Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

使用电动和一维和二维文化磁场神经元的外部激励

doi: 10.3791/54357 Published: May 7, 2017

Summary

神经元培养是通过其对单个神经元或神经元群体的影响来研究新兴脑刺激技术的良好模型。这里提出的是通过直接由浴电极产生的电场或由时变磁场诱导的电场刺激图案化神经元培养物的不同方法。

Abstract

当它的膜电位超过某个阈值的神经元就会触发动作电位。在大脑中的典型的活性,这发生如化学投入到它的突触的结果。然而,神经细胞也可以通过强加的电场激发。尤其是,最近的临床应用程序激活由外部产生电场的神经元。因此,感兴趣的研究神经元如何响应外场是什么原因导致的动作电位。幸运的是,外部电场的精确和受控应用是可能的被切下,解离和在培养物中生长的神经元的胚胎细胞。这使得在一个高度可重复的系统,这些问题的调查。

在本文中的一些用于外部电场对神经元培养物控制的应用程序的技术进行了综述。这些网络可以是一维的,在LINEA 图案化ř形式或允许在基板的整个平面成长,因此二维的。此外,激发可通过电场直接应用通过浸入流体(浴电极)或通过使用磁脉冲的远程创建诱导电场的电极产生。

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

神经元和外部电场之间的相互作用具有根本性的影响以及实际的。虽然人们自从沃尔的倍外部施加的电场可以激发组织已知的,负责神经细胞中生产的所得动作电位的机制最近才开始被揭开1,2,3,4。这包括关于查找导致膜电位的去极化,膜性质和离子通道的作用,甚至该区域响应该电场2,5神经元的机制问题的答案。治疗神经刺激6,7,8,9,

测量体内大脑内的相互作用为这一理解提供了重要的组成部分,但受到颅骨内测量不精确和低可控性的阻碍。相比之下,文化中的测量可以很容易地以高精度,优异的信噪比和高重现性和控制的高精度执行。使用文化可以阐明集体网络行为的各种神经元属性11,12,13,14 15,16 。类似地,期望这种良好控制的系统在阐明其他刺激方法的作用机制方面是非常有效的,例如在光激活神经元17,18,19中的光学刺激期间如何通道开放负责产生动作电位。

这里的重点是描述可以通过外部电场有效地激发神经元的工具的开发和理解。在本文中,我们描述了二维和一维图案海马培养物的制备,使用浴电极直接施加的电场的不同构型和取向的刺激,最后通过一个刺激二维和图案化的一维培养物时变磁场,其引起电场5,20,21

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

伦理声明:涉及动物的处理程序是按照魏茨曼科学研究所的机构动物护理和使用委员会(IACUC),以及适当的以色列法律的指引完成。魏兹曼研究所由协会为实验动物国际评估和认可委员会(AAALAC)的认可。魏茨曼机构动物护理和使用委员会批准了这项研究,与海马神经元进行。

1.二维(2D)和一维(1D)海马培养制备

  1. 盖玻片2D培养的制备。
    1. 制备平板培养基(PM)组成:0.9毫升极限必需培养基(MEM)+ 3G,0.05毫升胎牛血清(FCS),0.05毫升热灭活的马血清(HI HS)和B27添加剂的1μL。注意:MEM + 3G包含每500毫升MEM的X 1,1 mL庆大霉素,5毫升稳定的L-谷氨酰胺的100倍(见
    2. 制备组成硼酸盐缓冲液:在200mL双蒸水(DDW)1.9克硼砂(四硼酸钠十水合物)(在60℃下混合),并在200毫升DDW1.24克硼酸。滴定最终溶液使用的1M HCl pH 8.5中。注意:将最终的溶液为400毫升的0.1M硼酸盐缓冲液。
    3. 浸泡在65%硝酸的玻璃盖玻片上2小时。冲洗在DDW三次,接着冲洗三次以绝对分析试剂(ABS AR)乙醇。
    4. 简要地两次或三次通过每个盖玻片通过本生灯的火焰1 - 2秒,然后离开用稀释11 mL聚-L-赖氨酸0.01%的溶液温育在过夜24个孔板:在硼酸盐缓冲液5( 0.1M,pH值8.4)。然后冲洗盖玻片在DDW三次,并用每孔1mL的PM过夜离开在一个标准的37℃,5%CO 2培养箱中。
  2. 盖玻片1D文化的准备。
    1. 清洁摹小姑娘盖玻片浸渍在由75毫升DDW,25毫升25%氨水溶液和25ml 30%过氧化氢的碱溶液食人鱼。与30分钟,然后用氮气干燥的玻璃盖玻片上的加热板的玻璃盖玻片上,在〜50℃的地方溶液。
    2. 外套盖玻片第一与6层的厚度的薄的铬膜(99.999%),其次是金(99.999%)30的层,即使用蒸汽或溅射沉积。
      1. 为了实现0.05的溅射速率 - 1埃/秒使用的溅射机2电子束,并用目标尺寸2" 260升/秒的真空系统和4" 。使用可以从0旋转舞台 - 100转每分钟(RPM)。使用的直流(DC)溅射的0功率 - 750瓦。
      2. 使用30rpm的旋转和氩99.999%在腔室10毫托的压力来获得血浆。
      3. 操作所述溅射枪的电源在40瓦的DC铬溅射功率,导致〜0.12埃/秒的覆盖率,并且在10瓦的直流溅射功率为金,导致〜0.28埃/秒。
    3. 在使用超声30分钟100mL的ABS AR乙醇将0.1g 1-十八烷硫醇。放置2个小时铬 - 金涂覆的盖玻片在该溶液中,然后用乙醇ABS AR,并用氮气干燥洗​​净。
    4. 700rpm下-在600 2小时-制备100毫升的Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水(D-PBS)和3.5克三嵌段共聚合物的溶液搅拌1(参见材料/试剂的表 )。放置盖玻片在1个小时的溶液中。干盖玻片用氮气。
    5. 通过刮擦生物排斥层22机械地蚀刻所期望的图案。做到这一点使用笔式绘图仪,其中,所述笔通过蚀刻针代替。划伤通过金属层的图案,以达到下面的玻璃。由计算机控制该过程以实现复制所需的图案。通过该方法形成的图案展示 D IN 图2图3。
    6. 制备100毫升的D-PBS,3.5克三嵌段共聚物,35.7μL/毫升纤连蛋白和29微升/毫升的层粘连蛋白生物相容层。
      1. 消毒在紫外光盖玻片至少10分钟。孵育在制备生物兼容的溶液中过夜盖玻片。
        注:生物相容层将形成仅发生在生物排斥层已在先前步骤中被蚀刻掉。
      2. 第二天洗具P-DBS盖玻片两次。在PM孵育盖玻片过夜。盖玻片现在已经准备好电池电镀。
  3. 根据已广泛前面23,24公布的标准程序进行清扫。
    1. 简言之,提取海马或皮质从大鼠胚胎,通常在一天E19,或从小鼠中,通常在一天E17 23,类= “外部参照”> 24。
    2. 离解的细胞首先在20木瓜蛋白酶溶液- 30分钟,随后通过机械研磨24与玻璃吸管的尖部是火抛光。
      注意:如果落入细胞从遗传修饰的小鼠然后从每个胚组织应在一个单独的1.5毫升的塑料管在整个过程中得以保持。
    3. 播种前用计数台盼蓝细胞。
      注:对于转基因动物的计数应分别对每个胚胎完成。
    4. 对于以每孔85万个细胞2D培养,种子小鼠的神经元在750000个大鼠神经元。对于图1D,种子以每孔65万个细胞。播种,确保盖玻片均匀覆盖后小幅立即摇板。
  4. 在神经细胞的维护。
    1. 制备变换媒体(每毫升)组成的(CM):0.9毫升MEM + 3G,0.1毫升HI HS,10μL5-氟-2'-脱氧尿苷(FUDR)与尿苷100X </ LI>
    2. 制备(每毫升)组成的最终培养基(FM):0.9毫升MEM + 3G和0.1毫升HI HS。
    3. 在体外 4天(DIV)替换1-1.5毫升CM PM。在6 DIV,更换新鲜的CM CM的50%。在DIV 8,改变介质至1.5mL FM,随后调频的每2天有50%的变化。大约一个星期后自发同步活动出现。
  5. 与荧光染料神经细胞自发或诱发活动的影像。
    1. 制备50微克钙敏感的荧光染料的溶液(参见材料/试剂的表 )的50微升DMSO(二甲亚砜)。
    2. 制备含有(以mM计)10个HEPES,4氯化钾,细胞外记录溶液(EM)2 CaCl 2的,1 MgCl 2的,139的NaCl,10 D-葡萄糖,蔗糖45(pH 7.4)中。
    3. 孵育神经元培养物在2mL EM用1个小时的钙敏感的荧光染料溶液的8μL。避光保存,并轻轻转动,以确保homogen染料对细胞的OU中蔓延。
    4. 更换成像前用新鲜EM溶液。荧光成像是体现在图4中
    5. 图像中的与钙荧光成像(在488nm的激发峰,在520nm的发射峰)的滤光器的荧光显微镜,使用照相机和软件能够视场内定量的关注区域(ROI)的任何区域的强度的显微镜。

文化2.电刺激

注:电刺激基本设置示于图1。在其上神经元培养物已生长约14天盖玻片放置在陪替氏培养皿在荧光显微镜下。神经元的电活动使用钙敏感性染料进行成像而将电压经由两对浴电极,其定位在培养外部施加。电极由作为驱动其输出由双通道放大器放大的点火发生器。因为电场矢量是直接确定的,所以用于刺激的电压控制优于更标准的电流控制器25,26 ,因此能够直接的矢量相加和组合。这需要仔细检查电场的均匀性,这可以在电压控制的情况下在整个样品上进行。当使用电压控制时,应注意避免任何接地回路,并确认电场的均匀性(见下文2.2)。

  1. 对于均匀电场的电刺激,使用一对平行电极线。
    1. 使用厚度在0.005“(127μm)左右的由铂制成的电极。当与13mm盖玻片一起使用时,请确保两个电极之间的距离约为11 mm,并将电极定位的1毫米培养上方。
      注意:为了使电极保持器( 图5A6A)使用聚四氟乙烯(PTFE)。通过PTFE钻窄孔中插入电极。该装置应比细胞外液中较高,使得顶端,其中电极被暴露,将永远不会在与溶液接触来。绝缘,使用环氧树脂胶上可能被露出的电极引线的任何部分。
    2. 使用方形脉冲形状具有50%的占空比,没有DC分量,以避免电解。改变脉冲10微秒和4毫秒之间的持续时间,以使有效的刺激不燃烧的培养。确保振幅在±22 V( 见图5)的顺序。方形脉冲可以并联连接到电极的示波器来观察。
      注:对于任何所需的波形容易编程,使用商业波形编辑软件(见材料清单
  2. 为了测试场均匀性使用的探针电极。使用的至少1mm×1mm的栅格,以允许探针在电极之间的区域移动,并测量电势。
    1. 测量电势。使用式(1)计算的电场。使用电极作为参比电极中的一个。测量的电场与100微秒之间变化的脉冲持续时间以4毫秒( 见图5B为100微秒的脉冲持续时间的一个例子)以验证该字段是刺激持续时间的范围内是均匀的。
      注意:请参阅图5D为一个测量的电场的均匀性的一个例子,当脉冲持续时间为1毫秒。
  3. 使用2个垂直双浴电极以产生更复杂的电场的形状,并能够定向在不同方向上字段( 见图6B)。用2对电极的装置将被使用,并在每对电极的信号将在两个单独的示波器来观察。
    1. 电极位置1毫米以上培养并以10的距离 - 彼此11毫米。确保两个电极对浮动的(有没有接地连接),并且不通过测量任何组的电极之间的电阻和验证不存在任何的电极之间的短路的具有任何共同点。验证中使用的所有设备,其连接到电极(如示波器,放大器,信号发生器 )相对于浮动到地通过检查所有设备是浮动的,并且没有参考电极的正触摸任何接地设备。
    2. 要改变场的取向,改变供给到使用解析度的两个电极对的电压的振幅PECT彼此(参见图7A)。例如,对于上电极对0°±使用22V的,它们垂直于所述图案和0伏为另一个电极。为45°,使用±在两个对电极15.6 V的没有相位滞后,为15.6 2 15.6 2 = 22 2的振幅矢量和。
    3. 施加旋转磁场使用正弦电压脉冲的一个单个波形和余弦电压脉冲与所述两对电极一个单个波形,以产生一个固定的振幅旋转电场(参见图6B)。
      注意:如可以在图6B中 ,使用正弦波的一个周期与一个电极±22 V和与±22伏在另一个电极的余弦波的一个周期时,可以观察时,矢量和是与旋转电场循环持续时间相同正弦波和余弦波,并与±22伏的振幅
  4. 测量和计算克罗恩氏在相同的培养的神经元培养物与树突轴突的AXIe和Rheobase执行以下步骤。
    1. 与图案化的薄(170微米的1D培养物),长(10mm)的线在材料/试剂的表中描述和1.5)使用钙敏感性荧光染料钙成像。钙敏感性染料将被应用到培养,并温育45分钟。染料将通过与新鲜的记录溶液替换洗涤。
    2. 断开网络,以实现对电刺激的直接反应的人口统计,没有突触传递的效果。要做到这一点,应用的荷包牡丹碱的40μM,其阻断γ-氨基丁酸-A的抑制作用(GABA A)受体,组合10 6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮的μM(CNQX) ,以阻断α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑(AMPA)和红藻氨酸受体和的(2R)20μM - 氨基-5- phosphonovaleRIC酸(APV),其阻断N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体。所述阻断剂将被添加到记录溶液。
    3. 作为具有变化的100微秒和4毫秒之间的持续时间在2.1和2.3中描述施加方波脉冲。该信号可以在示波器上观察到。
    4. 使用荧光显微镜图像采集程序(见1.5)来监视钙瞬变的强度在几个感兴趣区,每个包含几百神经元。获得使用灵敏EMCCD照相机(见材料清单)的图像中,能够至少每秒20帧的图像采集速率。光强度的变化是正比于刺激神经元的数量。估计使用在强度的相对变化刺激神经元的分数。
    5. 对于每个脉冲持续时间(100微秒到4毫秒),改变施加到起始于其中强度没有变化被看作(几伏特)的电压的电极上的电压的振幅,以THE上的电压其中强度由于所施加的电压的变化已经饱和的(高达±22 V)。
      注:强度变化将被分布为累积高斯5相对于所施加的电压为刺激的电压脉冲的每个持续时间。
    6. 适合的强度与每个时间的施加电压的累积高斯分布并从该配合提取的高斯平均。
      注:此平均值是到神经元的反应代表电压。
    7. 在此过程结束时获得每个刺激持续时间的平均电压施加到神经元答复。使用这些对持续时间和强度绘制的强度-持续时间曲线( 见图7)。

3.文化的磁刺激

注意:用于磁刺激的基本设置在图2中被示出。在右上角显示是,用于在神经元图像钙敏感性染料倒置荧光显微镜。磁线圈(蓝色圆圈)同心地定位上方的神经元环培养,(蓝色轮廓)约5mm。在陪替氏培养皿的圆周上的拾波线圈(红圈)监视由磁脉冲感应的电压。在左上角被示出具有5000千伏的电容器电压负载磁刺激(MS)线圈的所测量的动力学,如从拾波线圈一体化。感应电场(对于14mm的环的半径计算),而磁场在蓝色描绘在绿色被描绘。在底部示出了神经元培养物的图像。在左下方是图案化24毫米盖玻片的亮场图像。在白色区域中的神经元。所拍摄的图形由具有不同半径的同心环的文化。在右下角是变焦到所述环中的一个短段,示出了单独的神经元。对于一个规模,环妇女参与发展th为约200μm。

  1. 生长的神经元中的圆形环图案为一维培养刺激(如1.2.5中所述蚀刻)。使用钙成像钙敏感的荧光染料(如在第1.5节所描述的)与图案化上薄(170微米)一维培养,长(10mm)的线。
    1. 使用圆形磁线圈和定位培养皿下面和同心大约5mm与线圈。使用大约30毫米(内径,46毫米外径)线圈的一个自定义的线圈与由载有5千伏的最高电压自制或商业MS从动L的电感= 90 毫亨
    2. 使用高电流的高电压开关以磁性刺激神经元培养物排出通过导电线圈的高电压和电流。 5千伏-如使用大电容,100 MF的量级上,以获得1的高电压在21所述的磁刺激(MS)可以构建。或者使用市售可用MS(见 材料/试剂的表 )。
      注意:使用0.254毫米厚6.35毫米宽的聚酯涂覆的铜扁线以制造自制线圈21。打开定制的帧,在与环氧玻璃纤维和浇铸绝缘电线(参见材料/试剂的表 )。可替代地使用可商购的线圈(参见材料/试剂的表 )。
  2. 使用旋转磁场刺激二维培养。
  3. 现在,使用旋转磁场刺激二维培养。火TMS与在盘中没有文化,以不同强度,以示与强度线圈读数的线性相关性。
  4. 接着,在记录钙瞬变与神经元培养物,开始在增加强度的同时录制两者钙瞬变和线圈烧制TMS。起初,网络突发观察到大的钙瞬变,昭ULD不同步回暖线圈TMS尖峰。继续增加强度,在某些点上,钙瞬变开始变得与TMS尖峰同步。可替换地,或另外地,实现了同步的响应之后,开始降低强度,直到同步取消,以确定所述阈值TMS。
    注:条件应保持严格固定的每个设置的,每次使用的确切数量,同样的船只和详细的线圈的位置和方向。
    1. 装入记录盘的基座上的拾波线圈,以便它是在平行于神经元培养物的平面和在相对于该培养的固定位置。
      注意:这确保了相对于所述磁铁的拾波线圈的定位的依赖性是忠实于培养物的位置,并且在定位的任何差异将在拾波线圈的读数可以忽略不计。
      1. 使用两个独立的线圈是位于相互垂直的( 图8B),以产生旋转磁场和感应电场。每个线圈连接到其自己的MS。确保刺激物以90度( 图10A)的相位滞后放电类似的电流,产生旋转磁场以〜270 V / m的最大字段( 图10B)扫描270度的实际空间。
      2. 的神经元培养物填充有外部记录溶液(EM)的球形玻璃容器内侧的位置。
      3. 如在步骤中描述2.4.4监测刺激与照相机(在神经元中的荧光强度变化)。
      4. 在交叉线圈( 图8B)的情况下,定位拾波线圈并联,并在神经元培养物下面的特定距离。小心地维持整个实验的这种配置。
  5. 计算分析一维configura电场用E 最大 = K 1 BR,其中E max是感应电场的最大振幅并且沿着半径为r的环的切线指向灰。 B为磁脉冲的幅度,而k 1是可以使用拾波线圈( 图8A)进行测定的尺寸比例常数。
  6. 使用数值模拟软件包(参见物料清单),数值模拟电场21。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

提出的协议允许神经元培养物的容易构图。当它与我们为刺激开发了几种方法相结合,它能够使一些内在的神经元属性,如时值和Rheobase 5的测量,比较健康和疾病的神经元27的特性,找到最佳的方法来刺激文化之间的函数关系它们的结构和更多的新方法。一些例子,在未来的数字呈现。

图3显示了 1D图案被蚀刻到生物排斥层配置。约170微米的宽度的细线通常刻,可以,例如,是同心环具有变化的半径( 图3A)或平行线,典型地〜11毫米长( 图3B)。

nt“fo:keep-together.within-page =”1“> 图4的顶部面板显示了培养中荧光活性的典型图像,采用电荷耦合器件(CCD),并显示荧光标记的图像在这个例子中,显示了三个不同的ROI,标记为黑色,绿色和红色。集成的荧光强度迹线显示在图4的底部面板中,在这三个不同的ROI中测量(痕迹处于相应的颜色如图所示,在采集该特定数据的帧采集时间的200ms分辨率内,三个不同ROI中的所有神经元同时突发。

用于单向恒定电场刺激的基本装置如图5A所示 。将电极线浸入记录介质中,距离神经元培养物约1毫米。用于电刺激的基本脉冲形状如图5B所示 。当施加该电压脉冲时,其产生恒定电场,其在半周期之后将其取向翻转180°。半周期后的场方向的变化被用于避免电解和损坏电极。施加到电极的典型电压为±22V,用于刺激2D培养的典型脉冲持续时间为100-500μs。

为了控制神经突生长中的各向异性,我们证实了2D培养物的刺激是各向同性的。通过以15°分辨率手动旋转电极360°( 图5C ),可以看出刺激方向没有优先选择。 图5C中的每种颜色表示不同培养物的刺激。与原点的距离代表最小的du配给需要刺激具有恒定幅度。显而易见的是,对于良好近似,二维培养不具备电刺激择优取向。

由于单对电极具有用于场(尽管它可以被翻转)一个限定方向被限制,我们开发了用于电刺激的设备与两对电极( 图6A)。培养的示意图(灰色圆形的背景,颜色较深的斑点是细胞体)和电极(平行粗线)的图6B中被示出。当波形,示出如在图6B中的蓝色和绿色的插入,是余弦波和正弦波中,然后一起施加旋转ë矢量场被产生。当电压脉冲是正方形,具有不同的振幅和在它们之间具有零相位滞后那么他们创建一个常数字段与由R所确定的所需的取向所述两对电极之间elative振幅。该电动旋转超过这是用于获得图5C刺激强度的角度分布的手册,机械旋转的明显改善。当然,作为图6C示出,但也可以使用此配置,以激发只有一个固定的方向,可能作为对照,通过仅激活一个对电极。

这些配置被用来激发2D神经元培养物与任一旋转磁场或固定角度字段,具有相同的均方根(RMS)电压,然后进行比较以激发培养时振幅被固定所需要的脉冲持续时间。我们发现,使用旋转电场为±22 V,150±14微秒的持续时间平均振幅一定时,需要达到的刺激,同时用一个单一的方向的电场的平均时间需要290±30微秒。因此0.53±0.02需要用于激励具有旋转相对于一个固定角字段培养的持续时间之间的比率。

由于在2D文化轴突四通八达,旋转磁场能激发许多轴突。与此相反,与单方向场有在该特定角度定向并且不能实现轴突激励只有少数轴突。当持续时间增加,存在神经元的令人兴奋的其他部位的可能性为好,特别是树突。这在下面进一步描述本时值测量说明。使用脑刺激外场的时候,因为有对脉冲持续时间往往技术水平的限制,采用旋转磁场时,需要对同一文化的激励更短的持续时间,这一事实是非常重要的。

图如图7所示 。在图7A中 ,1D断开的网络沿着培养线(针对轴突刺激为0°)的电场或通过两对电极垂直于培养物线(用于树枝状刺激的90°)被刺激。随着电压的增加,更多的神经元将被刺激,这是流感的反映orescence强度,其正比于刺激神经元的数量(参见图7B)。增加的电压幅度被用来逐渐刺激整个培养。每个神经元具有最小的阈值电压(用于特定脉冲持续时间),这将响应,并且通过大量的规律,这些阈值的分布预期为高斯。因此,如果我们看那个回应神经元的数目和绘制它针对所施加的电压,分配将是一个累积高斯分布,这是一个错误函数(ERF)5。该电场的特定振幅响应神经元的数目具有近似高斯分布,因此,荧光既受其积分描述-刺激场( 图7C)的振幅的误差函数。

图7C是用来至eXTRACT一个参数,期望(平均)分布的。这是通过拟合累积高斯分布,得到最适合做。这种期望是其中50%的细胞将响应所施加的电压。这个过程被重复几个脉冲持续时间(范围从100微秒到4毫秒)。到的培养物的反应的平均值的电压作图脉冲持续时间,以获得强度 - 持续时间曲线。进行两组测量。在第一场平行于图案,并且在第二它是垂直于它。它先前已表明15,23轴突与模式一致,而树突各个方向生长。这给出了两种不同的强度 - 持续时间曲线,这是用于获得轴突和树突激发之间有明显的差异非常有用的。完全分离的树突和轴突的贡献由众所周知的事实,轴突实现人的时间常数激励比树枝状者2,3,4短得多。

的强度 - 持续时间曲线然后拟合到时值衰变方程公式2 ,其中V RH是Rheobase电压,C是时值。在t <1毫秒的脉冲持续时间是被激励的第一和导致神经元激发的轴突,具有用于在强度 - 持续时间曲线激励电压较低的值。轴突时值计算为110微秒。在显着对比,在长的持续时间(T> 1毫秒)激发的树突状隔室是激励的用于与树突时值神经元在900微秒中计算出的源。

底层二维和一维培养物的刺激与CIR的原理在图8中描述了线圈。为了更好地了解物理情况,使用COMSOL封装产生了磁场和感应电场的数值模拟。为了刺激1D培养物,使用圆形电磁线圈,同心地位于培养皿上方。神经元在圆形盖玻片上生长成环形,放置在培养皿内进行记录。在这种情况下,感应电场可以分析计算,等于E max = k 1 Br ,其中E max是感应电场的最大振幅,并且沿着具有半径r的环的切线指向。 B是磁脉冲的幅度, k 1是可以使用拾取线圈测量的尺寸比例常数。

磁场的COMSOL数值计算c通过在培养1D线圈reated示于图8A(红色流线)的顶板。在图8A的底面板的计算提出了一种用于感应电场。与交叉线圈配置的二维培养的刺激示于图8B中 。刺激2D培养的横线圈用于产生旋转磁场,以定位在其内部一个2D神经元培养物,放置在填充有记录介质(EM)的球形玻璃容器中。在这种情况下所产生的电场可以不再分析计算。交叉线圈在图8B的顶板所描绘的,与设置在两个线圈和玻璃盖玻片支撑2D培养放置在容器的底部内侧的球形容器内。对于规模,内侧线圈的内径是65毫米。使用COMSOL与涡流3D模型数值模拟显示在底部面板,描绘在球形容器的内表面中感应的电场。与用于刺激典型1D神经元培养物的玻璃盖玻片的亮视野显微镜图像示于图8C。的白线显示图案线,其被定向都切向地和径向地对实验比较和控制上的方向性的效果上的神经元。

一维文化的几何形状在确定文化是否会响应磁刺激火了很大的作用。只有22%的1D环培养物的响应磁刺激。成功率激发强烈依赖于培养的线性长度,并且如图9A所示,培养物更长大于80mm到磁刺激的响应的60%以上。这意味着特殊条件所必需的磁响应。为了研究这种几何依赖文化W¯¯ERE生长在是环的部分结构-通过图案化它们的弧,而不是完整的圆具有相同的半径但不同的长度(参见图8C)

磁场的阈值作为1D环文化的半径的函数的全面调查示于图9B。白色圆圈表示刺激阈值的实验测量,而颜色编码表示所计算出的概率测量的激发阈值。甲刺激阈值被定义为仍然引起对于给定的神经元培养物的响应中最薄弱的字段。

图9B强调更大的环具有较低的刺激阈值的趋势,随着环的半径和刺激阈值之间的明显负相关。例如,平均14毫米环响应MAGN备有1.5T的振幅客位脉冲而平均7毫米环只响应3T或更高。这是从感应电场,作为颜色编码的预测概率火被描绘的理论计算的预期。实际上,在7毫米的半径诱导3T电场等于两倍的半径诱导的1.5T。总之,平均电场阈值是301±128(标准偏差)V / m时 ,不依赖于培养物的环的半径的。

与此相反的单个圆形线圈,其不能在2D培养引起响应,30所2D培养的15是由旋转磁场磁刺激刺激回应爆破神经元兴奋。被定位彼此垂直的( 图8B)在两个独立的线圈产生旋转磁场和感应电场。每个线圈连接到其自己的MS,这两者DISCHARGE以90度的相位滞后类似电流。在交叉线圈配置诱导所述两个线圈的电场的幅度绘制在图10A中 ,并且相同的迹线通过方向的极性表示和振幅两个线圈的叠加的电场在图10B中表示的。将得到的感应电场以〜270 V / m的最大场扫描270度的实际空间。

图1
图1:用于神经细胞的电刺激的安装示意图。所需的信号由信号发生器与没有公共接地两个输出产生的。这些信号被放大以得到高达±30 V.然后电信号被通过两个独立的对电极供给,在TW刺激神经元培养物的输出电压Ò正交和独立的方向。神经元的刺激,可以查看和钙染料监测。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2:示意图用于神经细胞的磁刺激设置的。 A.在顶部示出了电磁线圈(蓝色圆圈),它同心地位于5毫米神经元环以上文化,置于陪替氏培养皿(蓝色轮廓)。定位在皮氏培养皿的圆周上的拾波线圈(红圈)测量由磁脉冲感应的电压。在底部示出了磁刺激器线圈的所测量的动力学(使用5000千伏的MS电容器电压负载),如从拾波线圈一体化。感应电场(CALCULATED为14mm的环半径),而磁场在蓝色B.倒置显微镜图像中描绘的荧光染料对神经元反应以磁脉冲的钙瞬变敏感的绿色被描绘。 C.神经元生长在同心环的图案,用于由环磁刺激的有效刺激。神经元D·布赖特场显微镜图像生长在图案的一个线。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3:1D神经元培养物用于和轴突生长的方向上取向的电场的模式的例子。 A.圆形图案被用于圆形磁性线圈,当感应ELE ctric场具有圆形方向。当诱导或直接电场具有单一取向时,使用线图案。

图4
图4:在同步网络突发期间成像的钙瞬变的示例迹线。 A.在实验前用钙染料染色的神经元的图像。 B.在A中的ROI的强度对时间的跟踪,其中跟踪的颜色表示在A的ROI的边界的颜色。在三个ROI内同步的强度的大幅增加表示网络突发。 请点击此处查看此图的较大版本。

54357fig5.jpg” />
图5:电刺激基本设置,使用并行电解质电极的一对,以确定2D文化有电刺激的没有择优取向。 A.用于培养刺激装置。电场通过将电压施加到铂丝电极产生的。两线之间的距离为13mm。对A.电极施加的电压信号的B.示例脉冲的双极形状有助于防止在电极处的记录溶液的电解。 C.当刺激电极的不同转的2D培养,有各向同性的神经的响应。 D.使用在步骤2.2中描述的探针的电场测量的一个例子。的电场是均匀的,以高达10%的误差。这个数字已经从5修改。上传/ 54357 / 54357fig5large.jpg”目标=‘_空白’>点击此处查看该图的放大版本。

图6
图6:带有电极的双电刺激允许对电场的旋转和刺激任意角度。 A.为了产生的电场的更复杂的形状,需要两个独立的电极对。 B.应用一个余弦电压形脉冲到一个电极和一个正弦脉冲到第二电极产生具有恒定幅度的旋转电场。 C.应用一个正方形电压脉冲到一对电极中的创建一个单向均匀的电场。这个数字已经从5修改。 请CLICK这里查看该图的放大版本。

图7
图7:通过阻断突触输入(如在2.4.2中所述)网络断开允许单细胞的总人口由在给定电场刺激的观察。 A.通过施加电压脉冲到两对电极的不同幅度,电场可以被定向到每一个角度,而不需要手动转动培养。在不同的施加电压电刺激钙瞬变的B.实施例的记录。四条迹线被示出,稍微偏移垂直,以允许观看。电压值写入蓝色走线下方。 C.当施加电场的一个恒定的持续时间,这将响应于所述电场激发神经元的数目具有累积DIST作为电压幅度(与场强成正比)的函数的累积高斯分布(或erf函数)的贡献函数(CDF)。 D.使用该方案时获得的强度 - 持续时间曲线的一个例子。这个数字已从5修改。 请点击此处查看此图的较大版本。

图8
图8:感应电场的磁线圈配置和计算。 A.顶部是圆形线圈(蓝色圆圈)位于一维神经元环培养物(蓝色圆盘)上方5mm。环与线圈平行并与其同心,产生沿着红线定向的磁脉冲。通过法拉第定律,感应电场位于平行于沿同心环与它的线圈平面。在底部是沿环文化的平面中的水平横截面。电场的相对值是颜色编码的,与由箭头示出的方向。更大的环包围磁通的较大区域,因此,电场诱导的有更高。 B.交叉线圈磁刺激器(顶部)和由它引起的电场的模拟的图像。用于生长其可以与任一圆形电场或径向电场被刺激神经元C.模式。这个数字已经从21修改,28。 请点击此处查看该图的放大版本。

9" SRC = “/文件/ ftp_upload / 54357 / 54357fig9.jpg”/>
图9:环培养磁场的响应。 A.刺激的成功率增长与文化的半径。误差棒代表标准误差(SE)。 B.环尺寸和磁场强度之间的关系被示出。激发文化的概率是颜色编码。确实培养物的最成功的激励位于在实验获得相位空间(白色矩形)和高概率区域(红色)之间的重叠。这个数字已经从21修改。 请点击此处查看该图的放大版本。

图10
图10:旋转磁场中设置字段。 <强> A.为了与交线圈磁刺激刺激时诱导旋转电场,需要在两个线圈之间/ 90度的相移。示出的是在位于三叶草线圈的2个相邻翼的拾取线圈中感应的电场。这些线圈是由2个商业刺激单独驱动。 B.甲重建,使用苜蓿叶形的线圈的脉冲期间中A中所示的曲线所得到的电场振幅和方向。这个数字已经从21修改,28。 请点击此处查看该图的放大版本。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1D图案是可用于多种应用的重要工具。例如,我们已经使用一维图案用于从神经元培养29创建逻辑门以及最近测量大鼠海马神经元5的时值和Rheobase,和唐氏综合征的海马神经元电活动的信号传播速度的下降的减速比野生型(WT)海马神经元27。一维图案的建议的方案是稳健的,这是容易形成任何所需的图案。我们建议观察1D培养前测量,以了解网络的任何可能断开,这可能会影响其功能。

神经元的配置图案化化学具有杰出的历史30,31,32。我们发现,我们的方法产量同样的情形结果化学图案,但他们更健壮,更容易实现。最近神经元的微流体图案的选择已经成为一个有趣的替代,我们提供的,具有可比的简单性和易用性33,34的做法。微流体的方法是在我们的实验室中使用与这里描述的蚀刻方法平行。

正如我们发现5,2D培养没有优选的取向和它们的刺激是各向同性的,并且不依赖于所施加的场的取向。当该字段被旋转所需的2D培养的刺激更短的持续时间。相比之下,1D文化非常依赖于该领域的方向。当该字段与图案定向的(并因此与轴突生长的方向),所需要的刺激的固定振幅场的持续时间比当该字段为东方短得多垂直于图形编类似地,如果持续时间保持恒定,然后,以激发培养所需要的场较小如果字段和图案是平行的。当垂直地刺激,场脉冲必须更长(在毫秒的数量级当网络断开),然后主要树突受到刺激。当电场(直接或通过一个磁场诱导的)被用于脑刺激,这是极其重要的。如果目标是已知的脑区域有轴突的捆,这些轴突可以通过在他们的方向上取向的场激发,然后需要较少的功率或场的用于刺激的持续时间较短。如果靶向的大脑区域不具有优选的取向,则旋转场是用于刺激的更有效。如果树突刺激的目标,更长的脉冲是更有效的。

磁场可以刺激神经元活动时磁脉冲我nduces电场激发的神经元。因为目前可实现的磁脉冲在持续时间上,树突,其响应时间是在毫秒数量级的微秒,不预期对磁刺激敏感。与此相反,轴突,其响应时间较快,是刺激2,3的目标。轴突到电激励的响应是最大的,当它们平行于电场,并且当它们垂直于它1,35减小;因此,在磁激励,我们努力建立系统,其中所产生的电场平行定向到目标轴突。因此,刺激1D环时,该字段应定向成平行于轴突,并且该环的大小决定用于刺激的阈值。用于通过浴电极直接刺激相似,以刺激2D培养,旋转诱导的E-LECTRIC场效率要高得多。

神经元和与电场或磁场外部激励的图案化的组合是一种有效的技术,许多可能的未来应用。时值和Rheobase,以及用于激活和激活传播动力学阈值和速度是被讲述一个神经元培养物的固有性能的所有参数。特别是,治疗性治疗以及药物或药物治疗的效果可以立即直接对神经元进行测试。这将使这两个疾病模型的神经元,并为TMS刺激方案的有效调查。在一个更概念性方向,刺激神经元培养物的能力精确地导致关于神经配置的信息处理方面新的可能性,并且允许我们设想微印刷电路结合的电子刺激与活的神经元网络,以提供新的计算人装置和新颖脑接口设备。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

作者宣称,他们没有竞争的经济利益。

Acknowledgments

作者感谢奥弗·费纳曼,弗雷德·沃尔夫,梅纳姆·塞加尔,安德烈亚斯·尼夫和艾塔恩·雷威尼非常有益的讨论。作者感谢伊兰·布雷斯金和佐迪·索利安诺开发技术的早期版本。作者感谢茨维·拉斯蒂和吉恩·皮尔·埃克曼与理论概念的帮助。这项研究是由密涅瓦基金会,科技,以色列,部和以色列科学基金会授予1320年至1309年和碧国家科学基金会资助2008331支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APV Sigma-Aldrich A8054 Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
B27 supp Gibco 17504-044 Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1
bicuculline Sigma-Aldrich 14343 Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
Borax (sodium tetraborate decahydrate) Sigma-Aldrich S9640 Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2
Boric acid Frutarom LTD 5550710 Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2
CaCl2 , 1 M Fluka  21098 Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
CNQX Sigma-Aldrich C239 Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
COMSOL COMSOL Inc Multiphysics 3.5 Numerical simulation. Mentioned in Section 3.5.2
D-(+)-Glucose, 1 M Sigma-Aldrich 65146 Plating medium, Extracellular recording solution. Mentioned in Sections 1.1.1 and 1.5.2
D-PBS Sigma-Aldrich D8537 Cell Cultures. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6
FCS (FBS) Gibco 12657-029 Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141 Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6
Fluo4AM Life technologies F14201 Imaging of spontaneous or evoked activity. Mentioned in Sections 1.5.1, 1.5.3, and 1.5.5
FUDR Sigma-Aldrich F0503 Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1
Gentamycin Sigma-Aldrich G1272 Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1
GlutaMAX 100x Gibco 35050-038 Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1
Hepes, 1 M Sigma-Aldrich H0887 Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
HI HS BI 04-124-1A Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Sections 1.1.1, 1.4.1, and 1.4.2
KCl,  3 M Merck 1049361000 Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Laminin  Sigma-Aldrich L2020 Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6
MEM x 1 Gibco 21090-022 Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.4.1    1.4.2
MgCl2 , 1 M Sigma-Aldrich M1028 Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
NaCl, 4 M Bio-Lab 19030591 Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Octadecanethiol Sigma-Aldrich 01858 Cleaning Cr-Au coated coverslips (1D cultures). Mentioned in Section 1.2.3
Pluracare F108 NF Prill BASF Corparation  50475278 Bio-Rejection Coating, Bio Coating. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6
Poly-L-lysine 0.01% solution  Sigma-Aldrich  P47075 Promote cell division. Mentioned in Section 1.1.4
Sucrose, 1 M Sigma-Aldrich S1888 Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Thiol  Sigma-Aldrich 1858 Bio-Rejection Coating. Mentioned in Section 1.2.3
URIDINE Sigma-Aldrich U3750 Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1
Sputtering machine AJA International, Inc ATC Orion-5Series  coating glass with thin layers of metal. Mentioned in Section 1.2.2
Pen plotter  Hewlett Packard  HP 7475A Etching of pattern to the coated coverslip. Mentioned in Section 1.2.5
Electrodes wires  A-M Systems, Carlsborg WA 767000 Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Sections 2.1, 2.2, 2.3, and 2.4.5
Signal generator BKPrecision 4079 Shaping of the electric signal. Mentioned in Section 2.3
Amplifier Homemade Voltage amplification of the signal from the signal generator to the electrodes. Mentioned in Section 2.3
Power supply Matrix  MPS-3005 LK-3  Power supply to the sputtering machine. Mentioned in Section 1.2.2.3
Transcranial magnetic stimulation Magstim, Spring Gardens, UK Rapid 2 Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Sections 3.1, 3.3, and 3.4
Epoxy Cognis Versamid 140 Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4
Epoxy Shell EPON 815  Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4
Platinum wires 0.005'' thick; A-M Systems,   Carlsborg WA  767000 Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1
Circular magnetic coil Homemade Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.3
WaveXpress SW B&K Precision  Waveform editing software. Mentioned in Section 2.1.32
Xion Ultra 897 Andor Sensitive EMCCD camera. Mentioned in Section 2.4.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nagarajan, S. S., Durand, D. M., Warman, E. N. Effects of induced electric fields on finite neuronal structures: a simulation study. IEEE Trans Biomed Eng. 40, (11), 1175-1188 (1993).
  2. Nowak, L. G., Bullier, J. Axons but not cell bodies, are activated by electrical stimulation in cortical gray matter. II. Evidence from selective inactivation of cell bodies and axon initial segments. Exp Brain Res. 118, (4), 489-500 (1998).
  3. Ranck, J. B. Which elements are excited in electrical stimulation of mammalian central nervous system: a review. Brain Res. 98, (3), 417-440 (1975).
  4. Rattay, F. The basic mechanism for the electrical stimulation of the nervous system. Neuroscience. 89, (2), 335-346 (1999).
  5. Stern, S., Agudelo-Toro, A., Rotem, A., Moses, E., Neef, A. Chronaxie Measurements in Patterned Neuronal Cultures from Rat Hippocampus. PLoS One. 10, (7), e0132577 (2015).
  6. Brunelin, J., et al. Examining transcranial direct-current stimulation (tDCS) as a treatment for hallucinations in schizophrenia. Am J Psychiatry. 169, (7), 719-724 (2012).
  7. Cruccu, G., et al. EFNS guidelines on neurostimulation therapy for neuropathic pain. Eur J Neurol. 14, (9), 952-970 (2007).
  8. Kennedy, S. H., et al. Canadian Network for Mood and Anxiety Treatments (CANMAT) Clinical guidelines for the management of major depressive disorder in adults. IV. Neurostimulation therapies. J Affect Disord. 117, Suppl 1. S44-S53 (2009).
  9. Minzenberg, M. J., Carter, C. S. Developing treatments for impaired cognition in schizophrenia. Trends Cogn Sci. 16, (1), 35-42 (2012).
  10. Vaidya, N. A., Mahableshwarkar, A. R., Shahid, R. Continuation and maintenance ECT in treatment-resistant bipolar disorder. J ECT. 19, (1), 10-16 (2003).
  11. Bartlett, W. P., Banker, G. A. An electron microscopic study of the development of axons and dendrites by hippocampal neurons in culture. II. Synaptic relationships. J Neurosci. 4, (8), 1954-1965 (1984).
  12. Bartlett, W. P., Banker, G. A. An electron microscopic study of the development of axons and dendrites by hippocampal neurons in culture. I. Cells which develop without intercellular contacts. J Neurosci. 4, (8), 1944-1953 (1984).
  13. Beggs, J. M., Plenz, D. Neuronal avalanches in neocortical circuits. J Neurosci. 23, (35), 11167-11177 (2003).
  14. Breskin, I., Soriano, J., Moses, E., Tlusty, T. Percolation in living neural networks. Phys Rev Lett. 97, (18), (2006).
  15. Feinerman, O., Moses, E. Transport of information along unidimensional layered networks of dissociated hippocampal neurons and implications for rate coding. J Neurosci. 26, (17), 4526-4534 (2006).
  16. Soriano, J., Rodriguez Martinez,, Tlusty, M., T,, Moses, E. Development of input connections in neural cultures. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (37), 13758-13763 (2008).
  17. Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8, (1), 26-29 (2011).
  18. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu Rev Neurosci. 34, 389-412 (2011).
  19. Williams, S. C., Deisseroth, K. Optogenetics. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (41), 16287 (2013).
  20. Rotem, A., Moses, E. Magnetic stimulation of curved nerves. IEEE Trans Biomed Eng. 53, (3), 414-420 (2006).
  21. Rotem, A., Moses, E. Magnetic stimulation of one-dimensional neuronal cultures. Biophys J. 94, (12), 5065-5078 (2008).
  22. Feinerman, O., Moses, E. A picoliter 'fountain-pen' using co-axial dual pipettes. J Neurosci Methods. 127, (1), 75-84 (2003).
  23. Feinerman, O., Segal, M., Moses, E. Signal propagation along unidimensional neuronal networks. J Neurophysiol. 94, (5), 3406-3416 (2005).
  24. Papa, M., Bundman, M. C., Greenberger, V., Segal, M. Morphological analysis of dendritic spine development in primary cultures of hippocampal neurons. J Neurosci. 15, (1 Pt 1), 1-11 (1995).
  25. Bikson, M., et al. Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro. J Physiol. 557, (1), 175-190 (2004).
  26. Rahman, A., et al. Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects. J Physiol. 591, (10), 2563-2578 (2013).
  27. Stern, S., Segal, M., Moses, E. Involvement of Potassium and Cation Channels in Hippocampal Abnormalities of Embryonic Ts65Dn and Tc1 Trisomic Mice. EBioMedicine. 2, (9), 1048-1062 (2015).
  28. Rotem, A., et al. Solving the orientation specific constraints in transcranial magnetic stimulation by rotating fields. PLoS One. 9, (2), e86794 (2014).
  29. Feinerman, O., Rotem, A., Moses, E. Reliable neuronal logic devices from patterned hippocampal cultures. Nat Phys. 4, (12), 967-973 (2008).
  30. Kleinfeld, D., Kahler, K. H., Hockberger, P. E. Controlled outgrowth of dissociated neurons on patterned substrates. J Neurosci. 8, (11), 4098-4120 (1988).
  31. Bugnicourt, G., Brocard, J., Nicolas, A., Villard, C. Nanoscale surface topography reshapes neuronal growth in culture. Langmuir. 30, (15), 4441-4449 (2014).
  32. Roth, S., et al. Neuronal architectures with axo-dendritic polarity above silicon nanowires. Small. 8, (5), 671-675 (2012).
  33. Peyrin, J. M., et al. Axon diodes for the reconstruction of oriented neuronal networks in microfluidic chambers. Lab Chip. 11, (21), 3663-3673 (2011).
  34. Renault, R., et al. Combining microfluidics, optogenetics and calcium imaging to study neuronal communication in vitro. PLoS One. 10, (4), e0120680 (2015).
  35. Roth, B. J., Basser, P. J. A model of the stimulation of a nerve fiber by electromagnetic induction. IEEE Trans Biomed Eng. 37, (6), 588-597 (1990).
使用电动和一维和二维文化磁场神经元的外部激励
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stern, S., Rotem, A., Burnishev, Y., Weinreb, E., Moses, E. External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures. J. Vis. Exp. (123), e54357, doi:10.3791/54357 (2017).More

Stern, S., Rotem, A., Burnishev, Y., Weinreb, E., Moses, E. External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures. J. Vis. Exp. (123), e54357, doi:10.3791/54357 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter