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Neuroscience

न्यूरॉन्स के विदेश उत्तेजना इलेक्ट्रिक और एक- या दो-आयामी संस्कृतियों में चुंबकीय क्षेत्र का उपयोग करना

Published: May 7, 2017 doi: 10.3791/54357
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 3
1Laboratory of Genetics, The Salk Institute for Biological Studies, 2Department of Physics and SEAS, Harvard University, 3Department of Physics of Complex Systems, Weizmann Institute of Science

Summary

Neuronal संस्कृतियों एकल न्यूरॉन्स पर उनके प्रभाव या न्यूरॉन्स की आबादी के माध्यम से उभरते मस्तिष्क उत्तेजना तकनीक के अध्ययन के लिए एक अच्छा मॉडल है। यहाँ प्रस्तुत एक बिजली के क्षेत्र स्नान इलेक्ट्रोड से सीधे उत्पादन या एक समय बदलती चुंबकीय क्षेत्र द्वारा प्रेरित द्वारा पैटर्न वाली न्यूरोनल संस्कृतियों की उत्तेजना के लिए अलग अलग तरीके हैं।

Abstract

एक न्यूरॉन एक संभावित कार्रवाई आग जब इसकी झिल्ली क्षमता एक निश्चित सीमा से अधिक होगा। मस्तिष्क के विशिष्ट गतिविधि में, यह अपने अन्तर्ग्रथन से रासायनिक आदानों का एक परिणाम के रूप में होता है। हालांकि, न्यूरॉन्स भी एक लगाया गया बिजली के क्षेत्र से उत्साहित किया जा सकता है। विशेष रूप से, हाल ही में नैदानिक ​​अनुप्रयोगों बाहर से एक बिजली के क्षेत्र बनाने के द्वारा न्यूरॉन्स सक्रिय करें। यह जांच करने के लिए कैसे न्यूरॉन बाहरी क्षेत्र का जवाब और क्या कार्रवाई की क्षमता का कारण बनता है ब्याज की इसलिए है। सौभाग्य से, एक बाहरी बिजली क्षेत्र की सटीक और नियंत्रित आवेदन भ्रूण neuronal कोशिकाओं है कि, excised हैं अलग और संस्कृतियों में बड़े हो के लिए संभव है। यह एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रणाली में इन सवालों की जांच की अनुमति देता है।

इस पत्र में neuronal संस्कृतियों पर बाहरी बिजली क्षेत्र के नियंत्रित आवेदन के लिए इस्तेमाल तकनीक के कुछ समीक्षा कर रहे हैं। नेटवर्क या तो एक आयामी, यानी लिनिया में नमूनों हो सकता हैआर रूपों या सब्सट्रेट के पूरे विमान पर विकसित करने के लिए अनुमति दी, और इस तरह दो आयामी। इसके अलावा, उत्तेजना द्रव (स्नान इलेक्ट्रोड) में या चुंबकीय दालों के दूरदराज के निर्माण का उपयोग कर बिजली के क्षेत्र उत्प्रेरण से डूबे इलेक्ट्रोड के माध्यम से बिजली के क्षेत्र के प्रत्यक्ष आवेदन के द्वारा बनाया जा सकता है।

Introduction

न्यूरॉन्स और बाहरी बिजली क्षेत्र के बीच बातचीत मौलिक प्रभाव के साथ-साथ व्यावहारिक लोगों की है। यह वोल्टा की किसी अवधि में बाह्य रूप से लागू किया बिजली के क्षेत्र ऊतक को उत्तेजित कर सकते हैं के बाद से जाना जाता है, वहीं तंत्र न्यूरॉन्स में एक परिणामी संभावित कार्रवाई के उत्पादन के लिए जिम्मेदार केवल हाल ही में 1 सुलझाया जाए, 2, 3, 4 शुरू कर रहे हैं। इस तंत्र कि न्यूरॉन कि बिजली के क्षेत्र 2, 5 का जवाब में झिल्ली क्षमता के विध्रुवण, झिल्ली संपत्तियों की और आयन चैनल की भूमिका, और यहां तक कि क्षेत्र का कारण बनता है के बारे में सवालों के जवाब पाने के भी शामिल है। चिकित्सीय neurostimulation 6, 7, 8, 9,

मापने इन विवो ब्रेन के भीतर बातचीत के इस समझ के एक महत्वपूर्ण घटक लेता है, लेकिन अस्पष्टता और खोपड़ी के भीतर माप की कम controllability द्वारा बाधा उत्पन्न कर रहा है। इसके विपरीत, संस्कृतियों में माप आसानी से उच्च परिशुद्धता, शोर प्रदर्शन के लिए उत्कृष्ट संकेत और reproducibility के और नियंत्रण के एक उच्च डिग्री के साथ उच्च मात्रा में किया जा सकता। संस्कृतियों का उपयोग करते हुए सामूहिक नेटवर्क व्यवहार के neuronal गुण की एक विशाल विविधता 11 स्पष्ट किया जा सकता है, 12, 13, 14, 15, 16। इसी तरह, यह अच्छी तरह से नियंत्रित प्रणाली व्यवस्था है जिसके द्वारा अन्य उत्तेजना तरीकों काम करते हैं, उदाहरण के कैसे optogenetically सक्रिय न्यूरॉन्स 17, 18 में ऑप्टिकल उत्तेजना के दौरान चैनल खोलने, 19 संभावित कार्रवाई बनाने के लिए जिम्मेदार है के लिए का वर्णन में अत्यधिक कुशल हो उम्मीद है।

यहाँ ध्यान देने के उपकरण है कि कुशलता से एक बाहरी बिजली के क्षेत्र के माध्यम से न्यूरॉन उत्तेजित कर सकते हैं के विकास और समझ का वर्णन पर है। इस पत्र में हम अलग अलग विन्यास और स्नान इलेक्ट्रोड के द्वारा एक सीधे लागू होता है बिजली के क्षेत्र के उन्मुखीकरण, और दो आयामी के अंत में उत्तेजना का उपयोग कर दो आयामी और एक आयामी पैटर्न वाली हिप्पोकैम्पस संस्कृतियों, उत्तेजना की तैयारी का वर्णन है और एक से एक आयामी संस्कृतियों नमूनों समय-बदलती चुंबकीय क्षेत्र है, जो एक बिजली के क्षेत्र को प्रेरित करता है5, 20, 21।

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Protocol

आचार कथन: पशु हैंडलिंग से जुड़े प्रक्रियाओं संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) विज्ञान के Weizmann संस्थान के, और उचित इजरायली कानून के दिशा निर्देशों के अनुसार किया गया। Weizmann संस्थान आकलन और प्रयोगशाला पशु की देखभाल इंटरनेशनल के प्रत्यायन के लिए एसोसिएशन (AAALAC) द्वारा मान्यता प्राप्त है। Weizmann संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति इस अध्ययन, हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स के साथ आयोजित मंजूरी दे दी।

1. दो आयामी (2 डी) और एक-आयामी (1 डी) हिप्पोकैम्पस संस्कृतियों की तैयारी

  1. 2 डी संस्कृतियों के लिए coverslips तैयार करना।
    1. 0.9 एमएल न्यूनतम आवश्यक मीडिया (सदस्य) + 3 जी, 0.05 एमएल भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS), 0.05 एमएल गर्मी निष्क्रिय घोड़े सीरम (HI एचएस) और B27 पूरक का 1 μL: मध्यम चढ़ाना (प्रधानमंत्री) से बना तैयार करें। नोट: सदस्य + 3 जी सदस्य एक्स 1 के हर 500 एमएल के लिए होता है, gentamycin के 1 एमएल, स्थिर एल glutamine 100x 5 एमएल (देखें
    2. 200 एमएल डीडीडब्ल्यू में 200 एमएल डबल डिस्टिल्ड वॉटर (डीडीडब्ल्यू) (मिश्रण 60 डिग्री सेल्सियस) और 1.24 ग्राम बोरिक एसिड में 1. 9 जी बोरैक्स (सोडियम टाट्राबोरेनेट डीकाइहाइड्रेट) तैयार करें। पीएच 8.5 को 1 एम एचसीएल का प्रयोग करके अंतिम चरण समाधान नोट: अंतिम समाधान 400 एमएल 0.1 एम बोरेट बफर है।
    3. 2 घंटे के लिए 65% नाइट्रिक एसिड में विसर्जित गिलास के कवर। डीडीडब्लू में तीन बार कुल्ला, निरपेक्ष विश्लेषणात्मक अभिकर्मक (एबीएस एआर) इथेनॉल के साथ तीन राइन्स
    4. बुनेन बर्नर की ज्वाला से 1-3 सेकंड के लिए दो बार आवरण के माध्यम से प्रत्येक कसरलाप को पास करें और फिर 24 एमबी पॉली-एल-लाइसिन 0.01% समाधान के साथ 24 प्लैट प्लेट में रातोंरात उबाए, बोरेट बफर में 1: 5 पतला होता है ( 0.1 एम, पीएच 8.4)। फिर डीडीडब्लू में तीन बार कुर्सियों को कुल्ला और एक मानक 37 डिग्री सेल्सियस, प्रतिदिन 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में अच्छी तरह से 1 एमएल पीएम छोड़ दें।
  2. 1 डी संस्कृतियों के लिए कवरलाप की तैयारी
    1. स्वच्छ जीएक आधार पिरान्हा 75 एमएल DDW, 25 एमएल 25% अमोनिया समाधान और 25 एमएल 30% हाइड्रोजन पेरोक्साइड से मिलकर समाधान में विसर्जन से लड़की coverslips। कांच 30 मिनट के लिए और फिर नाइट्रोजन के साथ कांच coverslips सूखी ~ 50 डिग्री सेल्सियस पर एक हीटिंग थाली पर coverslips के साथ प्लेस समाधान।
    2. एक पतली क्रोम फिल्म (99.999%) 6 मोटाई का सोना (99.999%) की एक 30 एक परत द्वारा पीछा किया, या तो भाप या भंग होते बयान का उपयोग कर के साथ पहली कोट coverslips।
      1. 0.05 की एक sputtering दर प्राप्त करने के लिए - 1 ए / एस 2 ई-बीम और लक्ष्य के साथ 260 l / s की एक निर्वात प्रणाली आकार 2 "और 4" के साथ एक sputtering मशीन का उपयोग करें। प्रति मिनट (आरपीएम) 100 राउंड - एक रोटेशन मंच है कि 0 से जा सकते हैं का प्रयोग करें। एक डायरेक्ट करेंट (डीसी) का प्रयोग करें 0 की शक्ति भंग होते - 750 वाट।
      2. 30 आरपीएम के रोटेशन का प्रयोग करें और 99.999% आर्गन कक्ष में 10 mTorr के दबाव में प्लाज्मा मिलता है।
      3. 40 डब्ल्यू क्रोम के लिए डीसी धूम सत्ता पर sputtering तोपों की बिजली की आपूर्ति काम करते हैं, के लिए अग्रणी ~ 0.12 ए / एस कवरेज दर, और सोने के लिए 10 डब्ल्यू डीसी स्पटर पावर पर, जिससे ~ 0.28 ए / एस हो
    3. 100 मिलीलीटर एबीएस एआर इथेनॉल में 0.1 ग्राम 1-अक्टेडेनैनिथोल अल्ट्रासाउंड का 30 मिनट के लिए उपयोग करें। इस समाधान में 2 घंटे के लिए सीआर-एयू लेपित कवरलेट रखें, फिर नाइट्रोजन के साथ इथेनॉल एबीएस एआर और सूखे से धो लें।
    4. 600 - 700 आरपीएम पर 1 से 2 घंटे के लिए सरगर्मी करके 100 मिलीलीटर डल्बेको के फॉस्फेट बफर किए गए खारा (डी पीबीएस) और त्रिकोणीय ब्लॉक सह-पॉलिमर के 3.5 ग्राम (देखें सामग्रियों की सामग्री देखें) का समाधान तैयार करें । 1 घंटे के लिए समाधान में शीतलिप्स रखें। नाइट्रोजन के साथ ड्राई कवरलेट
    5. जैव-अस्वीकृति परत 22 को खरोंच करके यंत्रवत रूप से वांछित पैटर्न खोदते हैं। एक पेन प्लॉटर का उपयोग करके इसे करें, जहां पेन को एचीचिंग सुई द्वारा बदल दिया गया है। अंतर्निहित कांच तक पहुंचने के लिए धातु परतों के माध्यम से पैटर्न को खरोंच करें। दोहराए गए वांछित पैटर्न को प्राप्त करने के लिए इस प्रक्रिया को कंप्यूटर द्वारा नियंत्रित करें। इस प्रक्रिया द्वारा गठित पैटर्न प्रदर्शित होते हैं चित्र 2 और 3 चित्र में डी।
    6. 100 एमएल डी पीबीएस, 3.5 ग्राम त्रिकोणीय ब्लॉक सह बहुलक, 35.7 μL / एमएल फ़ाइब्रोनेक्टिन और 29 μl / मिलीलीटर laminin के एक जैव संगत परत तैयार करें।
      1. कम से कम 10 मिनट के लिए अल्ट्रा-वायलेट प्रकाश में coverslips जीवाणुरहित। तैयार जैव संगत समाधान रातोंरात में coverslips सेते।
        नोट: जैव संगत परत बनेगी केवल जहां जैव अस्वीकृति परत पिछले चरण में बंद etched किया गया है।
      2. अगले दिन धोने पर पी-डीबीएस के साथ दो बार coverslips। रात भर अपराह्न में coverslips सेते। Coverslips अब सेल चढ़ाना के लिए तैयार हैं।
  3. मानक प्रक्रियाओं है कि बड़े पैमाने पर पहले से 23, 24 प्रकाशित किया गया है के अनुसार विच्छेदन निष्पादित करें।
    1. संक्षिप्त, निकालने हिप्पोकैम्पस या चूहा भ्रूण से प्रांतस्था, आम तौर पर दिन E19 पर में, या चूहों, आम तौर पर दिन पर E17 23 से,Class = "xref"> 24
    2. कोशिकाओं को पहले से 20- 30 मिनट के लिए पपैन समाधान में अलग करना, उसके बाद यांत्रिक कचरे के 24 गिलास पिपेट्स जिनके सुझाव आग पॉलिश हैं
      नोट: यदि कोशिकाएं आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों से आती हैं तो पूरी प्रक्रिया के दौरान प्रत्येक भ्रूण के ऊतक को एक अलग 1.5 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब में बनाए रखा जाना चाहिए।
    3. बोने से पहले ट्रिपपेन नीले के साथ कोशिकाओं की गणना करें।
      नोट: आनुवंशिक रूप से संशोधित पशुओं के लिए प्रत्येक भ्रूण के लिए गिनती अलग से की जानी चाहिए।
    4. 2 डी संस्कृतियों के लिए, 750,000 में बीज माउस न्यूरॉन्स और 850,000 प्रति कोशिकाओं पर अच्छी तरह से चूहे न्यूरॉन्स। 1 डी के लिए, बीज प्रति 650,000 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से। Coverslip की सजातीय कवरेज सुनिश्चित करने के लिए सीडिंग के तुरंत बाद शेक प्लेट।
  4. न्यूरोनल संस्कृतियों का रखरखाव
    1. बदलते मध्यम (सीएम) तैयार (प्रति एमएल): 0.9 एमएल एमईएम + 3 जी, 0.1 एमएल HI एचएस, 10 μL 5-फ्लुरो-2'-डीओक्यूरिडिन (एफयूडीआर) यूरेइडिन 100 एक्स के साथ। </ Li>
    2. 0.9 एमएल सदस्य + 3 जी और 0.1 एमएल HI एच एस: अंतिम मध्यम (एफएम) (एमएल प्रति) से बना तैयार करें।
    3. इन विट्रो में 4 दिन (DIV) के बाद 1-1.5 एमएल मुख्यमंत्री के साथ प्रधानमंत्री को बदलें। 6 DIV में ताजा मुख्यमंत्री के साथ मुख्यमंत्री का 50% की जगह। DIV 8 में, 1.5 एमएल एफएम को मध्यम, एफएम के हर 2 दिन में 50% की परिवर्तन के बाद बदल जाते हैं। के बारे में एक सप्ताह के बाद सहज तुल्यकालिक गतिविधि उभर रहे।
  5. फ्लोरोसेंट रंजक के साथ neuronal संस्कृतियों में सहज या पैदा की गतिविधि के इमेजिंग।
    1. 50 माइक्रोग्राम प्रति कैल्शियम संवेदनशील फ्लोरोसेंट डाई के एक समाधान तैयार 50 μL DMSO (डाइमिथाइल sulfoxide) में (सामग्री / अभिकर्मकों की तालिका देखें)।
    2. कोशिकी रिकॉर्डिंग समाधान (ईएम) (मिमी में) युक्त 10 HEPES, 4 KCl, तैयार 2 2 CaCl, 1 2 MgCl, 139 NaCl, 10 डी ग्लूकोज, 45 सुक्रोज (पीएच 7.4)।
    3. 1 घंटे के लिए कैल्शियम संवेदनशील फ्लोरोसेंट डाई समाधान के 8 μL के साथ 2 एमएल ईएम में neuronal संस्कृति सेते हैं। प्रकाश से सुरक्षित रखें और धीरे homogen सुनिश्चित करने के लिए बारी बारी सेकोशिकाओं को डाई के ous फैल गया।
    4. ताजा ईएम के साथ समाधान इमेजिंग से पहले बदलें। फ्लोरोसेंट इमेजिंग चित्र 4 में प्रदर्शित किया गया है।
    5. कैल्शियम प्रतिदीप्ति इमेजिंग (488 एनएम पर उत्तेजना शिखर, 520 एनएम पर उत्सर्जन चोटी) के लिए ऑप्टिकल फिल्टर के साथ एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी में छवि, एक कैमरा और सॉफ्टवेयर के दृश्य के क्षेत्र के भीतर ब्याज (आरओआई) के किसी भी क्षेत्र की तीव्रता मात्र निर्धारण करने में सक्षम का उपयोग करते हुए माइक्रोस्कोप।

2. संस्कृतियों का इलेक्ट्रिक उत्तेजना

नोट: बिजली उत्तेजना के लिए बुनियादी सेटअप चित्र 1 में दिखाया गया है। एक कवर पर्ची जिस पर न्यूरोनल संस्कृति के बारे में 14 दिनों के लिए बड़ा हो गया है प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे एक पेट्री डिश में रखा गया है। न्यूरॉन्स की विद्युत गतिविधि कैल्शियम संवेदनशील रंगों का उपयोग कर छवि उतारी है, जबकि एक वोल्टेज स्नान इलेक्ट्रोड के दो जोड़े है कि संस्कृति के बाहर तैनात कर रहे हैं के माध्यम से लागू किया जाता है। इलेक्ट्रोड के रूप से प्रेरित हैंignal जनरेटर जिसका उत्पादन एक दोहरी चैनल एम्पलीफायर से बढ़ जाता है। उत्तेजना के लिए वोल्टेज नियंत्रण अधिक मानक वर्तमान नियंत्रण 25, 26, क्योंकि बिजली के क्षेत्र वैक्टर सीधे निर्धारित कर रहे हैं से अधिक पसंद किया जाता है, इस प्रकार सरल वेक्टर अलावा और संयोजन सक्षम करने से। यह विद्युत क्षेत्र की एकरूपता, जो वोल्टेज नियंत्रण के मामले के लिए पूरे नमूना भर में प्रदर्शन किया जा सकता का सावधानीपूर्वक जांच की जरूरत है। का उपयोग कर वोल्टेज नियंत्रण देखभाल किसी भी जमीन छोरों से बचने के लिए लिया जाना चाहिए जब और बिजली के क्षेत्र की एकरूपता सत्यापित किया जाना चाहिए (नीचे 2.2 देखें)।

  1. एक सजातीय बिजली के क्षेत्र के साथ बिजली उत्तेजना के लिए समानांतर इलेक्ट्रोड तारों की एक जोड़ी का उपयोग करें।
    1. 0.005 '' (127 सुक्ष्ममापी) के आदेश पर एक मोटाई के साथ प्लैटिनम से बना इलेक्ट्रोड का उपयोग करें। जब 13 मिमी coverslips के साथ प्रयोग किया, यह सुनिश्चित करें कि दो इलेक्ट्रोड के बीच की दूरी लगभग 11 मिमी है, और इलेक्ट्रोड की स्थितिसंस्कृति से ऊपर 1 मिमी।
      नोट: इलेक्ट्रोड धारक (आंकड़े 5 ए और 6A) का उपयोग polytetrafluoroethylene (PTFE) बनाने के लिए। PTFE के माध्यम से संकीर्ण छेद ड्रिल इलेक्ट्रोड डालने के लिए। डिवाइस कोशिकी समाधान से अधिक होना चाहिए, ताकि शीर्ष अंत है, जहां इलेक्ट्रोड संपर्क में हैं, समाधान के साथ संपर्क में कभी नहीं आ जाएगा। इन्सुलेशन के लिए, संपर्क में हो सकता है कि इलेक्ट्रोड सुराग के किसी भाग पर epoxy गोंद का उपयोग करें।
    2. एक 50% कर्तव्य चक्र के साथ एक वर्ग पल्स आकार का उपयोग करें, कोई डीसी घटक के साथ इलेक्ट्रोलिसिस से बचने के लिए। 10 μs और 4 एमएस के बीच की अवधि पल्स संस्कृति जल के बिना प्रभावी उत्तेजना पैदा करने के लिए बदलती हैं। सुनिश्चित करें कि आयाम ± 22 वी (चित्रा 5 देखें) के क्रम में है। वर्ग पल्स इलेक्ट्रोड से समानांतर में जुड़े एक आस्टसीलस्कप पर मनाया जा सकता है।
      नोट: के लिए किसी भी वांछित तरंग की आसान प्रोग्रामिंग, एक वाणिज्यिक तरंग संपादन सॉफ्टवेयर का उपयोग करें (सामग्री सूची देखने
  2. क्षेत्र एकरूपता के लिए परीक्षण करने के लिए एक जांच इलेक्ट्रोड का उपयोग करें। जांच इलेक्ट्रोड के बीच क्षेत्र में ले जाया गया और बिजली की क्षमता को मापने करने की अनुमति कम से कम 1 मिमी x 1 मिमी की एक ग्रिड का उपयोग करें।
    1. बिजली क्षमता का आकलन करें। उपयोग समीकरण 1 बिजली के क्षेत्र की गणना की। एक संदर्भ इलेक्ट्रोड के रूप में इलेक्ट्रोड का उपयोग करें। 4 एमएस (100 μs पल्स अवधि का एक उदाहरण के लिए चित्रा 5 ब देखें) के लिए 100 μs के बीच पल्स अवधि अलग-अलग सत्यापित करें कि क्षेत्र उत्तेजक अवधि की सीमा के भीतर सजातीय है के साथ बिजली के क्षेत्र का आकलन करें।
      ध्यान दें: एक मापा बिजली के क्षेत्र एकरूपता का एक उदाहरण के लिए चित्रा 5D देखें जब पल्स अवधि 1 एमएस था।
  3. स्नान इलेक्ट्रोड के 2 सीधा जोड़े का उपयोग करें और अधिक जटिल बिजली के क्षेत्र आकार का निर्माण करने के लिए, और करने के लिए(देखें अंजीर। 6B) अलग अलग दिशाओं में क्षेत्र उन्मुख करने के लिए सक्षम हो। इलेक्ट्रोड के 2 जोड़ी के साथ डिवाइस का उपयोग किया जाएगा, और इलेक्ट्रोड के प्रत्येक जोड़ी पर संकेत दो अलग-अलग oscilloscopes पर रखा जाएगा।
    1. एक दूसरे से 11 मिमी - इलेक्ट्रोड संस्कृति से ऊपर और 10 की दूरी पर 1 मिमी रखें। सुनिश्चित करें कि दोनों इलेक्ट्रोड जोड़े (कोई जमीन कनेक्शन है) चल रहे हैं, और इलेक्ट्रोड के किसी सेट के बीच प्रतिरोध को मापने और इलेक्ट्रोड के बीच किसी भी शॉर्ट सर्किट के अभाव पुष्टि करने के द्वारा किसी भी सामान्य आधार न करना पड़े। सत्यापित करें कि उपयोग किए गए सभी उपकरण है, जो इलेक्ट्रोड (जैसे oscilloscopes, एम्पलीफायरों, संकेत जनरेटर, आदि) से जुड़ा है जमीन के संबंध में चल रहा है को चेक करके सभी उपकरण चल रहा है और संदर्भ इलेक्ट्रोड कि कोई भी स्पर्श कर रही है कि किसी भी जमीन उपकरण।
    2. क्षेत्र उन्मुखीकरण को बदलने के लिए, वोल्टेज रेस के साथ दो इलेक्ट्रोड जोड़े को खिलाया के आयाम भिन्न होpect एक दूसरे के लिए (चित्रा 7A देखें)। उदाहरण के लिए, 0 डिग्री इलेक्ट्रोड जोड़ी पर ± 22 वी उपयोग के लिए जो पैटर्न के लम्बवत होती और 0 अन्य इलेक्ट्रोड के लिए वी। 45 ° के लिए, कोई चरण अंतराल के साथ ± 15.6 वी इलेक्ट्रोड के दोनों जोड़े पर इस्तेमाल करते हैं, 15,6 2 +15,6 2 = 22 2 के एक आयाम सदिश योग के लिए।
    3. एक घूर्णन क्षेत्र एक साइन वोल्टेज नाड़ी की एक ही तरंग और इलेक्ट्रोड के दो जोड़े के लिए एक कोज्या वोल्टेज नाड़ी की एक ही तरंग का उपयोग एक निश्चित आयाम बिजली के क्षेत्र घूर्णन उत्पादन करने के लिए लागू करने के लिए (चित्र 6B)।
      नोट: के रूप में जब ± 22 एक इलेक्ट्रोड में वी और ± 22 वी अन्य इलेक्ट्रोड में के साथ एक कोज्या लहर के एक चक्र के साथ साइन वेव के एक चक्र का उपयोग कर चित्रा 6B, में देखी जा सकती है, सदिश योग के साथ एक घूर्णन बिजली के क्षेत्र है चक्र अवधि ज्या और कोज्या तरंगों के रूप में एक ही है, और ± 22 वी का एक आयाम के साथ
  4. मापने और गणना करने के लिए इतिएक ही संस्कृति में न्यूरोनल कल्चर बनाम डेन्ड्रैक्ट्स में ऐक्सि और रियोबसे के एक्सॉन्स निम्न चरणों का पालन करते हैं।
    1. कैल्शियम इमेजिंग के लिए कैल्शियम के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट डाई का प्रयोग करें, जैसा कि तालिका / सामग्री और सामग्री में वर्णित है, 1.5) पतली (170 माइक्रोन), लंबे (10 मिमी) लाइनों पर नमूनों के साथ 1 डी संस्कृति के साथ। कैल्शियम संवेदनशील डाई संस्कृति के लिए लागू किया जाएगा, और 45 मिनट के लिए incubated। एक ताजा रिकॉर्डिंग समाधान के साथ जगह डाई जाएगी।
    2. अन्तर्ग्रथनी संचरण के प्रभाव के बिना, विद्युत उत्तेजना की प्रत्यक्ष प्रतिक्रिया के आबादी आंकड़े प्राप्त करने के लिए नेटवर्क को डिस्कनेक्ट करें। ऐसा करने के लिए, बाइक्यूकुलिन के 40 सुक्ष्ममापी के संयोजन को लागू करें, जो गामा-अमीनोब्युटिक एसिड-ए (गाबा ए ) रिसेप्टर्स की अवरोधक क्रिया को रोकता है, 6 माइक्रोन 6-साइनो -7-नाइट्रोक्विनॉक्लीनिन -2, 3-डायोन (सीएनयुएक्स) , Α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (एएमपीए) और कैनेट रिसेप्टर्स और 20 माइक्रोन (2 आर) -मिनो -5-फोस्फोोनोवेल को ब्लॉक करने के लिएरिक एसिड (APV) है, जो ब्लॉक एन मिथाइल- D-aspartate (NMDA) रिसेप्टर्स। ब्लॉकर्स रिकॉर्डिंग समाधान के लिए जोड़ दिया जाएगा।
    3. 100 μs और 4 एमएस के बीच समय अवधि अलग-अलग 2.1 और 2.3 में बताए अनुसार एक वर्ग पल्स लागू करें। संकेत आस्टसीलस्कप पर मनाया जा सकता है।
    4. (1.5 देखें) कई ROI को पर कैल्शियम यात्रियों की तीव्रता की निगरानी के लिए एक छवि अधिग्रहण कार्यक्रम के साथ एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करें, प्रत्येक कुछ सौ न्यूरॉन्स युक्त। एक संवेदनशील EMCCD कैमरे का उपयोग कर छवियों (सामग्री सूची देखें), प्रति सेकंड कम से कम 20 तख्ते की एक छवि अधिग्रहण दर में सक्षम प्राप्त। प्रकाश की तीव्रता में परिवर्तन न्यूरॉन्स की राशि जो प्रेरित कर रहे थे के लिए आनुपातिक है। तीव्रता में सापेक्ष परिवर्तन का उपयोग कर प्रेरित न्यूरॉन्स के अंश का अनुमान लगाएं।
    5. प्रत्येक स्पंद अवधि (4 एमएस करने के लिए 100 μs) के लिए, वोल्टेज इलेक्ट्रोड एक वोल्टेज जहां तीव्रता में कोई बदलाव नहीं देखा जाता है (कुछ वोल्ट) से शुरू करने के लिए आवेदन के आयाम बदलने के लिए, th के लिएई वोल्टेज जहां लागू वोल्टेज के कारण तीव्रता में परिवर्तन संतृप्त है (ऊपर 22 वी ± के लिए)।
      नोट: तीव्रता परिवर्तन वोल्टेज नाड़ी में से प्रत्येक के समय अवधि के लिए उत्तेजना के लिए लागू वोल्टेज के संबंध में एक संचयी गाऊसी 5 के रूप में वितरित किया जाएगा।
    6. तीव्रता बनाम प्रत्येक अवधि के लिए लागू वोल्टेज के लिए एक संचयी गाऊसी वितरण फिट हैं और इस फिट से गाऊसी मतलब निकालें।
      नोट: यह मतलब प्रतिनिधि वोल्टेज जो न्यूरॉन्स प्रतिक्रिया व्यक्त की है।
    7. इस प्रक्रिया के अंत में प्रत्येक उत्तेजना अवधि के लिए एक मतलब वोल्टेज प्राप्त जो न्यूरॉन्स अमल किया। शक्ति-अवधि घटता साजिश करने के लिए अवधियों और ताकत के इन जोड़ों का उपयोग करें (चित्रा 7 देखें)।

3. संस्कृतियों के चुंबकीय उत्तेजना

ध्यान दें: चुंबकीय उत्तेजना के लिए बुनियादी सेटअप चित्र 2 में दिखाया गया है। ऊपर दाईं ओर दिखाया गया हैएक उल्टे प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी जो न्यूरॉन्स में छवि कैल्शियम संवेदनशील रंगों के लिए प्रयोग किया जाता है। चुंबकीय कुंडल (नीला हलकों) एक न्यूरोनल अंगूठी संस्कृति से ऊपर 5 मिमी के बारे में केंद्रित है, (नीली रूपरेखा)। पेट्री डिश के परिधि पर पिकअप कॉयल (लाल वृत्त) चुंबकीय पल्स द्वारा प्रेरित वोल्टेज पर नज़र रखता है। ऊपर बायीं ओर चुंबकीय उत्तेजक (एमएस) कुंडली की मापा गतिशीलता को 5000 केवी के संधारित्र वोल्टेज लोड के साथ दिखाया गया है, जैसा कि पिक कुंडली से एकीकृत है। प्रेरित विद्युत क्षेत्र (14 मिमी का एक अंगूठी त्रिज्या के लिए गणना) हरे रंग में दर्शाया गया है जबकि चुंबकीय क्षेत्र को नीले रंग में दिखाया गया है। नीचे पर न्यूरोनल कल्चर की छवियां दिखायी जाती हैं। निचले बाएं तल पर 24-मिमी के आवरण के एक उज्ज्वल क्षेत्र की छवि है। सफेद क्षेत्रों न्यूरॉन्स हैं। फोटोग्राफ पैटर्न में विभिन्न रेडीआई के साथ गाढ़ा रिंग संस्कृतियां होती हैं। निचले दाहिने ओर, रिंगों के एक छोटे से सेगमेंट पर एक ज़ूम है, जिसमें व्यक्तिगत न्यूरॉन्स दिखाई देते हैं। एक पैमाने के लिए, छल्ले 'widवें लगभग 200 सुक्ष्ममापी है।

  1. एक परिपत्र अंगूठी पैटर्न में न्यूरॉन्स के लिए आगे बढ़ें (etched 1.2.5 में वर्णित है) -1 डी संस्कृति उत्तेजना के लिए। पतली (170 सुक्ष्ममापी) पर नमूनों एक -1 डी संस्कृति, लंबी (10 मिमी) लाइनों के साथ कैल्शियम इमेजिंग के लिए एक कैल्शियम संवेदनशील फ्लोरोसेंट डाई (खंड 1.5 में वर्णित है) का प्रयोग करें।
    1. एक परिपत्र चुंबकीय तार का उपयोग करें और एक पेट्री डिश स्थिति तार के साथ नीचे और गाढ़ा लगभग 5 मिमी। एल के एक प्रेरण = 90 महाराष्ट्र 5 केवी की अधिकतम वोल्टेज के साथ भरी हुई एक घर या व्यावसायिक एमएस द्वारा संचालित के साथ लगभग 30 मिमी (भीतरी व्यास, 46-मिमी बाहरी व्यास) का तार के एक कस्टम का तार का प्रयोग करें।
    2. एक उच्च वर्तमान उच्च वोल्टेज स्विच का उपयोग चुंबकीय न्यूरोनल संस्कृतियों प्रोत्साहित करने के लिए एक उच्च वोल्टेज और एक का आयोजन तार के माध्यम से वर्तमान निर्वहन। 5 केवी - चुंबकीय उत्तेजक (एमएस) 21 में वर्णित के रूप में बड़े संधारित्र का उपयोग कर, 100 एमएफ आदेश पर, 1 की एक उच्च वोल्टेज प्राप्त करने के लिए बनाया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से एक व्यावसायिक रूप से उपयोग करेंउपलब्ध एमएस (देखें सामग्री / अभिकर्मकों की तालिका)।
      नोट: एक घर का तार 21 निर्माण करने के लिए एक 0.254 मिमी मोटी और 6.35 मिमी विस्तृत पॉलिएस्टर में लिपटे आयताकार तांबे के तार का उपयोग करें। बारी कस्टम मेड फ्रेम, epoxy में कांच फाइबर और कलाकारों के साथ अछूता पर तारों (सामग्री / अभिकर्मकों की तालिका देखें)। वैकल्पिक रूप से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कॉयल का उपयोग करें (सामग्री / अभिकर्मकों की तालिका देखें)।
  2. चुंबकीय क्षेत्र घूर्णन 2 डी संस्कृतियों प्रोत्साहित करने के लिए प्रयोग करें।
  3. अब, 2 डी संस्कृतियों प्रोत्साहित करने के लिए घूर्णन चुंबकीय क्षेत्र का उपयोग करें। डिश में कोई संस्कृति के साथ टीएमएस आग, विभिन्न तीव्रताओं पर, तीव्रता के साथ तार पढ़ने के रैखिक आपसी संबंध को प्रदर्शित करने के लिए।
  4. इसके बाद, एक neuronal संस्कृति के साथ कैल्शियम यात्रियों रिकॉर्डिंग करते समय, बढ़ती तीव्रता दोनों कैल्शियम यात्रियों और कुंडल रिकॉर्डिंग करते समय पर टीएमएस फायरिंग शुरू करते हैं। सबसे पहले, नेटवर्क फटने, बड़े कैल्शियम यात्रियों के रूप में मनाया थानेदारuld के साथ सिंक्रनाइज़ नहीं कुंडल टीएमएस कीलें लेने। , तीव्रता को बढ़ाने के कुछ बिंदु पर जारी रखते हुए, कैल्शियम यात्रियों टीएमएस कीलें सिंक्रनाइज़ हो जाते हैं लगते हैं। वैकल्पिक रूप से, या इसके अलावा, एक तुल्यकालन प्रतिक्रिया प्राप्त करने के बाद, तीव्रता कम हो रही है जब तक तुल्यकालन, को समाप्त कर दिया है टीएमएस सीमा निर्धारित करने के लिए शुरू करते हैं।
    नोट: स्थितियां बनाए रखा सख्ती से व्यवस्था से प्रत्येक के लिए तय किया जाना चाहिए, सही मात्रा हर बार, एक ही वाहिकाओं और सटीक तार की स्थिति और झुकाव का उपयोग कर।
    1. रिकॉर्डिंग पकवान के आधार पर पिक तार माउंट इतना है कि यह न्यूरोनल संस्कृति के लिए एक विमान समानांतर में और संस्कृति के संबंध में एक निश्चित स्थिति में है।
      नोट: यह सुनिश्चित करता है कि चुंबक के संबंध में पिक तार की स्थिति की निर्भरता संस्कृति की स्थिति के लिए वफादार है और स्थिति में किसी भी विसंगतियों पिक कुंडल रीडिंग पर नगण्य होगा।
      1. दो स्वतंत्र कॉयल हैं कि का उपयोग करेंएक दूसरे के लंबवत तैनात (चित्रा 8B) एक घूर्णन चुंबकीय और प्रेरित बिजली के क्षेत्र उत्पन्न करने के लिए। अपनी ही एमएस करने के लिए प्रत्येक का तार कनेक्ट करें। सुनिश्चित करें कि stimulators 90 डिग्री (चित्रा 10A) का एक चरण अंतराल पर समान धाराओं का निर्वहन, एक घूर्णन चुंबकीय क्षेत्र जो ~ 270 वी / मीटर की अधिकतम क्षेत्र (चित्रा 10B) पर वास्तविक अंतरिक्ष के 270 डिग्री को स्कैन करता है, जिसके परिणामस्वरूप।
      2. बाहरी रिकॉर्डिंग समाधान (ईएम) से भरा एक गोलाकार कांच कंटेनर के अंदर न्यूरोनल संस्कृति स्थित करें।
      3. मॉनिटर उत्तेजना कैमरा के साथ (न्यूरॉन्स के प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन) कदम 2.4.4 में वर्णित है।
      4. पार कॉयल (चित्रा 8B) के मामले में, पिक का तार समानांतर स्थिति और neuronal संस्कृति के नीचे एक विशिष्ट दूरी पर। ध्यान से प्रयोगों के दौरान इस विन्यास बनाए रखें।
  5. विश्लेषणात्मक गणना -1 डी configura के लिए बिजली के क्षेत्रई अधिकतम = कश्मीर 1 बीआर, जहां ई अधिकतम प्रेरित बिजली के क्षेत्र की अधिकतम आयाम है और r त्रिज्या के साथ छल्ले की स्पर्श के साथ निर्देशित है द्वारा tion। बी चुंबकीय नाड़ी के आयाम है और कश्मीर 1 एक आयामी समानुपातिक स्थिरांक कि पिक का तार (चित्रा 8A) का उपयोग मापा जा सकता है है।
  6. एक संख्यात्मक सिमुलेशन पैकेज (सामग्री सूची देखें) का प्रयोग करें संख्यानुसार बिजली के क्षेत्र 21 अनुकरण करने के लिए।

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Representative Results

प्रस्तुत प्रोटोकॉल न्यूरोनल संस्कृतियों का आसान आकृति के लिए अनुमति देता है। यह कई तरीके हम उत्तेजना के लिए विकसित के साथ संयुक्त है, यह इस तरह के Chronaxie और Rheobase 5 के रूप में कुछ आंतरिक न्यूरॉन संपत्तियों की माप बनाने के लिए, स्वस्थ और रोगग्रस्त न्यूरॉन्स 27 के गुणों की तुलना करने, के एक समारोह के रूप में संस्कृतियों को प्रोत्साहित करने इष्टतम तरीके खोजने के लिए सक्षम बनाता है उनकी संरचना और कई और अधिक उपन्यास दृष्टिकोण। कुछ उदाहरणों में अगले आंकड़े में प्रस्तुत कर रहे हैं।

3 चित्र से पता चलता -1 डी नमूनों विन्यास कि जैव अस्वीकृति परत में etched कर रहे हैं। के बारे में 170 सुक्ष्ममापी चौड़ाई की पतली लाइनों आम तौर पर उत्कीर्ण हैं कि, उदाहरण के लिए, अलग-अलग त्रिज्या (चित्रा 3 ए) या समानांतर लाइनों के साथ समान वलय हो सकता है आम तौर पर ~ 11 म लोंग (चित्रा 3 बी)।

NT "के लिए: रखने together.within-पन्ने की =" 1 "> चित्रा 4 के शीर्ष पैनल संस्कृति में फ्लोरोसेंट गतिविधि, एक आरोप युग्मित डिवाइस (सीसीडी) के साथ लिया का एक विशिष्ट चित्र और fluorescently की एक छवि दिखा लेबल से पता चलता एक 2D संस्कृति में न्यूरॉन्स। इस उदाहरण में तीन अलग-अलग ROI को दिखाए जाते हैं, काले, हरे और लाल। एकीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता निशान में चिह्नित, चित्र 4 के नीचे पैनल में दिखाए जाते हैं इन तीन अलग अलग ROI को में मापा (निशान इसी रंग में हैं ROI को) के। इनसेट पता चलता है, फ्रेम अधिग्रहण समय है, जिस पर इस विशेष डेटा लिया गया था के 200 एमएस संकल्प के भीतर, तीन अलग अलग ROI को में सभी न्यूरॉन्स एक साथ फट।

बुनियादी एक uni-दिशात्मक, लगातार बिजली के क्षेत्र द्वारा उत्तेजना के लिए इस्तेमाल किया उपकरण चित्रा 5 ए में दिखाया गया है। इलेक्ट्रोड तारों, रिकॉर्डिंग माध्यम में डूबे हैं न्यूरोनल संस्कृति से ऊपर के बारे में 1 मिमी।बिजली उत्तेजना के लिए इस्तेमाल बुनियादी पल्स आकार चित्रा 5 ब में दिखाया गया है। जब इस वोल्टेज पल्स लागू किया जाता है यह एक निरंतर बिजली के क्षेत्र है कि चक्र के आधे के बाद 180 डिग्री से अपने उन्मुखीकरण flips पैदा करता है। आधे से एक चक्र के बाद क्षेत्र दिशा में बदलाव करने के लिए इलेक्ट्रोड इलेक्ट्रोलिसिस और नुकसान से बचने के लिए प्रयोग किया जाता है। इलेक्ट्रोड के लिए लागू किया ठेठ वोल्टेज ± 22 वी कर रहे हैं, और 2 डी संस्कृतियों की उत्तेजना के लिए विशिष्ट पल्स अवधि 100 के क्रम में है - 500 μs।

neurites की विकास में किसी भी असमदिग्वर्ती होने की दशा के लिए नियंत्रित करने के लिए, हम सत्यापित 2D संस्कृतियों की कि उत्तेजना समदैशिक है। मैन्युअल रूप से 15 ° संकल्प बिल्कुल 360 डिग्री में इलेक्ट्रोड घूर्णन तक (चित्रा 5C) यह देखा जाता है उत्तेजना के लिए उन्मुखीकरण के कोई वरीयता नहीं है। चित्रा 5C में प्रत्येक रंग एक अलग संस्कृति की उत्तेजना का प्रतिनिधित्व करता है। मूल से दूरी कम से कम डु का प्रतिनिधित्व करता हैराशन एक निरंतर आयाम के साथ उत्तेजना के लिए की जरूरत है। ऐसा नहीं है कि, एक अच्छा सन्निकटन करने के लिए, 2 डी संस्कृतियों बिजली उत्तेजना के लिए एक पसंदीदा उन्मुखीकरण की जरूरत नहीं है स्पष्ट है।

के बाद से इलेक्ट्रोड की एक जोड़ी क्षेत्र (हालांकि यह रूप से फ़्लिप किया जा सकता है) के लिए एक परिभाषित दिशा होने में सीमित है, हम इलेक्ट्रोड के दो जोड़े (चित्रा 6A) के साथ बिजली उत्तेजना के लिए एक तंत्र विकसित किया है। संस्कृति का एक योजनाबद्ध (ग्रे परिपत्र पृष्ठभूमि, गहरे रंग के धब्बे सेल निकायों कर रहे हैं) और इलेक्ट्रोड (समानांतर मोटी लाइनों) की चित्रा 6B में दिखाया गया है। जब waveforms, चित्रा 6B में नीले और हरे रंग आवेषण, के रूप में दिखाया कोज्या और साइन लहरें हैं और एक साथ फिर से लागू होते हैं एक घूर्णन ई सदिश क्षेत्र का उत्पादन किया है। जब वोल्टेज दालों वर्ग हैं, अलग-अलग आयाम है और वे आर द्वारा निर्धारित वांछित उन्मुखीकरण के साथ एक निरंतर क्षेत्र बनाने के तो उन दोनों के बीच शून्य चरण अंतराल हैइलेक्ट्रोड के दो जोड़े के बीच उत्कृष्ट आयाम यह इलेक्ट्रिक रोटेशन मैनुअल, मैकेनिकल रोटेशन पर एक स्पष्ट सुधार है जो चित्रा 5 सी में उत्तेजना शक्तियों के कोणीय वितरण को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। बेशक, जैसा कि चित्रा 6 सी दिखाता है, यह केवल एक निश्चित दिशा को उत्तेजित करने के लिए इस कॉन्फ़िगरेशन का उपयोग करना संभव है, संभवतः एक नियंत्रण के रूप में, केवल एक जोड़ी इलेक्ट्रोड को सक्रिय करके।

इन कॉन्फ़िगरेशनों का प्रयोग 2 डी न्यूरोनल संस्कृतियों को एक घूर्णन क्षेत्र या एक निश्चित-कोण क्षेत्र के साथ, एक ही रूट अर्थ स्क्वायर (आरएमएस) वोल्टेज के साथ उत्तेजित करने के लिए किया गया और फिर जब आयाम ठीक हो गया तो संस्कृति को उत्तेजित करने के लिए पल्स की अवधि की तुलना करना। हमने पाया कि ± 22 वी के एक स्थिर आयाम के साथ एक घूर्णन बिजली के क्षेत्र का उपयोग करते समय, उत्तेजना प्राप्त करने के लिए 150 ± 14 μ की एक औसत अवधि की आवश्यकता थी, जबकि एक ही दिशा विद्युत क्षेत्र में एक औसत अवधि290 ± 30 μs की जरूरत थी। एक निश्चित कोण क्षेत्र बनाम एक घूर्णन के साथ रोमांचक संस्कृति के लिए आवश्यक अवधियों के बीच का अनुपात इसलिए 0.53 ± 0.02 है।

के बाद से एक 2D संस्कृति में एक्सोन सभी दिशाओं में विस्तार, घूर्णन क्षेत्र एक्सोन के कई उत्तेजित करने के लिए सक्षम है। इसके विपरीत, एकल उन्मुखीकरण क्षेत्र के साथ वहाँ केवल कुछ एक्सोन कि विशिष्ट कोण में उन्मुख और axonal उत्तेजना हासिल नहीं हो पाता। जब अवधि बढ़ जाती है, वहाँ न्यूरॉन के रोमांचक अन्य भागों की संभावना के साथ-साथ, विशेष रूप से डेन्ड्राइट में है। यह आगे Chronaxie माप का वर्णन करने में नीचे समझाया गया है। तथ्य यह है कि बहुत छोटी अवधि जब एक घूर्णन क्षेत्र का उपयोग कर एक ही संस्कृति की उत्तेजना के लिए आवश्यक हैं जब मस्तिष्क उत्तेजना के लिए बाहरी क्षेत्रों का उपयोग कर, के बाद से वहाँ नाड़ी अवधियों पर अक्सर तकनीकी सीमाएं हैं उच्च महत्व का है।

चित्रा 7 में दिखाया जाता है। चित्रा 7A में एक -1 डी कट नेटवर्क या तो (वृक्ष के समान उत्तेजना के लिए 90 डिग्री पर) संस्कृति की लाइन के लिए या सीधा (axonal उत्तेजना के लिए 0 डिग्री पर) इलेक्ट्रोड के दो जोड़े द्वारा संस्कृति की रेखा के साथ विद्युत क्षेत्र से प्रेरित है। वोल्टेज के रूप में बढ़ जाती है, और अधिक न्यूरॉन्स प्रेरित किया जाएगा, और इस फ्लू से परिलक्षित होता हैorescence तीव्रता है, जो प्रेरित न्यूरॉन्स की संख्या के लिए आनुपातिक है (चित्र देखें 7 बी)। बढ़ाने से वोल्टेज आयाम धीरे-धीरे पूरे संस्कृति को प्रोत्साहित किया जाता है। प्रत्येक न्यूरॉन एक न्यूनतम सीमा वोल्टेज (एक विशेष पल्स अवधि के लिए) है कि यह का जवाब देंगे, और बड़ी संख्या में कानून द्वारा, इन सीमाओं के वितरण गाऊसी होने की उम्मीद है। इसलिए, यदि हमें न्यूरॉन्स कि प्रतिक्रिया व्यक्त की संख्या को देखो और वोल्टेज लागू के खिलाफ यह साजिश, वितरण एक संचयी गाऊसी वितरण, एक त्रुटि समारोह (ERF) 5 जो हो जाएगा। कि बिजली के क्षेत्र की एक विशिष्ट आयाम का जवाब न्यूरॉन्स की संख्या लगभग एक गाऊसी वितरण है, और इसलिए प्रतिदीप्ति अच्छी तरह से अपनी अभिन्न द्वारा वर्णित है - उत्तेजक क्षेत्र (चित्रा 7C) के आयाम का एक त्रुटि कार्य करते हैं।

चित्रा 7C ई करने के लिए प्रयोग किया जाता हैxtract एक पैरामीटर, उम्मीद वितरण के (मतलब)। यह एक संचयी गाऊसी वितरण फिटिंग और सबसे अच्छा फिट प्राप्त करने के द्वारा किया जाता है। यह अपेक्षा लागू वोल्टेज जो करने के लिए कोशिकाओं का 50% जवाब देंगे है। इस प्रक्रिया में कई पल्स अवधि (100 μs से 4 एमएस तक) के लिए दोहराया है। मतलब वोल्टेज जो करने के लिए संस्कृति प्रतिक्रिया व्यक्त की शक्ति-अवधि की अवस्था प्राप्त करने के लिए बनाम पल्स अवधि साजिश रची है। माप के दो सेट प्रदर्शन किया गया। पहले में क्षेत्र पैटर्न के समानांतर था, और दूसरे में यह यह करने के लिए खड़ा था। यह पहले 15, 23 कि एक्सोन पैटर्न से तालमेल दिखाया गया है, जबकि डेन्ड्राइट सभी दिशाओं में हो जाना। यह दो अलग-अलग शक्ति-अवधि घटता है, जो axonal और वृक्ष के समान उत्तेजना के बीच एक स्पष्ट अंतर प्राप्त करने के लिए बहुत उपयोगी होते हैं देता है। वृक्ष के समान और axonal योगदान करने के लिए पूर्ण जुदाई अक्षतंतु कि ज्ञात तथ्य द्वारा हासिल की हैअल समय उत्तेजना के लिए निरंतर वृक्ष के समान लोगों 2, 3, 4 की तुलना में बहुत कम है।

शक्ति-अवधि घटता तो Chronaxie क्षय समीकरण के लिए फिट हैं समीकरण 2 , जहां वी rh Rheobase वोल्टेज है और सी Chronaxie है। टी <1ms की नब्ज अवधि में यह एक्सोन कि उत्साहित पहले स्थान पर है और न्यूरॉन आग का कारण है, शक्ति-अवधि की अवस्था में उत्तेजना वोल्टेज के लिए कम मूल्य हो रही है। Axonal Chronaxie 110 μs की गणना की गई थी। हड़ताली इसके विपरीत, लम्बे समय तक (टी> 1 एमएस) में उत्तेजना के लिए वृक्ष के समान डिब्बे 900 μs पर गणना की एक वृक्ष के समान Chronaxie साथ न्यूरॉन के लिए उत्तेजना का स्रोत है।

सिद्धांतों एक cir के साथ 2 डी और -1 डी संस्कृतियों की उत्तेजना अंतर्निहितcular कुंडल चित्र 8 में वर्णित हैं। शारीरिक स्थिति का एक बेहतर समझ प्राप्त करने के लिए, चुंबकीय और प्रेरित बिजली क्षेत्र के संख्यात्मक सिमुलेशन COMSOL पैकेज का उपयोग किया जाता है। -1 डी संस्कृतियों एक परिपत्र चुंबकीय तार प्रयोग किया जाता है, संकेंद्रित रूप पेट्री डिश ऊपर तैनात प्रोत्साहित करने के लिए। न्यूरॉन्स कि रिकॉर्डिंग के लिए पेट्री डिश के अंदर रखा जाता एक दौर coverslip पर परिपत्र के छल्ले में उगाए जाते हैं। इस मामले में प्रेरित बिजली के क्षेत्र विश्लेषणात्मक गणना की जा सकती और ई अधिकतम = कश्मीर 1 बीआर, जहां ई अधिकतम प्रेरित बिजली के क्षेत्र की अधिकतम आयाम है और r त्रिज्या के साथ छल्ले की स्पर्श के साथ निर्देशित है के बराबर है। बी चुंबकीय नाड़ी के आयाम है और कश्मीर 1 एक आयामी समानुपातिक स्थिरांक है कि एक पिक का तार मापा जा सकता है।

चुंबकीय क्षेत्र ग के COMSOL संख्यात्मक गणना-1 डी संस्कृति में कुंडल द्वारा reated चित्रा 8A (लाल सुव्यवस्थित) के शीर्ष पैनल में दिखाया गया है। चित्रा 8A के नीचे पैनल में गणना प्रेरित बिजली के क्षेत्र के लिए प्रस्तुत किया है। एक पार तार विन्यास के साथ एक 2D संस्कृति की उत्तेजना चित्रा 8B में दिखाया गया है। 2 डी संस्कृतियों एक क्रॉस का तार इस्तेमाल किया गया था का उत्पादन है कि इसके अंदर एक 2D न्यूरोनल संस्कृति, एक गोलाकार कांच कंटेनर रिकॉर्डिंग माध्यम (EM) से भर जाता है कि में रखा के साथ तैनात चुंबकीय क्षेत्र, घूर्णन को प्रोत्साहित करने के लिए। इस मामले में प्रेरित बिजली के क्षेत्र नहीं रह गया है विश्लेषणात्मक गणना की जा सकती। क्रॉस का तार दो कुंडलियां और गिलास coverslip 2 डी संस्कृति कंटेनर के तल में रखा समर्थन के अंदर रखा गोलाकार कंटेनर के साथ चित्रा 8B के शीर्ष पैनल में दिखाया गया है,। पैमाने के लिए, आंतरिक कुंडली के भीतरी व्यास 65 मिमी है। एड़ी धाराओं 3 डी मॉडल के साथ COMSOL का उपयोग कर संख्यात्मक सिमुलेशन, नीचे पैनल में दिखाया जाता हैबिजली के क्षेत्र गोलाकार कंटेनर की भीतरी सतह में प्रेरित चित्रित। ठेठ -1 डी न्यूरोनल उत्तेजना के लिए इस्तेमाल किया संस्कृतियों के साथ एक गिलास coverslip के एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप छवि चित्रा 8C में दिखाया गया है। सफेद लाइनों नमूनों लाइनों, जो प्रयोगात्मक तुलना और दिशात्मकता के प्रभाव पर नियंत्रण के लिए दोनों स्पर्शरेखीय उन्मुख और त्रिज्यात कर रहे हैं पर न्यूरॉन्स दिखा।

-1 डी संस्कृति की ज्यामिति है कि क्या एक संस्कृति चुंबकीय उत्तेजना वजह से उन्हें सक्रिय होगा निर्धारित करने में एक बड़ी भूमिका निभाता है। -1 डी अंगूठी संस्कृतियों का केवल 22% चुंबकीय उत्तेजना का जवाब दिया। सफल उत्तेजना दर दृढ़ता से संस्कृति के रैखिक लंबाई पर निर्भर है, और चित्रा 9 ए है, जैसा कि संस्कृतियों है कि लंबे समय तक की तुलना में 80 मिमी चुंबकीय उत्तेजना का जवाब कर रहे हैं की 60% से अधिक। इसका मतलब है कि विशेष परिस्थितियों चुंबकीय प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक हैं। इस ज्यामितीय निर्भरता संस्कृतियों डब्ल्यू जांच करने के लिएपहले विन्यास है कि छल्ले के हिस्से हैं में वृद्धि हुई - बल्कि पूरा हलकों पर से आर्क्स पर उन्हें patterning द्वारा एक ही त्रिज्या लेकिन अलग-अलग लंबाई होने (चित्र देखें 8C)

-1 डी अंगूठी संस्कृतियों की त्रिज्या के एक समारोह के रूप में चुंबकीय क्षेत्र थ्रेसहोल्ड की एक व्यापक जांच 9b चित्रा में दिखाया गया है। व्हाइट हलकों, उत्तेजना थ्रेसहोल्ड की प्रयोगात्मक माप का प्रतिनिधित्व करते हुए रंग कोडिंग एक उत्तेजना सीमा को मापने के लिए गणना की संभावना को दर्शाता है। एक उत्तेजना सीमा सबसे कमजोर क्षेत्र है कि अभी भी एक दिया न्यूरोनल संस्कृति के लिए एक प्रतिक्रिया elicits के रूप में परिभाषित किया गया है।

9b चित्रा प्रवृत्ति है कि बड़े छल्ले कम उत्तेजना थ्रेसहोल्ड है, छल्ले की त्रिज्या और उत्तेजना सीमा के बीच एक स्पष्ट उलटा सहसंबंध के साथ जोर देती है। उदाहरण के लिए, औसत 14 मिमी अंगूठी Magn का जवाब1.5 टी के आयाम के साथ एटिक दालों जबकि औसत 7 मिमी की अंगूठी केवल 3 टी या अधिक का जवाब देती है। यह प्रेरित इलेक्ट्रिक फील्ड की सैद्धांतिक गणना से अपेक्षित है, जिसे रंग कोडित भविष्यवाणी की संभावना है जो आग लगने की संभावना है। वास्तव में, त्रिज्या के त्रिज्या में 3T द्वारा प्रेरित विद्युत क्षेत्र, उस बराबर है, जो 1.5 टी द्वारा त्रिज्या में दो बार प्रेरित होता है। संक्षेप में, औसत बिजली क्षेत्र की दहलीज 301 ± 128 (मानक विचलन) वी / एम है , जो अंगूठी संस्कृतियों के दायरे से अलग है।

एक सर्कल कॉयल के विपरीत, जो 2 डी संस्कृतियों में प्रतिक्रिया नहीं दे पाती थी, 15 से 30 2 डी संस्कृतियों को क्षेत्र चुंबकीय उत्तेजना को घूमने से प्रेरित किया गया था, जिससे न्यूरॉनल उत्तेजना को फटा जा रहा था। दो अलग-अलग कॉइल जो एक दूसरे के लिए लंबवत स्थिति में हैं ( चित्रा 8 बी ) चुंबकीय और प्रेरित विद्युत क्षेत्रों को घूर्णन करते हैं। प्रत्येक कुंडल स्वयं के एमएस से जुड़ा हुआ है, जो दोनों डिस्च90 डिग्री के एक चरण अंतराल पर समान धाराओं Arge। बिजली के क्षेत्र पार तार विन्यास में दो कुंडलियां में से प्रत्येक के द्वारा प्रेरित के आयाम चित्रा 10A में साजिश रची है, और एक ही निशान दिशा की एक ध्रुवीय प्रतिनिधित्व और दोनों कुंडलियों के आरोपित बिजली के क्षेत्र के आयाम द्वारा चित्रा 10B में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । जिसके परिणामस्वरूप प्रेरित बिजली के क्षेत्र ~ 270 वी / मीटर की अधिकतम क्षेत्र में वास्तविक अंतरिक्ष के 270 डिग्री स्कैन करता है।

आकृति 1
चित्रा 1: सेटअप Neuronal संस्कृतियों की बिजली की उत्तेजना के लिए प्रयुक्त की योजनाबद्ध। वांछित सिग्नल दो आउटपुट कोई आम जमीन है के साथ एक संकेत जनरेटर द्वारा निर्मित है। इन संकेतों 30 वी विद्युत संकेतों तो इलेक्ट्रोड के दो अलग-अलग जोड़े के माध्यम से तंग आ चुके हैं ± अप करने के लिए, tw में एक neuronal संस्कृति उत्तेजक की एक आउटपुट वोल्टेज देने के लिए परिलक्षित कर रहे हैंओ ओर्थोगोनल और स्वतंत्र दिशाओं। न्यूरॉन्स की उत्तेजना देखी और कैल्शियम रंगों द्वारा नजर रखी जा सकती है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्र 2: सेटअप Neuronal संस्कृति के चुंबकीय उत्तेजना के लिए प्रयुक्त की योजनाबद्ध। ए शीर्ष पर चुंबकीय तार (नीले घेरे) है, जो न्यूरोनल अंगूठी संस्कृति ऊपर 5 मिमी संकेंद्रित स्थित है, एक पेट्री डिश (नीला रूपरेखा) में रखा दिखाया गया है। एक पिक का तार (लाल वृत्त) पेट्री डिश की परिधि पर तैनात वोल्टेज चुंबकीय नाड़ी द्वारा प्रेरित आकलन करता है। तल में चुंबकीय उत्तेजक कुंडली के मापा गतिशीलता, दिखाया गया है (5,000 केवी का एक एमएस संधारित्र वोल्टेज लोड का प्रयोग करके) के रूप में पिक तार से एकीकृत। बिजली के क्षेत्र प्रेरित (calculat14 मिमी के एक अंगूठी त्रिज्या के लिए एड) हरे रंग में दिखाया गया है जबकि चुंबकीय क्षेत्र को नीले रंग में दिखाया गया है । एक उल्टे माइक्रोस्कोप छवियों चुंबकीय दालों पर प्रतिक्रिया न्यूरॉन्स के कैल्शियम यात्रियों के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट रंजक। सी। न्यूरॉन्स गाढ़ा रिंगों के पैटर्न पर उगता है, अंगूठी चुंबकीय उत्तेजक द्वारा प्रभावी उत्तेजना के लिए उपयोग किया जाता है। डी । पैटर्न की एक पंक्ति पर उगने वाले न्यूरॉन्स की उज्ज्वल फील्ड माइक्रोस्कोप छवि। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: 1 डी न्यूरॉनल कल्चर के पैटर्न के उदाहरण जो एक्सीनल ग्रोथ की दिशा के साथ इलेक्ट्रिक फील्ड को ओरिएंटिंग के लिए उपयोग किया जाता है। ए। परिपत्र पैटर्न का इस्तेमाल परिपत्र चुंबकीय कुंड के लिए किया जाता है, ctric क्षेत्र एक परिपत्र उन्मुखीकरण है। बी रेखा पैटर्न उपयोग किया जाता है जब प्रेरित या सीधे बिजली के क्षेत्र में एक भी उन्मुखीकरण है।

चित्रा 4
चित्र 4: तुल्यकालिक नेटवर्क फटने के दौरान Imaged कैल्शियम यात्रियों का उदाहरण निशान। ए न्यूरॉन्स कि एक कैल्शियम डाई के साथ प्रयोग करने के लिए पिछले रंगे थे का चित्र। बी बनाम ट्रेस ए में लागत पर लाभ तीन ROI को भीतर सिंक्रनाइज़ तीव्रता में बहुत ज्यादा बढ़ोतरी की बॉर्डर का रंग का प्रतिनिधित्व करने के रंग के साथ एक में ROI की समय तीव्रता के निशान एक नेटवर्क फट प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्र 5: इलेक्ट्रिक उत्तेजना के लिए बुनियादी सेटअप, समानांतर स्नान इलेक्ट्रोड की एक जोड़ी का उपयोग कर का निर्धारण करने के लिए है कि 2 डी संस्कृतियों इलेक्ट्रिक उत्तेजना का कोई पसंदीदा अभिविन्यास है। ए संस्कृति उत्तेजना के लिए इस्तेमाल किया उपकरण। बिजली के क्षेत्र प्लैटिनम तार इलेक्ट्रोड से वोल्टेज लागू करने के द्वारा निर्मित है। दो तारों के बीच की दूरी 13 मिमी है। एक वोल्टेज संकेत बी एक उदाहरण ए में इलेक्ट्रोड पर लागू किए जाने नाड़ी की द्विध्रुवी आकार इलेक्ट्रोड पर रिकॉर्डिंग समाधान के इलेक्ट्रोलिसिस नहीं जा पाता। सी जब इलेक्ट्रोड के विभिन्न रोटेशन में एक 2D संस्कृति उत्तेजक, वहाँ न्यूरोनल प्रतिक्रिया की isotropy है। डी जांच कदम 2.2 में वर्णित का उपयोग कर बिजली के क्षेत्र माप का एक उदाहरण। बिजली के क्षेत्र के लिए 10% की एक त्रुटि के लिए एक समान है। यह आंकड़ा 5 से संशोधित किया गया है।अपलोड करें / 54357 / 54357fig5large.jpg "target =" _ blank "> कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

चित्रा 6
चित्रा 6: इलेक्ट्रोड उत्तेजना इलेक्ट्रोड के दो जोड़े के साथ इलेक्ट्रिक फील्ड के रोटेशन की अनुमति देता है और किसी भी वांछित कोण में उत्तेजना के लिए। ए बिजली के क्षेत्र के अधिक जटिल आकार का उत्पादन करने के लिए, दो स्वतंत्र इलेक्ट्रोड जोड़े की जरूरत है। बी एक इलेक्ट्रोड के लिए कोसाइन वोल्टेज के आकार की नब्ज को लागू करना और दूसरे इलेक्ट्रोड में एक साइन नाड़ी को लागू करने से लगातार आयाम के साथ एक घूर्णन विद्युत क्षेत्र तैयार होता है। सी। इलेक्ट्रोड के एक जोड़ी में स्क्वायर वोल्टेज नाड़ी को लागू करना एक यूनिडायरेक्शनल वर्दी इलेक्ट्रिक फील्ड बनाता है। यह आंकड़ा 5 से संशोधित किया गया है कृपया सीएलयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां Ick।

चित्रा 7
चित्र 7: अन्तर्ग्रथन आगतों को अवरुद्ध करने (के रूप में 2.4.2 में वर्णित) द्वारा नेटवर्क डिस्कनेक्शन एकल कक्षों की कुल जनसंख्या है कि एक को देखते हुए बिजली क्षेत्र द्वारा प्रेरित कर रहे हैं के निरीक्षण से सक्षम बनाता है। ए इलेक्ट्रोड के दो जोड़े के लिए वोल्टेज दालों के विभिन्न आयाम को लागू करके, बिजली के क्षेत्र की जरूरत मैन्युअल रूप से चालू करने के लिए संस्कृति के बिना हर कोण के लिए उन्मुख किया जा सकता है। विभिन्न लागू वोल्टेज पर बिजली उत्तेजना के साथ कैल्शियम यात्रियों की बी उदाहरण रिकॉर्डिंग। चार निशान दिखाए जाते हैं, थोड़ा खड़ी स्थानांतरित कर दिया देखने के अनुमति देने के लिए। वोल्टेज मूल्यों नीले निशान के नीचे लिखा जाता है। सी जब बिजली के क्षेत्र की एक निरंतर अवधि को लागू करने, कि बिजली के क्षेत्र वजह से उन्हें सक्रिय होगा न्यूरॉन्स की संख्या एक संचयी जिले हैribution समारोह (CDF) है कि एक संचयी गाऊसी वितरण (या एक ERF समारोह) वोल्टेज (जो क्षेत्र शक्ति के लिए आनुपातिक है) के आयाम के एक समारोह के रूप में है। डी एक शक्ति-अवधि, जबकि इस प्रोटोकॉल को रोजगार प्राप्त वक्र का एक उदाहरण। यह आंकड़ा 5 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आंकड़ा 8
चित्र 8: चुंबकीय कुंडल विन्यास और प्रेरित इलेक्ट्रिक फील्ड की गणना। ए शीर्ष पर एक परिपत्र का तार (नीले घेरे) एक आयामी न्यूरोनल अंगूठी संस्कृतियों से ऊपर 5 मिमी स्थिति में है (नीला डिस्क) है। के छल्ले के समानांतर और कुंडल, जो एक चुंबकीय पल्स कि लाल लाइनों के साथ उन्मुख है बनाता है के साथ गाढ़ा कर रहे हैं। द्वारा फैराडे के कानून, प्रेरित बिजली के क्षेत्र विमानों है कि यह साथ वलय साथ कुंडल के समानांतर हैं पर स्थित है। तल में अंगूठी संस्कृतियों के विमान के पास क्षैतिज पार अनुभाग है। बिजली के क्षेत्र के सापेक्ष मूल्य तीर द्वारा दिखाया गया दिशा के साथ, रंग कोडित है। बड़ी छल्ले प्रवाह के एक बड़े क्षेत्र संलग्न है और इसलिए बिजली के क्षेत्र प्रेरित है अधिक है। पार का तार चुंबकीय उत्तेजक (ऊपर) और बिजली के क्षेत्र है कि यह से प्रेरित है के अनुकरण के बी छवि। सी पैटर्न न्यूरॉन होते हैं जो या तो एक परिपत्र बिजली के क्षेत्र या एक रेडियल विद्युत क्षेत्र से प्रेरित किया जा सकता विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया। यह आंकड़ा 28 21 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्र 9: चुंबकीय क्षेत्र को रिंग संस्कृतियों का रिस्पांस। ए उत्तेजना की सफलता की दर संस्कृति की त्रिज्या के साथ बढ़ता है। त्रुटि सलाखों मानक त्रुटि (एसई) प्रतिनिधित्व करते हैं। बी अंगूठी आकार और चुंबकीय क्षेत्र ताकत के बीच संबंध दिखाया गया है। संभावना संस्कृति उत्तेजित करने के लिए रंग कोडित है। दरअसल संस्कृतियों के सबसे सफल excitations प्रयोगात्मक सुलभ फेज़ स्पेस (सफेद आयत) और उच्च संभावना क्षेत्र (लाल) के बीच ओवरलैप में झूठ बोलते हैं। यह आंकड़ा 21 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 10
चित्रा 10: चुंबकीय क्षेत्र सेटअप फील्ड घूर्णन। </ strong> ए क्रम जब पार कुंडल चुंबकीय उत्तेजक के साथ उत्तेजक एक घूर्णन बिजली के क्षेत्र के लिए प्रेरित करने के लिए, 90 डिग्री के एक चरण में बदलाव दो कुंडलियां के बीच की जरूरत है। दिखाया गया है बिजली के क्षेत्र एक पिकअप कुंडल तिपतिया घास पत्ती कुंडली के 2 पड़ोसी पंखों पर तैनात में प्रेरित है। कॉयल 2 वाणिज्यिक stimulators द्वारा अलग से खदेड़ दिया गया। बी ए पुनर्निर्माण, तिपतिया घास पत्ती का तार का एक नाड़ी के दौरान घटता एक में दिखाया गया है, उसके एवज में बिजली के क्षेत्र आयाम और दिशा का इस्तेमाल करते हैं। यह आंकड़ा 28 21 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

1 डी पैटर्निंग एक महत्वपूर्ण उपकरण है जिसका इस्तेमाल विभिन्न प्रकार के अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, हमने न्यूरोनल संस्कृतियों से तर्कशास्त्र द्वार बनाने के लिए 1D पैटर्निंग का इस्तेमाल किया है 29 और हाल ही में चूहा हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स 5 के क्रैनीक्सी और रियोबैस को मापने के लिए, और डाउन सिंड्रोम हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स में फायरिंग गतिविधि की सिग्नल प्रोपेगेशन वेग को धीमा करने के लिए जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स 27 1 डी पैटर्न के लिए सुझाए गए प्रोटोकॉल मजबूत है और किसी भी इच्छित पैटर्न को बनाने के लिए आसान है हम नेटवर्क के किसी भी संभावित डिसकनेक्शन के बारे में पता करने के लिए माप से पहले 1 डी संस्कृति का पालन करने का सुझाव देते हैं, जो इसके कार्य को प्रभावित कर सकते हैं

न्यूरॉनल कॉन्फ़िगरेशन के रासायनिक पैटर्न में एक प्रतिष्ठित इतिहास 30 , 31 , 32 है । हमने पाया कि हमारा दृष्टिकोण उपजरासायनिक आकृति के समान परिणाम है, फिर भी वे और अधिक मजबूत और प्राप्त करने के लिए आसान है। हाल ही में न्यूरॉन्स की microfluidic आकृति के लिए विकल्प दृष्टिकोण हम तुलनीय सादगी और उपयोग 33, 34 की आसानी के साथ प्रस्तुत करते हैं, के लिए एक दिलचस्प विकल्प बन गया है। microfluidic दृष्टिकोण यहाँ वर्णित नक़्क़ाशी विधि के साथ समानांतर में हमारी प्रयोगशाला में प्रयोग किया जा रहा है।

जैसा कि हम पता चला है 5, 2 डी संस्कृतियों कोई पसंदीदा अभिविन्यास है और उनकी उत्तेजना आइसोट्रोपिक और फील्ड का प्रयोग किया के उन्मुखीकरण पर निर्भर नहीं करता। जब क्षेत्र घूर्णन है छोटी अवधि 2 डी संस्कृतियों की उत्तेजना के लिए आवश्यक हैं। इसके विपरीत, 1 डी संस्कृतियों क्षेत्र के उन्मुखीकरण पर बहुत निर्भर कर रहे हैं। क्षेत्र (axonal विकास की दिशा के साथ है और इसलिए) पैटर्न के साथ उन्मुख किया जाता है, एक निश्चित आयाम उत्तेजना के लिए आवश्यक क्षेत्र की अवधि जब क्षेत्र ओरिएंट है की तुलना में बहुत कम हैपैटर्न के लम्बवत एड। इसी प्रकार, यदि अवधि को स्थिर रखा गया तो क्षेत्र संस्कृति उत्तेजित करने के लिए की जरूरत है छोटा होता है, तो क्षेत्र और पैटर्न समानांतर हैं। जब लंबवत उत्तेजक, क्षेत्र नाड़ी बहुत लंबे समय तक होने के लिए (एक millisecond के क्रम में जब नेटवर्क डिस्कनेक्ट हो) की जरूरत है, और उसके बाद मुख्य रूप से डेन्ड्राइट प्रेरित कर रहे हैं। बिजली क्षेत्र (या तो प्रत्यक्ष या एक चुंबकीय क्षेत्र से प्रेरित) मस्तिष्क उत्तेजना के लिए उपयोग किया जाता है, इस अति महत्वपूर्ण है। मस्तिष्क क्षेत्र को लक्षित में जाना जाता है एक्सोन के बंडलों के लिए है, तो इन एक्सोन उनके दिशा में क्षेत्र orienting से उत्साहित किया जा सकता है और फिर कम शक्ति या उत्तेजना के लिए क्षेत्र की एक छोटी अवधि की जरूरत है। मस्तिष्क क्षेत्र को निशाना बनाया उन्मुखीकरण पसंद करते हैं नहीं करता है, तो एक घूर्णन क्षेत्र उत्तेजना के लिए और अधिक कुशल है। डेन्ड्राइट उत्तेजना का लक्ष्य रखते हैं, लंबे समय तक दालों अधिक प्रभावी हैं।

चुंबकीय क्षेत्र न्यूरोनल गतिविधि को प्रोत्साहित कर सकते हैं जब एक चुंबकीय पल्स मैंएक बिजली के क्षेत्र है कि न्यूरॉन्स उत्तेजित nduces। क्योंकि वर्तमान में प्राप्त चुंबकीय दालों की अवधि, डेन्ड्राइट, जिनकी प्रतिक्रिया समय मिलीसेकंड के आदेश की है में माइक्रोसेकंड हैं, चुंबकीय उत्तेजना के प्रति संवेदनशील होने की उम्मीद नहीं कर रहे हैं। इसके विपरीत, एक्सोन, जिनकी प्रतिक्रिया समय तेजी से होता है में, उत्तेजना 2, 3 का लक्ष्य कर रहे हैं। बिजली उत्तेजना को एक्सोन की प्रतिक्रिया अधिक से अधिक है जब वे बिजली के क्षेत्र के समानांतर हैं और कम हो, जब वे यह 1, 35 करने के लिए खड़ा कर रहे हैं; इसलिए, चुंबकीय उत्तेजना में, हम जहां प्रेरित बिजली के क्षेत्र लक्षित एक्सोन के समानांतर orients प्रणाली स्थापित करने के लिए प्रयास करते हैं। इसलिए, जब एक -1 डी अंगूठी उत्तेजक, क्षेत्र समानांतर एक्सोन के लिए उन्मुख होना चाहिए, और अंगूठी के आकार उत्तेजना के लिए सीमा निर्धारित करता है। स्नान इलेक्ट्रोड द्वारा प्रत्यक्ष उत्तेजना के लिए इसी तरह, एक 2D संस्कृति, एक घूर्णन प्रेरित ई प्रोत्साहित करने के लिएlectric क्षेत्र और अधिक कुशल है।

न्यूरॉन्स की और बिजली या चुंबकीय क्षेत्र के साथ बाहरी उत्तेजना की आकृति के संयोजन कई संभावित भविष्य के अनुप्रयोगों के साथ एक शक्तिशाली तकनीक है। Chronaxie और Rheobase, साथ ही सक्रियण और सक्रियण प्रचार गतिशीलता के लिए सीमा और वेग सभी मापदंडों कि एक neuronal संस्कृति के आंतरिक गुणों के लिए कह रहे हैं कर रहे हैं। विशेष रूप से, चिकित्सीय उपचार और दवाओं या औषधीय उपचार के प्रभाव तुरंत न्यूरॉन्स पर सीधे परीक्षण किया जा सकता। यह दोनों रोग मॉडल न्यूरॉन्स की और टीएमएस उत्तेजना के लिए प्रोटोकॉल के लिए एक कुशल सर्वेक्षण की अनुमति होगी। एक और अधिक वैचारिक दिशा पर, न्यूरोनल संस्कृतियों को प्रोत्साहित करने की क्षमता ठीक तंत्रिका विन्यास की सूचना संसाधन पहलुओं के बारे में उपन्यास संभावनाओं की ओर जाता है, और हमें सूक्ष्म मुद्रित सर्किट कि neuronal नेटवर्क रहने वाले नई गणना प्रदान करने के लिए के साथ इलेक्ट्रॉनिक उत्तेजना को जोड़ती है की परिकल्पना करने की अनुमतिअल उपकरणों और उपन्यास मस्तिष्क इंटरफ़ेस उपकरणों।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है।

Acknowledgments

लेखकों बहुत उपयोगी विचार विमर्श के लिए ऑफ़र फाइनरमैन, फ्रेड वुल्फ, मेनाहेम सेगल, एंड्रियास नीफ और आइटान रुयवेनी धन्यवाद। लेखकों प्रौद्योगिकी के प्रारंभिक संस्करणों के विकास के लिए इलान ब्रेस्किन और जॉर्डी सोरिआनो धन्यवाद। लेखकों सैद्धांतिक अवधारणाओं के साथ मदद के लिए ससेवीई टलस्टी और जीन पियरे एकमैन धन्यवाद। इस शोध मिनर्वा फाउंडेशन, विज्ञान और प्रौद्योगिकी, इज़राइल, मंत्रालय द्वारा और इसराइल विज्ञान फाउंडेशन अनुदान 1320-1309 और द्वि-राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान 2,008,331 द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APV Sigma-Aldrich A8054 Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
B27 supp Gibco 17504-044 Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1
bicuculline Sigma-Aldrich 14343 Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
Borax (sodium tetraborate decahydrate) Sigma-Aldrich S9640 Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2
Boric acid Frutarom LTD 5550710 Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2
CaCl2 , 1 M Fluka  21098 Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
CNQX Sigma-Aldrich C239 Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
COMSOL COMSOL Inc Multiphysics 3.5 Numerical simulation. Mentioned in Section 3.5.2
D-(+)-Glucose, 1 M Sigma-Aldrich 65146 Plating medium, Extracellular recording solution. Mentioned in Sections 1.1.1 and 1.5.2
D-PBS Sigma-Aldrich D8537 Cell Cultures. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6
FCS (FBS) Gibco 12657-029 Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141 Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6
Fluo4AM Life technologies F14201 Imaging of spontaneous or evoked activity. Mentioned in Sections 1.5.1, 1.5.3, and 1.5.5
FUDR Sigma-Aldrich F0503 Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1
Gentamycin Sigma-Aldrich G1272 Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1
GlutaMAX 100x Gibco 35050-038 Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1
Hepes, 1 M Sigma-Aldrich H0887 Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
HI HS BI 04-124-1A Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Sections 1.1.1, 1.4.1, and 1.4.2
KCl,  3 M Merck 1049361000 Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Laminin  Sigma-Aldrich L2020 Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6
MEM x 1 Gibco 21090-022 Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.4.1    1.4.2
MgCl2 , 1 M Sigma-Aldrich M1028 Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
NaCl, 4 M Bio-Lab 19030591 Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Octadecanethiol Sigma-Aldrich 01858 Cleaning Cr-Au coated coverslips (1D cultures). Mentioned in Section 1.2.3
Pluracare F108 NF Prill BASF Corparation  50475278 Bio-Rejection Coating, Bio Coating. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6
Poly-L-lysine 0.01% solution  Sigma-Aldrich  P47075 Promote cell division. Mentioned in Section 1.1.4
Sucrose, 1 M Sigma-Aldrich S1888 Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Thiol  Sigma-Aldrich 1858 Bio-Rejection Coating. Mentioned in Section 1.2.3
URIDINE Sigma-Aldrich U3750 Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1
Sputtering machine AJA International, Inc ATC Orion-5Series  coating glass with thin layers of metal. Mentioned in Section 1.2.2
Pen plotter  Hewlett Packard  HP 7475A Etching of pattern to the coated coverslip. Mentioned in Section 1.2.5
Electrodes wires  A-M Systems, Carlsborg WA 767000 Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Sections 2.1, 2.2, 2.3, and 2.4.5
Signal generator BKPrecision 4079 Shaping of the electric signal. Mentioned in Section 2.3
Amplifier Homemade Voltage amplification of the signal from the signal generator to the electrodes. Mentioned in Section 2.3
Power supply Matrix  MPS-3005 LK-3  Power supply to the sputtering machine. Mentioned in Section 1.2.2.3
Transcranial magnetic stimulation Magstim, Spring Gardens, UK Rapid 2 Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Sections 3.1, 3.3, and 3.4
Epoxy Cognis Versamid 140 Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4
Epoxy Shell EPON 815  Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4
Platinum wires 0.005'' thick; A-M Systems,   Carlsborg WA  767000 Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1
Circular magnetic coil Homemade Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.3
WaveXpress SW B&K Precision  Waveform editing software. Mentioned in Section 2.1.32
Xion Ultra 897 Andor Sensitive EMCCD camera. Mentioned in Section 2.4.4

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 123 न्यूरोनल नेटवर्क बिजली उत्तेजना चुंबकीय उत्तेजना Chronaxie Rheobase कैल्शियम इमेजिंग नमूनों संस्कृतियों
न्यूरॉन्स के विदेश उत्तेजना इलेक्ट्रिक और एक- या दो-आयामी संस्कृतियों में चुंबकीय क्षेत्र का उपयोग करना
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Stern, S., Rotem, A., Burnishev, Y., Weinreb, E., Moses, E. External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures. J. Vis. Exp. (123), e54357, doi:10.3791/54357 (2017).

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