Summary
culturas neuronais são um bom modelo para o estudo de técnicas emergentes de estimulação do cérebro através de seus efeitos sobre os neurônios individuais ou uma população de neurônios. Aqui apresentados são diferentes métodos para a estimulação de culturas neuronais modeladas por um campo eléctrico produzido directamente por eléctrodos de banho ou induzida por um campo magnético variável no tempo.
Abstract
Um neurónio irá disparar um potencial de acção, quando o seu potencial de membrana excede um determinado limiar. A actividade típica do cérebro, isto ocorre como resultado de entradas químicos às suas sinapses. No entanto, os neurônios também pode ser excitado por um campo eléctrico imposto. Em particular, aplicações clínicas recentes ativar os neurônios, criando um campo elétrico externo. Por isso, é de interesse para investigar como o neurônio responde ao campo externo eo que faz com que o potencial de ação. Felizmente, a aplicação precisa e controlada de um campo eléctrico externo é possível que as células neuronais embrionárias que são excisados, dissociadas e cultivadas em culturas. Isso permite que a investigação dessas questões em um sistema altamente reprodutível.
Neste artigo algumas das técnicas utilizadas para aplicação controlada de campo elétrico externo em culturas neuronais são revistos. As redes podem ser unidimensional, ou seja padronizado em lineaformas R ou deixadas a crescer em todo o plano do substrato, e, assim, bidimensional. Além disso, a excitao pode ser criada por aplicação directa do campo eléctrico através de eléctrodos imersos no fluido (eléctrodos de banho) ou através da indução do campo eléctrico utilizando o criação remota de impulsos magnéticos.
Introduction
A interacção entre os neurónios e os campos eléctricos externos tem implicações fundamentais, bem como os práticos. Embora seja conhecido desde os tempos de Volta que um campo eléctrico aplicado externamente pode excitar tecido, os mecanismos responsáveis para a produção de um potencial de acção resultante em neurónios são apenas recentemente começando a ser desvendado 1, 2, 3, 4. Isto inclui encontrar respostas a perguntas sobre o mecanismo que causa despolarização do potencial de membrana, o papel das propriedades da membrana e de canais iônicos, e até mesmo a região do neurônio que reage ao campo elétrico 2, 5. Terapêutico neuro 6, 7, 8, 9, A medição da interação dentro do cérebro in vivo acrescenta um componente importante a esta compreensão, mas é dificultada pela imprecisão e baixa controlabilidade das medições dentro do crânio. Em contraste, as medições em culturas podem ser facilmente realizadas em alto volume com alta precisão, excelente desempenho sinal-ruído e um alto grau de reprodutibilidade e de controle. Usando culturas uma grande variedade de propriedades neuronais do comportamento coletivo da rede pode ser elucidada 11 , 12 , 13 , 14 , 15, 16. De igual modo, este sistema é bem controlada esperado ser altamente eficientes para elucidar o mecanismo pelo qual outros métodos de estimulação trabalhar, por exemplo, como a abertura do canal durante a estimulação óptica em neurónios optogenetically activas 17, 18, 19, é responsável pela criação de potencial de acção. Aqui, o foco está em descrever o desenvolvimento e compreensão das ferramentas que podem eficientemente excitam o neurônio através de um campo elétrico externo. Neste documento descreve-se a preparação de bidimensional e unidimensional culturas de hipocampo estampados, estimulação utilizando diferentes configurações e orientação de um campo eléctrico aplicado directamente por eléctrodos de banho, e, finalmente, a estimulação da bidimensional e modelado culturas unidimensionais por um tempo variando no campo magnético, o que induz um campo eléctrico5, 20, 21.
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Protocol
Declaração de Ética: Os procedimentos envolvendo manuseio de animais foram feitos de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Instituto Weizmann de Ciência e a lei israelense apropriada. O Instituto Weizmann é credenciado pela Associação de Avaliação e Acreditação do Laboratório Animal Care International (AAALAC). O Comitê Institucional de Cuidados e Uso Animal de Weizmann aprovou este estudo, conduzido com os neurônios do hipocampo.
1. Preparação de culturas hipocampais bidimensionais (2D) e unidimensionais (1D)
- Preparação de lamínulas para culturas 2D.
- Preparar o meio de revestimento (PM) composto por: 0,9 mL de meio essencial mínimo (MEM) + 3G, 0,05 mL de soro fetal de vitelo (FCS), 0,05 mL de soro de cavalo inativado pelo calor (HI HS) e 1μL de suplemento B27. Nota: MEM + 3G contém para cada 500 mL de MEM x 1, 1 mL de gentamicina, 5 mL de L-glutamina estabilizada 100x (ver
- Preparar tampão borato composto por: 1,9 g de bórax (tetraborato de sódio deca-hidrato) em 200 mL de água duplamente destilada (ADD) (mistura a 60 ° C) e 1,24 g de ácido bórico em 200 ml de DDW. Titula-se a solução final a pH 8,5 utilizando HCl 1 M. Nota: A solução final é de 400 ml de 0,1 M tampão de borato.
- Imergir lamelas de vidro em ácido nítrico a 65% durante 2 h. Lavar três vezes em DDW, seguido por três lavagens com reagente analítica absoluta (ABS AR) etanol.
- Passar cada lamela rapidamente através da chama de um queimador de Bunsen duas ou três vezes por 1 - 2 s, e, em seguida, deixou-se incubar durante a noite em placas de 24 poços com uma solução a 0,01% de poli-L-lisina ml diluída 1: 5 em tampão de borato ( 0,1 M, pH 8,4). Em seguida, lavar lamelas em DDW três vezes e deixar com um PM mL por poço num padrão de 37 ° C, 5% incubadora de CO 2 durante a noite.
- Preparar o meio de revestimento (PM) composto por: 0,9 mL de meio essencial mínimo (MEM) + 3G, 0,05 mL de soro fetal de vitelo (FCS), 0,05 mL de soro de cavalo inativado pelo calor (HI HS) e 1μL de suplemento B27. Nota: MEM + 3G contém para cada 500 mL de MEM x 1, 1 mL de gentamicina, 5 mL de L-glutamina estabilizada 100x (ver
- Preparação de lamelas para culturas 1D.
- Limpe glamelas lass por imersão em uma solução de base piranha consistindo de 75 mL de DDW, 25 mL de solução de amoníaco a 25% e 25 mL de 30% de peróxido de hidrogénio. solução lugar com as lamelas de vidro sobre uma placa de aquecimento a ~ 50 ° C durante 30 min e, em seguida, secar a lamelas de vidro com azoto.
- lamelas de revestimento primeiro por uma película fina de crómio (99,999%) de 6 de espessura, seguida por uma camada de 30 Å de ouro (99,999%), usando qualquer um de vapor ou deposição por pulverização catódica.
- Para conseguir uma taxa de pulverização catódica de 0,05-1 a / s usar uma máquina de pulverização catódica com 2 E-vigas e um sistema de vácuo de 260 l / s com alvo tamanhos 2" e 4" . Use uma etapa de rotação que pode ir de 0 - 100 rotações por minuto (RPM). Use uma corrente contínua (DC) por pulverização catódica poder de 0 - 750 Watts.
- Usar uma rotação de 30 rpm e árgon 99,999% para obter plasma a 10 mTorr pressão na câmara.
- Operar a fonte de alimentação dos canhões de pulverização de 40 W de energia DC de descarga eléctrica durante o cromo, levando a ~ 0,12 Å / s taxa de cobertura, e a 10 W DC sputter poder para o ouro, levando a ~ 0,28 Å / s.
- Dissolver 0,1 g de 1-octadecanotiol em 100 mL de etanol ABS AR utilizando ultra-som durante 30 min. Colocar lamínulas revestidas de Cr-Au durante 2 h nesta solução, em seguida, lavar com etanol ABS AR e secar com azoto.
- Preparar uma solução de 100 mL de solução salina tamponada com fosfato Dulbecco (D-PBS) e 3,5 g de um copolímero tribloco (ver Tabela de Materiais / Reagentes ) por agitação durante 1 - 2 h a 600-700 rpm. Coloque lamínulas na solução por 1 h. Seque lamínulas com nitrogênio.
- Mecanicamente gravar o padrão desejado arranhando a camada de bio-rejeição 22 . Faça isso usando um plotter caneta, onde a caneta é substituída por uma agulha de gravação. Raspe o padrão através das camadas de metal para alcançar o vidro subjacente. Controle este processo por um computador para conseguir um padrão replicado desejado. Padrões formados por este processo são d na Figura 2 e na Figura 3.
- Prepara-se uma camada de bio-compatíveis de 100 ml de D-PBS, 3,5 g de tri-bloco de co-polímero, 35,7 uL / mL de fibronectina e 29 ul / ml de laminina.
- Esterilizar lamelas em luz ultra-violeta durante pelo menos 10 min. Incubar lamelas na solução durante a noite bio-compatível preparado.
NOTA: A camada de bio-compatível irá formar apenas quando a camada de bio-rejeição foi gravado fora no passo anterior. - No próximo dia lavagem lamelas duas vezes com P-DBS. Incubar lamínulas em PM durante a noite. Lamelas estão agora prontos para revestimento celular.
- Esterilizar lamelas em luz ultra-violeta durante pelo menos 10 min. Incubar lamelas na solução durante a noite bio-compatível preparado.
- Realizar dissecção de acordo com os procedimentos padrão que foram publicados anteriormente extensivamente 23, 24.
- Em resumo, hipocampo extracto ou córtex de embriões de rato, tipicamente no dia E19, ou a partir de ratinhos, tipicamente no dia E17 23,class = "xref"> 24.
- Dissociar células primeiro em solução de papaína por 20 - 30 min, seguido por trituração mecânica 24 com pipetas de vidro cujas pontas são fogo polido.
NOTA: Se as células provenientes de murganhos geneticamente modificados, em seguida, o tecido de cada embrião deve ser mantida num tubo de plástico separada 1,5 mL ao longo de todo o processo. - Contar as células com azul de tripano antes de semear.
NOTA: Para os animais geneticamente modificados a contagem deve ser feita separadamente para cada embrião. - Para culturas 2D, neurónios de rato de sementes em 750.000 e de rato em neurónios 850.000 células por poço. Para 1D, semear a 650.000 células por cavidade. Agitar ligeiramente placa imediatamente após a sementeira para assegurar a cobertura homogénea da lamela.
- Manutenção das culturas neuronais.
- Prepare mudando médio (CM) composto de (por ml):. 0,9 mL de MEM + 3G, 0,1 mL de HI HS, 10 ul de 5-fluoro-2'-desoxiuridina (FUDR) com 100x uridina </ Li>
- Prepare meio final (FM) de composto (por ml): 0,9 mL de MEM + 3G e 0,1 mL de HI HS.
- Substituir PM com 1-1,5 mL CM após 4 dias in vitro (DIV). Às 6 DIV, substituir 50% do CM com CM fresco. No DIV 8, mudar o meio de 1,5 mL de FM, seguido de uma variação de 50% de FM a cada 2 dias. Depois de cerca de uma semana a actividade espontânea síncrono emerge.
- Imagem da atividade espontânea ou evocada em culturas neuronais com corantes fluorescentes.
- Prepara-se uma solução de 50 ug de cálcio corante fluorescente sensível (ver Tabela de Reagentes Materiais /) em 50 mL de DMSO (sulfóxido de dimetilo).
- Preparar a soluo de registo extracelular (ME) contendo (em mM) 10 de HEPES, 4 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 139 de NaCl, 10 a D-glucose, 45 sacarose (pH 7,4).
- Incubar cultura neuronal em 2 mL de EM com 8 ul de solução de corante fluorescente sensível cálcio durante 1 h. Proteger da luz e rodar cuidadosamente para garantir Homogenpropagação ous do corante para as células.
- Substituir solução com EM fresco antes da imagiologia. A imagem fluorescente é demonstrado na Figura 4.
- Imagem num microscópio de fluorescência com filtros ópticos para imagiologia de fluorescência de cálcio (pico de excitação a 488 nm, pico de emissão a 520 nm), usando uma câmara e um software capaz de quantificar a intensidade de qualquer região de interesse (ROI) no interior do campo de visão de o microscópio.
2. Estimulação Elétrica de Culturas
NOTA: A configuração básica para a estimulação eléctrica é mostrada na Figura 1. Uma lamela de cobertura em que a cultura neuronal foi cultivado durante cerca de 14 dias é colocado numa placa de Petri com um microscópio de fluorescência. A actividade eléctrica dos neurónios é visualizada utilizando corantes sensível ao cálcio, enquanto é aplicada uma voltagem através de dois pares de eléctrodos de banho que está posicionado do lado de fora da cultura. Os eléctrodos são movidos por quantogerador ignal cuja saída é amplificado por um amplificador de dois canais. Controle de tensão de estimulação é preferido em relação ao controlo de corrente mais padrão 25, 26 porque os vectores de campo eléctrico são determinadas directamente, permitindo assim a adição de vectores simples e combinação. Isto requer uma verificação cuidadosa da uniformidade do campo elétrico, que pode ser realizada ao longo de toda a amostra para o caso de controle de tensão. Quando se utiliza o cuidado controle de tensão deve ser tomado para evitar quaisquer circuitos de terra e a homogeneidade do campo eléctrico deve ser verificado (ver 2.2 abaixo).
- Para a estimulação eléctrica com um campo eléctrico homogéneo usar um par de fios de eléctrodos paralelos.
- Utilizar eléctrodos de platina com uma espessura da ordem de 0.005 '' (127? M). Quando utilizado com as lamelas de 13 mm, garantir que a distância entre os dois eléctrodos é de cerca de 11 mm, e posicionar o eléctrodos 1 mm acima da cultura.
NOTA: Para fazer o suporte do eléctrodo (Figuras 5A e 6A) usar o politetrafluoretileno (PTFE). Perfurar orifícios estreitos através do PTFE para inserir os eléctrodos. O dispositivo deve ser mais elevada do que a solução extracelular de modo que a extremidade superior, em que os eléctrodos estão expostos, nunca entrar em contacto com a solução. Para isolamento, usar cola epóxi em qualquer parte dos condutores dos eléctrodos que pode ser expostas. - Usar uma forma de impulso quadrado com um ciclo de trabalho de 50%, sem nenhum componente de DC para evitar electrólise. Variar entre a duração de impulso 10 us e 4 ms para causar estimulação eficaz sem queimar a cultura. Assegure-se que a amplitude é da ordem de ± 22 V (ver a Figura 5). O pulso quadrado pode ser observado num osciloscópio ligado em paralelo com os eléctrodos.
NOTA: Para uma fácil programação de qualquer forma de onda desejada, use um software de edição de forma de onda comercial (ver lista Materiais
- Utilizar eléctrodos de platina com uma espessura da ordem de 0.005 '' (127? M). Quando utilizado com as lamelas de 13 mm, garantir que a distância entre os dois eléctrodos é de cerca de 11 mm, e posicionar o eléctrodos 1 mm acima da cultura.
- Para testar a homogeneidade do campo usar um eléctrodo de sonda. Utilizar uma grelha de, pelo menos, 1 mm x 1 mm, para permitir que a sonda a ser movido na área entre os eléctrodos e medir o potencial eléctrico.
- Medir o potencial elétrico. Usar
para calcular o campo elétrico. Usar um dos eléctrodos como um eléctrodo de referência. Medir o campo eléctrico com diferentes durações de pulso entre 100 uS a 4 ms (ver Figura 5B para um exemplo de 100 uS duração do pulso) para verificar que o campo é homogéneo dentro da gama de durações estimulantes.
NOTA: Ver Figura 5D para um exemplo de um campo eléctrico homogeneidade medido quando a duração do impulso era de 1 ms.
- Medir o potencial elétrico. Usar
- Utilizam-se 2 pares perpendiculares de eléctrodos de banho para a produção de formas mais complicadas de campo eléctrico, e aser capaz de orientar o campo em diferentes direcções (ver Fig. 6B). O dispositivo com 2 pares de eléctrodos será utilizado, e o sinal em cada par dos eléctrodos vai ser observada em dois osciloscópios separadas.
- Posicionar os eléctrodos de 1 mm acima da cultura e, a uma distância de 10 - 11 mm um do outro. Certifique-se que ambos os pares de eletrodos são flutuante (não têm ligação à terra), e não têm qualquer fundamento comum medindo a resistência entre qualquer conjunto de eletrodos e verificação de ausência de curtos-circuitos entre qualquer um dos eletrodos. Verificar que todo o equipamento utilizado, o qual está ligado aos eléctrodos (tais como os osciloscópios, os amplificadores, os geradores de sinais, etc.) é flutuante em relação à terra, verificando que todos os equipamentos sejam flutuantes e que nenhum dos eléctrodos de referência está a tocar qualquer equipamento ligado à terra.
- Para mudar a orientação do campo, variar a amplitude da tensão de alimentação para os dois pares de eléctrodos com resEntre si (ver Figura 7A ). Por exemplo, para 0 ° usar ± 22 V no par de eléctrodos que são perpendiculares ao padrão e 0 V para o outro eléctrodo. Para 45 °, utilizar ± 15,6 V em ambos os pares de eléctrodos sem fase lag, para uma amplitude vector soma de 15,6 2 +15,6 2 = 22 2 .
- Para aplicar um campo rotativo, use uma única forma de onda de um pulso de tensão senoidal e uma única forma de onda de um impulso de tensão de coseno para os dois pares de eletrodos para produzir um campo elétrico de rotação de amplitude fixa (veja a Figura 6B ).
NOTA: Como pode ser visto na Figura 6B , quando se utiliza um ciclo de uma onda sinusoidal com ± 22 V num eléctrodo e um ciclo de uma onda coseno com ± 22 V no outro eléctrodo, a soma vectorial é um campo eléctrico rotativo com A duração do ciclo igual às ondas seno e coseno, e com uma amplitude de ± 22 V.
- Para medir e calcular ChronAxie e reobase de axónios na cultura neuronal vs dendritos na mesma cultura executar as seguintes etapas.
- Utilizar um corante fluorescente sensível cálcio para imagiologia de cálcio, como descrito na tabela de materiais / Reagentes e 1,5) com uma cultura 1D modelado na fina (170 um), 10 mm) de comprimento linhas (. Cálcio corante sensível será aplicado à cultura e incubou-se durante 45 minutos. O corante será lavada, substituindo com uma solução de gravação fresco.
- Desligue a rede para obter estatísticas populacionais da resposta direta à estimulação elétrica, sem o efeito da transmissão sináptica. Para fazer isso, aplicar uma combinação de 40 uM de bicuculina, que bloqueia os receptores a acção inibidora de ácido gama-aminobutírico-A (GABAA), 10 uM de 6-ciano-7-nitroquinoxalina-2.3-diona (CNQX) , para bloquear o α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolopropiónico (AMPA) e cainato e 20 uM de (2R) -amino-5-phosphonovaleácido ric (APV), que bloqueia o N-metil-D-aspartato (NMDA). Os bloqueadores vai ser adicionada à solução de gravação.
- Aplicar um pulso quadrado, conforme descrito em 2.1 e 2.3 com diferentes durações de tempo entre 100 ms e 4 ms. O sinal pode ser observado no osciloscópio.
- Usar um microscópio de fluorescência com um programa de aquisição de imagem (ver 1.5) para monitorar a intensidade dos transientes de cálcio em vários ROIs, contendo cada um a algumas centenas de neurónios. Adquirir imagens usando uma câmera EMCCD sensíveis (ver lista de materiais), capazes de uma taxa de aquisição de imagem de pelo menos 20 quadros por segundo. A alteração na intensidade da luz é proporcional à quantidade de neurónios que foram estimuladas. Estimar a fracção de neurónios estimuladas usando a mudança relativa na intensidade.
- Para cada duração de impulsos (100 uS a 4 ms), alterar a amplitude da tensão aplicada aos eléctrodos a partir de uma tensão onde nenhuma mudança na intensidade é visto (alguns volts), para the tensão, onde as alterações na intensidade devido à tensão aplicada tem saturado (até ± 22 V).
NOTA: A mudança de intensidade irá ser distribuído como um cumulativa Gaussiana 5 com respeito à tensão aplicada para a estimulação para cada tempo de duração do impulso de tensão. - Encaixar uma distribuição de Gauss acumulado para a intensidade versus a voltagem aplicada para cada duração e extrair a média de Gauss deste ajuste.
NOTA: Esta média é a tensão representante para que os neurônios respondeu. - No final deste processo de obtenção para cada período de estimulação de uma tensão média para que os neurónios respondeu. Use esses pares de durações e forças para traçar as curvas força-duração (ver Figura 7).
para calcular o campo elétrico. Usar um dos eléctrodos como um eléctrodo de referência. Medir o campo eléctrico com diferentes durações de pulso entre 100 uS a 4 ms (ver Figura 5B para um exemplo de 100 uS duração do pulso) para verificar que o campo é homogéneo dentro da gama de durações estimulantes. 3. Estimulação Magnética das Culturas
Nota: A configuração básica para a estimulação magnético é mostrado na Figura 2. No topo direito é mostradoum microscópio de fluorescência invertido que é usado para corantes sensíveis imagem de cálcio nos neurónios. A bobina magnética (círculos azuis) está posicionado cerca de 5 mm acima de forma concêntrica um anel cultura neuronal, (contorno azul). Uma bobina de recolha (círculo vermelho), na circunferência da placa de Petri monitora a tensão induzida pelo impulso magnético. Na parte superior esquerda está mostrado a dinâmica de medição da bobina de estimulador magnico (MS) com uma carga de tensão do condensador de 5,000 kV, como integrado a partir da bobina de recolha. O campo eléctrico induzido (calculado para um raio de anel de 14 mm) é representado em verde, enquanto o campo magnético é mostrado em azul. Na parte inferior são mostradas as imagens da cultura neuronal. No canto inferior esquerdo é uma imagem de campo claro de uma lamela padronizada de 24 mm. As áreas brancas são os neurónios. O padrão consiste de culturas fotografado anéis concêntricos com diferentes raios. Na parte inferior direita é um zoom para um segmento curto dos anéis, mostrando os neurónios individuais. Para uma escala, wid dos anéisth é cerca de 200 um.
- Crescer os neurónios em um padrão de anel circular (gravado como descrito em 1.2.5) para a estimulação cultura 1D. Utilizar um corante fluorescente sensível cálcio para imagiologia de cálcio (como descrito na secção 1.5), com uma cultura 1D modelado na fina (170 um), (10 mm) de linhas longas.
- Usar uma bobina magnética circular e posicionar uma placa de Petri de aproximadamente 5 mm abaixo e concêntricos com a bobina. Utilizar uma bobina de costume (diâmetro interno, diâmetro externo de 46 mm) da bobina de aproximadamente 30 mm com uma indutância de L = 90 mH accionado por um MS caseiras comerciais ou carregados com uma voltagem máxima de 5 kV.
- Descarregar uma alta tensão e a corrente através de uma bobina de condução através de um interruptor de alta corrente de alta voltagem para estimular magneticamente culturas neuronais. O estimulador magnico (MS) pode ser construído como descrito em 21, utilizando grandes condensadores, da ordem de 100 mF, para obter uma alta voltagem de 1-5 kV. Alternativamente usar um comercialmenteMS disponível (ver Tabela de Materiais / Reagentes ).
NOTA: Use um fio de cobre retangular revestido de poliéster de 0,254 mm de espessura e 6,35 mm de largura para fabricar uma bobina caseira 21 . Torne os fios em caixilhos feitos sob medida, isolados com fibras de vidro e moldados em epóxi (ver Tabela de Materiais / Reagentes ). Alternativamente, use bobinas disponíveis comercialmente (ver Tabela de Materiais / Reagentes ).
- Use campos magnéticos rotativos para estimular culturas 2D.
- Agora, use os campos magnéticos rotativos para estimular culturas 2D. Incêndio do TMS sem cultura no prato, em intensidades diferentes, para mostrar a correlação linear da leitura da bobina com as intensidades.
- Em seguida, enquanto registra transientes de cálcio com uma cultura neuronal, comece a disparar o TMS a intensidades crescentes enquanto registra os transientes de cálcio e a bobina. Inicialmente, as rajadas de rede observadas como grandes transientes de cálcio,uld não sincronizar com pegar picos bobina TMS. Continuando a aumentar a intensidade, em algum ponto, os transientes de cálcio começam a tornar-se sincronizado com os picos de TMS. Alternativamente, ou em adição, após obtenção de uma resposta sincronizado, começar a diminuir as intensidades até que a sincronização é abolida, para determinar o limiar de TMS.
NOTA: As condições devem ser mantidas estritamente fixado para cada uma das configurações, usando o volume exato de cada vez, os mesmos navios e posições bobina exatas e orientações.- Montar a bobina de recolha na base do prato de gravação de modo que ele está num plano paralelo à cultura neuronal e numa posição fixa com respeito à cultura.
NOTA: Este assegura que a dependência do posicionamento da bobina de recolha em relação ao íman é fiel para a posição da cultura e que quaisquer discrepâncias no posicionamento será negligenciável sobre as leituras bobina de recolha.- Use duas bobinas independentes que sãoposicionados perpendiculares uns aos outros (Figura 8B) para gerar um campo eléctrico e magnético induzido a rodar. Ligar cada bobina para as suas próprias MS. Assegure-se que os estimuladores de descarga correntes semelhantes a um atraso de fase de 90 graus (Figura 10A), resultando em um campo magnético rotativo que digitaliza 270 graus do espaço real em um campo máximo de ~ 270 V / m (Figura 10B).
- Posicionar a cultura neuronal dentro de um recipiente de vidro esférico preenchido com a solução de gravação externa (ME).
- Monitorar a estimulação (mudança na intensidade de fluorescência dos neurónios) com a câmara, conforme descrito no passo 2.4.4.
- No caso das bobinas cruzadas (Figura 8B), posicionar a bobina de recolha paralelo e a uma distância específica a seguir a cultura neuronal. Cuidadosamente manter esta configuração ao longo dos experimentos.
- Montar a bobina de recolha na base do prato de gravação de modo que ele está num plano paralelo à cultura neuronal e numa posição fixa com respeito à cultura.
- Calcular analiticamente o campo elétrico para Configura 1Dção por Emax = k 1 Br, onde E é o máximo de amplitude máximo do campo eléctrico induzido e é dirigida ao longo da tangente dos anéis com raio r. B é a amplitude do impulso magnético e um k é uma constante de proporcionalidade dimensional que pode ser medido usando a bobina de recolha (Figura 8A).
- Use um pacote de simulação numérica (ver lista de materiais) para simular numericamente o campo elétrico 21.
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Representative Results
O protocolo apresentado permite fácil padronização das culturas neuronais. Quando é combinado com vários métodos desenvolvidos para a estimulação, que permite fazer medições de alguns intrínsecas propriedades neuronais como chronaxie e reobase 5, para comparar as propriedades dos neurónios saudáveis e doentes 27, para encontrar formas ideais para estimular culturas como uma função de sua estrutura e muitos mais novas abordagens. Alguns exemplos são apresentados nos próximos números.
A Figura 3 mostra o 1D modelado configurações que são gravadas na camada bio-rejeição. As linhas finas de cerca de 170? M de largura são tipicamente inscrito que pode, por exemplo, ser anéis concêntricos com diferentes raios (Figura 3A) ou linhas paralelas, tipicamente ~ 11 mm long (Figura 3B).
nt" FO: manter-together.within-page = '1'> O painel superior da Figura 4 mostra uma imagem típica da actividade fluorescente no cultura, feita com um dispositivo de carga acoplada (CCD) e que mostra uma imagem de fluorescência marcado neurónios em uma cultura 2D. neste exemplo, três ROIs diferentes são mostrados, marcados em preto, verde e vermelho. integrados vestígios de intensidade de fluorescência são apresentados no painel inferior da figura 4, medido nestes três ROIs diferentes (traços são na cor correspondente da ROI). Como mostra a inserir, no interior da resolução de 200 ms o tempo de aquisição de quadro na qual estes dados em particular foi feita, todos os neurónios nos três diferentes ROIs explosão simultaneamente.O aparelho básico utilizado para a estimulação por uma uni-direcional, campo eléctrico constante é mostrado na Figura 5A. Os fios dos eléctrodos são imersos no meio de gravação, de cerca de 1 mm acima da cultura neuronal.A forma do impulso básico utilizado para estimulação eléctrica é mostrado na Figura 5B. Quando este impulso de tensão é aplicado cria-se um campo eléctrico constante que inverte a sua orientação de 180 °, depois de metade do ciclo. A mudança na direcção do campo depois de meio ciclo é utilizado para evitar a electrólise e a deteriorao dos eltrodos. voltagens típicas aplicadas aos eléctrodos são ± 22 V, e a duração do impulso típico para a estimulação de culturas 2D é na ordem de 100 - 500 mS.
Para controlar qualquer anisotropia no crescimento de neurites, verificou-se que a estimulação de culturas 2D é isotrópico. Ao rodar manualmente os eléctrodos em todos os 360 ° em resolução 15 ° (Figura 5C) vê-se que não existe uma preferência de orientação para a estimulação. Cada cor na Figura 5C representa a estimulação de uma cultura diferente. A distância entre a origem representa o du mínimaração necessária para a estimulação com uma amplitude constante. É evidente que, para uma boa aproximação, culturas 2D não têm uma orientação preferencial para a estimulação elétrica.
Uma vez que o único par de eléctrodos está limitada a ter uma direcção definida para o campo (embora possa ser invertida), desenvolveu-se um aparelho para a estimulação eléctrica com dois pares de eléctrodos (Figura 6A). Um esquema da cultura (fundo cinzento circular, manchas escuras são os corpos celulares) e dos eléctrodos (linhas grossas paralelas) é mostrado na Figura 6B. Quando as formas de onda, mostrado como pastilhas azuis e verdes na Figura 6B, são co-seno e ondas de seno e são aplicados em conjunto, em seguida, um campo de vectores E rotativo é produzido. Quando os impulsos de tensão são quadrados, têm amplitudes diferentes e têm atraso de fase de zero entre eles, em seguida, eles criam um campo constante com a orientação desejada determinada pela relative amplitude entre os dois pares de eléctrodos. Esta rotação eléctrico é uma melhoria evidente através da rotação manual, mecânica, que foi utilizado para se obter a distribuição angular de forças de estimulação na Figura 5C. Claro que, como mostra a Figura 6C, é também possível utilizar esta configuração para excitar uma única direcção fixa, possivelmente, como um controlo, ao activar apenas um par de eléctrodos.
Estas configurações foram usadas para excitar as culturas neuronais 2D com qualquer um de um campo rotativo ou um campo de ângulo fixo, com a mesma raiz média (RMS) da tensão quadrada e, em seguida, para comparar a duração do impulso necessária para excitar a cultura quando a amplitude é fixa. Descobrimos que, ao utilizar um campo eltrico que roda com uma amplitude constante de ± 22 V, uma duração média de 150 ± 14 pS era necessária para atingir a estimulação, ao passo que com uma única direcção do campo eléctrico uma duração média de290 ± 30 pS era necessária. A relação entre as durações necessários para excitar a cultura com uma rotação versus uma área de ângulo fixo é, por conseguinte, 0,53 ± 0,02.
Desde numa cultura 2D os axônios se estendem em todas as direções, o campo rotativo é capaz de excitar muitos dos axônios. Em contraste, com o campo de orientação única existem apenas alguns axónios orientadas em que o ângulo específico de excitação e axonal não é alcançado. Quando a duração é maior, há a possibilidade de emocionantes outras partes do neurônio, bem como, em especial, as dendrites. Isto é explicado mais adiante na descrição das medições chronaxie. O fato de que durações muito mais curtos são necessários para a excitação da mesma cultura quando se utiliza um campo rotativo é de grande importância quando se utiliza campos externos para estimulação cerebral, uma vez que existem limitações, muitas vezes técnicas sobre as durações de pulso.
Figura 7. Na Figura 7A uma rede desligado 1D é estimulado com o campo eléctrico, quer ao longo da linha de cultura (a 0 ° C para a estimulação axonal) ou perpendiculares à linha de cultura (a 90 ° durante a estimulação dendrítica) por dois pares de eléctrodos. À medida que a tensão aumenta, mais neurónios vai ser estimulada, o que se reflecte pela gripeorescence intensidade, que é proporcional ao número de neurónios estimuladas (ver Figura 7B). Aumentando as amplitudes de tensão são usados para estimular gradualmente toda a cultura. Cada neurônio tem uma tensão de limiar mínimo (para uma duração de pulso específica) que ele vai responder, e pela lei dos grandes números, é esperado que a distribuição desses limiares para ser Gaussian. Portanto, se olharmos para o número de neurónios que responderam e traçar-lo contra a tensão aplicada, a distribuição será uma distribuição de Gauss cumulativa, que é uma função de erro (FER) 5. O número de neurónios que respondem a uma amplitude específica do campo eléctrico tem, aproximadamente, uma distribuição de Gauss, e, portanto, a fluorescência é bem descrito por sua integral - uma função de erro da amplitude do campo estimulante (Figura 7C).
A Figura 7C é usado para eXtract um parâmetro, a expectativa (média) da distribuição. Isso é feito por montagem de uma distribuição de Gauss cumulativo e obter o melhor ajuste. Esta expectativa é a tensão aplicada à qual 50% das células irá responder. Este processo é repetido para várias durações de pulso (variando de 100 mS de 4 ms). A voltagem média à qual a cultura respondeu é representada graficamente versus a duração do pulso para obter a curva de força-Duração. Foram realizados dois conjuntos de medições. Na primeira, o campo foi paralelo ao padrão, e no segundo era perpendicular a ele. Foi previamente mostrado 15, 23 que axónios alinhar com padrão, enquanto dendrites crescem em todas as direcções. Isto dá duas curvas força-duração diferente, que são muito úteis para a obtenção de uma clara diferença entre o axonal e excitação dendrítica. A separação total para dendríticas e axonais contribuições é alcançada pelo fato conhecido que o axônioal constante para a excitação de tempo é muito mais curto do que as dendríticas 2, 3, 4.
As curvas de intensidade-duração é, em seguida, ajuste a equação de decaimento chronaxie 
, Onde V é a tensão rh reobase e C é a chronaxie. No durações de pulso de t <1ms são os axônios que são animado em primeiro lugar e fazer com que o neurônio ao fogo, com um valor mais baixo para tensão de excitação na curva força-Duração. Axonal chronaxie foi calculada como sendo de 110 mS. Em contraste impressionante, para excitação a durações longas (t> 1 ms) do compartimento dendríticas é a fonte de excitação para o neurónio com um chronaxie dendrítica calculada em 900 us.
Os princípios subjacentes a estimulação de culturas 2D e 1D com uma circular bobina estão descritos na Figura 8. Para obter uma melhor compreensão da situação física, simulações numéricas dos campos eléctricos e magnéticos induzidos são produzidos utilizando o pacote COMSOL. Para estimular as culturas 1D uma bobina magnética circular é usado, posicionado concentricamente acima da placa de Petri. Os neurónios são cultivados em anéis circulares sobre uma lamela redonda que é colocado no interior do prato de Petri para a gravação. Neste caso, o campo eléctrico induzido pode ser calculada analiticamente e é igual a E max = k 1 Br, onde E é o máximo de amplitude máximo do campo eléctrico induzido e é dirigida ao longo da tangente dos anéis com raio r. B é a amplitude do impulso magnético e um k é uma constante de proporcionalidade dimensional que pode ser medida utilizando uma bobina de recolha.
O cálculo numérico COMSOL do campo magnético created pela bobina na cultura 1D é mostrada no painel superior da Figura 8A (linhas de corrente do vermelho). No painel inferior da Figura 8A o cálculo é apresentado para o campo eléctrico induzido. A estimulação de uma cultura 2D com uma configuração de bobina cruzado é mostrada na Figura 8B. Para estimular as culturas 2D uma bobina cruzada foi utilizado rotativo que produz campos magnéticos, posicionadas com uma cultura neuronal 2D no seu interior, colocado num recipiente de vidro esférico que é preenchido com o meio de gravação (EM). Neste caso, o campo eléctrico induzido já não pode ser calculada analiticamente. A bobina cruzada é representado no painel de topo da Figura 8B, com o recipiente esférico colocadas no interior das duas bobinas e a lamela de vidro suportando a cultura 2D colocada no fundo do recipiente. Para escala, o diâmetro interno da serpentina interior é 65 milímetros. simulações numéricas usando COMSOL com o modelo 3D Correntes de Eddy são mostrados no painel inferior,retratando o campo eléctrico induzido na superfície interior do recipiente esférico. Uma imagem de microscópio de campo brilhante de uma lamela de vidro com culturas neuronais 1D típicos usados para a estimulação é mostrado na Figura 8C. As linhas brancas mostram os neurónios nas linhas modelado, que estão orientadas tangencialmente e tanto radialmente para comparação experimental e de controlo sobre o efeito de direccionalidade.
Geometria da cultura 1D desempenha um grande papel em determinar se uma cultura dispara em resposta à estimulação magnética. Apenas 22% das culturas anel 1D respondeu a estimulação magnética. A taxa de sucesso de excitação dependia fortemente do comprimento linear da cultura, e como mostra a figura 9A, mais de 60% das culturas que são mais longos do que 80 milímetros respondem à estimulação magnética. Isto implica que condições especiais são necessários para a resposta magnética. Para investigar esta culturas dependência geométricas were cultivadas em configurações que são peças de anéis - tendo o mesmo raio, mas diferentes comprimentos por patterning-los em arcos em vez de em círculos completos (ver Figura 8C)
Uma investigação exaustiva dos limites do campo magnético como uma função do raio de culturas anel 1D é mostrado na Figura 9B. círculos a branco representam as medições experimentais de limiares de estimulação, ao passo que o código de cores indica a probabilidade calculado para medir um limiar de excitação. Um limiar de estimulação é definida como o campo mais fraco que ainda induz uma resposta para uma determinada cultura neuronal.
A Figura 9B enfatiza a tendência que os anéis maiores têm mais baixos limiares de estimulação, com uma clara correlação inversa entre o raio dos anéis e o limiar de estimulação. Por exemplo, a média do anel 14 milímetros responde a magnPulsos etic com amplitude de 1,5 T enquanto que o anel médio de 7 mm responde apenas a 3 T ou mais. Isto é esperado a partir do cálculo teórico do campo elétrico induzido, que é representado como a codificação de cores predita a probabilidade de incêndio. De fato, o campo elétrico induzido por 3T em um raio de 7mm é igual ao induzido por 1,5 T em duas vezes o raio. Em resumo, o limiar do campo elétrico médio é 301 ± 128 (desvio padrão) V / m , independente do raio das culturas de anel.
Em contraste com a única bobina circular, que não poderia induzir resposta em culturas 2D, 15 das 30 culturas 2D que foram estimuladas por estímulo magnético de campo rotativo responderam com excitação neuronal explosiva. As duas bobinas independentes que estão posicionadas perpendicularmente entre si ( Figura 8B ) geram campos magnéticos e indutivos rotativos. Cada bobina é conectada a seu próprio MS, ambos os quais discharge correntes semelhantes a um atraso de fase de 90 graus. A amplitude do campo eléctrico induzido por cada uma das duas bobinas na configuração de bobina cruzada é representada na Figura 10A, e os mesmos traços são representados na Figura 10B por uma representação polar da direcção e da amplitude do campo eléctrico sobreposta de ambas as bobinas . O campo eléctrico induzido resultante digitaliza 270 graus do espaço real em um campo máximo de ~ 270 V / m.
Figura 1: Diagrama esquemático do conjunto usado para a estimulação elétrica de culturas neuronais. O sinal desejado é produzido por um gerador de sinal com duas saídas que não têm uma base comum. Estes sinais são amplificados para dar uma tensão de até ± 30 V. Os sinais eléctricos são então alimentados através de dois pares separados de eléctrodos, estimulando uma cultura neuronal na saída twO direções ortogonais e independentes. A estimulação de neurónios pode ser visualizada e monitorizada por corantes de cálcio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Esquema da Configuração Utilizada para Estimulação Magnética de Culturas Neuronais. A. No topo é mostrada a bobina magnética (círculos azuis), que está localizado 5 mm concêntrica acima da cultura do anel neuronal, colocada em uma placa de Petri (contorno azul). Uma bobina de captação (círculo vermelho) posicionada na circunferência da placa de Petri mede a tensão induzida pelo pulso magnético. No fundo, a dinâmica medida da bobina estimuladora magnética é mostrada (usando uma carga de tensão do capacitor MS de 5.000 kV), como integrado a partir da bobina de captação. Campo elétrico induzido (calculated para um raio de anel de 14 mm) é representado em verde, enquanto o campo magnético é representada na azul B. Um imagens de microscópio invertido corantes fluorescentes sensíveis ao cálcio transientes de neurónios que reagem aos impulsos magnéticos. C. Os neurónios cultivados sobre um padrão de anéis concêntricos, utilizado para uma estimulação eficaz pelo estimulador magnético anel. D. imagem microscópio de campo brilhante de neurônios cultivados em uma linha do padrão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Exemplos de Padrões de culturas 1D neuronais usados para orientar o campo elétrico com a direção do crescimento axonal. A. padrão circular é usado para a bobina magnética circular, ELE quando o induzido campo ctric tem uma orientação circular. B. padrões de linha são utilizados quando o campo eléctrico induzido ou directa tem uma orientação única.
Figura 4: Exemplo Traços de transientes de cálcio com Imagem Durante síncronos de rede Bursts. A. Uma imagem de neurónios que foram tingidos anterior à experiência com um corante de cálcio. B. Traços de intensidade versus tempo dos ROIs em A com a cor do traço representando a cor da borda da ROI em A. Um grande aumento na intensidade sincronizado dentro dos três ROIs representa uma explosão rede. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 5: Configuração básica para a estimulação elétrica, usando um par de eletrodos de banho paralelos para determinar que as culturas 2D Não tenha orientação preferencial de estimulação elétrica. A. Os aparelhos utilizados para estimulação de cultura. O campo eléctrico é produzido através da aplicação de tensão aos eléctrodos de fio de platina. A distância entre os dois fios é de 13 mm. B. Um exemplo de um sinal de tensão a ser aplicada nos eléctrodos em A. A forma bipolar do pulso ajuda a prevenir a electrólise da solução de gravação nos eléctrodos. C. Ao estimular uma cultura 2D em diferentes rotações dos eléctrodos, há isotropia da resposta neuronal. D. Um exemplo da medição do campo eléctrico utilizando a sonda descrita no passo 2.2. O campo eléctrico é uniforme a um erro de até 10%. Esta figura foi modificado a partir de 5.carregar 54357 / 54357fig5large.jpg" target = '/ _ blank'> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Estimulação Elétrica com dois pares de eletrodos permite a rotação do campo elétrico e para a estimulação em qualquer ângulo desejado. A. Para produzir formas mais complicadas do campo eléctrico, são necessários dois pares de eléctrodos independentes. B. Aplicando um impulso de tensão em forma de co-seno de um eléctrodo e um impulso seno para o segundo eléctrodo cria um campo eléctrico rotativo com amplitude constante. C. Aplicando um impulso de tensão quadrada de um par de eléctrodos os cria um campo eléctrico uniforme unidireccional. Esta figura foi modificado a partir de 5. Por favor click aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: desconexão da rede, bloqueando Synaptic Entradas (como descrito em 2.4.2) permite a observação da população total de células individuais que são estimulados por um campo elétrico de Given. A. Através da aplicação de diferentes amplitudes de impulsos de voltagem para os dois pares de eléctrodos, o campo eléctrico pode ser orientada para qualquer ângulo sem a necessidade de girar manualmente a cultura. Gravações B. Exemplo de transientes de cálcio, com a estimulação eléctrica em diferentes tensões aplicadas. Quatro traços são mostrados, ligeiramente deslocado verticalmente para permitir a visualização. valores de tensão são escritos sob os traços azuis. C. Ao aplicar uma duração constante de campo eléctrico, o número de neurónios que será activado em resposta ao campo eléctrico tem uma dist cumulativafunção ribution (CDF) que é uma distribuição cumulativa de Gauss (ou uma função erf) como uma função da amplitude da voltagem (que é proporcional à intensidade de campo). D. Um exemplo de uma curva de força-Duração obtidos ao empregar este protocolo. Esta figura foi modificado a partir de 5. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Configuração bobina magnética e Cálculo do Induced campo elétrico. A. Na parte superior é uma bobina circular (círculos azuis) está posicionada a 5 mm acima do anel culturas neuronais unidimensionais (azul de disco). Os anéis são paralelas a e concêntrico com a bobina, o que gera um impulso magnético que é orientado ao longo das linhas vermelhas. De A lei de Faraday, o campo elétrico induzido reside em aviões que são paralelas à bobina junto anéis concêntricos com ele. No fundo é um corte horizontal ao longo do plano das culturas de anel. O valor relativo do campo eléctrico é codificada por cores, com direcção representada pelas setas. anéis maiores delimitar uma área maior de fluxo e, por conseguinte, o campo eléctrico induzido há mais elevada. B. Imagem do estimulador-perpendicular da bobina magnética (topo) e uma simulação do campo eléctrico que é induzido por ele. C. Teste padrão utilizado para crescer neurónios que podem ser estimuladas com um campo eléctrico circular ou um campo eléctrico radial. Esta figura foi modificado a partir de 21, 28. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 9: Resposta de culturas anel ao campo magnético. A. A taxa de sucesso da estimulação cresce com o raio da cultura. As barras de erro representam o erro padrão (SE). B. A relação entre o tamanho do anel e a força do campo magnético é representada. A probabilidade de excitar a cultura é codificado por cores. Com efeito excitações mais bem sucedidos de culturas encontram-se na sobreposição entre o espaço acessível experimentalmente fase (rectângulo branco) e a região de elevada probabilidade (vermelho). Esta figura foi modificado a partir de 21. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10: Girando campo de configuração do campo magnético. </ forte> A. A fim de induzir um campo eltrico que roda quando se estimula com o estimulador magnético perpendicular da bobina, é necessário um deslocamento de fase de 90 graus entre as duas bobinas. É mostrado o campo eléctrico induzido numa bobina de recolha posicionado em 2 asas vizinhas da bobina de folha de trevo. As bobinas foram conduzidos separadamente por 2 estimuladores comerciais. B. Uma reconstrução, utilizando as curvas mostradas em A, da amplitude do campo eléctrico resultante e sentido durante um pulso da bobina de folha de trevo. Esta figura foi modificado a partir de 21, 28. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Padrão 1D é uma ferramenta importante que pode ser usado para uma variedade de aplicações. Por exemplo, utilizamos padrões 1D para criar portas lógicas a partir de culturas neuronais 29 e mais recentemente para medir o Chronaxie e Rheobase de neurônios do hipocampo de ratos 5 e a desaceleração da velocidade de propagação de sinal da atividade de disparo em neurônios do hipocampo de síndrome de Down em comparação com a Neurônios do hipocampo do tipo selvagem (WT) 27 . O protocolo sugerido para padronização 1D é robusto e é fácil formar qualquer padrão desejado. Sugerimos observar a cultura 1D antes das medições para estar ciente de eventuais desconexões da rede, o que pode afetar sua função.
Padronização química de configurações neuronais tem uma história distinta 30 , 31 , 32 . Descobrimos que a nossa abordagems resultados semelhantes aos padrões químicos, mas eles são mais robustos e mais fáceis de atingir. Recentemente, a opção para padronização microfluídico de neurônios tornou-se uma alternativa interessante para a abordagem que oferecemos, com a simplicidade comparável e facilidade de uso 33, 34. A abordagem de microfluidos está a ser usado no nosso laboratório em paralelo com o método de gravação descrito aqui.
Como mostramos 5, culturas 2D não têm nenhuma orientação preferencial e sua estimulação é isotrópico e não depende da orientação do campo aplicado. durações mais curtas são necessários para a estimulação de culturas 2D quando o campo está girando. Em contraste, as culturas 1D são muito dependentes da orientação do campo. Quando o campo é orientado com o padrão (e, por conseguinte, com a direcção do crescimento axonal), a duração de uma amplitude fixa campo necessário para a estimulação é muito menor do que quando o campo é orienteed perpendicular ao padrão. Da mesma forma, se a duração é mantida constante, em seguida, o campo necessária para excitar a cultura é menor se o campo e padrão são paralelas. Ao estimular perpendicularmente, o impulso do campo tem de ser muito mais tempo (na ordem de um milésimo de segundo quando a rede está desligada), e, em seguida, principalmente os dendritos são estimulados. Quando os campos eléctricos (quer directa ou induzidas por um campo magnético) são usados para a estimulação do cérebro, este é de extrema importância. Se a área do cérebro alvo é conhecido por ter feixes de axónios, esses axónios podem ser excitados por meio da orientação do campo na sua direcção e, em seguida, precisa de menos energia ou uma duração mais curta do campo de estimulação. Se a região do cérebro alvo não têm orientação preferencial, seguida de um campo rotativo é mais eficiente para a estimulação. Se dendritos são o alvo da estimulação, impulsos mais longas são mais eficazes.
Os campos magnéticos podem estimular a actividade neuronal quando um impulso magnético induces um campo eléctrico que excita neurónios. Porque impulsos magnéticos actualmente são realizáveis microssegundos de duração, dendritos, cujo tempo de resposta é da ordem de milésimos de segundo, não se espera que sejam sensíveis a estimulação magnética. Em contraste, os axónios, cujo tempo de resposta é mais rápida, são o alvo de estimulação 2, 3. A resposta de axónios a excitação eléctrica é máxima quando eles são paralelos ao campo eléctrico e diminui quando eles são perpendiculares a ele 1, 35; portanto, na excitação magnético, que se esforça para criar sistemas onde o campo eléctrico induzido orienta paralelamente aos axónios segmentados. Portanto, ao estimular um anel 1D, o campo deve ser orientada em paralelo para os axónios, e o tamanho do anel de determina o limiar de estimulação. Semelhante para a estimulação directa por eléctrodos de banho, para estimular uma cultura 2D, uma rotativa e induzidacampo lectric é muito mais eficiente.
A combinação de padronização de neurónios e de excitação externa com campo eléctrico ou magnético é uma tecnologia potente com diversos possíveis aplicações futuras. Chronaxie e reobase, bem como limiar de activação e de propagação de activação dinâmica e velocidades são todos os parâmetros que estão dizendo de propriedades intrínsecas de uma cultura neuronal. Em particular, os tratamentos terapêuticos e do efeito das drogas ou tratamento farmacológico pode ser imediatamente testada directamente sobre os neurónios. Isso permitiria uma pesquisa eficiente de ambos os neurônios modelo de doença e de protocolos de estimulação TMS. Em um sentido mais conceitual, a capacidade de estimular culturas neuronais conduz precisamente a novas possibilidades em relação aos aspectos de processamento de informações de configurações neurais, e nos permitem conceber micro circuitos impressos que combina estímulo eletrônico com vivendo redes neuronais para fornecer novo cálculoDispositivos alfa e novos dispositivos de interface cerebral.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores agradecem Ofer Feinerman, Fred Wolf, Menahem Segal, Andreas Neef e Eitan Reuveny para discussões muito úteis. Os autores agradecem Ilan Breskin e Jordi Soriano para o desenvolvimento de versões iniciais da tecnologia. Os autores agradecem a Tsvi Tlusty e Jean-Pierre Eckmann pela ajuda com os conceitos teóricos. Esta pesquisa foi apoiada pela Fundação Minerva, o Ministério da Ciência e Tecnologia, Israel, e pela Fundação Ciência de Israel subvenção 1320/09 e da Fundação Bi-Ciência Fundação 2008331.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APV | Sigma-Aldrich | A8054 | Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2 |
| B27 supp | Gibco | 17504-044 | Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| bicuculline | Sigma-Aldrich | 14343 | Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2 |
| Borax (sodium tetraborate decahydrate) | Sigma-Aldrich | S9640 | Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2 |
| Boric acid | Frutarom LTD | 5550710 | Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2 |
| CaCl2 , 1 M | Fluka | 21098 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| CNQX | Sigma-Aldrich | C239 | Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2 |
| COMSOL | COMSOL Inc | Multiphysics 3.5 | Numerical simulation. Mentioned in Section 3.5.2 |
| D-(+)-Glucose, 1 M | Sigma-Aldrich | 65146 | Plating medium, Extracellular recording solution. Mentioned in Sections 1.1.1 and 1.5.2 |
| D-PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Cell Cultures. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6 |
| FCS (FBS) | Gibco | 12657-029 | Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6 |
| Fluo4AM | Life technologies | F14201 | Imaging of spontaneous or evoked activity. Mentioned in Sections 1.5.1, 1.5.3, and 1.5.5 |
| FUDR | Sigma-Aldrich | F0503 | Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1 |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1272 | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| GlutaMAX 100x | Gibco | 35050-038 | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| Hepes, 1 M | Sigma-Aldrich | H0887 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| HI HS | BI | 04-124-1A | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Sections 1.1.1, 1.4.1, and 1.4.2 |
| KCl, 3 M | Merck | 1049361000 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6 |
| MEM x 1 | Gibco | 21090-022 | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.4.1 1.4.2 |
| MgCl2 , 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| NaCl, 4 M | Bio-Lab | 19030591 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| Octadecanethiol | Sigma-Aldrich | 01858 | Cleaning Cr-Au coated coverslips (1D cultures). Mentioned in Section 1.2.3 |
| Pluracare F108 NF Prill | BASF Corparation | 50475278 | Bio-Rejection Coating, Bio Coating. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6 |
| Poly-L-lysine 0.01% solution | Sigma-Aldrich | P47075 | Promote cell division. Mentioned in Section 1.1.4 |
| Sucrose, 1 M | Sigma-Aldrich | S1888 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| Thiol | Sigma-Aldrich | 1858 | Bio-Rejection Coating. Mentioned in Section 1.2.3 |
| URIDINE | Sigma-Aldrich | U3750 | Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1 |
| Sputtering machine | AJA International, Inc | ATC Orion-5Series | coating glass with thin layers of metal. Mentioned in Section 1.2.2 |
| Pen plotter | Hewlett Packard | HP 7475A | Etching of pattern to the coated coverslip. Mentioned in Section 1.2.5 |
| Electrodes wires | A-M Systems, Carlsborg WA | 767000 | Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Sections 2.1, 2.2, 2.3, and 2.4.5 |
| Signal generator | BKPrecision | 4079 | Shaping of the electric signal. Mentioned in Section 2.3 |
| Amplifier | Homemade | Voltage amplification of the signal from the signal generator to the electrodes. Mentioned in Section 2.3 | |
| Power supply | Matrix | MPS-3005 LK-3 | Power supply to the sputtering machine. Mentioned in Section 1.2.2.3 |
| Transcranial magnetic stimulation | Magstim, Spring Gardens, UK | Rapid 2 | Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Sections 3.1, 3.3, and 3.4 |
| Epoxy | Cognis | Versamid 140 | Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4 |
| Epoxy | Shell | EPON 815 | Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4 |
| Platinum wires 0.005'' thick; A-M Systems, | Carlsborg WA | 767000 | Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1 |
| Circular magnetic coil | Homemade | Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.3 | |
| WaveXpress SW | B&K Precision | Waveform editing software. Mentioned in Section 2.1.32 | |
| Xion Ultra 897 | Andor | Sensitive EMCCD camera. Mentioned in Section 2.4.4 |
References
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