Summary
神経細胞培養は、単一ニューロンまたはニューロンの人口への影響を通じて新興脳刺激技術を研究するための良いモデルです。ここに提示バス電極によって直接生成または時間変化する磁場によって誘起される電界によりパターニング神経細胞培養物の刺激のための異なる方法があります。
Abstract
その膜電位が一定の閾値を超えた場合、ニューロンは活動電位を発射します。脳の典型的な活動では、これは、シナプスへの化学入力の結果として生じます。しかし、ニューロンも課せられ、電界によって励起することができます。特に、最近の臨床応用には、外部から電場を作成することによって、神経細胞を活性化させます。これは、ニューロンが外部磁場に応答して、何が活動電位が発生する方法を検討することが重要です。幸いなことに、外部電場の正確かつ制御されたアプリケーションは、切除解離、および培養物中で増殖させ、胚性神経細胞のために可能です。これは、再現性の高いシステムではこれらの質問の調査を可能にします。
本論文では、ニューロン培養物に対する外部電界の制御された適用のために使用される技術のいくつかが検討されています。ネットワークは、いずれか1次元、 すなわちリネアにパターニングすることができますR形態または基板の全体面上に成長させ、したがって、二次元。また、励起は、流体中に浸漬電極を介して電界の直接適用（バス電極）または磁気パルスのリモート作成を使用して電場を誘導することによって作成することができます。
Introduction
ニューロンおよび外部電場との相互作用は、基本的な意味合いだけでなく、実用的なものを持っています。それは外部から印加される電界が組織を励起することができるボルタの時代から知られているが、ニューロンにおける結果として得られる活動電位の生成を担うメカニズムは、ごく最近、4 3、2、1解明され始めています。これは、電場2、5に応答ニューロンにおける膜電位の脱分極、膜特性のとイオンチャネルの役割、さらには地域の原因となるメカニズムに関する質問への回答を見つけることが含まれます。治療的神経刺激6、7、8、9、 in vivoでの脳内の相互作用を測定することは、この理解に重要な要素が追加されますが、頭蓋骨内の測定の不正確さと低制御性によって妨げられています。対照的に、培養物中の測定を容易に高精度、ノイズ性能に優れた信号と再現性と制御性の高い大量に行うことができます。集合的ネットワーク動作のニューロン特性の多種多様を14、13、12、11明らかにすることができる培養物を使用して、 15、16。同様に、このよく制御されたシステムは、他の刺激方法がoptogeneticallyアクティブニューロン17、18の光刺激の間のチャネル開口部、19は活動電位を生成するための責任がある方法、例えば、動作するメカニズムを解明するには非常に効率的であることが期待されます。 ここでの焦点は、効率的に外部電界を経由してニューロンを励起することができるツールの開発と理解を記述するにあります。本稿では、バス電極によって異なる構成と直接印加される電界の向きを使用して、刺激を二次元の調製と一次元パターン化された海馬培養物を記述し、そして最終的に二次元の刺激とによって一次元培養をパターニング時間的に変化する電界を誘起する磁界を、5、20、21。
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Protocol
倫理文：動物の扱いを含む手順は、ワイツマン科学研究所の所内動物管理使用委員会（IACUC）、および適切なイスラエルの法律のガイドラインに従って行われました。ワイツマン研究所は、実験動物管理・インターナショナルの評価と認定協会（AAALAC）の認定を受けています。ワイツマン制度動物実験委員会は、海馬神経細胞で行ったこの研究を、承認しました。
（2D）2次元の一次元（1D）海馬培養物の調製
- 2D培養のためにカバースリップの調製。
- 0.9 mLの最小必須培地（MEM）+ 3G、0.05 mLのウシ胎児血清（FCS）、0.05 mLの熱不活性化ウマ血清（HI HS）およびB27サプリメントの1μL：メッキ媒質で構成される（PM）を準備します。注：ゲンタマイシンのMEM + 3Gは、MEM×1のすべての500ミリリットルのために含まれている1 mLを、安定化L-グルタミン、100倍の5ミリリットル（参照
- 200ml中に1.9グラムのホウ砂（四ホウ酸ナトリウム十水和物）、二重蒸留水（DDW）（60℃で混合）と200mLのDDW中の1.24グラムのホウ酸：からなるホウ酸緩衝液を調製します。 1 M HClを用いてpH8.5に最終溶液を滴定。注：最終溶液は400mLの0.1 Mホウ酸緩衝液です。
- 2時間、65％硝酸でカバーガラスを浸し。絶対的な分析試薬（ABS用AR）エタノールで3回リンスが続いDDWで3回すすいでください。
- （ホウ酸緩衝液中で5：2秒、次いで1 mLのポリ-L-リジン0.01％溶液1に希釈し、24枚のウェルプレート中で一晩インキュベートする残す - ブンゼンバーナーの炎を介して簡単に1 2回または3回、各カバースリップを渡します0.1 M、pHは8.4）。その後、DDWでカバースリップを3回リンスし、一晩、標準37°C、5％CO 2インキュベーター中でウェルあたり1mLのPMで残します。
- 0.9 mLの最小必須培地（MEM）+ 3G、0.05 mLのウシ胎児血清（FCS）、0.05 mLの熱不活性化ウマ血清（HI HS）およびB27サプリメントの1μL：メッキ媒質で構成される（PM）を準備します。注：ゲンタマイシンのMEM + 3Gは、MEM×1のすべての500ミリリットルのために含まれている1 mLを、安定化L-グルタミン、100倍の5ミリリットル（参照
- 1D培養のためのカバースリップの調製。
- クリーングラム75mLのDDW、25mLの25％アンモニア溶液および25mLの30％過酸化水素からなるベースピラニア溶液に浸漬することによってLASSカバースリップ。 〜50℃の加熱板上にカバーガラス30分間、次いで窒素でカバーガラスを乾燥さと場所の溶液。
- 第1の堆積蒸気やスパッタのいずれかを使用して金（99.999％）の30オングストロームの層が続く6Åの厚さの薄いクロム膜（99.999％）でコートしたカバー。
- 0.05のスパッタリング速度を達成するために - 1オングストローム/ sが2の電子ビームでスパッタ装置を使用して、ターゲット260リットル/秒の真空システムは、2" つのサイズおよび4" 。分（RPM）あたり100ラウンド - 0から行くことができる回転ステージを使用してください。 750ワット - 0のパワーをスパッタ直流（DC）を使用します。
- チャンバ10ミリトールの圧力でプラズマを得るために、30 rpmで、アルゴン99.999％の回転を使用します。
- つながる、クロム用DCスパッタ電力W 40でスパッタリングガンの電源を操作〜0.12Å/ sのカバレッジ率、および10でDC W〜0.28 A / Sにつながる、金のために力をスパッタ。
- 30分間の超音波を用いて100 mLのABS ARエタノール中に0.1グラム1-オクタデカンチオールを溶解します。次いでエタノールABS ARと窒素で乾燥で洗浄し、この溶液に2時間のCr-Auの被覆されたカバースリップを置きます。
- 700 RPM - 600で2時間- 1撹拌し（ 材料/試薬の表を参照） を 100 mLのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（D-PBS）およびトリブロックコポリマー3.5gの溶液を調製。 1時間溶液中でカバースリップを置きます。窒素で乾燥したカバースリップ。
- 機械バイオ拒絶層22をスクラッチすることにより所望のパターンをエッチングします。ペンをエッチング針で置き換えられるペンプロッタを使用して、これを行います。下地ガラスに到達するために金属層を介してパターンを傷つけます。複製された所望のパターンを達成するために、コンピュータでこのプロセスを制御します。このプロセスによって形成されたパターンは実証されています 図2および図3の d。
- 100mLのD-PBS、3.5gのトリブロック共重合体、35.7μL/ mLのフィブロネクチンおよび29μL/ mLのラミニンの生体適合性層を調製する。
- 少なくとも10分間、紫外線でカバースリップを滅菌する。調製した生体適合性溶液中のカバースリップを一晩インキュベートする。
注記：生体適合層は、前のステップで生体拒絶層がエッチング除去された場所にのみ形成されます。 - 翌日、P-DBSで2回カバースリップを洗浄する。 PMのカバーガラスを一晩インキュベートする。カバースリップは細胞播種の準備が整いました。
- 少なくとも10分間、紫外線でカバースリップを滅菌する。調製した生体適合性溶液中のカバースリップを一晩インキュベートする。
- 以前広範囲に公開されている標準的な手順23,24に従って解剖を行う。
- 簡単には、典型的にはE19日に、または典型的にはE17 23日にマウスから、ラット胚から海馬または皮質を抽出し、クラス= "外部参照"> 24。
- ヒント火災研磨されたガラスピペットと機械的に粉砕24に続いて30分間、 - 20パパイン溶液中の第一の細胞を解離します。
注：細胞は、遺伝的に改変されたマウスから来る場合は、各胚からの組織は、全体のプロセス中に別個1.5mLのプラスチックチューブ内に維持されるべきです。 - 播種前にトリパンブルーを用いて細胞を数えます。
注：遺伝子改変動物のカウントが各胚のために個別に行う必要があります。 - ウェル当たり85万細胞における75万で2D培養、種マウスニューロンおよびラットニューロンのため。図1Dは、ウェル当たり65万細胞で播種。カバースリップの均質なカバレッジを確保するために、播種後わずかすぐにプレートを振ります。
- 神経細胞培養のメンテナンス。
- （ミリリットルあたり）からなる培地（CM）を変更する準備：ウリジン100Xと0.9mLのMEM + 3G、0.1mLのHI HS、10μL5-フルオロ-2'-デオキシウリジン（FUDR）を</ li>
- 0.9mLのMEM + 3Gおよび0.1mLのHI HSからなる最終培地（FM）を調製する（mLあたり）。
- インビトロで 4日後にPMを1〜1.5 mLのCMに交換する（DIV）。 6 DIVでは、CMの50％を新しいCMに置き換えます。 DIV 8で、培地をFM 1.5mLに変更し、FMを2日ごとに50％変更する。約1週間後、自発的な同期活動が現れる。
- 蛍光染料を用いたニューロン培養における自発的または誘発された活性のイメージング。
- 50μLのDMSO（ジメチルスルホキシド）中の50μgのカルシウム感受性蛍光色素（ Table of Materials / Reagents参照）の溶液を調製する。
- 10 mM HEPES、4 KCl、2 CaCl、1 MgCl、139 NaCl、10 D-グルコース、45スクロース（pH 7.4）を含む細胞外記録溶液（EM）を調製する。
- 8μLのカルシウム感受性蛍光色素溶液と2mLのEMのニューロン培養を1時間インキュベートする。軽くて軽く回転させてホモジナイズする細胞への色素のOUの普及。
- 画像化の前に、新鮮なEMとソリューションを交換してください。蛍光イメージングは、 図4に示されています。
- カルシウム蛍光画像（488nmの励起ピーク、520nmで発光ピーク）のための光学フィルタを有する蛍光顕微鏡で画像の視野内の関心領域（ROI）の任意の領域の強度を定量化することが可能なカメラおよびソフトウェアを使用して顕微鏡。
文化の2.電気刺激
注：電気刺激のための基本的なセットアップを図1に示されています。神経培養物は、約14日間成長されたカバースリップを、蛍光顕微鏡下でペトリ皿に置かれます。電圧が培養外側に位置しているバス電極の二対を介して印加されるニューロンの電気的活動は、カルシウム感受性色素を用いて画像化されます。電極は、などによって駆動されます。その出力は、デュアルチャネルアンプによって増幅されるignalジェネレータ。刺激のための電圧制御は、このように簡単なベクトル加算及び組合せを可能にする、より標準的な電流制御25、電界ベクトルが直接決定されるので、26よりも好ましいです。これは、電圧制御の場合のために試料全体にわたって実行することができ、電界の均一性を慎重にチェックが必要です。電圧制御ケアを使用する場合（下記2.2参照）、任意の接地ループを避けるために注意すべきであり、電界の均一性を検証すべきです。
- 均一な電界と電気的刺激のために平行電極線の対を使用します。
- 0.005「」（127ミクロン）のオーダーの厚さの白金製の電極を使用します。 13ミリメートルカバースリップで使用される場合、二つの電極間の距離は約11 mmであることを確認し、電極を配置培養上1mmです。
注記：電極ホルダー（ 図5Aおよび6A）を作るためには、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）を使用します。電極を挿入するためにPTFEを通じて狭い穴を開けます。電極が露出している先端は、溶液との接触で来ることは決してありませんように、デバイスは、細胞外溶液よりも高くする必要があります。絶縁のために、暴露されるかもしれない電極リード線のいずれかの部分にエポキシ接着剤を使用しています。 - 電気分解を回避するためにないDC成分と、50％のデューティサイクルを有する方形パルス形状を使用します。文化を燃焼することなく、効果的な刺激を引き起こすことが10マイクロ秒と4ミリ秒の間のパルス期間を変更します。振幅は±22 V（ 図5参照 ）の順であることを確認してください。方形パルスが電極に並列に接続されたオシロスコープ上で観察することができます。
注：任意の所望の波形の容易なプログラミングは、商用の波形編集ソフトウェアを使用するために（ 材料のリストを参照してください
- 0.005「」（127ミクロン）のオーダーの厚さの白金製の電極を使用します。 13ミリメートルカバースリップで使用される場合、二つの電極間の距離は約11 mmであることを確認し、電極を配置培養上1mmです。
- 磁場均一性をテストするには、プローブ電極を使用しています。プローブは、電極間の領域に移動して電位を測定できるように少なくとも1mm X 1mmのグリッドを使用します。
- 電位を測定します。つかいます
電界を計算します。参照電極として電極のいずれかを使用します。フィールドは、刺激期間の範囲内で均一であることを確認するために、4ミリ秒（100マイクロ秒のパルス持続時間の例については、図5Bを参照）は100μsの間のパルス持続時間を変化させて電場を測定します。
注：パルス持続時間が1ミリ秒であるときに測定した電界の均一性の例については、図5Dを参照してください。
- 電位を測定します。つかいます
- より複雑な電界形状を生成するためにバス電極の2直交対を使用し、へ異なる方向に電界を配向することができる（ 図6B参照 ）。電極の2対を有する装置が使用され、各電極対上の信号は、2つの別個のオシロスコープ上で観察されるであろう。
- 位置1ミリメートル培養上記と10の距離で電極 - 互いから11ミリメートル。両方の電極対が（ない接地接続を有していない）がフローティングされており、電極の任意のセットの間の抵抗を測定し、電極の間の短絡が存在しないことを検証することによって、任意の共通の基盤を持っていないことを確認してください。 （ 等オシロスコープ、増幅器、信号発生器、など）電極に接続されて使用される全ての機器は、すべての機器がフローティングされ、基準電極のどれも触れていないことを確認することにより、地面に対してフローティングされていることを確認任意の接地機器。
- 磁場配向を変更するために、解像度を持つ2つの電極対に供給される電圧の振幅を変化させます互いにPECT（ 図7A参照 ）。例えば、0°の使用のために他の電極用パターンと0 Vに対して垂直である電極対上に22 V、±。 45°の場合は、15.6 2 15.6 2 = 22 2の振幅のベクトル和のために、無位相遅れと電極の両方の対に15.6 V±使用。
- 回転磁界が電界を回転固定振幅を生成する正弦波電圧パルスの1つの波形と2つの電極対余弦電圧パルスの単一の波形を使用して適用する（ 図6B参照 ）。
注： 図6Bに見ることができるように、他の電極に±22 Vと一方の電極と余弦波の一回の周期で±22 Vの正弦波の1サイクルを使用した場合、ベクトル和が有する回転電界であります正弦と余弦波と同様、および±22 Vの振幅と周期期間
- クロンを測定し、計算するために、AxieおよびRheobaseの神経細胞培養における軸索の樹状細胞と同じ培養物における樹状突起は、以下のステップを実行する。
- 薄い（170μm）、長さ（10mm）の線にパターンを描いた1D培養液を用いて、1.5の表に記載のようにカルシウムイメージングにカルシウム感受性蛍光色素を使用する。カルシウム感受性色素を培養物に適用し、45分間インキュベートする。染料は、新しい記録溶液と交換することによって洗浄される。
- シナプス伝達の影響を受けずに、電気刺激に対する直接応答の母集団統計を達成するためにネットワークを切断する。そのためには、γ-アミノ酪酸-A （GABA A ）受容体、6-シアノ-7-ニトロキノキサリン-2,3-ジオン（CNQX）受容体の阻害作用を遮断する40μMのビククリンと、 α-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4-イソオキサゾールプロピオン酸（AMPA）およびカイニン酸受容体および20μMの（2R） - アミノ-5-ホスホノバールRIC酸（APV）、そのブロックN-メチル-D-アスパラギン酸（NMDA）受容体。ブロッカーは、記録液に追加されます。
- 2.1および2.3に記載したように100マイクロ秒と4秒の間の時間期間を変化させて方形パルスを印加します。信号をオシロスコープで観測することができます。
- いくつかの関心領域でカルシウムトランジェントの強度を監視する（1.5を参照）は、画像取得プログラムを用いて蛍光顕微鏡を使用して、数百のニューロンをそれぞれ含みます。少なくとも毎秒20枚のフレームの画像取得速度が可能な敏感EMCCDカメラを用いて画像を（材料のリストを参照）、取得することができます。光強度の変化は、刺激された神経細胞の量に比例します。強度の相対的変化を使用して刺激されたニューロンの割合を推定します。
- 各パルス持続時間（4ミリ秒〜100マイクロ秒）のために、目に、強度の変化が見られない電圧（数ボルト）から始まる電極に印加する電圧の振幅を変更します（22 V、±まで）による印加電圧の強度の変化が飽和したE電圧。
注：強度変化は、電圧パルスのそれぞれの持続時間のための刺激のための印加電圧に対する累積ガウス5のように分配されます。 - 各期間のための印加電圧対強度の累積ガウス分布にフィットし、このフィットからガウス平均値を抽出します。
注：この平均は、ニューロンが応答先の代表電圧です。 - このプロセスの終わりに、どのニューロンが応答する各刺激期間の平均電圧を得ます。強度・持続時間曲線をプロットする期間と強みのこれらのペアを使用します（ 図7を参照）。
電界を計算します。参照電極として電極のいずれかを使用します。フィールドは、刺激期間の範囲内で均一であることを確認するために、4ミリ秒（100マイクロ秒のパルス持続時間の例については、図5Bを参照）は100μsの間のパルス持続時間を変化させて電場を測定します。 文化の3磁気刺激
注意：磁気刺激のための基本的な設定は、図2に示されています。右上に表示されますニューロンにおける画像カルシウム感受性色素に用いられる倒立蛍光顕微鏡。磁気コイル（青丸）は同心神経環培養、（青のアウトライン）の上方約5mmに配置されます。ペトリ皿の周囲にピックアップコイル（赤丸）は、磁気パルスによって誘起された電圧を監視します。ピックアップコイルから集積左上に、5,000キロボルトのコンデンサ電圧負荷と磁気刺激装置（MS）コイルの測定された動態を示しています。磁界は青で示されているが（14mmのリング半径について計算）誘導電界は緑色で示されています。底にニューロン培養物の画像を示しています。左下にパターン化された24 mmのカバースリップの明視野像です。白い部分はニューロンです。撮影パターンは、異なる半径を有する同心円培養物から成ります。右下の個々のニューロンを示し、環の短いセグメント上のズームです。規模については、リングWID目には約200μmです。
- 1D培養刺激のための円形リングパターンにおけるニューロンの成長（1.2.5に記載されるようにエッチング）。薄い（170ミクロン）上にパターニング1D培養、長い（10mM）を行と（セクション1.5で説明したように）カルシウムイメージングのためにカルシウム感受性蛍光色素を使用します。
- 約5ミリメートル以下とコイルと同心ペトリ皿円形の磁気コイルと位置を使用します。 5キロボルトの最大電圧を負荷した自家製または商業MSによって駆動さL = 90 はmHのインダクタンスと約30ミリメートル（内径46 mmの外径）コイルのカスタムコイルを使用します。
- 磁気ニューロン培養物を刺激する高電流、高電圧スイッチを使用して導電コイルを介して高電圧及び電流を放電します。 5キロボルト- 21で説明したように、磁気刺激（MS）は、1の高電圧を得るために、100 mFでの順に、大きなコンデンサを使用して構築することができます。また、商業的使用利用できるMS（参照 材料/試薬の表 ）。
注：自家製コイル21を製造するために厚さ0.254ミリメートルと6.35ミリメートルワイドポリエステルでコーティングされた長方形の銅線を使用します。エポキシ樹脂にガラス繊維とキャストで絶縁カスタムメイドフレーム上の配線をオン（ 材料/試薬の表を参照のこと）。あるいは（ 材料/試薬の表を参照）、市販のコイルを使用します。
- 2Dの文化を刺激するために回転磁界を使用してください。
- さて、2Dの文化を刺激するために回転磁界を使用しています。強度を有するコイル読み取りの線形相関を示すために、異なる強度で、皿にない培養でTMSを発射します。
- 次に、神経細胞培養でのカルシウムトランジェントを記録しながら、両方のカルシウムトランジェントとコイルを記録しながら、強度を増加させることTMSを焼成開始。まず、ネットワークバーストがsho、大きなカルシウムトランジェントとして観察しますULDと同期しないコイルTMSスパイクを拾います。ある時点で、強度を増加し続け、カルシウムトランジェントはTMSスパイクと同期なり始めます。あるいは、またはさらに、同期応答を達成した後、同期がTMS閾値を決定するために、廃止されるまで、強度を低下させる開始。
注：条件は厳密に同じ船や正確なコイルの位置および向き、正確な量を毎回使用して、セットアップごとに一定に維持されるべきです。- それは神経細胞培養に平行な面内で培養に対して固定位置にあるように記録ディッシュのベースにピックアップコイルを取り付けます。
注：これは、磁石に対するピックアップコイルの位置の依存性は、培養の位置に忠実であることを確実に位置決めにおける矛盾がピックアップコイルの読みに無視できるであろうこと。- 二つの独立したコイルを使用します回転磁界および誘導電界を生成する（ 図8B）互いに直交する配置。独自のMSに各コイルを接続します。刺激物質が〜270 V / M（ 図10B）の最大分野で実空間の270度を走査する回転磁界を生じる、90度（ 図10A）の位相遅れで同様の電流を放電することを確認してください。
- 外部記録溶液（EM）を充填した球状ガラス容器の内部ニューロン培養物を置き。
- ステップ2.4.4で説明したようにカメラで刺激（神経細胞の蛍光強度の変化）を監視します。
- クロスコイル（ 図8B）の場合には、ピックアップコイル平行およびニューロン培養下の特定の距離に位置します。慎重に実験を通してこの構成を維持。
- それは神経細胞培養に平行な面内で培養に対して固定位置にあるように記録ディッシュのベースにピックアップコイルを取り付けます。
- 解析的に1次元configuraための電界を計算E maxは誘導電界の最大振幅であり、半径rのリングの接線に沿って向けられているE マックス = K 1 Brの 、によってション。 Bは、磁気パルスの振幅であり、k 1は、ピックアップコイル（ 図8A）を用いて測定することができる三次元比例定数です。
- 数値的に電場21をシミュレートするために、（材料リストを参照してください）数値シミュレーションパッケージを使用してください。
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Representative Results
提示プロトコルは、神経細胞培養の容易なパターニングが可能になります。それは私たちが刺激のために開発され、いくつかの方法と組み合わせると、それは、健康と病気のニューロン27の特性を比較するための関数としての文化を刺激するための最適な方法を見つけるために、そのような時値および基電流5のように、いくつかの固有のニューロンの特性の測定を行うことができますその構造と、より多くの斬新なアプローチ。いくつかの例を次の図に示されています。
図3に示します 図1Dは、バイオ拒絶層にエッチングされた構成をパターニングします。約170ミクロン幅の細い線は、典型的には、例えば、典型的には、変化する半径（ 図3A）又は平行線と同心リングできることが刻まれ〜11ム・ロング（ 図3B）。
NT」FO：キープtogether.withinページ= 『1』> 図4の上部パネルは、電荷結合素子（CCD）を用いて採取し、蛍光標識の画像を示す、培養中の蛍光活性の代表的写真を示します2D培養中のニューロン（トレースは対応する色である。この例では、3つの異なる関心領域が示されている、黒、緑と赤でマークされた。統合された蛍光強度トレースは、図4の下のパネルに示されているが、これらの三つの異なるのROIで測定関心領域）から。挿入図が示すように、この特定のデータが取られたときのフレームの取得時間の200ミリ秒の分解能内で、三つの異なる関心領域内の全てのニューロンが同時に破裂します。一方向、定電場による刺激のために使用される基本的な装置は、 図5Aに示されています。電極のワイヤは約1mmニューロン培養の上に、記録媒体に浸漬されます。電気刺激のために使用される基本的なパルス形状は、 図5Bに示されています。この電圧パルスが印加されたときには、サイクルの半分の後180°その向きを反転一定の電界を生成します。半サイクル後のフィールド方向の変化は、電極に電気分解し、損傷を避けるために使用されます。電極に印加される典型的な電圧は±22 Vであり、2D培養の刺激のための典型的なパルス持続時間は100程度である - 500マイクロ秒。
神経突起の成長のいずれかの異方性を制御するために、我々は、2D培養の刺激が等方性であることを確認しました。手動で15°の分解能で全360°で電極を回転させることにより（ 図5C）は、刺激のためのオリエンテーションのプリファレンスが存在しないことがわかります。 図5Cの各色は、異なる文化の刺激を表します。原点からの距離が最小のデュを表します一定振幅の刺激のために必要な飼料。良い近似に、2Dの文化は、電気刺激のための好ましい配向を持っていない、ということは明白です。
（それは反転することができるが）電極の単一対がフィールドための一のに定義さ方向を有するに制限されるため、我々は2つの電極対（ 図6A）と電気刺激のための装置を開発しました。培養の模式（灰色の円形の背景、暗いスポットが細胞体である）と電極（平行太い線）は、 図6Bに示されています。 図6Bに青と緑インサートとして示される波形は、余弦および正弦波であり、回転Eベクトル場が生成され、次いで一緒に適用される場合。電圧パルスが正方形である場合、異なる振幅を有しており、それらはRによって決定される所望の向きに一定のフィールドを作成し、それらの間にゼロ位相遅れを持っています2つの電極対の間elative振幅。この電動回転は、 図5Cにおける刺激強度の角度分布を得るために使用した手動、機械的な回転を超える明らかな改善です。もちろん、 図6Cが示すように 、電極の一方のみ対を活性化することによって、可能性の対照として、一つだけ一定方向を励起するために、この構成を使用することも可能です。
これらの構成は同じルートで正方形（RMS）電圧を平均した後、振幅が固定されているときに培養を励起するのに必要なパルス持続時間を比較するために、回転磁界または固定角度フィールドのいずれかを有する2Dニューロン培養物を励起するために使用しました。一方、単一方向電場と我々は、平均持続時間、±22 Vの定振幅で回転電界を使用する場合、150±14マイクロ秒の平均期間は、刺激を達成するために必要なことがわかっ290±30マイクロ秒が必要でした。固定角度フィールドに対して回転しながら励起培養に必要な期間との比率は、したがって、0.53±0.02です。
2D培養で軸索は全ての方向に延びているので、回転磁界は、軸索の多くを励起することが可能です。これとは対照的に、単一配向場とその特定の角度に配向し、軸索の興奮が達成されていないだけで、いくつかの軸索があります。持続時間が増加すると、樹状突起特に、ならびにニューロンの励起他の部分の可能性があります。これにより、クロナキシー測定を説明する際に説明します。パルス持続時間で、多くの場合、技術的な限界があるため、脳刺激のために、外部のフィールドを使用するときに回転磁界を使用した場合、はるかに短い期間は、同じ文化の励起のために必要とされるという事実は非常に重要です。
図7に示されています。 図7Aに1D切断されたネットワークは、培養の線に沿って（樹状刺激のための90℃で）培養の線または垂直（軸索刺激のために0℃で）2つの電極対のいずれかによって電界が刺激されます。電圧が増加するにつれて、より多くのニューロンが刺激され、これはインフルエンザで反射され刺激されたニューロンの数に比例するorescence強度、（ 図7B参照 ）。増加する電圧振幅は徐々に全体の文化を刺激するために使用されています。各ニューロンはそれに応答すること（特定のパルス持続時間のために）最小しきい値電圧を有し、大数の法則により、これらのしきい値の分布がガウス分布であると予想されます。私たちは答えたニューロンの数を見て、印加電圧に対してそれをプロットした場合そのため、分布は、Error関数（ERF）5である累積ガウス分布になります。電場の特定振幅に応答するニューロンの数は、ほぼガウス分布を有し、そのため蛍光が良く、その積分によって記載されている-刺激フィールド（ 図7C）の振幅の誤差関数。
図7Cは、電子に使用されていますxtract 1つのパラメータ、分布の期待値（平均）。これは、累積的なガウス分布を適合させ、最良の適合を得ることによって行われる。この期待は、細胞の50％が応答する印加電圧である。このプロセスは、いくつかのパルス持続時間（100μs〜4msの範囲）にわたって繰り返される。培養物が応答した平均電圧をパルス持続時間に対してプロットし、強度 - 持続時間曲線を得る。 2組の測定を行った。最初のフィールドはパターンに平行で、2番目のフィールドはパターンに垂直でした。樹状突起はあらゆる方向に成長するが、軸索はパターンと整列することが以前に15,23で示されている。これは、軸索と樹状突起の励起の間に明確な差を得るのに非常に有用な2つの異なる強度 - 持続時間曲線を与える。樹状突起および軸索の寄与への完全な分離は、軸索励起用アルの時定数は、樹状のもの2、3、4よりもはるかに短いです。
強度・持続時間曲線は、クロナキシー減衰式にフィットさ
、VのRHは、基電流の電圧であり、Cはクロナキシーあります。 T <1ミリ秒のパルス持続時間では強度持続時間曲線における励起電圧の下限値を有する、第一励起され、ニューロンが発火させる軸索です。軸索クロナキシーは110マイクロ秒であると計算されました。打撃対照的に、長い持続時間（T> 1ミリ秒）での励起のための樹状区画は900マイクロ秒で算出した樹状クロナキシーとニューロンの励起源です。
CIRと2Dおよび1D培養物の刺激の基礎となる原理cularコイルを図8に記載されています。物理的な状況のより良い理解を得るためには、磁気や誘導電界の数値シミュレーションは、COMSOLパッケージを使用して製造されています。同心ペトリ皿の上方に位置する円形の磁気コイルが使用される1D培養物を、刺激します。ニューロンは、記録用のペトリ皿の内側に配置される丸いカバースリップ上の円形リングで増殖させます。この場合、誘導電界は解析的に計算し、E maxは誘導電界の最大振幅であり、半径rのリングの接線に沿って向けられているE maxの K = 1のBrに等しいことができます。 Bは、磁気パルスの振幅であり、k 1は、ピックアップコイルを用いて測定することができる三次元比例定数です。
磁界CのCOMSOL数値計算図8Aの上部パネル（赤色の流線）に1D培養物中のコイルによって再生されたものが示されている。 図8Aの下のパネルでは、誘導電界についての計算が示されている。交差コイル配置を用いた2D培養の刺激を図8Bに示す 。 2D培養物を刺激するために、二次元ニューロン培養物を内部に配置し、記録媒体（EM）で満たされた球状ガラス容器に入れた回転磁界を生成するクロスコイルを使用した。この場合、誘導電場はもはや解析的に計算することができない。交差コイルは図8Bの上部パネルに示され、球状容器は2つのコイルの内側に配置され、2D培養物を支持するガラスカバースリップは容器の底部に配置される。スケールの場合、内側コイルの内径は65mmです。 Eddy Currents 3DモデルでCOMSOLを使用した数値シミュレーションを下のパネルに示します。球状容器の内面に誘導電界を描きました。刺激のために使用される典型的な1Dニューロン培養したガラスカバースリップの明視野顕微鏡像を図8Cに示されています。白線は、指向性の効果に関する実験的比較および制御の両方接線方向及び半径方向に配向されているパターン化されたライン上のニューロンを示します。
1D文化のジオメトリは、文化が磁気刺激に反応して発火するかどうかを決定する上で大きな役割を果たしています。 1Dリング文化の唯一の22％は、磁気刺激に応答しました。成功した励起率が強く文化の直線長さに依存し、 図9（a）が示すように 、磁気刺激により長い80ミリメートル応答している文化の60％以上。これは、特別な条件が磁気応答のために必要であることを示唆しています。 Wこの幾何学的な依存の文化を調査するために、ERE環の一部である構成で増殖させた- （ 図8C参照 ）の円弧上ではなく、完全な円上にパターニングすることにより、同一半径が異なる長さを有します
1Dリング培養の半径の関数としての磁界閾値の包括的調査は、 図9Bに示されています。カラーコードは、興奮閾値を測定するために計算された確率を示しながら、白丸は、刺激閾値の実験測定値を表します。刺激閾値は依然として所与ニューロン培養に対する応答を誘発する最も弱いフィールドとして定義されています。
図9Bは、リングの半径と刺激閾値の間に明確な逆相関を有するより大きな環が低い刺激閾値を有する傾向を強調する。例えば、平均14ミリメートルリングはMAGNに応答しますエリックパルスは1.5Tの振幅を有し、平均7mmリングは3T以上にしか応答しない。これは、誘発電場の理論的計算から予想されます。誘導電場は、発火する可能性のある色分けされた予測確率として描かれています。実際に、7mmの半径で3Tによって誘導される電場は、2倍の半径で1.5Tによって誘導される電界に等しい。要約すると、平均電界閾値は、リング培養の半径とは無関係に、301±128（標準偏差） V / mである。
2D培養物において応答を引き出すことができなかった単一の円形コイルとは対照的に、回転磁界磁界刺激によって刺激された30の2D培養物のうち15個は、拍動する神経興奮で応答した。互いに垂直に配置された2つの独立したコイル（ 図8B ）は、回転する磁気および誘起電界を生成する。各コイルはそれ自身のMSに接続され、両方とも放電する90度の位相遅れで同様の電流をARGE。クロスコイル構成の2つのコイルの各々により誘導される電場の振幅は、 図10Aにプロットされ、そして同じトレースは両方のコイルの重畳された電界の方向及び振幅の極座標表現によって図10Bに表されています。得られた誘導電界は〜270 V / Mの最大分野で実空間の270度を走査します。
図1：神経細胞培養の電気刺激のために使用されるセットアップの概略図。所望の信号は、共通接地を持たない二つの出力と信号発生器によって生成されます。これらの信号は、TWにおけるニューロン培養を刺激、電気信号は、次に、電極の二つの別々の組を介して供給される30 V.最大±の出力電圧を与えるように増幅され直交し、独立した方向O。ニューロンの刺激は見およびカルシウム色素によってモニターすることができます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：ニューロンの文化の磁気刺激のために使用されるセットアップの概略図。上部にA.をペトリ皿（青輪郭）に配置された神経環培養5mm上に同心に配置されている磁気コイル（青丸）を、示されています。ペトリ皿の円周上に位置するピックアップコイル（赤丸）は、磁気パルスによって誘起された電圧を測定します。ピックアップコイルからの積分として底部に磁気刺激コイルの測定されたダイナミクスは、（5,000キロボルトのMSコンデンサ電圧負荷を使用して）示されています。誘導電界（calculat磁場は、青色B.アン倒立顕微鏡像の磁気パルスに反応するニューロンのカルシウムトランジェントに対して感受性色素を蛍光性示されているが14mmのリング半径）のためのEDは緑色で示されています。 C.ニューロンはリング磁気刺激装置によって効果的な刺激のために使用される、同心リングのパターン上に成長させました。パターンの一本のライン上に成長させたニューロンのD.明視野顕微鏡画像。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：軸索成長の方向に電界を配向させるために使用1Dニューロン培養物のパターンの例。 A.円形パターンは、円形磁気コイル誘導ELEのために使用されます ctricフィールドには、円形の向きを有します。誘起または直接電界が単一配向を有する場合B.ラインパターンが使用されます。
図4：同期ネットワークバースト中画像形成されたカルシウムトランジェントの例トレース。 A.カルシウム色素を用いた実験の前染色した神経細胞の画像。 3つのROI内の同期強度A.におけるROIの境界の色を表すトレースの色に大きな増加ROIの時間対強度のB.トレースは、ネットワークバーストを表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図5：1対の平行浴電極を使用して2次元培養物が電気刺激の好ましい向きを有していないことを判定する電気刺激の基本設定。 A.培養刺激に使用される装置。電場は、白金線電極に電圧を印加することによって生成される。 2本のワイヤー間の距離は13mmです。 B.Aの電極上に印加される電圧信号の例。パルスのバイポーラ形状は、電極での記録溶液の電気分解を防止するのに役立つ。電極の異なる回転における2D培養を刺激する場合、ニューロン応答の等方性が存在する。 D.ステップ2.2で説明したプローブを使用した電場測定の例。電場は最大10％の誤差に均一です。この数字は5から変更されています。/ 54357 / 54357fig5large.jpg」ターゲット= 『_空白』をアップロード>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6：電気刺激電極の2組は、任意の所望の角度における電界の回転を刺激することを可能にします。電界のより複雑な形状を生成するためA. 2つの独立した電極対が必要です。 B.は、一方の電極に余弦電圧形パルスを印加し、第2の電極に正弦波パルスは、一定の振幅で回転電界を生成します。電極の一対に方形電圧パルスを印加C.は、一方向に均一な電界を生成します。この図は、5から変更されています。 CLくださいこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをICK。
図7：（2.4.2に記載）シナプス入力を遮断することによりネットワーク切断は、与えられた電場によって刺激される単一細胞の総人口の観察することができます。電極の二対、電場に電圧パルスの異なる振幅を印加することによりA.手動で培養をオンにする必要なく、あらゆる角度に配向させることができます。異なる印加電圧で電気刺激によるカルシウムトランジェントのB.例レコーディング。 4つのトレースは、わずかに閲覧できるように垂直方向にシフトし、表示されます。電圧値は青、トレースの下に書かれています。 C.電界の一定の持続時間を適用する場合、電界に応答して発火するニューロンの数は累積DISTを有しますribution関数（電界強度に比例する）電圧の振幅の関数として累積ガウス分布（又はERF関数）である（CDF）。 D.このプロトコルを採用しながら、得られた強度-時間曲線の例。この図は、5から変更されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図8：磁気コイル構成と誘導電界の計算。上部にA.一次元ニューロンリング培養5mm上に配置される円形コイル（青丸）（ブルーディスク）です。リングは、赤い線に沿って配向された磁気パルスを生成するコイルとに平行と同心です。によってファラデーの法則では、誘起電場は、それと同心のリングに沿ってコイルに平行な面にある。底部は、リングカルチャーの平面に沿った水平断面である。電場の相対値は、矢印で描かれた方向で色分けされている。大きなリングはより大きな磁束領域を囲み、したがってそこに誘導される電場はより高い。 B.クロスコイル磁気刺激装置の画像（上）とそれによって誘導される電場のシミュレーション。円形の電界または放射状の電界のいずれかで刺激することができるニューロンを成長させるために使用されるパターン。この数字は21,28から変更されています。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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図9：磁場にリング文化の応答。 A.刺激の成功率は、文化の半径で成長します。エラーバーは標準誤差（SE）を表します。 B.は、リングサイズと磁場強度との関係が示されています。培養物を励起する確率が色分けされています。実際培養の最も成功した励起は、実験的にアクセス可能な位相空間（白い四角形）及び高確率領域（赤色）との間の重なりにあります。この図は、21から変更されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図10：磁場セットアップフィールドを回転させます。 <クロスコイルの磁気刺激で刺激する場合、回転電場を誘導するために/強い> A.は 、90度の位相シフトは二つのコイルの間に必要とされます。クローバーの葉のコイルの2つの隣接する翼の上に位置するピックアップコイルに誘導電界が示されています。コイルは2つの商用刺激物質によって別々に駆動されました。 B.再構築、クローバーの葉のコイルのパルスの間に生じた電界の振幅および方向のAに示された曲線を、使用。この図は、21、28から変更されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
1Dパターニングは、様々な用途に使用することができる重要なツールです。例えば、我々は、ラット海馬ニューロン5のクロナキシーおよび基電流を測定するために、より最近ニューロン培養物29からの論理ゲートを作成するための1次元パターニングを使用している、とと比較してダウン症候群海馬ニューロンにおける発火活動の信号伝搬速度の減速します野生型（WT）海馬ニューロン27。 1Dパターニングの推奨プロトコルは、ロバストであり、任意の所望のパターンを形成することが容易です。私たちは、測定がその機能に影響を与える可能性があるネットワークの任意の可能な切断、を認識する前に、1D文化を観察することをお勧めします。
ニューロンの構成のケミカルパターニングを区別履歴30、31、32を有しています。我々は我々のアプローチ収率ことがわかりました化学的パターン形成と同様の結果をね、まだ彼らは、より堅牢で達成するのが容易です。最近、神経細胞のマイクロ流体パターニングのためのオプションは、我々は同等のシンプルさと使用33、34の容易さと、提供するアプローチに興味深い選択肢となっています。マイクロ流体のアプローチは、ここで説明したエッチング方法と並行して、私たちの研究室で使用されています。
私たちは5を示したとして、2D培養液には好ましい配向を持っていないし、その刺激が等方性であると適用分野の向きに依存しません。フィールドが回転しているとき、短い期間は、2D培養の刺激のために必要とされます。これとは対照的に、1Dの文化は、フィールドの向きに大きく依存しています。フィールドは、（軸索成長の方向と従ってなど）パターンで配向される場合、刺激のために必要な固定振幅フィールドの持続時間は、フィールドが配向である場合よりもはるかに短いですパターンに対して垂直編。持続時間が一定に保たれている場合、フィールドパターンが平行である場合同様、次いで培養物を励起するために必要なフィールドが小さくなっています。垂直刺激場合、磁場パルスは、はるかに長い（ネットワークが切断されたミリ秒のオーダーで）する必要があり、その後、主に樹状突起が刺激されます。 （直接または磁場によって誘起されるのいずれか）電場が脳刺激のために使用される場合、これは非常に重要です。対象の脳領域が軸索の束を持っていることが知られている場合は、これらの軸索は、その方向にフィールドを配向させることにより励起して、少ない電力や刺激のためのフィールドの短い期間を必要とすることができます。対象脳領域が方向を優先しているしない場合には、回転磁界は、刺激のための、より効率的です。樹状突起は、刺激の対象であれば、より長いパルスは、より効果的です。
磁界は神経活動を刺激することができたときに磁気パルスIニューロンを励起する電界をnduces。現在、実現可能な磁気パルスは、応答時間ミリ秒のオーダーである期間、樹状突起、でマイクロ秒であるため、磁気刺激に敏感であることが期待されていません。対照的に、その応答時間が速くなり、軸索は、刺激2、3の目標です。電気励起に軸索の応答は、それらが電場に平行であるときに最大であり、彼らはそれ1、35に対して垂直であるときに減少します。そのため、磁気励起では、我々は、誘導電界が標的に軸索に平行に配向システムをセットアップするために努力しています。 1Dリングを刺激する場合したがって、フィールドは、軸索に平行に配向されるべきであり、環の大きさは、刺激のための閾値を決定します。バス電極によって直接刺激のために同様の、2D培養、回転誘起電子を刺激しますlectricフィールドには、はるかに効率的です。
神経細胞の電気や磁場と外部励起のパターニングの組み合わせは、多くの可能な将来のアプリケーションとの強力な技術です。クロナキシーおよび基電流、ならびに活性化および活性化伝播のダイナミクスと速度の閾値は神経細胞培養の固有の特性を言っているすべてのパラメータです。具体的には、治療処置および薬理学的または治療の効果はすぐに、ニューロン上で直接テストすることができます。これは、両方の疾患モデルニューロンのとTMS刺激のためのプロトコルの効率的な調査を可能にします。より概念的な方向では、神経細胞培養を刺激する能力は、正確に、神経構成の情報処理側面に関する小説の可能性につながる、と私たちは新しい計算を提供するために、生きている神経細胞のネットワークと電子刺激を組み合わせたマイクロ印刷回路を想定することができますアル・デバイスおよび新規脳インタフェースデバイス。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。
Acknowledgments
著者たちは、Ofer Feinerman、Fred Wolf、Menahem Segal、Andreas Neef、Eitan Reuvenyに非常に有益な議論に感謝します。著者は、この技術の初期バージョンの開発について、Ilan BreskinとJordi Sorianoに感謝します。作者は理論的概念の助けを借りてTsvi TlustyとJean-Pierre Eckmannに感謝します。この研究は、ミネルバ財団、イスラエル科学技術省、イスラエル科学財団助成金1320/09およびバイナショナル科学財団助成金2008331によって支援された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APV | Sigma-Aldrich | A8054 | Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2 |
| B27 supp | Gibco | 17504-044 | Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| bicuculline | Sigma-Aldrich | 14343 | Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2 |
| Borax (sodium tetraborate decahydrate) | Sigma-Aldrich | S9640 | Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2 |
| Boric acid | Frutarom LTD | 5550710 | Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2 |
| CaCl2 , 1 M | Fluka | 21098 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| CNQX | Sigma-Aldrich | C239 | Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2 |
| COMSOL | COMSOL Inc | Multiphysics 3.5 | Numerical simulation. Mentioned in Section 3.5.2 |
| D-(+)-Glucose, 1 M | Sigma-Aldrich | 65146 | Plating medium, Extracellular recording solution. Mentioned in Sections 1.1.1 and 1.5.2 |
| D-PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Cell Cultures. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6 |
| FCS (FBS) | Gibco | 12657-029 | Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6 |
| Fluo4AM | Life technologies | F14201 | Imaging of spontaneous or evoked activity. Mentioned in Sections 1.5.1, 1.5.3, and 1.5.5 |
| FUDR | Sigma-Aldrich | F0503 | Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1 |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1272 | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| GlutaMAX 100x | Gibco | 35050-038 | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| Hepes, 1 M | Sigma-Aldrich | H0887 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| HI HS | BI | 04-124-1A | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Sections 1.1.1, 1.4.1, and 1.4.2 |
| KCl, 3 M | Merck | 1049361000 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6 |
| MEM x 1 | Gibco | 21090-022 | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.4.1 1.4.2 |
| MgCl2 , 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| NaCl, 4 M | Bio-Lab | 19030591 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| Octadecanethiol | Sigma-Aldrich | 01858 | Cleaning Cr-Au coated coverslips (1D cultures). Mentioned in Section 1.2.3 |
| Pluracare F108 NF Prill | BASF Corparation | 50475278 | Bio-Rejection Coating, Bio Coating. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6 |
| Poly-L-lysine 0.01% solution | Sigma-Aldrich | P47075 | Promote cell division. Mentioned in Section 1.1.4 |
| Sucrose, 1 M | Sigma-Aldrich | S1888 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| Thiol | Sigma-Aldrich | 1858 | Bio-Rejection Coating. Mentioned in Section 1.2.3 |
| URIDINE | Sigma-Aldrich | U3750 | Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1 |
| Sputtering machine | AJA International, Inc | ATC Orion-5Series | coating glass with thin layers of metal. Mentioned in Section 1.2.2 |
| Pen plotter | Hewlett Packard | HP 7475A | Etching of pattern to the coated coverslip. Mentioned in Section 1.2.5 |
| Electrodes wires | A-M Systems, Carlsborg WA | 767000 | Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Sections 2.1, 2.2, 2.3, and 2.4.5 |
| Signal generator | BKPrecision | 4079 | Shaping of the electric signal. Mentioned in Section 2.3 |
| Amplifier | Homemade | Voltage amplification of the signal from the signal generator to the electrodes. Mentioned in Section 2.3 | |
| Power supply | Matrix | MPS-3005 LK-3 | Power supply to the sputtering machine. Mentioned in Section 1.2.2.3 |
| Transcranial magnetic stimulation | Magstim, Spring Gardens, UK | Rapid 2 | Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Sections 3.1, 3.3, and 3.4 |
| Epoxy | Cognis | Versamid 140 | Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4 |
| Epoxy | Shell | EPON 815 | Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4 |
| Platinum wires 0.005'' thick; A-M Systems, | Carlsborg WA | 767000 | Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1 |
| Circular magnetic coil | Homemade | Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.3 | |
| WaveXpress SW | B&K Precision | Waveform editing software. Mentioned in Section 2.1.32 | |
| Xion Ultra 897 | Andor | Sensitive EMCCD camera. Mentioned in Section 2.4.4 |
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