Summary
Nevrale kulturer er en god modell for å studere nye hjernestimuleringsteknikker via deres effekt på enkeltnerveceller eller en populasjon av nerveceller. Presenteres her er forskjellige metoder for stimulering av mønstrede neuronale kulturer av et elektrisk felt frembragt direkte ved badelektroder eller indusert av et tidsvarierende magnetfelt.
Abstract
En nevron vil avfyre et aksjonspotensial når dens membranpotensialet overstiger en viss terskel. I typisk aktiviteten i hjernen, skjer dette som et resultat av kjemiske innganger til sine synapser. Imidlertid kan neuroner også bli eksitert av et pålagt elektrisk felt. Spesielt de siste kliniske applikasjoner aktivere nerveceller ved å skape et elektrisk felt eksternt. Det er derfor av interesse å undersøke hvordan nervecellen reagerer på ytre felt og hva som forårsaker handlingen potensial. Heldigvis er nøyaktig og kontrollert påføring av et eksternt elektrisk felt mulig for embryonale neuronale celler som er skåret ut, dissosierte og dyrket i kulturer. Dette gjør etterforskningen av disse spørsmålene i en svært reproduserbar system.
I dette papiret noen av de teknikker som brukes for styrt påføring av ytre elektrisk felt på neuronale kulturer blir gjennomgått. Nettverkene kan enten være endimensjonal, det vil si mønstret i linear former eller tillatt å vokse på hele planet til substratet, og således todimensjonale. Videre kan eksitasjon skapes ved direkte anvendelse av elektrisk felt via elektroder nedsenket i væsken (badelektroder), eller ved å indusere det elektriske feltet ved hjelp av fjern opprettelse av magnetiske pulser.
Introduction
Samspillet mellom nevroner og eksterne elektriske felt har fundamentale konsekvenser samt praktiske seg. Mens det er kjent siden tider av Volta som en ytre påført elektrisk felt kan eksitere vev, blir de mekanismer som er ansvarlig for produksjonen av en resulterende virkningspotensial i neuroner bare nylig begynt å bli avslørt 1, 2, 3, 4. Dette inkluderer å finne svar på spørsmål angående den mekanisme som forårsaker depolarisering av membranpotensialet, rollen av membranegenskaper og ione-kanaler, og til og med regionen i nervecelle som reagerer på det elektriske felt 2, 5. Terapeutisk nerve 6, 7, 8, 9, Måling av vekselvirkning inne i hjernen in vivo gir en viktig komponent til denne forståelse, men er hemmet av den unøyaktighet og lav kontrollerbarhet av målinger i kraniet. I motsetning til dette, kan målinger i kulturer enkelt bli utført i høyt volum med høy presisjon, utmerket signal til støyforhold og en høy grad av reproduserbarhet og av kontroll. Ved bruk av kulturer et stort utvalg av nevronale egenskaper for kollektive forbindelsene oppførsel kan bli belyst 11, 12, 13, 14, 15, 16. Tilsvarende er det godt kontrollert system forventes være svært effektiv i å belyse mekanismen ved hvilken andre stimuleringsmetoder arbeide, for eksempel hvor kanalen åpner seg under optisk stimulering i optogenetically aktive neuroner 17, 18, 19 er ansvarlig for å opprette aksjonspotensial. Her fokuseres det på å beskrive utvikling og forståelse av verktøy som effektivt kan opphisse nervecellen via en ekstern elektrisk felt. I denne beskrivelsen beskriver vi fremstilling av todimensjonale og endimensjonal mønstrede hippocampal kulturer, stimulering ved hjelp av forskjellige konfigurasjoner og orientering av en direkte påtrykt elektrisk felt av badelektroder, og endelig stimulering av to-dimensjonale og mønstrede endimensjonale kulturer ved en tidsvarierende magnetisk felt som induserer en elektrisk felt5, 20, 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk Uttalelse: Prosedyrer som involverer dyr behandling ble gjort i samsvar med retningslinjene i Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) av Weizmann Institute of Science, og den aktuelle israelsk lov. Weizmann Institute er akkreditert av Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). Weizmann Institutional Animal Care og bruk komité godkjente denne studien, utført med hippocampalneuroner.
1. Fremstilling av to-dimensjonale (2D) og En-dimensjonal (1D) Hippocampale kulturer
- Fremstilling av dekkglass for 2D-kulturer.
- Forbered pletteringsmedium (PM) består av: 0,9 ml minimalt essensielt medium (MEM) + 3G, 0,05 ml føtalt kalveserum (FCS), 0,05 ml varme-inaktivert hesteserum (HS HI) og 1 pl av B27 supplement. Merk: MEM + 3G inneholder for hver 500 ml MEM x 1, 1 ml gentamycin, 5 ml stabilisert L-glutamin 100x (se
- Forbered boratbuffer bestående av: 1,9 g boraks (natriumtetraboratdekahydrat) i 200 ml dobbelt destillert vann (DDW) (bland ved 60 ° C) og 1,24 g borsyre i 200 ml DDW. Titrere endelige løsning til pH 8,5 ved anvendelse av 1 M HCI. Merk: Den endelige løsning er 400 ml 0,1 M boratbuffer.
- Dyppe dekkglass i 65% salpetersyre i 2 timer. Skyll tre ganger i DDW fulgt av tre skyllinger med absolutt analytisk reagens (ABS AR) etanol.
- Passere hvert dekk kort gjennom flammen fra en Bunsen-brenner to eller tre ganger i 1 - 2 sekunder, og deretter la inkuberes over natten i 24 brønners plater med 1 ml poly-L-lysin 0,01% oppløsning fortynnet 1: 5 i boratbuffer ( 0,1 M, pH 8,4). Skyll Dekk i DDW tre ganger og få med 1 ml PM per brønn i en standard 37 ° C, 5% CO2 inkubator over natten.
- Forbered pletteringsmedium (PM) består av: 0,9 ml minimalt essensielt medium (MEM) + 3G, 0,05 ml føtalt kalveserum (FCS), 0,05 ml varme-inaktivert hesteserum (HS HI) og 1 pl av B27 supplement. Merk: MEM + 3G inneholder for hver 500 ml MEM x 1, 1 ml gentamycin, 5 ml stabilisert L-glutamin 100x (se
- Fremstilling av dekkglass for 1D kulturer.
- clean gLass dekselglass ved nedsenkning i en base piranha løsning bestående av 75 ml DDW, 25 ml 25% ammoniakkløsning og 25 ml 30% hydrogenperoksid. Plasser løsningen med glassdeksel på en varmeplade ved ~ 50 ° C i 30 minutter og tørk deretter glassdekselene med nitrogen.
- Påfør dekslene først med en tynn kromfilm (99,999%) på 6 Å tykkelse etterfulgt av et 30 Å lag av gull (99,999%) ved å bruke enten damp- eller sputterdeponering.
- For å oppnå en forstøvningshastighet på 0,05 - 1 Å / s, bruk en forstøvningsmaskin med 2 e-bjelker og et vakuumsystem på 260 l / s med målstørrelser 2 "og 4". Bruk et rotasjonsstadium som kan gå fra 0 - 100 runder per minutt (RPM). Bruk en likestrøm (DC) sputterkraft på 0 - 750 watt.
- Bruk en rotasjon på 30 rpm og argon 99,999% for å få plasma ved 10 mTorr-trykk i kammeret.
- Bruk spenningspistolens strømforsyning ved 40 W DC sputter strøm for krom, som fører til ~ 0,12 Å / s dekning, og ved et 10 W DC frese strøm til gull, som fører til ~ 0,28 A / S.
- Oppløs 0,1 g 1-octadecanethiol i 100 ml ABS AR etanol ved hjelp av ultralyd i 30 min. Plasser Cr-Au-belagte dekkglass i 2 timer i denne oppløsning, og deretter vaske med etanol ABS AR og tørr med nitrogen.
- Fremstill en løsning av 100 ml Dulbeccos fosfatbufret saltoppløsning (D-PBS) og 3,5 g av en tri-blokk-ko-polymer (se tabell of Materials / reagenser) av omrøring i 1 - 2 timer ved 600 til 700 rpm. Plasser Dekk i løsningen i 1 time. Tørre Dekkglass med nitrogen.
- Mekanisk etse det ønskede mønster ved å skrape den bio-avvisning sjikt 22. Gjør dette ved å bruke en penn plotter, hvor pennen er erstattet av en etsning nål. Skrap mønsteret gjennom metallsjikt for å nå den underliggende glass. Styre denne prosess ved hjelp av en datamaskin for å oppnå en replikert ønsket mønster. Mønstre dannet ved denne fremgangsmåten er demonstrere d i Figur 2 og Figur 3.
- Fremstill en bio-kompatibelt lag av 100 ml D-PBS, 3,5 g tri-blokk-ko-polymer, 35,7 pl / ml fibronektin og 29 ul / ml laminin.
- Steriliser Dekk i ultrafiolett lys i minst 10 min. Inkuber Dekk i stilles bio-kompatibel løsning over natten.
MERK: bio-kompatibelt lag vil bare bli dannet hvor den bio-avvisning lag er etset ut i det foregående trinn. - På neste dag vaske dekk to ganger med P-DBS. Inkuber Dekk i PM natten. Dekk er nå klar for celle plating.
- Steriliser Dekk i ultrafiolett lys i minst 10 min. Inkuber Dekk i stilles bio-kompatibel løsning over natten.
- Utfør disseksjon i henhold til standard prosedyrer som har blitt publisert mye tidligere 23, 24.
- I korthet ble ekstrakt hippocampus eller hjernebark fra rotteembryoer, typisk på dag E19, eller fra mus, typisk på dag E17 23,class = "ekstern referanse"> 24.
- Dissosiere cellene først i papain løsning for 20 - 30 For minutter, etterfulgt av mekanisk triturering 24 med glasspipetter som tips er ildpolert.
MERK: Hvis cellene kommer fra genetisk modifiserte mus så bør opprettholdes i vev fra hver embryo i et separat 1,5 ml plastrøret under hele prosessen. - Telle celler med trypanblått før seeding.
MERK: For genmodifiserte dyr tellingen bør gjøres separat for hvert embryo. - For 2D kulturer, frø mus neuroner på 750.000 og rotte-neuroner på 850.000 celler per brønn. For 1D, frø på 650.000 celler per brønn. Rist plate litt rett etter seeding for å sikre homogen dekning av dekkglass.
- Vedlikehold av nevronale kulturer.
- Forbered endring medium (CM) bestående av (pr ml). 0,9 ml MEM + 3G, 0,1 ml HI HS, 10 ul 5-fluor-2'-deoksyuridin (FUDR) med uridin 100x </ Li>
- Forbered endelige medium (FM) bestående av (pr ml): 0,9 ml MEM + 3G og 0,1 ml HI HS.
- Erstatt PM med 1 til 1,5 ml CM etter 4 dager in vitro (DIV). Ved 6 DIV, erstatte 50% av CM med frisk CM. Ved DIV 8, endres mediet til 1,5 ml FM, etterfulgt av en endring av FM etter 2 dager 50%. Etter ca en uke spontan synkron aktivitet framgår.
- Avbildning av spontan eller fremkalt aktivitet i neuronale kulturer med fluorescerende fargestoffer.
- Fremstill en oppløsning av 50 ug kalsiumfølsomme fluorescerende fargestoff (se tabell of Materials / reagenser) i 50 ul DMSO (dimetylsulfoksyd).
- Fremstill ekstracellulære opptak løsning (EM) inneholdende (i mM): 10 HEPES, 4 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 139 NaCl, 10 D-glukose, 45 sukrose (pH 7,4).
- Inkuber neuronal kultur i 2 ml EM med 8 pl av kalsiumfølsomme fluorescerende fargeløsning i 1 time. Beskytt mot lys og forsiktig rotere for å sikre homogenous spredning av fargestoffet til cellene.
- Erstatt løsning med frisk EM før avbildning. Den fluoriserende billeddannelse er vist i figur 4.
- Bilde i et fluorescens-mikroskop med optiske filtre for kalsium fluorescensavbildning (eksitasjon topp ved 488 nm, emisjonstopp ved 520 nm), ved hjelp av et kamera og programvare i stand til å kvantifisere intensiteten av en region av interesse (ROI) innenfor det synsfeltet til mikroskopet.
2. Elektrisk Stimulering av kulturer
MERK: leggende oppsett for elektrisk stimulering, er vist i figur 1. Et dekkglass på hvilken den neuronale kulturen har blitt dyrket i omtrent 14 dager, er plassert i en petriskål under et fluorescens mikroskop. Elektriske aktivitet av nervecellene blir avbildet ved å bruke kalsiumfølsomme fargestoffer, mens en spenning påtrykkes via to par av badelektroder som er plassert utenfor kulturen. Elektrodene er drevet med såignal generator hvis utgang blir forsterket av en dobbeltkanalforsterker. Spenningsstyring for stimuleringen er foretrukket fremfor de mer standard strømstyrer 25, 26 fordi de elektriske feltvektorene bestemmes direkte, slik at enkel vektor tilsetning og kombinasjoner. Dette krever en grundig sjekk av ensartethet av det elektriske feltet, som kan utføres over hele utvalget for tilfelle av spenning kontroll. Ved bruk av spenningsstyring forsiktighet bør utvises for å unngå jordsløyfer og homogeniteten av det elektriske felt bør verifiseres (se 2.2 nedenfor).
- For elektrisk stimulering med et homogent elektrisk felt bruke et par parallelle elektrodetråder.
- Bruke elektroder fremstilt av platina med en tykkelse i størrelsesorden 0,005 '' (127 um). Når de brukes sammen med de 13 mm dekkglass, sørge for at avstanden mellom de to elektrodene er omkring 11 mm, og plassere elektrodens 1 mm over kulturen.
NB: For å gjøre elektrodeholderen (figurene 5A og 6A) brukes polytetrafluoretylen (PTFE). Bor små hull gjennom PTFE for å sette elektrodene. Anordningen bør være høyere enn den ekstracellulære løsning, slik at den øvre ende, hvor elektrodene er eksponert, aldri vil komme i kontakt med løsningen. For isolering, å bruke epoksylim på noen del av elektrodeledningene som kan bli utsatt for. - Bruke en firkantpuls-form med en 50% arbeidssyklus, uten noen DC-komponent for å unngå elektrolyse. Variere pulsvarigheten mellom 10 mikrosekunder og 4 ms for å bevirke effektiv stimulering uten å brenne kulturen. Sørge for at amplituden er i størrelsesorden ± 22 V (se figur 5). Den firkantpuls kan observeres på et oscilloskop koplet i parallell med elektrodene.
MERK: For enkel programmering av ønsket bølgeform, bruke en kommersiell bølgeform redigering programvare (se Materialer liste
- Bruke elektroder fremstilt av platina med en tykkelse i størrelsesorden 0,005 '' (127 um). Når de brukes sammen med de 13 mm dekkglass, sørge for at avstanden mellom de to elektrodene er omkring 11 mm, og plassere elektrodens 1 mm over kulturen.
- For å teste for felthomogenitet bruke en sonde-elektrode. Bruke et rutenett på minst 1 mm x 1 mm, slik at sonden kan beveges i området mellom elektrodene og måle elektrisk potensial.
- Mål elektrisk potensial. Bruk
å beregne det elektriske felt. Bruk av en av elektrodene som en referanseelektrode. Måle den elektriske felt med varierende pulsvarigheter på mellom 100 ms 4 ms (se figur 5B for et eksempel på 100 mikrosekunder pulsbredde) for å bekrefte at feltet er homogent innenfor området stimulerende varigheter.
NB: Se figur 5D for et eksempel på et målt elektrisk felt homogenitet når pulstiden var 1 ms.
- Mål elektrisk potensial. Bruk
- Bruk 2 perpendikulære par av badelektroder for å fremstille mer kompliserte elektriske felt former, og for åvære i stand til å orientere felt i forskjellige retninger (se fig. 6B). Anordningen med 2 par av elektroder vil bli brukt, og signalet på hvert par av elektrodene vil bli observert på to separate oscilloskop.
- Plasser elektrodene 1 mm over kulturen og i en avstand på 10 - 11 mm fra hverandre. Kontroller at begge elektrodeparene er flytende (ikke ha noen jordforbindelse), og ikke har noe til felles ved å måle motstanden mellom et hvilket som helst sett av elektroder og verifisering av fravær av kortslutninger mellom en hvilken som helst av elektrodene. Kontrollere at alt utstyr som brukes, som er forbundet med elektrodene (for eksempel oscilloskoper, forsterkere, signalgeneratorer, etc.) er flytende i forhold til jord ved å kontrollere at alt utstyret er flytende og at ingen av referanseelektroder berører noen jordet utstyr.
- For å endre feltorientering, varierer amplituden av den spenning som mates til de to elektrodeparene med resPekt til hverandre (se figur 7A ). For eksempel bruk 0 ± 22 V på elektrodeparet som er vinkelrett på mønsteret og 0 V for den andre elektroden. For 45 °, bruk ± 15,6 V på begge par elektroder uten faselagring, for en amplitude vektor sum på 15,6 2 +15,6 2 = 22 2 .
- For å anvende et roterende felt, bruk en enkelt bølgeform av en sinusspenningspuls og en enkelt bølgeform av en cosinusspenningspuls til de to par elektroder for å produsere et roterende elektrisk felt med fast amplitude (se figur 6B ).
MERK: Som det kan ses i figur 6B , er vektorsummen et roterende elektrisk felt med en vinkel på ± 22 V i en elektrode og en syklus av en cosinabølge med ± 22 V i den andre elektroden med Syklusvarigheten er den samme som sinus- og cosinusbølgene, og med en amplitude på ± 22 V.
- Å måle og beregne kronenAxie og Rheobase av aksoner i den neuronale kulturen vs. dendritter i den samme kulturen utføre følgende trinn.
- Bruke et kalsiumfølsomme fluorescerende fargestoff for kalsium-avbildning, som beskrevet i tabellform materialer / Reagenser og i 1.5) med en 1D kultur etter mønster av tynne (170 um), lang (10 mm) linjer. Kalsiumfølsomme fargestoffer vil bli brukt til kulturen og inkubert i 45 minutter. Fargestoffet vil bli vasket ved å erstatte med en ny innspilling løsning.
- Koble fra nettverket for å oppnå befolknings statistikk fra direkte respons på elektrisk stimulering, uten effekt av synaptisk transmisjon. For å gjøre dette, anvende en kombinasjon av 40 uM av bicucullin, som blokkerer den hemmende virkningen av gamma-aminosmørsyre-A (GABAA-reseptorer), 10 mM 6-cyano-7-nitrokinoksalin-2,3-dion (CNQX) det å blokkere α-amino-3-hydroksy-5-metyl-4-isoxazolepropionic (AMPA) og kainat-reseptorer og 20 pM av (2R) -amino-5-phosphonovaleric syre (APV), som blokkerer N-metyl-D-aspartat (NMDA) -reseptorer. De stopper vil bli lagt til opptaksoppløsningen.
- Anvende en firkantpuls som beskrevet i 2.1 og 2.3 med forskjellige tidsvarigheter på mellom 100 ms og 4 ms. Signalet kan observeres på oscilloskop.
- Bruke et fluorescens mikroskop med et bilde-innhentingsprogram (se 1.5) for å overvåke intensiteten av kalsium transienter på flere ROIs, som hver inneholder et par hundre neuroner. Erverve bilder ved hjelp av et følsomt EMCCD kamera (se Materialer liste), i stand til et bildeopptak hastighet på minst 20 bilder per sekund. Endringen i lys intensitet er proporsjonal med mengden av nerveceller som var stimulert. Estimer fraksjon av stimulerte nerveceller ved hjelp av den relative endringen i intensitet.
- For hver puls varighet (100 mikrosekunder til 4 ms), endre amplituden av den spenning som påtrykkes elektrodene som starter ved en spenning der ingen forandring i intensitet er sett (noen få volt), til the spenning hvor forandringene i intensitet på grunn av den påtrykte spenning er mettet (opp til ± 22 V).
MERK: Endringen intensitet vil bli fordelt som en kumulativ Gaussisk 5 i forhold til påtrykt spenning for stimulering for hver gang varigheten av spenningspulsen. - Monter en kumulativ Gaussisk distribusjon for intensiteten vs. den påtrykte spenning for hver varighet og trekke ut gauss middelverdien fra dette passer.
MERK: Dette gjennomsnittet er representant spenning til hvilke nervecellene reagerte. - Ved slutten av denne prosess oppnå for hver stimulering varighet en middelspenningen til hvilken nervecellene reagerte. Bruk disse parene av varighet og styrke for å plotte den styrke Varighet kurver (se figur 7).
å beregne det elektriske felt. Bruk av en av elektrodene som en referanseelektrode. Måle den elektriske felt med varierende pulsvarigheter på mellom 100 ms 4 ms (se figur 5B for et eksempel på 100 mikrosekunder pulsbredde) for å bekrefte at feltet er homogent innenfor området stimulerende varigheter. 3. Magnetisk Stimulering av kulturer
Merk: Den grunnleggende oppsett for magnetisk stimulering er vist i figur 2. På toppen til høyre viseset invertert mikroskop fluorescens som brukes til å avbilde kalsiumfølsomme fargestoffer i nervecellene. Magnetspolen (blå linje) er posisjonert omtrent 5 mm konsentrisk over en neuronal ring kultur, (blå omriss). En pickup spole (rød sirkel) på omkretsen av petriskålen overvåker den spenning som induseres av den magnetiske puls. Øverst til venstre er vist de målte dynamikken i den magnetiske stimulator (MS) spole med en kondensator spenningsbelastning på 5000 kV, som er integrert fra pickup spole. Den induserte elektriske feltet (beregnet for en ring radius på 14 mm) er avbildet i grønt, mens det magnetiske felt er vist i blått. På bunnen blir vist bilder av neuronal kultur. Nede til venstre er et lysende felt bilde av en mønstret 24 mm dekkglass. De hvite områdene er nervecellene. Den fotografert Mønsteret består av konsentriske ring kulturer med forskjellige radier. Nederst til høyre er en zoom på et kort segment av ringene, viser enkelte nerveceller. For en skala, ringene width er omtrent 200 um.
- Grow neuronene i en sirkulær ring mønster (etset som beskrevet i 1.2.5) for 1D kultur stimulering. Bruke et kalsiumfølsomme fluorescerende fargestoff for kalsium avbildning (som beskrevet i seksjon 1.5) med en 1D kultur etter mønster av tynne (170 um), lang (10 mm) linjer.
- Bruk en sirkulær magnetspole og posisjonere en petriskål omtrent 5 mm nedenfor og konsentrisk med spolen. Bruke et tilpasset spole på omtrent 30 mm (indre diameter, 46 mm ytre diameter) kveil med en induktans på L = 90 mH drevet av en hjemmelaget eller kommersiell MS lastet med en maksimal spenning på 5 kV.
- Utslipp en høy spenning og strøm gjennom en ledende spole ved hjelp av en sterkstrøms Høyspenningsbryter til magnetisk stimulere neuronale kulturer. Det magnetiske stimulator (MS) kan bygges som beskrevet i 21 bruk av store kondensatorer, av størrelsesorden 100 mF, for å oppnå en høy spenning på 1 - 5 kV. Alternativt kan bruke et kommersieltTilgjengelig MS (se Materialebord / reagenser ).
MERK: Bruk en 0,254 mm tykk og 6,35 mm bred polyesterbelagt rektangulært kobbertråd for å lage en hjemmelaget spole 21 . Slå ledninger på skreddersydde rammer, isolert med glassfiber og støp i epoxy (se Materialebeskrivelse / Reagenser ). Alternativt bruk kommersielt tilgjengelige spoler (se tabell over materialer / reagenser ).
- Bruk roterende magnetfelt for å stimulere 2D kulturer.
- Bruk de roterende magnetfeltene til å stimulere 2D-kulturer. Brann TMS uten kultur i parabolen, med forskjellige intensiteter, for å vise den lineære korrelasjonen til spoleavlesningen med intensitetene.
- Deretter begynner du å skyte TMS ved økende intensiteter mens du registrerer kalsiumtransienter og spolen mens du registrerer kalsiumtransienter med en nevronkultur. I begynnelsen observeres nettverksbrudd som store kalsiumtransienter, shoUld ikke synkronisere med pick up spole TMS spikes. Fortsatt å øke intensiteten, på et tidspunkt begynner kalsiumtransittene å bli synkronisert med TMS-pigger. Alternativt, eller i tillegg, etter å ha oppnådd en synkronisert respons, begynner du å redusere intensitetene inntil synkronisering avskaffes for å bestemme TMS-terskelen.
MERK: Forholdene bør opprettholdes strengt fastsatt for hver oppsett, med det nøyaktige volum hver gang, de samme fartøyene og eksakte spoleposisjoner og retninger.- Monter oppsamlingsspolen på undersiden av opptaksretten slik at den er i et plan parallelt med nevronkulturen og i en fast stilling med hensyn til kulturen.
MERK: Dette sikrer at avhengigheten av plasseringen av oppsamlingsspolen i forhold til magneten er trofast mot kulturens posisjon og at eventuelle uoverensstemmelser i posisjoneringen vil være ubetydelige på oppsamlingsspolens avlesninger.- Bruk to uavhengige spiraler som erplassert vinkelrett på hverandre (figur 8B) for å frembringe et roterende magnetfelt og induserte elektriske felt. Koble hver spole til egne MS. Sikre at stimulatorer utslipp tilsvarende strøm ved en faseforsinkelse på 90 ° (figur 10A), noe som resulterer i et roterende magnetisk felt som avsøker 270 grader av den virkelige plass ved et maksimum felt på ~ 270 V / m (figur 10B).
- Plasser den neuronale kulturen inne i en sfærisk glassbeholder fylt med den ytre opptaksløsning (EM).
- Monitor stimulering (forandring i fluorescensintensitet av neuronene) med kameraet som beskrevet i trinn 2.4.4.
- I tilfelle av tverrspoler (figur 8B), plasser oppfangningsspolen parallelt og i en bestemt avstand under den nevronale kulturen. opprettholde nøye denne konfigurasjonen gjennom eksperimenter.
- Monter oppsamlingsspolen på undersiden av opptaksretten slik at den er i et plan parallelt med nevronkulturen og i en fast stilling med hensyn til kulturen.
- Beregn analytisk det elektriske feltet for 1D Configurasjon ved E maks = k 1 Br, hvor E max er den maksimale amplituden til det induserte elektriske feltet og er rettet langs tangenten til ringene med radius r. B er amplituden av den magnetiske puls og k 1 er en dimensjonal proporsjonalitetskonstant som kan måles ved hjelp av oppfangningsspolen (figur 8A).
- Bruke en numerisk simulering pakke (se Materiale liste) til numerisk simulere det elektriske feltet 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen present gir mulighet for enkel mønstring av neuronale kulturer. Når den kombineres med flere metoder vi utviklet for stimulering, gjør det mulig å foreta målinger av noen iboende neuron egenskaper som Chronaxie og Rheobase 5, for å sammenligne egenskapene av friske og syke neuroner 27, for å finne optimale måter å stimulere kulturer som en funksjon av sin struktur og mange flere nye tilnærminger. Noen eksempler er presentert i løpet av de neste tallene.
Figur 3 viser 1D mønstrede konfigurasjoner som er etset inn i bio-avvisning lag. Tynne linjer på ca 170 um bredde er typisk innskrevet som kan, for eksempel, være konsentriske ringer med varierende radier (figur 3A) eller parallelle linjer, typisk ~ 11 mm long (figur 3B).
nt" fo: hold-together.within-siden = 'en'> Den øvre delen av figur 4 viser et typisk bilde av fluoriserende aktivitet i kulturen, tatt med en ladningskoblet enhet (CCD), og viser et bilde av fluorescensmerkede neuroner i et 2D-kultur. i dette eksempel ble tre forskjellige ROIs er vist, markert med svart, grønt og rødt. Integrerte fluorescensintensitet traser er vist i det nedre diagram på fig 4, målt i disse tre forskjellige ROIs (traser er i det aktuelle farge av ROIs). som innfelte viser, innenfor 200 ms oppløsning av rammen registreringstiden ved hvilken denne bestemte data ble tatt, alle nevroner i de tre forskjellige ROIs briste samtidig.Den grunnleggende apparat som brukes for stimulering av en uni-retningsbestemt, konstant elektrisk felt, er vist i figur 5A. Elektrode ledningene er nedsenket i opptaksmediet, ca. 1 mm over den nevronale kulturen.Den grunnleggende pulsform benyttes for elektrisk stimulering, er vist i figur 5B. Når dette spenningspuls påtrykkes det opprettes et konstant elektrisk felt som vender sin orientering 180 ° etter at halvparten av syklusen. Endringen i feltretningen etter en halv syklus blir brukt for å unngå elektrolyse og skader på elektrodene. Typiske spenninger påtrykt på elektrodene er ± 22 V, og den typiske pulsvarigheten for stimulering av 2D kulturer er i størrelsesorden 100 - 500 us.
For å kontrollere for en hvilken som helst anisotropi i veksten av neuritter, bekreftet vi at stimulering av 2D-kulturer er isotropisk. Ved manuelt å dreie elektrodene i alle 360 ° ved 15 ° oppløsning (figur 5C) vil det sees at det ikke er noen preferanse for orientering for stimuleringen. Hver farge i figur 5C viser stimuleringen av en annen kultur. Avstanden fra origo representerer minimal duRation som trengs for stimulering med konstant amplitude. Det er tydelig at 2D kulturer ikke har en foretrukket orientering for elektrisk stimulering til en god tilnærming.
Siden det enkle par elektroder er begrenset til å ha en definert retning for feltet (selv om den kan vendes), utviklet vi et apparat for elektrisk stimulering med to par elektroder ( figur 6A ). En skjematisk av kulturen (grå sirkelbakgrunn, mørkere flekker er cellelegemene) og av elektrodene (parallelle tykke linjer) er vist i figur 6B . Når bølgeformene, vist som blå og grønne innsatser i figur 6B , er cosinus og sinusbølger og påføres sammen, blir det produsert et roterende E vektorfelt. Når spenningsimpulser er firkantede, har forskjellige amplituder og har nullfaseforsinkelse mellom dem da oppretter de et konstant felt med ønsket orientering bestemt av rElativ amplitude mellom de to par elektroder. Denne elektriske rotasjonen er en åpenbar forbedring i forhold til manuell, mekanisk rotasjon som ble brukt til å oppnå vinkeldistribusjonen av stimuleringsstyrker i figur 5C . Selvfølgelig, som figur 6C viser, er det også mulig å bruke denne konfigurasjonen til å excitere bare en fast retning, muligens som en kontroll ved å aktivere bare ett par elektroder.
Disse konfigurasjonene ble brukt til å excitere 2D neuronalkulturer med enten et roterende felt eller et fastvinkelfelt, med samme rotasjonsmiddelfelt (RMS) -spenning og deretter for å sammenligne pulsvarigheten som trengs for å opphisse kulturen når amplituden er fikset. Vi fant at ved bruk av et roterende elektrisk felt med en konstant amplitude på ± 22 V, var det nødvendig med en gjennomsnittlig varighet på 150 ± 14 μs for å oppnå stimulering, mens det med en enkelt retnings elektrisk felt var en gjennomsnittlig varighet på290 ± 30 μs var nødvendig. Forholdet mellom varigheten som trengs for å stimulere kulturen med et roterende versus et fastvinkelfelt er derfor 0,53 ± 0,02.
Siden i en 2D-kultur strekker aksonene i alle retninger, er det roterende feltet i stand til å excitere mange av axonene. I motsetning til det enkelt orienteringsfeltet er det bare få aksoner orientert i den spesifikke vinkelen, og aksonal eksitering oppnås ikke. Når varigheten økes, er det også mulighet for spennende andre deler av nevronet, spesielt dendriter. Dette beskrives nærmere nedenfor under beskrivelse av Chronaxie-målingene. Det faktum at mye kortere varighet er nødvendig for å spenne den samme kulturen når du bruker et roterende felt, er av stor betydning når du bruker eksterne felter for hjernestimulering, siden det ofte er tekniske begrensninger på pulsvarighetene.
figur 7. I figur 7A et 1D frakoblet nettverk er stimulert med det elektriske felt, enten langs linjen av kulturen (ved 0 ° i akson-stimulering) eller vinkelrett på linjen i kultur (ved 90 ° C i dendrittisk stimulering) av to par elektroder. Som spenningen økes, vil flere nevroner bli stimulert, og dette gjenspeiles ved influensaOrescence intensitet, som er proporsjonal med antall neuroner stimulert (se figur 7B ). Økende spennings amplituder brukes til gradvis å stimulere hele kulturen. Hver neuron har en minimal terskelspenning (for en bestemt pulsvarighet) som den vil reagere på, og ved lov av store tall, forventes fordelingen av disse terskelverdiene å være gaussisk. Derfor, hvis vi ser på antall neuroner som reagerte og plot det mot spenningen som brukes, vil fordelingen være en kumulativ Gauss-distribusjon, som er en feilfunksjon (erf) 5 . Antallet nevroner som reagerer på en bestemt amplitude av elektrisk felt har omtrent en gaussisk fordeling, og derfor er fluorescensen godt beskrevet av dens integral - en feilfunksjon av amplituden til stimuleringsfeltet ( figur 7C ).
Figur 7C brukes til å eXtract ene parameter, en forventning (gjennomsnitt) av fordelingen. Dette blir gjort ved prøving av en kumulativ Gaussisk fordeling og få best mulig tilpasning. Denne forventningen er den påtrykte spenning til hvilken 50% av cellene vil reagere. Denne prosessen gjentas for flere pulsvarighetene (varierende fra 100 mikrosekunder til 4 ms). Den midlere spenning til hvilken kulturen reagerte er plottet vs. pulsvarighet for å oppnå den styrke-Duration kurve. To sett med målinger ble utført. I det første feltet var parallelt til mønsteret, og i den andre var det vinkelrett på det. Det har tidligere blitt vist 15, 23 at aksoner justere med mønster, mens dendritter vokse i alle retninger. Dette gir to forskjellige styrke Varighet kurver, som er meget nyttig for oppnåelse av en klar forskjell mellom de axonal og dendrittiske eksitasjon. Full separasjon til dendrittiske og aksonal bidrag oppnås ved kjent faktum at axonal tidskonstant for eksitasjon er mye kortere enn de dendrittiske 2, 3, 4.
Den styrke-kurvene varighet er da tilpasset platens Chronaxie forråtnelse ligning 
, Hvor V er den rh Rheobase spenning og C er den Chronaxie. Ved pulsvarigheter av T <1 ms er det aksonene som er spent første og forårsake neuron til brann, å ha en lavere verdi for eksiteringsspenningen i styrke-Duration kurve. Aksonal Chronaxie ble beregnet til å være 110 ms. I slående kontrast til magnetisering ved lang varighet (T> 1 ms) dendrittiske rommet er kilden til magnetisering for neuron med en dendrittisk Chronaxie beregnet på 900 us.
Prinsippene som ligger til grunn stimulering av 2D og 1D kulturer med et cirrund spole er beskrevet i figur 8. For å få en bedre forståelse av den fysiske situasjon de numeriske simuleringer av de magnetiske og induserte elektriske felt produsert ved hjelp av COMSOL pakken. For å stimulere 1D kulturer et sirkulært magnetspole blir brukt, plassert konsentrisk over petriskålen. Nerveceller blir dyrket i sirkulære ringer på en runde dekkglass som er plassert på innsiden av petriskål for opptak. I dette tilfellet er det induserte elektriske feltet kan beregnes analytisk og er lik E max = k 1 Br, hvor E max er den maksimale amplituden til det induserte elektriske feltet og er rettet langs tangenten til ringene med radius r. B er amplituden av den magnetiske puls og k 1 er en dimensjonal proporsjonalitetskonstant som kan måles ved hjelp av en pickup spole.
Den COMSOL tallmessig beregning av det magnetiske felt created av spolen i den 1D kultur er vist i den øvre delen av figur 8A (rød strømlinjene). I bunnpanelet i Figur 8A beregningen blir presentert for det induserte elektriske feltet. Stimulering av en 2D-kultur sammen med en krysset spiral konfigurasjon er vist i figur 8B. For å stimulere 2D kulturer et krysspole ble anvendt som frembringer roterende magnetiske felt, plassert med en 2D-neuronal kultur inni den som er lagt inn i et sfærisk glassbeholder som er fylt med opptaksmedium (EM). I dette tilfellet er det induserte elektriske feltet ikke lenger kan beregnes analytisk. Tverr spole er vist i den øvre delen av figur 8B, med den sfæriske beholderen plassert inne i de to spolene og det glass dekkglass bære 2D kulturen plasseres i bunnen av beholderen. For målestokk, den indre diameter av den indre spolen er 65 mm. Numeriske simuleringer som bruker COMSOL med virvelstrømmene 3D-modellen er vist i bunnpanelet opptrerfremstiller det elektriske feltet som induseres i den indre overflaten av den sfæriske beholderen. Et lyst felt mikroskopbilde av et dekkglass med typiske 1D neuronale kulturer benyttes for stimulering er vist i figur 8C. De hvite linjer viser neuroner på mønsterlinjer, som er orientert både tangentialt og radialt for eksperimentell sammenligning og kontroll på virkningen av retningen.
Geometrien til den 1D kulturen spiller en stor rolle i å bestemme hvorvidt en kultur vil brann som reaksjon på magnetiske stimulering. Bare 22% av 1D ring kulturene svarte til magnetisk stimulering. Den vellykkede eksitasjon hastigheten sterkt avhengig av kulturens lineære lengde, og som figur 9A viser, mer enn 60% av kulturene som er lengre enn 80 mm reagerer på magnetisk stimulering. Dette innebærer at spesielle betingelser er nødvendige for magnetisk respons. For å undersøke dette geometriske avhengighet kulturer were dyrket i konfigurasjoner som er del av ringene - med den samme radien men forskjellig lengde ved mønstring av dem på buer heller enn på komplette kretser (se figur 8C)
En omfattende undersøkelse av de magnetiske feltgrenser som en funksjon av radien av 1D ring kulturer er vist i figur 9B. Hvite sirkler representerer eksperimentelle målinger av stimuleringsterskler, mens fargekoden angir den beregnede sannsynlighet for å måle en eksitasjon terskel. En stimuleringsterskelen er definert som det svakeste felt som fortsatt frembringer en respons for et gitt neuronal kultur.
Figur 9B streker den trend som større ringer har lavere stimulerings terskler, med en klar invers korrelasjon mellom radien av ringene og stimulering terskel. For eksempel, svarer den gjennomsnittlige 14 mm ring til Magnmagnetiske pulser med amplitude på 1,5 T, mens den gjennomsnittlige 7 mm ring bare reagerer på 3 T eller mer. Dette er forventet fra den teoretisk beregning av det induserte elektriske feltet, som er vist som den fargekodede predikerte sannsynlighet for brann. Faktisk er det elektriske felt som induseres ved 3T med en radius på 7 mm er lik det som blir indusert ved 1,5 T ved det dobbelte av radien. I sammendrag, er det midlere elektriske feltstyrke terskel 301 ± 128 (standard avvik) V / m, uavhengig av radien av ring kulturer.
I motsetning til den enkle sirkulære spolen, som ikke kunne fremkalle reaksjon i 2D-kulturer, 15 av 30 2D kulturer som var stimulert med roterende felt og magnetisk stimulering reagerte med spreng nevronal eksitasjon. De to uavhengige spoler som er plassert vinkelrett på hverandre (figur 8B) generere roterende magnetiske og induserte elektriske felt. Hver spole er forbundet til sin egen MS, som begge Discharge lignende strømmer ved en faseforskyvning på 90 grader. Amplituden av det elektriske felt som induseres av hver av de to spoler i krysspolen konfigurasjonen er plottet i figur 10A, og de samme spor er vist i figur 10B av et polart representasjon av retning og amplituden av det overlagrede elektriske felt av begge spolene . Den resulterende induserte elektriske felt skanner 270 grader av den virkelige plass ved et maksimum felt på ~ 270 V / m.
Figur 1: Skjematisk av oppsettet som ble brukt for elektrisk stimulering av neuronal kulturer. Det ønskede signal frembringes av en signalgenerator med to utganger som ikke har noen felles jord. Disse signaler forsterkes for å gi en utgangsspenning på opp til ± 30 V. De elektriske signalene blir så matet via to separate par elektroder, stimulering av en neuronal kultur i two ortogonale og uavhengige retninger. Stimulering av nerveceller kan sees og følges opp av kalsium fargestoffer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Skjematisk av oppsettet som ble brukt for magnetisk stimulering av neuronal kulturer. A. Ved toppen er vist magnetspolen (blå sirkler), som er plassert 5 mm konsentrisk over den neuronale ring kulturen som er lagt i en petriskål (blå omriss). En pickup spole (rød sirkel) som er anordnet på omkretsen av petriskålen måler den spenning som induseres av den magnetiske puls. Ved bunnen av de målte dynamikken i den magnetiske stimulatoren polen er vist (ved hjelp av en MS kondensatorspenningen belastning på 5000 kV), som er integrert fra pickup spole. Induserte elektriske felt (calculated for en ring radius på 14 mm) er avbildet i grønt, mens det magnetiske felt er vist i blått B. et invertert mikroskop-bilder fluorescerende fargestoffer som er følsomme overfor kalsium transienter av nerveceller som reagerer på magnetiske pulser. C. Nerveceller dyrket på et mønster av konsentriske ringer, som brukes for en effektiv stimulering av ring magnetiske stimulator. D. Bright feltet mikroskop bilde av nerveceller dyrket på en linje i mønsteret. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Eksempler på Mønstre av 1D Nevronale kulturer brukt for Orientere elektrisk felt med retningen av aksonal vekst. A. sirkulært mønster brukes for den sirkulære magnetspolen, når den induserte ele Ctric-feltet har en sirkulær orientering. B. Linjemønstre brukes når det induserte eller direkte elektriske feltet har en enkelt orientering.
Figur 4: Eksempelspor av kalsiumtransienter som ble avbildet under synkron nettverksbrudd. A. Et bilde av nevroner som ble farget før eksperimentet med kalsiumfargestoff. B. Spor av intensitet vs. tidspunktet for avkastningene i A med fargen på sporet som representerer fargen på grensen for avkastningen i A. En stor intensitets intensitet synkronisert innenfor de tre ROIene representerer en nettverksbrudd. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
54357fig5.jpg"/>
Figur 5: Grunnleggende oppsett for Electric stimulering, ved hjelp av ett par parallelle Bath Elektroder fastslår at 2D kulturer har ingen Preferred Orientering av elektrisk stimulering. A. Apparat anvendt for dyrking stimulering. Det elektriske felt frembringes ved å tilføre spenning til platina trådelektroder. Avstanden mellom de to ledningene er 13 mm. B. Et eksempel på et spenningssignal som skal påføres på elektrodene i A. bipolare formen av pulsen bidrar til å hindre elektrolyse av opptaket løsningen ved elektrodene. C. Ved stimulering av en 2D-kultur i ulike rotasjoner av elektrodene, er isotropi av nerveaktivitet. D. Et eksempel på den elektriske feltmålingen ved å anvende proben som er beskrevet i trinn 2.2. Det elektriske felt er ensartet til en feil på opp til 10%. Dette tallet har blitt forandret fra fem.laste / 54357 / 54357fig5large.jpg" target = '_ blank'> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Elektrisk Stimulering med to par elektroder Tillater Rotasjon av det elektriske feltet og for stimulering i ønsket vinkel. A. For å fremstille mer kompliserte utforminger av det elektriske felt, blir to uavhengige elektrodepar nødvendig. B. Bruk av en cosinus spenning formet puls til en elektrode og en sinuspuls til den andre elektroden danner et roterende elektrisk felt med konstant amplitude. C. Bruk av en firkantet spenningspuls til et par av elektrodene danner en ensrettet ensartet elektrisk felt. Dette tallet har blitt forandret fra fem. Vennligst click her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: Nettverks Frakobling ved å blokkere Synaptic innganger (som beskrevet i 2.4.2) Aktiverer Observasjon av den totale befolkningen i enkeltceller som blir stimulert av en gitt elektrisk felt. A. Ved å anvende forskjellige amplituder av spenningspulser til de to parene med elektroder, kan det elektriske feltet blir rettet til alle vinkler uten behov for å slå av kulturen manuelt. B. Eksempler på opptak av kalsium-transienter med elektrisk stimulering ved forskjellige påtrykte spenninger. Fire spor er vist, litt forskjøvet vertikalt for å muliggjøre betraktning. Spenningsverdier er skrevet under den blå spor. C. Ved påføring av en konstant varighet av elektrisk felt, antallet av neuroner som vil brann som reaksjon på det elektriske feltet har en kumulativ distribution funksjon (CDF) som er en kumulativ Gaussisk fordeling (eller en erf funksjon) som en funksjon av amplituden av den spenning (som er proporsjonal med feltstyrken). D. Et eksempel på en Strength-Duration kurve oppnådd under anvendelse av denne protokollen. Dette tallet har blitt forandret fra fem. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: magnetspole Konfigurasjon og Beregning av den induserte elektriske feltet. A. På toppen er en sirkulær strømspoleapparat (blå linje) er plassert 5 mm ovenfor endimensjonale neuronale kulturer ring (blå disk). Ringene er parallelt med og konsentrisk med spolen, noe som skaper et magnetisk puls som er orientert langs den røde linjer. Av Faradays lov, ligger det induserte elektriske feltet på plan som er parallelle med spolen sammen ringene er konsentriske med den. Ved bunnen er et horisontalt snitt langs planet av ring kulturer. Den relative verdi av det elektriske felt er fargekodet, med retning som er vist med piler. Større ringer omslutter et større område av fluks og dermed det elektriske felt som induseres det er høyere. B. bilde av krysspolen magnetisk stimulator (topp) og en simulering av det elektriske felt som induseres av den. C. mønster som brukes til å dyrke neuroner som kan stimuleres med enten et sirkulært elektrisk felt eller et radielt elektrisk felt. Dette tallet har blitt forandret fra 21, 28. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
9" src = "/ files / ftp_upload / 54357 / 54357fig9.jpg" />
Figur 9: Respons på Ring kulturer til Magnetic Field. A. suksessrate på stimulering vokser med radius av kulturen. Feilstolpene representerer standardfeil (SE). B. Forholdet mellom ringstørrelse og magnetfeltets styrke er vist. Sannsynligheten for å opphisse kulturen er fargekodet. Faktisk mest vellykkede eksitasjoner av kulturer ligge i overlappingen mellom den eksperimentelt tilgjengelige faserommet (hvit firkant) og den høye sannsynligheten regionen (rød). Dette tallet har blitt forandret fra 21. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 10: roterende magnetfelt konfigurasjonsfeltet. </ strong> A. For å indusere en roterende elektrisk felt ved stimulering med kryss-spole magnet stimulator, en faseforskyvning på 90 grader er nødvendig mellom de to spoler. Det er vist det elektriske felt som induseres i en pickup spole anbrakt på 2 nabo vinger kløverblad spiral. Spolene ble drevet separat ved 2 kommersielle stimulatorer. B. En rekonstruksjon, ved hjelp av kurvene vist i A, av det resulterende elektriske feltet amplitude og retning under en puls i kløverblad spiral. Dette tallet har blitt forandret fra 21, 28. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1D mønster er et viktig verktøy som kan brukes for en rekke anvendelser. For eksempel har vi brukt 1D mønstring for å lage logiske porter fra neuronale kulturer 29 og mer nylig for å måle Chronaxie og Rheobase av rotte-hippokampale neuroner 5, og nedbremsing av signalforplantningshastigheten til avfyring aktivitet i Down syndrom hippocampalneuroner forhold til villtype (WT) hippocampalneuroner 27. Den foreslåtte protokoll for 1D mønster er robust, og det er lett å danne en hvilken som helst ønsket mønster. Vi foreslår å observere 1D kulturen før målinger for å være oppmerksom på eventuelle avbrudd i nettverket, som kan påvirke dens funksjon.
Kjemisk mønster av nevrale konfigurasjoner har en særegen historie 30, 31, 32. Vi fant at vår tilnærming utbyttetS lignende resultater til kjemisk mønster, men de er mer robuste og enklere å oppnå. Nylig har muligheten for mikrofluidisk mønster av nevroner blitt et interessant alternativ til tilnærmingen vi tilbyr, med tilsvarende enkelhet og brukervennlighet 33 , 34 . Den mikrofluidiske tilnærmingen blir brukt i laboratoriet parallelt med etsningsmetoden beskrevet her.
Som vi viste 5 , har 2D kulturer ingen foretrukket orientering, og deres stimulering er isotrop og er ikke avhengig av orienteringen av feltet som er påført. Kortere varighet er nødvendig for stimulering av 2D kulturer når feltet roterer. I motsetning er 1D kulturer svært avhengige av retningen av feltet. Når feltet er orientert med mønsteret (og dermed med retningen for aksonal vekst), er varigheten av et fast amplitudefelt som trengs for stimulering, mye kortere enn når feltet er orientertEd vinkelrett på mønsteret. På samme måte, hvis varigheten holdes konstant, er feltet som trengs for å opphisse kulturen, mindre hvis feltet og mønsteret er parallelle. Når du stimulerer vinkelrett, må feltpulsen være mye lengre (i rekkefølge av en millisekund når nettverket er frakoblet), og deretter blir dendrittene hovedsakelig stimulert. Når elektriske felter (enten direkte eller indusert av et magnetfelt) brukes til hjernestimulering, er dette av ekstrem betydning. Hvis hjerneområdet målrettet er kjent med å ha bunter av axoner, kan disse axonene bli opphisset ved å orientere feltet i deres retning og deretter trenger mindre kraft eller kortere varighet av feltet for stimulering. Hvis hjerneområdet målrettet ikke har foretrukket orientering, er et roterende felt effektivere for stimulering. Hvis dendritt er målet for stimuleringen, er lengre impulser mer effektive.
Magnetiske felter kan stimulere nevronaktivitet når en magnetisk puls induces et elektrisk felt som interesserer neuroner. Fordi tiden oppnåelige magnetiske pulser er mikrosekunder i varighet, dendritter, hvis responstiden er i størrelsesorden millisekunder, er ikke forventet å være følsomme for magnetisk stimulering. I motsetning til dette, aksoner, hvis responstiden er hurtigere, er målet for stimulering 2, 3. Responsen av aksoner til elektrisk eksitering er maksimal når de ligger parallelt med det elektriske felt, og avtar når de er vinkelrett på den 1, 35; Derfor, i magnetisk eksitasjon, ønsker vi å sette opp systemer hvor det induserte elektriske felt orienterer parallelt til de målrettede aksonene. Derfor, ved stimulering av en 1D ring, feltet skal være orientert parallelt axoner, og størrelsen av ringen bestemmer terskelverdien for stimuleringen. Lignende for direkte stimulering av badelektroder, for å stimulere en 2D-kultur, en roterende indusert eLectric feltet er mye mer effektiv.
Kombinasjonen av fordelingen av neuroner og ekstern eksitasjon med elektrisk eller magnetisk felt er en potent teknologi med mange mulige fremtidige anvendelser. Chronaxie og Rheobase, samt terskel for aktivering og aktivering forplantnings dynamikk og hastighetene er alle parametere som forteller av en neuronal kulturens iboende egenskaper. Spesielt kan terapeutiske behandlinger og effekten av medikamenter eller farmakologisk behandling umiddelbart bli testet direkte på neuroner. Dette ville tillate en effektiv undersøkelse av begge sykdomsmodell neuroner og av protokoller for TMS stimulering. På en mer konseptuell retning, evnen til å stimulere neuronale kulturer fører nettopp til nye muligheter når det gjelder den nevnte informasjonsprosesser aspekter av nevrale konfigurasjoner, og gjør det mulig å se for seg mikro en trykt krets som kombinerer elektronisk stimulering med levende nevrale nettverk for å tilveiebringe nye beregningsAl enheter og nye hjernen grensesnitt enheter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne takker Ofer Feinerman, Fred Wolf, Menahem Segal, Andreas Neef og Eitan Reuveny for svært nyttige diskusjoner. Forfatterne takker Ilan Breskin og Jordi Soriano for utvikling av tidlige versjoner av teknologien. Forfatterne takker Tsvi Tlusty og Jean-Pierre Eckmann for hjelp med de teoretiske begreper. Denne forskningen ble støttet av Minerva Foundation, Ministry of Science and Technology, Israel, og Israel Science Foundation bevilgning 1320-1309 og Bi-National Science Foundation bevilgning 2.008.331.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APV | Sigma-Aldrich | A8054 | Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2 |
| B27 supp | Gibco | 17504-044 | Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| bicuculline | Sigma-Aldrich | 14343 | Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2 |
| Borax (sodium tetraborate decahydrate) | Sigma-Aldrich | S9640 | Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2 |
| Boric acid | Frutarom LTD | 5550710 | Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2 |
| CaCl2 , 1 M | Fluka | 21098 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| CNQX | Sigma-Aldrich | C239 | Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2 |
| COMSOL | COMSOL Inc | Multiphysics 3.5 | Numerical simulation. Mentioned in Section 3.5.2 |
| D-(+)-Glucose, 1 M | Sigma-Aldrich | 65146 | Plating medium, Extracellular recording solution. Mentioned in Sections 1.1.1 and 1.5.2 |
| D-PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Cell Cultures. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6 |
| FCS (FBS) | Gibco | 12657-029 | Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6 |
| Fluo4AM | Life technologies | F14201 | Imaging of spontaneous or evoked activity. Mentioned in Sections 1.5.1, 1.5.3, and 1.5.5 |
| FUDR | Sigma-Aldrich | F0503 | Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1 |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1272 | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| GlutaMAX 100x | Gibco | 35050-038 | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| Hepes, 1 M | Sigma-Aldrich | H0887 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| HI HS | BI | 04-124-1A | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Sections 1.1.1, 1.4.1, and 1.4.2 |
| KCl, 3 M | Merck | 1049361000 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6 |
| MEM x 1 | Gibco | 21090-022 | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.4.1 1.4.2 |
| MgCl2 , 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| NaCl, 4 M | Bio-Lab | 19030591 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| Octadecanethiol | Sigma-Aldrich | 01858 | Cleaning Cr-Au coated coverslips (1D cultures). Mentioned in Section 1.2.3 |
| Pluracare F108 NF Prill | BASF Corparation | 50475278 | Bio-Rejection Coating, Bio Coating. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6 |
| Poly-L-lysine 0.01% solution | Sigma-Aldrich | P47075 | Promote cell division. Mentioned in Section 1.1.4 |
| Sucrose, 1 M | Sigma-Aldrich | S1888 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| Thiol | Sigma-Aldrich | 1858 | Bio-Rejection Coating. Mentioned in Section 1.2.3 |
| URIDINE | Sigma-Aldrich | U3750 | Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1 |
| Sputtering machine | AJA International, Inc | ATC Orion-5Series | coating glass with thin layers of metal. Mentioned in Section 1.2.2 |
| Pen plotter | Hewlett Packard | HP 7475A | Etching of pattern to the coated coverslip. Mentioned in Section 1.2.5 |
| Electrodes wires | A-M Systems, Carlsborg WA | 767000 | Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Sections 2.1, 2.2, 2.3, and 2.4.5 |
| Signal generator | BKPrecision | 4079 | Shaping of the electric signal. Mentioned in Section 2.3 |
| Amplifier | Homemade | Voltage amplification of the signal from the signal generator to the electrodes. Mentioned in Section 2.3 | |
| Power supply | Matrix | MPS-3005 LK-3 | Power supply to the sputtering machine. Mentioned in Section 1.2.2.3 |
| Transcranial magnetic stimulation | Magstim, Spring Gardens, UK | Rapid 2 | Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Sections 3.1, 3.3, and 3.4 |
| Epoxy | Cognis | Versamid 140 | Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4 |
| Epoxy | Shell | EPON 815 | Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4 |
| Platinum wires 0.005'' thick; A-M Systems, | Carlsborg WA | 767000 | Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1 |
| Circular magnetic coil | Homemade | Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.3 | |
| WaveXpress SW | B&K Precision | Waveform editing software. Mentioned in Section 2.1.32 | |
| Xion Ultra 897 | Andor | Sensitive EMCCD camera. Mentioned in Section 2.4.4 |
References
- Nagarajan, S. S., Durand, D. M., Warman, E. N. Effects of induced electric fields on finite neuronal structures: a simulation study. IEEE Trans Biomed Eng. 40 (11), 1175-1188 (1993).
- Nowak, L. G., Bullier, J. Axons but not cell bodies, are activated by electrical stimulation in cortical gray matter. II. Evidence from selective inactivation of cell bodies and axon initial segments. Exp Brain Res. 118 (4), 489-500 (1998).
- Ranck, J. B. Which elements are excited in electrical stimulation of mammalian central nervous system: a review. Brain Res. 98 (3), 417-440 (1975).
- Rattay, F. The basic mechanism for the electrical stimulation of the nervous system. Neuroscience. 89 (2), 335-346 (1999).
- Stern, S., Agudelo-Toro, A., Rotem, A., Moses, E., Neef, A. Chronaxie Measurements in Patterned Neuronal Cultures from Rat Hippocampus. PLoS One. 10 (7), e0132577 (2015).
- Brunelin, J., et al. Examining transcranial direct-current stimulation (tDCS) as a treatment for hallucinations in schizophrenia. Am J Psychiatry. 169 (7), 719-724 (2012).
- Cruccu, G., et al. EFNS guidelines on neurostimulation therapy for neuropathic pain. Eur J Neurol. 14 (9), 952-970 (2007).
- Kennedy, S. H., et al. Canadian Network for Mood and Anxiety Treatments (CANMAT) Clinical guidelines for the management of major depressive disorder in adults. IV. Neurostimulation therapies. J Affect Disord. 117, Suppl 1. S44-S53 (2009).
- Minzenberg, M. J., Carter, C. S. Developing treatments for impaired cognition in schizophrenia. Trends Cogn Sci. 16 (1), 35-42 (2012).
- Vaidya, N. A., Mahableshwarkar, A. R., Shahid, R. Continuation and maintenance ECT in treatment-resistant bipolar disorder. J ECT. 19 (1), 10-16 (2003).
- Bartlett, W. P., Banker, G. A. An electron microscopic study of the development of axons and dendrites by hippocampal neurons in culture. II. Synaptic relationships. J Neurosci. 4 (8), 1954-1965 (1984).
- Bartlett, W. P., Banker, G. A. An electron microscopic study of the development of axons and dendrites by hippocampal neurons in culture. I. Cells which develop without intercellular contacts. J Neurosci. 4 (8), 1944-1953 (1984).
- Beggs, J. M., Plenz, D. Neuronal avalanches in neocortical circuits. J Neurosci. 23 (35), 11167-11177 (2003).
- Breskin, I., Soriano, J., Moses, E., Tlusty, T. Percolation in living neural networks. Phys Rev Lett. 97 (18), (2006).
- Feinerman, O., Moses, E. Transport of information along unidimensional layered networks of dissociated hippocampal neurons and implications for rate coding. J Neurosci. 26 (17), 4526-4534 (2006).
- Soriano, J., Rodriguez Martinez,, Tlusty, M., T,, Moses, E. Development of input connections in neural cultures. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (37), 13758-13763 (2008).
- Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu Rev Neurosci. 34, 389-412 (2011).
- Williams, S. C., Deisseroth, K. Optogenetics. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16287 (2013).
- Rotem, A., Moses, E. Magnetic stimulation of curved nerves. IEEE Trans Biomed Eng. 53 (3), 414-420 (2006).
- Rotem, A., Moses, E. Magnetic stimulation of one-dimensional neuronal cultures. Biophys J. 94 (12), 5065-5078 (2008).
- Feinerman, O., Moses, E. A picoliter 'fountain-pen' using co-axial dual pipettes. J Neurosci Methods. 127 (1), 75-84 (2003).
- Feinerman, O., Segal, M., Moses, E. Signal propagation along unidimensional neuronal networks. J Neurophysiol. 94 (5), 3406-3416 (2005).
- Papa, M., Bundman, M. C., Greenberger, V., Segal, M. Morphological analysis of dendritic spine development in primary cultures of hippocampal neurons. J Neurosci. 15 (1 Pt 1), 1-11 (1995).
- Bikson, M., et al. Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro. J Physiol. 557 (1), 175-190 (2004).
- Rahman, A., et al. Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects. J Physiol. 591 (10), 2563-2578 (2013).
- Stern, S., Segal, M., Moses, E. Involvement of Potassium and Cation Channels in Hippocampal Abnormalities of Embryonic Ts65Dn and Tc1 Trisomic Mice. EBioMedicine. 2 (9), 1048-1062 (2015).
- Rotem, A., et al. Solving the orientation specific constraints in transcranial magnetic stimulation by rotating fields. PLoS One. 9 (2), e86794 (2014).
- Feinerman, O., Rotem, A., Moses, E. Reliable neuronal logic devices from patterned hippocampal cultures. Nat Phys. 4 (12), 967-973 (2008).
- Kleinfeld, D., Kahler, K. H., Hockberger, P. E. Controlled outgrowth of dissociated neurons on patterned substrates. J Neurosci. 8 (11), 4098-4120 (1988).
- Bugnicourt, G., Brocard, J., Nicolas, A., Villard, C. Nanoscale surface topography reshapes neuronal growth in culture. Langmuir. 30 (15), 4441-4449 (2014).
- Roth, S., et al. Neuronal architectures with axo-dendritic polarity above silicon nanowires. Small. 8 (5), 671-675 (2012).
- Peyrin, J. M., et al. Axon diodes for the reconstruction of oriented neuronal networks in microfluidic chambers. Lab Chip. 11 (21), 3663-3673 (2011).
- Renault, R., et al. Combining microfluidics, optogenetics and calcium imaging to study neuronal communication in vitro. PLoS One. 10 (4), e0120680 (2015).
- Roth, B. J., Basser, P. J. A model of the stimulation of a nerve fiber by electromagnetic induction. IEEE Trans Biomed Eng. 37 (6), 588-597 (1990).
