los autores agradecen a Ilan Breskin y Jordi Soriano para el desarrollo de las primeras versiones de la tecnología. Los autores agradecen a Tsvi Tlusty y Jean-Pierre Eckmann para obtener ayuda con los conceptos teóricos. Esta investigación fue apoyada por la Fundación Minerva, el Ministerio de Ciencia y Tecnología, Israel, y por la Fundación de Ciencias de Israel subvención 1320-1309 y la beca de la Fundación Nacional de Ciencias Bi-2008331.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APV | Sigma-Aldrich | A8054 | Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2 |
| B27 supp | Gibco | 17504-044 | Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| bicuculline | Sigma-Aldrich | 14343 | Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2 |
| Borax (sodium tetraborate decahydrate) | Sigma-Aldrich | S9640 | Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2 |
| Boric acid | Frutarom LTD | 5550710 | Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2 |
| CaCl2 , 1 M | Fluka | 21098 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| CNQX | Sigma-Aldrich | C239 | Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2 |
| COMSOL | COMSOL Inc | Multiphysics 3.5 | Numerical simulation. Mentioned in Section 3.5.2 |
| D-(+)-Glucose, 1 M | Sigma-Aldrich | 65146 | Plating medium, Extracellular recording solution. Mentioned in Sections 1.1.1 and 1.5.2 |
| D-PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Cell Cultures. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6 |
| FCS (FBS) | Gibco | 12657-029 | Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6 |
| Fluo4AM | Life technologies | F14201 | Imaging of spontaneous or evoked activity. Mentioned in Sections 1.5.1, 1.5.3, and 1.5.5 |
| FUDR | Sigma-Aldrich | F0503 | Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1 |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1272 | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| GlutaMAX 100x | Gibco | 35050-038 | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| Hepes, 1 M | Sigma-Aldrich | H0887 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| HI HS | BI | 04-124-1A | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Sections 1.1.1, 1.4.1, and 1.4.2 |
| KCl, 3 M | Merck | 1049361000 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6 |
| MEM x 1 | Gibco | 21090-022 | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.4.1 1.4.2 |
| MgCl2 , 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| NaCl, 4 M | Bio-Lab | 19030591 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| Octadecanethiol | Sigma-Aldrich | 01858 | Cleaning Cr-Au coated coverslips (1D cultures). Mentioned in Section 1.2.3 |
| Pluracare F108 NF Prill | BASF Corparation | 50475278 | Bio-Rejection Coating, Bio Coating. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6 |
| Poly-L-lysine 0.01% solution | Sigma-Aldrich | P47075 | Promote cell division. Mentioned in Section 1.1.4 |
| Sucrose, 1 M | Sigma-Aldrich | S1888 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| Thiol | Sigma-Aldrich | 1858 | Bio-Rejection Coating. Mentioned in Section 1.2.3 |
| URIDINE | Sigma-Aldrich | U3750 | Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1 |
| Sputtering machine | AJA International, Inc | ATC Orion-5Series | coating glass with thin layers of metal. Mentioned in Section 1.2.2 |
| Pen plotter | Hewlett Packard | HP 7475A | Etching of pattern to the coated coverslip. Mentioned in Section 1.2.5 |
| Electrodes wires | A-M Systems, Carlsborg WA | 767000 | Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Sections 2.1, 2.2, 2.3, and 2.4.5 |
| Signal generator | BKPrecision | 4079 | Shaping of the electric signal. Mentioned in Section 2.3 |
| Amplifier | Homemade | Voltage amplification of the signal from the signal generator to the electrodes. Mentioned in Section 2.3 | |
| Power supply | Matrix | MPS-3005 LK-3 | Power supply to the sputtering machine. Mentioned in Section 1.2.2.3 |
| Transcranial magnetic stimulation | Magstim, Spring Gardens, UK | Rapid 2 | Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Sections 3.1, 3.3, and 3.4 |
| Epoxy | Cognis | Versamid 140 | Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4 |
| Epoxy | Shell | EPON 815 | Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4 |
| Platinum wires 0.005'' thick; A-M Systems, | Carlsborg WA | 767000 | Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1 |
| Circular magnetic coil | Homemade | Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.3 | |
| WaveXpress SW | B&K Precision | Waveform editing software. Mentioned in Section 2.1.32 | |
| Xion Ultra 897 | Andor | Sensitive EMCCD camera. Mentioned in Section 2.4.4 |
References
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