Summary
colture neuronali sono un buon modello per lo studio delle tecniche di stimolazione cerebrale emergenti tramite il loro effetto sui singoli neuroni o di una popolazione di neuroni. Qui presentati sono diversi metodi per la stimolazione di colture neuronali modellate da un campo elettrico prodotto direttamente dalla elettrodi bagno o indotto da un campo magnetico variabile nel tempo.
Abstract
Un neurone spara un potenziale d'azione quando il suo potenziale di membrana supera una certa soglia. Nell'attività tipica del cervello, questo si verifica come risultato di ingressi chimici alle sue sinapsi. Tuttavia, i neuroni possono anche essere eccitati da un campo elettrico imposto. In particolare, le recenti applicazioni cliniche attivano i neuroni creando un campo elettrico esternamente. È quindi interessante studiare come il neurone risponda al campo esterno e ciò che provoca il potenziale d'azione. Fortunatamente, un'applicazione precisa e controllata di un campo elettrico esterno è possibile per le cellule neuronali embrionali che vengono escise, dissociate e coltivate in colture. Ciò consente di esaminare queste domande in un sistema altamente riproducibile.
In questo lavoro vengono esaminate alcune delle tecniche utilizzate per l'applicazione controllata del campo elettrico esterno sulle culture neuronali. Le reti possono essere unidimensionali, cioè modellate in linear forme o lasciate crescere su tutto il piano del substrato, e quindi bidimensionale. Inoltre, l'eccitazione può essere creata mediante l'applicazione diretta del campo elettrico tramite elettrodi immersi nel liquido (elettrodi bagno) o inducendo il campo elettrico mediante la creazione remota di impulsi magnetici.
Introduction
L'interazione tra i neuroni e campi elettrici esterni ha implicazioni fondamentali, nonché quelli pratici. Mentre è noto fin dai tempi di Volta che un campo elettrico applicato esternamente può eccitare il tessuto, i meccanismi responsabili per la produzione di un potenziale d'azione risultante in neuroni sono solo di recente iniziando da dipanare 1, 2, 3, 4. Ciò include trovare le risposte alle domande per quanto riguarda il meccanismo che provoca la depolarizzazione del potenziale di membrana, il ruolo di proprietà di membrana e dei canali ionici, e anche la regione nel neurone che risponde al campo elettrico 2, 5. Terapeutico neurostimolazione 6, 7, 8, 9, Misurare l'interazione all'interno del cervello in vivo aggiunge una componente importante per questa comprensione, ma è ostacolato dalla imprecisione e bassa la controllabilità delle misure all'interno del cranio. Al contrario, le misurazioni in culture possono essere facilmente eseguite in alto volume con alta precisione, eccellente rapporto segnale rumore prestazioni e un elevato grado di riproducibilità e di controllo. Utilizzando colture una grande varietà di proprietà neuronali del comportamento della rete collettiva può essere chiarita 11, 12, 13, 14, 15, 16. Analogamente, questo sistema ben controllato è prevista essere altamente efficace nel chiarire il meccanismo che altri metodi di stimolazione di lavoro, ad esempio come apertura del canale durante la stimolazione ottico in neuroni optogenetically attive 17, 18, 19 è responsabile della creazione potenziale d'azione. Qui l'attenzione è rivolta che descriva lo sviluppo e la comprensione di strumenti in grado di eccitare in modo efficiente il neurone tramite un campo elettrico esterno. In questo documento si descrive la preparazione di bidimensionale e unidimensionale colture ippocampali fantasia, stimolazione con diverse configurazioni e l'orientamento di un campo elettrico applicato direttamente dagli elettrodi bagno, e infine stimolazione bidimensionale e modellata culture unidimensionali di un variabili nel tempo del campo magnetico, che induce un campo elettrico5, 20, 21.
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Protocol
Etica Dichiarazione: procedure che coinvolgono la movimentazione degli animali sono stati fatti in accordo con le linee guida del Comitato Istituzionale cura degli animali ed uso (IACUC) del Weizmann Institute of Science, e la legge israeliana appropriata. Il Weizmann Institute è accreditato dalla Associazione per la valutazione e l'accreditamento del Laboratorio di Animal Care International (AAALAC). Il Comitato Istituzionale Cura ed uso degli animali Weizmann approvato questo studio, condotto con neuroni dell'ippocampo.
1. Preparazione di bidimensionale (2D) e monodimensionale (1D) Culture Hippocampal
- Preparazione di lamelle per colture 2D.
- Preparare mezzo di placcatura (PM) composto da: 0,9 mL minimo supporto essenziale (MEM) + 3G, 0,05 ml di siero di vitello fetale (FCS), 0,05 ml di calore siero di cavallo inattivato (HI HS) e 1 ml di supplemento B27. Nota: MEM + 3G contiene per ogni 500 ml di MEM x 1, 1 ml di gentamicina, 5 mL di stabilizzato 100x L-glutammina (vedi
- Preparare tampone borato composta 1,9 g borace (sodio tetraborato decaidrato) in 200 mL di acqua bidistillata (DDW) (della miscela a 60 ° C) e 1,24 g di acido borico in 200 mL DDW. Titolare soluzione finale a pH 8,5 usando 1 M HCl. Nota: La soluzione finale è di 400 mL di 0,1 M tampone borato.
- Immergere coprioggetto di vetro in acido nitrico 65% per 2 h. Risciacquare tre volte in acqua bidistillata seguiti da tre risciacqui con reagente analitico assoluto (ABS AR) etanolo.
- Passare ogni coprioggetto brevemente attraverso la fiamma di un becco Bunsen due o tre volte per 1 - 2 s, e quindi lasciare incubare durante la notte in piastre da 24 pozzetti con soluzione 1 0,01% di poli-L-lisina mL diluito 1: 5 in tampone borato ( 0.1 M, pH 8.4). Quindi sciacquare coprioggetto in DDW tre volte e lasciare con 1 mL PM per pozzetto in uno standard 37 ° C, 5% CO 2 incubatore durante la notte.
- Preparare mezzo di placcatura (PM) composto da: 0,9 mL minimo supporto essenziale (MEM) + 3G, 0,05 ml di siero di vitello fetale (FCS), 0,05 ml di calore siero di cavallo inattivato (HI HS) e 1 ml di supplemento B27. Nota: MEM + 3G contiene per ogni 500 ml di MEM x 1, 1 ml di gentamicina, 5 mL di stabilizzato 100x L-glutammina (vedi
- Preparazione di lamelle per colture 1D.
- Clean gcoprioggetti lass mediante immersione in una soluzione di base piranha costituito da 75 mL DDW, 25 mL di soluzione di ammoniaca al 25% e 25 ml di perossido di idrogeno al 30%. Soluzione posto con i vetrini su una piastra riscaldante a ~ 50 ° C per 30 min e poi asciugare i coprioggetti vetro con azoto.
- coprioggetto Coat prima con una pellicola sottile di cromo (99,999%) del 6 spessore a seguito da uno strato 30 Å di oro (99,999%), utilizzando vapore o deposizione per polverizzazione catodica.
- Per ottenere un tasso di sputtering dello 0,05 - 1 A / s usare una macchina di polverizzazione con 2 e-travi e un sistema di aspirazione di 260 l / s con obiettivo formati 2" e 4" . Utilizzare una fase di rotazione che può andare da 0 - 100 giri al minuto (RPM). Utilizzare una corrente continua (DC) per polverizzazione catodica potenza di 0 - 750 Watt.
- Utilizzare una rotazione di 30 rpm e argon 99,999% per ottenere plasma a pressione 10 mTorr nella camera.
- Azionare l'alimentazione delle pistole sputtering a 40 W di potenza a sputtering DC per il cromo, che porta a ~ 0,12 a / s tasso di copertura, ed a 10 W DC sputtering di potenza per l'oro, che porta a ~ 0,28 a / s.
- Sciogliere 0.1 g di 1-octadecanethiol in 100 mL ABS AR etanolo con ultrasuoni per 30 min. Posizionare Cr-Au coprioggetto rivestiti per 2 h in questa soluzione, poi lavare con AR etanolo ABS e asciugare con azoto.
- Preparare una soluzione di 100 mL di soluzione salina fosfato tamponata Dulbecco (D-PBS) e 3,5 g di un copolimero triblocco (vedere Tabella dei materiali / reagenti) da agitazione per 1 - 2 ore a 600 - 700 rpm. Mettere vetrini nella soluzione per 1 ora. coprioggetto secco con azoto.
- Meccanicamente incidere il modello desiderato graffiando strato bio-rifiuto 22. Fate questo utilizzando un plotter a penna, in cui la penna viene sostituito da un ago di incisione. Graffiare il modello attraverso gli strati metallici per raggiungere il vetro sottostante. Controllare questo processo da un computer per realizzare un disegno desiderato replicato. Modelli formate da questo processo sono dimostrano D in Figura 2 e Figura 3 .
- Preparare uno strato bio-compatibile di 100 ml di D-PBS, di 3,5 g di co-polimero tri-blocco, di 35,7 μL / ml di fibronectina e di 29 μl / ml di laminina.
- Sterilizzare le copertine in luce ultravioletta per almeno 10 min. Incubare le copertine nella soluzione bio-compatibile preparata durante la notte.
NOTA: Lo strato bio-compatibile si forma solo dove lo strato di bio-rifiuto è stato inciso nel passaggio precedente. - Il giorno dopo il lavaggio copre due volte con P-DBS. Incubare coverlips in PM durante la notte. Le coperture sono ora pronte per la placcatura delle cellule.
- Sterilizzare le copertine in luce ultravioletta per almeno 10 min. Incubare le copertine nella soluzione bio-compatibile preparata durante la notte.
- Eseguire la dissezione secondo procedure standard che sono state pubblicate in modo esteso in precedenza 23 , 24 .
- In breve, estrarre ippocampo o corteccia da embrioni di ratto, tipicamente al giorno E19, o da topi, tipicamente al giorno E17 23 ,class = "xref"> 24.
- Separa celle prima in soluzione papaina per 20 - 30 minuti, seguita da triturazione meccanica 24 con pipette di vetro le cui punte sono di fuoco lucido.
NOTA: Se le cellule provenienti da topi geneticamente modificati, quindi il tessuto da ogni embrione deve essere mantenuta in un tubo di plastica da 1,5 ml separato durante l'intero processo. - Contare le celle con trypan blu prima della semina.
NOTA: Per gli animali geneticamente modificati il conteggio dovrebbe essere fatto separatamente per ogni embrione. - Per culture 2D, neuroni di topo seme a 750.000 e ratto neuroni alla 850.000 cellule per pozzetto. Per 1D, sementi a 650.000 cellule per pozzetto. Agitare piastra leggermente subito dopo la semina per garantire una copertura omogenea del coprioggetto.
- Mantenimento delle colture neuronali.
- Preparare cambiamento medio (CM) composto da (per ml):. 0.9 mL MEM + 3G, 0,1 ml HI HS, 10 ml 5-fluoro-2'-deossiuridina (FUDR) con uridina 100x </ Li>
- Preparare mezzo finale (FM) composto (per ml): 0,9 mL MEM + 3G e 0,1 ml HI HS.
- Sostituire PM con 1-1,5 ml CM dopo 4 giorni in vitro (DIV). A 6 DIV, sostituire il 50% del CM con CM fresca. A DIV 8, cambiare il supporto a 1,5 ml FM, seguito da una variazione del 50% di FM ogni 2 giorni. Dopo circa una settimana di attività sincrona spontanea emerge.
- Imaging di attività spontanea o evocata in colture neuronali con coloranti fluorescenti.
- Preparare una soluzione di colorante fluorescente sensibile 50 ug di calcio (vedere Tabella dei materiali / reagenti) in 50 ml di DMSO (dimetilsolfossido).
- Preparare soluzione di registrazione extracellulare (EM) contenente (in mM) 10 HEPES, 4 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2, 139 NaCl, 10 D-glucosio, saccarosio 45 (pH 7,4).
- Incubare colture neuronali in 2 mL EM con 8 ml di soluzione di colorante fluorescente sensibile calcio per 1 h. Proteggere dalla luce e ruotare delicatamente per garantire homogenLa diffusione del colorante alle cellule.
- Sostituire la soluzione con EM fresco prima dell'immagine. La rappresentazione fluorescente è illustrata nella figura 4 .
- Immagine in un microscopio a fluorescenza con filtri ottici per l'imaging di fluorescenza del calcio (picco di eccitazione a 488 nm, picco di emissione a 520 nm), utilizzando una fotocamera e un software in grado di quantificare l'intensità di qualsiasi regione di interesse (ROI) nel campo visivo Il microscopio.
2. Stimolazione elettrica delle culture
NOTA: L'impostazione base per la stimolazione elettrica è mostrata in Figura 1 . Una scivoletta di copertura su cui la coltura neuronale è stata coltivata per circa 14 giorni viene posta in un piatto di Petri sotto un microscopio a fluorescenza. L'attività elettrica dei neuroni viene ripresa utilizzando coloranti sensibili al calcio mentre una tensione viene applicata tramite due coppie di elettrodi da bagno posizionati al di fuori della cultura. Gli elettrodi sono guidati daGeneratore ignale la cui uscita è amplificata da un amplificatore a doppio canale. Il controllo della tensione per la stimolazione è preferito rispetto al controllo di corrente più standard 25 , 26 perché i vettori di campo elettrico sono determinati direttamente, consentendo così l'aggiunta e la combinazione di vettori diretti. Ciò richiede un controllo accurato dell'uniformità del campo elettrico, che può essere eseguito su tutto il campione per il caso del controllo di tensione. Quando si utilizza la tensione, occorre prestare attenzione per evitare eventuali cicli di terra e verificare l'omogeneità del campo elettrico (vedere 2.2).
- Per la stimolazione elettrica con un campo elettrico omogeneo utilizzare un paio di cavi elettrodi paralleli.
- Utilizzare elettrodi in platino con uno spessore dell'ordine di 0,005 '' (127 μm). Se utilizzato con i coperchi da 13 mm, assicurarsi che la distanza tra i due elettrodi sia di circa 11 mm e posizionare l'elettrodos 1 mm sopra la cultura.
NOTA: per rendere il portaelettrodo (Figure 5A e 6A) utilizzare politetrafluoroetilene (PTFE). Forare strette attraverso il PTFE per inserire gli elettrodi. Il dispositivo dovrebbe essere superiore alla soluzione extracellulare in modo che l'estremità superiore, in cui sono esposti gli elettrodi, non verrà mai a contatto con la soluzione. Per l'isolamento, utilizzare colla epossidica su qualsiasi parte dei conduttori di elettrodo che potrebbero essere esposti. - Utilizzare una forma impulso quadrato con un duty cycle del 50%, senza alcuna componente DC per evitare elettrolisi. Variare durata dell'impulso tra 10 ms e 4 ms per causare una stimolazione efficace senza bruciare la cultura. Assicurarsi che l'ampiezza è dell'ordine di ± 22 V (vedi Figura 5). L'impulso quadrato può essere osservato su un oscilloscopio collegato in parallelo agli elettrodi.
NOTA: Per una facile programmazione di qualsiasi forma d'onda desiderata, utilizzare un software di editing della forma d'onda commerciale (vedi elenco Materiali
- Utilizzare elettrodi in platino con uno spessore dell'ordine di 0,005 '' (127 μm). Se utilizzato con i coperchi da 13 mm, assicurarsi che la distanza tra i due elettrodi sia di circa 11 mm e posizionare l'elettrodos 1 mm sopra la cultura.
- Per eseguire il test per il campo di omogeneità usa un elettrodo sonda. Utilizzare una griglia di almeno 1 mm x 1 mm per consentire alla sonda di essere spostato nella zona tra gli elettrodi e misurare il potenziale elettrico.
- Misurare potenziale elettrico. Uso
per calcolare il campo elettrico. Utilizzare uno degli elettrodi come elettrodo di riferimento. Misurare il campo elettrico variabile con durate di impulso tra 100 ms a 4 ms (vedere Figura 5B per un esempio di 100 ms durata dell'impulso) per verificare che il campo sia omogenea all'interno della gamma di durate stimolanti.
NOTA: Vedere Figura 5D per un esempio di un'omogeneità di campo elettrico misurato quando la durata dell'impulso era di 1 ms.
- Misurare potenziale elettrico. Uso
- Usare 2 paia di elettrodi perpendicolari bagno di produrre forme di campo elettrico più complicate, eessere in grado di orientare l'azione nella direzioni diverse (vedi Fig. 6B). Il dispositivo con 2 coppie di elettrodi sarà utilizzato, e si osserverà il segnale su ciascuna coppia di elettrodi su due oscilloscopi separati.
- Posizionare gli elettrodi 1 mm sopra la cultura e ad una distanza di 10 - 11 mm l'uno dall'altro. Assicurarsi che entrambe le coppie di elettrodi sono flottanti (non abbia collegamento a terra), e non hanno alcun terreno comune misurando la resistenza tra ogni gruppo di elettrodi e verificare l'assenza di cortocircuiti tra qualsiasi degli elettrodi. Verificare che tutte le apparecchiature utilizzate, che è collegato agli elettrodi (come gli oscilloscopi, gli amplificatori, i generatori di segnale, ecc) è flottante rispetto a terra verificando che tutte le apparecchiature galleggia e che nessuno dei elettrodi di riferimento sta toccando qualsiasi apparecchiatura a terra.
- Per modificare l'orientamento del campo, variare l'ampiezza della tensione alimentata ai due coppie di elettrodi con rispect tra loro (vedi figura 7A). Ad esempio, per 0 ° uso ± 22 V sul coppia di elettrodi che sono perpendicolari al modello e 0 V per l'altro elettrodo. Il 45 °, utilizzare ± 15,6 V su entrambe le coppie di elettrodi senza il ritardo di fase, per una somma vettoriale ampiezza 15,6 2 15,6 2 = 22 2.
- Per applicare un campo rotante utilizzare un'unica forma d'onda di un impulso di tensione sinusoidale e una singola forma d'onda di un impulso di tensione coseno alle due coppie di elettrodi per produrre un'ampiezza fissa campo elettrico rotante (vedere Figura 6B).
NOTA: Come può essere visto nella figura 6B, quando si utilizza un ciclo di un'onda sinusoidale con ± 22 V in un elettrodo e un ciclo di un'onda coseno con ± 22 V in altro elettrodo, la somma vettoriale è un campo elettrico rotante la durata del ciclo stessi delle onde di seno e coseno, e con un'ampiezza di ± 22 V.
- Per misurare e calcolare ChronAXIe e reobase degli assoni nella cultura neuronale vs dendriti nella stessa cultura effettuare le seguenti operazioni.
- Utilizzare un colorante fluorescente sensibile calcio per l'imaging di calcio come descritto nella tabella dei materiali / reagenti e 1.5) con una cultura 1D modellata sulla sottile (170 um), lungo (10 mm) linee. colorante sensibile calcio sarà applicata alla cultura, e incubata per 45 minuti. Il colorante sarà lavato sostituendo con una soluzione di registrazione fresco.
- Scollegare la rete per ottenere statistiche demografiche della risposta diretta alla stimolazione elettrica, senza l'effetto della trasmissione sinaptica. Per fare ciò, applicare una combinazione di 40 pM di bicucullina, che blocca l'azione inibitoria di gamma-amminobutirrico-A (GABA A) recettori, 10 uM di 6-ciano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione (CNQX) , per bloccare l'α-ammino-3-idrossi-5-metil-4-isoxazolepropionic (AMPA) e kainato e 20 pM di (2R) -ammino-5-phosphonovaleacido ric (APV), che blocca l'N-metil-D-aspartato (NMDA). I bloccanti saranno aggiunti alla soluzione di registrazione.
- Applicare un impulso quadrato come descritto in 2.1 e 2.3 con diverse durate di tempo tra 100 ms e 4 ms. Il segnale può essere osservato sull'oscilloscopio.
- Utilizzare un microscopio a fluorescenza con un programma di acquisizione delle immagini (vedi 1.5) per controllare l'intensità dei transienti di calcio in diversi ROI, ciascuna contenente poche centinaia neuroni. Acquisire le immagini utilizzando una fotocamera EMCCD sensibile (vedi elenco Materials), capaci di un tasso di acquisizione di immagini di almeno 20 fotogrammi al secondo. La variazione di intensità della luce è proporzionale alla quantità di neuroni che sono stati stimolati. Stimare la frazione di neuroni stimolati mediante la variazione relativa di intensità.
- Per ogni durata dell'impulso (100 ms a 4 ms), modificare l'ampiezza della tensione applicata agli elettrodi da una tensione in cui nessun cambiamento di intensità è visto (alcuni volt), a the tensione dove le variazioni di intensità a causa della tensione applicata è saturo (fino a ± 22 V).
NOTA: La modifica intensità sarà distribuito come cumulativo gaussiano 5 rispetto alla tensione applicata per la stimolazione per ogni durata dell'impulso di tensione. - Adattare una distribuzione gaussiana cumulativa per l'intensità contro la tensione applicata per ogni durata ed estrarre la media gaussiana da questa misura.
NOTA: Questo medio è la tensione rappresentativo cui i neuroni risposto. - Al termine di questo processo riceve per ogni durata stimolazione una tensione media a cui i neuroni risposto. Utilizzare queste coppie di durata e forza per tracciare le curve forza-Durata (vedere Figura 7).
per calcolare il campo elettrico. Utilizzare uno degli elettrodi come elettrodo di riferimento. Misurare il campo elettrico variabile con durate di impulso tra 100 ms a 4 ms (vedere Figura 5B per un esempio di 100 ms durata dell'impulso) per verificare che il campo sia omogenea all'interno della gamma di durate stimolanti. 3. Stimolazione Magnetica delle Culture
Nota: La configurazione di base per la stimolazione magnetica è mostrato in Figura 2. In alto a destra è mostratoun microscopio invertito a fluorescenza che è utilizzata per coloranti sensibili immagine calcio nei neuroni. La bobina magnetica (cerchi blu) è posizionata concentricamente circa 5 mm sopra un anello cultura neuronale, (blu contorno). Una bobina di captazione (cerchio rosso) sulla circonferenza del piatto Petri controlla la tensione indotta dal impulsi magnetici. In alto a sinistra è indicata la dinamica di misura della bobina stimolatore magnetico (MS) con un carico tensione del condensatore di 5,000 kV, integrate dalla bobina di captazione. Il campo elettrico indotto (calcolato per un raggio anello di 14 mm) è raffigurato in verde mentre il campo magnetico è rappresentato in blu. Sul fondo sono mostrate immagini della cultura neuronale. In basso a sinistra è un campo immagine luminosa di un modellato coprioggetto 24 mm. Le aree bianche sono i neuroni. Il modello fotografato costituito da culture anulari concentrici con raggi differenti. In basso a destra è uno zoom su un breve segmento degli anelli, che mostra i singoli neuroni. Per una scala, wid gli anelliesimo è di circa 200 micron.
- Crescere i neuroni in un modello anello circolare (inciso come descritto in 1.2.5) per la stimolazione cultura 1D. Utilizzare un colorante fluorescente sensibile calcio per l'imaging del calcio (come descritto nella sezione 1.5) con una cultura 1D modellata sulla sottile (170 um), lungo (10 mm) linee.
- Utilizzare una bobina magnetica circolare e posizionare una piastra di Petri di circa 5 mm al di sotto e concentrici con la bobina. Utilizzare una bobina personalizzata di circa 30 mm (diametro interno, diametro esterno 46 mm) bobina con un'induttanza L = 90 mH azionata da MS artigianali o commerciali caricate con una tensione massima di 5 kV.
- Scaricare una alta tensione e corrente attraverso una bobina condurre mediante un interruttore ad alta corrente ad alta tensione per stimolare magneticamente colture neuronali. Lo stimolatore magnetico (MS) può essere costruito come descritto in 21 utilizzando grandi condensatori, dell'ordine di 100 mF, per ottenere una elevata tensione di 1 - 5 kV. In alternativa, utilizzare un commercialmentedisponibile MS (vedi Tabella dei materiali / reagenti).
NOTA: utilizzare un filo di rame rettangolare rivestito di poliestere 0,254 millimetri di spessore e 6,35 mm per fabbricare una bobina casalingo 21. Girare fili su telai su misura, isolati con fibre di vetro e resina epossidica cast (vedere Tabella dei materiali / reagenti). In alternativa utilizzare bobine disponibili in commercio (vedere Tabella dei materiali / reagenti).
- Utilizzare il campo magnetico rotante per stimolare culture 2D.
- Ora, utilizzare i campi magnetici rotanti per stimolare culture 2D. Fuoco l'TMS senza coltura nel piatto, a diverse intensità, per mostrare la correlazione lineare della lettura bobina con le intensità.
- Successivamente, durante la registrazione di transienti di calcio con una cultura neuronale, iniziare a sparare il TMS ad aumentare di intensità durante la registrazione di entrambi i transienti di calcio e la bobina. Dapprima, raffiche di rete osservati grandi transienti di calcio, shoULD non la sincronizzazione con raccogliere picchi bobina TMS. Continuando per aumentare l'intensità, ad un certo punto, i transienti di calcio iniziano a diventare sincronizzato con le punte TMS. In alternativa, o in aggiunta, dopo aver ottenuto una risposta sincronizzato, comincerà a diminuire le intensità fino sincronizzazione abolita, per determinare la soglia TMS.
Nota: Le condizioni devono essere mantenuti rigorosamente fissati per ciascuna delle impostazioni, utilizzando il volume esatto ogni volta, gli stessi vasi e le posizioni esatte della bobina e orientamenti.- Montare la bobina trasduttrice sulla base del piatto di registrazione in modo che sia in un piano parallelo alla cultura neuronale e in una posizione fissa rispetto alla cultura.
NOTA: Questo assicura che la dipendenza del posizionamento della bobina di captazione rispetto al magnete è fedele alla posizione della cultura e che eventuali discrepanze nel posizionamento sarà trascurabile sulle letture bobina pickup.- Utilizzare due bobine che sono indipendentiposizionati perpendicolari tra loro (figura 8B) per generare un campo elettrico indotto magnetico e rotante. Collegare ogni bobina ai propri MS. Assicurarsi che gli stimolatori scaricano correnti simili in un ritardo di fase di 90 gradi (figura 10A), risultando in un campo magnetico rotante che analizza 270 gradi dello spazio reale in un campo massimo di ~ 270 V / m (Figura 10B).
- Posizionare la coltura neuronale all'interno di un contenitore di vetro sferico riempito con la soluzione di registrazione esterna (EM).
- Monitorare stimolazione (cambiamento di intensità di fluorescenza dei neuroni) con la fotocamera come descritto al punto 2.4.4.
- Nel caso delle bobine incrociate (Figura 8B), posizionare la bobina di captazione parallelo e ad una distanza specifica inferiore alla cultura neuronale. mantenere con attenzione questa configurazione durante gli esperimenti.
- Montare la bobina trasduttrice sulla base del piatto di registrazione in modo che sia in un piano parallelo alla cultura neuronale e in una posizione fissa rispetto alla cultura.
- Calcolare analiticamente il campo elettrico per configura 1Dzione da E max = k 1 Br, dove E max è l'ampiezza massima del campo elettrico indotto ed è diretto lungo la tangente degli anelli con raggio r. B è l'ampiezza dell'impulso magnetico e k 1 è una costante di proporzionalità dimensionale che può essere misurata utilizzando la bobina pickup (Figura 8A).
- Utilizzare un pacchetto di simulazione numerica (vedi elenco Material) per simulare numericamente il campo elettrico 21.
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Representative Results
Il protocollo presentato permette una facile patterning di colture neuronali. Quando è combinato con vari metodi che abbiamo sviluppato per la stimolazione, permette di effettuare misurazioni di alcune proprietà neuroni intrinseci quali chronaxie e reobase 5, per confrontare le proprietà di neuroni sani e malati 27, per trovare il modo ottimale per stimolare culture come funzione di la loro struttura e molti altri nuovi approcci. Alcuni esempi sono presentati nelle prossime figure.
La figura 3 mostra la 1D modellata configurazioni che sono incise nello strato bio-rigetto. Linee sottili di circa 170 micron di larghezza sono tipicamente inscritte che può, per esempio, essere anelli concentrici con un raggio variabile (figura 3A) o linee parallele, tipicamente ~ lunga 11 mm (Figura 3B).
nt" fo: keep-together.within-page = '1'> Il pannello superiore della Figura 4 mostra una tipica immagine di attività fluorescente nella cultura, prelevate mediante accoppiamento di carica (CCD) e che mostra un'immagine di fluorescente neuroni in coltura 2D. in questo esempio vengono mostrati tre differenti ROI, segnate in nero, verde e rosso. integrati tracce di intensità di fluorescenza sono mostrati nella parte inferiore della figura 4, misurato in tre differenti ROI (tracce sono nel colore corrispondente delle ROI). Come mostra incasso, all'interno della risoluzione 200 ms del tempo di acquisizione fotogramma in cui è stata scattata questi dati particolare, tutti i neuroni in tre differenti ROI scoppiano simultaneamente.L'apparecchiatura di base utilizzato per la stimolazione da un campo elettrico costante unidirezionale è mostrato in Figura 5A. I fili elettrodi sono immersi nel supporto di registrazione, di circa 1 mm sopra la coltura neuronale.La forma dell'impulso di base utilizzata per la stimolazione elettrica è mostrato in figura 5B. Quando viene applicato questo impulso di tensione si crea un campo elettrico costante che inverte l'orientamento di 180 ° dopo la metà del ciclo. Il cambiamento di direzione del campo dopo mezzo ciclo viene utilizzato per evitare elettrolisi e danni agli elettrodi. tensioni tipiche applicate agli elettrodi sono ± 22 V, e la durata tipica di impulso per la stimolazione delle culture 2D è dell'ordine di 100 - 500 ms.
Per controllare per qualsiasi anisotropia nella crescita dei neuriti, abbiamo verificato che la stimolazione delle culture 2D è isotropo. Ruotando manualmente gli elettrodi in tutti i 360 ° a risoluzione 15 ° (Figura 5C), si vede che non v'è nessuna preferenza di orientamento per la stimolazione. Ciascun colore in figura 5C rappresenta la stimolazione di una cultura diversa. La distanza dall'origine rappresenta la minima durazione necessaria per stimolazione con un'ampiezza costante. È evidente che, con buona approssimazione, culture 2D non hanno un orientamento preferito per la stimolazione elettrica.
Poiché la singola coppia di elettrodi è limitato ad avere una direzione definita per il campo (anche se può essere capovolto), abbiamo sviluppato un apparato per la stimolazione elettrica con due coppie di elettrodi (Figura 6A). Uno schema della cultura (circolare sfondo grigio, macchie scure sono i corpi cellulari) e degli elettrodi (linee spesse parallele) è mostrato in Figura 6B. Quando le forme d'onda, indicata come inserti blu e verdi in figura 6B, sono coseno e onde sinusoidali e vengono applicati insieme quindi una rotazione E campo vettoriale è prodotto. Quando gli impulsi di tensione sono quadrati, hanno diverse ampiezze e hanno ritardo di fase zero tra loro poi creano un campo costante con l'orientamento desiderato determinato dalla rampiezza elative tra le due coppie di elettrodi. Questa rotazione elettrico è un miglioramento evidente sulla rotazione manuale, meccanico utilizzato per ottenere la distribuzione angolare di forza di stimolazione in figura 5C. Naturalmente, come mostra la Figura 6C, è anche possibile utilizzare questa configurazione per eccitare una sola direzione fissa, possibilmente come controllo, attivando solo una coppia di elettrodi.
Queste configurazioni sono stati usati per eccitare colture neuronali 2D sia con un campo rotante o un campo ad angolo fisso, con la stessa quadratico medio (RMS) tensione e quindi di confrontare la durata dell'impulso necessaria per eccitare la cultura quando l'ampiezza è fisso. Abbiamo scoperto che quando si utilizza un campo elettrico rotante con un'ampiezza costante di ± 22 V, una durata media di 150 ± 14 ms era necessario per raggiungere stimolazione, mentre con un singolo campo elettrico verso una durata media diera necessario 290 ± 30 ms. Il rapporto tra le durate necessari per eccitare la cultura con una rotazione rispetto a un campo ad angolo fisso è quindi 0,53 ± 0,02.
Poiché in una cultura 2D assoni si estendono in tutte le direzioni, il campo di rotazione è in grado di eccitare molti degli assoni. In contrasto, con il campo di orientamento singolo esistono solo pochi assoni orientata dal fatto che l'angolo specifico e eccitazione assonale non viene raggiunta. Quando la durata è aumentata, v'è la possibilità di eccitare altre parti del neurone pure, in particolare i dendriti. Questo è ulteriormente spiegato in seguito nella descrizione delle misurazioni chronaxie. Il fatto che le durate molto più brevi sono necessari per l'eccitazione della stessa cultura quando si utilizza un campo rotante è di grande importanza quando si utilizzano campi esterni per stimolazione cerebrale, poiché ci sono limitazioni spesso tecniche sulle durate di impulso.
Figura 7. In Figura 7A una rete disconnesso 1D viene stimolato con il campo elettrico sia lungo la linea della coltura (a 0 ° per stimolazione assonale) o perpendicolari alla linea della coltura (a 90 ° per stimolazione dendritica) da due coppie di elettrodi. Quando la tensione viene aumentata, più neuroni vengono stimolati, e ciò si riflette dall'influenzaintensità orescence, che è proporzionale al numero di neuroni stimolati (vedere Figura 7B). Crescente ampiezze di tensione sono utilizzati per stimolare gradualmente l'intera cultura. Ciascun neurone ha una tensione di soglia minima (per una determinata durata dell'impulso) che risponde a, e dalla legge dei grandi numeri, la distribuzione di tali soglie dovrebbe essere gaussiana. Pertanto, se si considera il numero di neuroni che hanno risposto e tracciare contro la tensione applicata, la distribuzione sarà una distribuzione gaussiana cumulativa, che è una funzione di errore (FER) 5. Il numero di neuroni che rispondono ad una determinata ampiezza del campo elettrico ha approssimativamente una distribuzione gaussiana, e quindi la fluorescenza viene ben descritto da suo integrale - una funzione di errore dell'ampiezza del campo stimolante (figura 7C).
Figura 7C è usato all'eXtract un parametro, l'aspettativa (media) della distribuzione. Questo viene fatto inserendo una distribuzione gaussiana cumulativa e ottenere la soluzione migliore. Questa attesa è la tensione applicata al quale il 50% delle cellule risponderà. Questo processo viene ripetuto per diverse durate degli impulsi (che vanno da 100 ms a 4 ms). La tensione media a cui la cultura risposto è tracciata contro la durata dell'impulso avere la curva forza-Durata. Sono stati condotti due serie di misurazioni. Nel primo campo è parallelo al modello, e nel secondo era perpendicolare ad esso. È stato precedentemente dimostrato 15, 23 che si allineano con gli assoni modello, mentre dendriti crescono in tutte le direzioni. Questo dà due diverse curve forza-Durata, che sono molto utili per ottenere una chiara differenza tra l'assonale e dendritica eccitazione. La separazione completa ai contributi dendritiche e assonale viene raggiunto grazie al fatto noto che l'assoneLa costante di tempo per l'eccitazione è molto più breve di quella dendritica 2 , 3 , 4 .
Le curve di Forza-Durata sono quindi adatte all'equazione di decadimento di Chronaxie 
, Dove V rh è la tensione Rheobase e C è la Chronaxie. A durate di impulso di t <1ms sono gli assoni che sono prima eccitato e causano il neurone a fuoco, avendo un valore inferiore per la tensione di eccitazione nella curva di Forza-Durata. L'Axonal Chronaxie è stato calcolato per essere 110 μs. Nel contrasto colpito, per l'eccitazione a lunga durata (t> 1 ms) il compartimento dendritico è la sorgente di eccitazione per il neurone con una Chronaxie dendritica calcolata a 900 μs.
I principi alla base della stimolazione delle colture 2D e 1D con cirLa bobina è descritta in Figura 8 . Per ottenere una migliore comprensione della situazione fisica, vengono realizzate simulazioni numeriche dei campi elettrici magnetici e indotti utilizzando il pacchetto COMSOL. Per stimolare le culture 1D, viene utilizzata una bobina magnetica circolare, posizionata concentricamente sopra il piatto di Petri. I neuroni vengono coltivati in anelli circolari su una copertura rotonda posta all'interno del piatto Petri per la registrazione. In questo caso il campo elettrico indotto può essere calcolato analiticamente ed è uguale a E max = k 1 Br , dove E max è l'ampiezza massima del campo elettrico indotto ed è diretta lungo la tangente degli anelli con raggio r . B è l'ampiezza dell'impulso magnetico e k 1 è una costante di proporzionalità dimensionale che può essere misurata usando una bobina di prelievo.
Il calcolo numerico COMSOL del campo magnetico created dalla bobina nella cultura 1D è mostrata nel riquadro superiore di figura 8A (linee di corrente rosso). Nella parte inferiore della figura 8A calcolo viene presentato per il campo elettrico indotto. La stimolazione di una cultura 2D con una configurazione incrociata serpentina è mostrata in Figura 8B. Per stimolare culture 2D una bobina trasversale è stato usato che produce campi magnetici rotanti, disposti con una cultura neuronale 2D suo interno, posto in un contenitore di vetro sferico che viene riempito con mezzo di registrazione (EM). In questo caso il campo elettrico indotto non può più essere calcolato analiticamente. La bobina croce è raffigurata nella parte superiore della figura 8B, con il contenitore sferico inserire all'interno delle due bobine e coprioggetto vetro sostenere la cultura 2D posizionato sul fondo del contenitore. Per scala, il diametro interno della bobina interna è 65 millimetri. Le simulazioni numeriche utilizzando COMSOL con il modello 3D correnti Eddy sono mostrati nel pannello inferiore,Raffigurante il campo elettrico indotto nella superficie interna del contenitore sferico. Un'immagine microscopica a campo luminoso di una copertura in vetro con tipiche culture neuronali 1D usate per la stimolazione è mostrata in Figura 8C . Le linee bianche mostrano i neuroni sulle linee modellate, orientate sia tangenzialmente sia radialmente per il confronto sperimentale e il controllo sull'effetto della direzionalità.
La geometria della cultura 1D svolge un ruolo importante nel determinare se una cultura si spara in risposta alla stimolazione magnetica. Solo il 22% delle culture degli anelli 1D ha risposto alla stimolazione magnetica. Il successo della velocità di eccitazione dipende fortemente dalla lunghezza lineare della cultura e, come mostra la figura 9A , più del 60% delle culture che superano i 80mm rispondono alla stimolazione magnetica. Ciò implica che siano necessarie condizioni speciali per la risposta magnetica. Per indagare su questa cultura di dipendenza geometrica were coltivare in configurazioni che sono parti di anelli - avente lo stesso raggio ma lunghezze diverse da loro modellando su archi piuttosto che su cerchi completi (vedi Figura 8C)
Un'indagine completa delle soglie di campo magnetico in funzione del raggio di culture anello 1D è mostrata in Figura 9B. cerchi bianchi rappresentano misurazioni sperimentali di soglie di stimolazione, mentre la codifica colore indica la probabilità calcolata per misurare una soglia di eccitazione. Una soglia di stimolazione è definito come il campo più debole che provoca ancora una risposta per una data cultura neuronale.
Figura 9B sottolinea la tendenza che gli anelli più grandi hanno soglie di stimolazione inferiori, con una chiara correlazione inversa tra il raggio degli anelli e la soglia di stimolazione. Ad esempio, la media anello 14 millimetri risponde Magnimpulsi etic con ampiezza di 1,5 T mentre l'anello media 7 millimetri risponde solo a 3 T o più. Questo è previsto dal calcolo teorico del campo elettrico indotto, che è rappresentato come un codice colore predetto probabilità al fuoco. Infatti, il campo elettrico indotto da 3T a un raggio di 7 mm è uguale a quello indotto da 1,5 T a due volte il raggio. In sintesi, la soglia media campo elettrico è 301 ± 128 (deviazione standard) V / m, indipendente dal raggio delle culture anello.
In contrasto con la bobina circolare singola, che non poteva suscitare la risposta in culture 2D, 15 su 30 2D culture che sono stati stimolati ruotando campo magnetico stimolazione risposte con scoppio eccitazione neuronale. Le due bobine indipendenti che sono posizionate perpendicolari tra loro (Figura 8B) generano campi elettrici rotanti magnetici e indotti. Ogni bobina è collegata ad un proprio MS, entrambi i quali DischArge correnti simili ad un ritardo di fase di 90 gradi. L'ampiezza del campo elettrico indotto da ciascuna delle due bobine nella configurazione serpentina croce è riportata in Figura 10A, e le stesse tracce sono rappresentati in figura 10B da una rappresentazione polare della direzione e ampiezza del campo elettrico sovrapposto di entrambe le bobine . Il campo elettrico indotto risultante scansiona 270 gradi dello spazio reale in un campo massimo di ~ 270 V / m.
Figura 1: Schema del programma di installazione utilizzato per la stimolazione elettrica di colture neuronali. Il segnale desiderato è prodotto da un generatore di segnali a due uscite che non hanno un terreno comune. Questi segnali vengono amplificati per dare una tensione di uscita fino a ± 30 V. I segnali elettrici vengono alimentati attraverso due coppie separate di elettrodi, stimolando una cultura neuronale in two ortogonale e direzioni indipendenti. La stimolazione dei neuroni può essere visualizzato e monitorato da coloranti di calcio. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Schema del programma di installazione utilizzato per la stimolazione magnetica di colture neuronali. R. In alto è indicata la bobina magnetica (cerchi blu), che si trova 5 mm concentricamente sopra cultura anello neuronale, posto in una capsula di Petri (blu contorno). Una bobina di captazione (cerchio rosso) posizionato sulla circonferenza del piatto Petri misura la tensione indotta dal impulsi magnetici. In fondo le dinamiche misurate della bobina stimolatore magnetico è indicato (usando un carico di tensione condensatore MS di 5,000 kV), come integrato dalla bobina di captazione. campo elettrico indotto (calculatEd per un raggio d'anello di 14 mm) è rappresentato in verde mentre il campo magnetico è rappresentato in blu B. Un microscopio invertito mostra coloranti fluorescenti sensibili ai transitori di calcio dei neuroni che reagiscono agli impulsi magnetici. C. Neuroni coltivati su un modello di anelli concentrici, usati per stimolare efficacemente lo stimolatore magnetico anulare. D. Immagine brillante del microscopio del campo dei neuroni coltivati su una riga del modello. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Esempi di modelli di 1D colture neuronali utilizzate per orientare il campo elettrico con la direzione della crescita asonnale. A. il modello circolare è utilizzato per la bobina magnetica circolare, quando gli ele indotte Il campo ctric ha un orientamento circolare. B. I modelli di linea vengono utilizzati quando il campo elettrico indotto o diretto ha un solo orientamento.
Figura 4: Esempio di tracce di transitori di calcio immagazzinati durante la rottura della rete sincrona. A. Un'immagine di neuroni tinti prima dell'esperimento con un colorante di calcio. B. Tracce di intensità rispetto al tempo dei ROI in A con il colore della traccia che rappresenta il colore del margine del ROI in A. Un forte aumento di intensità sincronizzato nei tre ROI rappresenta una rottura di rete. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Figura 5: Impostazioni di base per la stimolazione elettrica, utilizzando una coppia di elettrodi Bath parallele per determinare che le culture 2D Non abbia orientamento preferenziale di stimolazione elettrica. A. La strumentazione utilizzata per la stimolazione della cultura. Il campo elettrico è prodotto applicando tensione agli elettrodi a filo di platino. La distanza tra i due fili è di 13 mm. B. Un esempio di un segnale di tensione da applicare agli elettrodi a A. La forma bipolare dell'impulso aiuta a prevenire elettrolisi della soluzione di registrazione agli elettrodi. C. Quando stimolando una cultura 2D in diverse rotazioni degli elettrodi, c'è isotropia della risposta neuronale. D. Un esempio di misurazione del campo elettrico usando la sonda descritta nel passaggio 2.2. Il campo elettrico è uniforme ad un errore di fino al 10%. Questo dato è stato modificato da 5.caricare / 54357 / 54357fig5large.jpg" target = '_ blank'> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6: La stimolazione elettrica con due coppie di elettrodi consente la rotazione del campo elettrico e per la stimolazione in qualsiasi angolazione desiderata. A. Per produrre forme più complesse del campo elettrico, sono necessarie due coppie di elettrodi indipendenti. B. L'applicazione di un impulso di tensione a forma di coseno di un elettrodo ed un impulso sinusoidale al secondo elettrodo crea un campo elettrico rotante con ampiezza costante. C. L'applicazione di un impulso di tensione quadrato per una coppia di elettrodi crea un campo elettrico uniforme unidirezionale. Questo dato è stato modificato da 5. Si prega di click qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 7: disconnessione dalla rete bloccando sinaptiche ingressi (come descritto in 2.4.2) permette l'osservazione della popolazione totale di singole cellule che vengono stimolati da un campo elettrico Dato. A. Applicando diverse ampiezze di impulsi di tensione verso le due coppie di elettrodi, il campo elettrico può essere orientata ad ogni angolo, senza la necessità di ruotare manualmente la cultura. Registrazioni B. Esempio di transienti di calcio con stimolazione elettrica con diverse tensioni applicate. Quattro tracce sono mostrati, leggermente spostata in senso verticale per consentire la visione. I valori di tensione sono scritti sotto le tracce blu. C. Quando si applica una durata costante di campo elettrico, il numero di neuroni che il fuoco in risposta al campo elettrico ha un dist cumulativoFunzione ribution (CDF), che è una distribuzione gaussiana cumulativa (o una funzione erf) in funzione dell'ampiezza della tensione (che è proporzionale all'intensità del campo). D. Un esempio di curva forza-Durata ottenuto impiegando questo protocollo. Questo dato è stato modificato da 5. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Configurazione bobina magnetica e il calcolo del campo elettrico indotto. R. In cima è una bobina circolare (cerchi blu) è posizionata 5 mm sopra colture neuronali anello monodimensionali (blu disco). Gli anelli sono paralleli e concentrica con la bobina, che crea un impulso magnetico che è orientata lungo le linee rosse. Di legge di Faraday, il campo elettrico indotto trova su piani paralleli alla bobina insieme anelli concentrici con esso. In fondo è una sezione orizzontale secondo il piano delle culture anello. Il valore relativo del campo elettrico è un colore, con direzione rappresentata dalle frecce. grandi anelli racchiudono un'area maggiore del flusso e quindi il campo elettrico indotto v'è maggiore. B. immagine dello stimolatore trasversale bobina magnetica (in alto) e una simulazione del campo elettrico che è indotta da essa. C. modello utilizzato per la coltivazione neuroni che possono essere stimolate sia con un campo elettrico circolare o un campo elettrico radiale. Questo dato è stato modificato da 21, 28. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 9: Risposta delle Culture anello al campo magnetico. A. Il tasso di successo della stimolazione cresce con il raggio della cultura. Le barre di errore rappresentano l'errore standard (SE). B. Il rapporto tra dimensione dell'anello e intensità del campo magnetico è raffigurato. La probabilità per eccitare la cultura è colore codificato. Infatti eccitazioni di maggior successo culture trovano nella sovrapposizione tra lo spazio sperimentalmente accessibile fase (rettangolo bianco) e la regione di alta probabilità (rosso). Questo dato è stato modificato da 21. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 10: Rotazione magnetico Setup Campo Campo. </ Strong> A. Per indurre un campo elettrico rotante quando si stimola con lo stimolatore magnetico a croce, è necessario un passaggio di fase di 90 gradi tra le due bobine. Viene mostrato il campo elettrico indotto in una bobina di prelievo posizionata su due ali vicine della bobina di foglie di trifoglio. Le bobine sono state guidate separatamente da 2 stimolatori commerciali. B. Una ricostruzione, utilizzando le curve illustrate in A, dell'ampiezza e della direzione del campo elettrico risultante durante un impulso della bobina di foglie di trifoglio. Questa cifra è stata modificata a partire dal 21 , 28 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il pattern di 1D è uno strumento importante che può essere utilizzato per una varietà di applicazioni. Per esempio, abbiamo utilizzato il modello 1D per la creazione di gate logici da culture neuronali 29 e più recentemente per misurare la Chronaxie e la Rheobase dei neuroni ippocampali 5 del ratto e il rallentamento della velocità di propagazione del segnale di attività di cottura nei neuroni ippocampali della sindrome di Down rispetto al Neuroni ippocampali di tipo selvaggio (WT) 27 . Il protocollo suggerito per il patterning 1D è robusto e è facile creare qualsiasi modello desiderato. Si consiglia di osservare la cultura 1D prima delle misurazioni per essere consapevoli di eventuali disconnessioni della rete, che potrebbero influenzare la sua funzione.
Il pattern chimico delle configurazioni neuronali ha una storia distinta 30 , 31 , 32 . Abbiamo scoperto che il nostro approccio resas risultati simili a patterning chimico, eppure sono più robusti e più facili da raggiungere. Recentemente l'opzione per patterning microfluidico neuroni è diventata una interessante alternativa all'approccio proponiamo, con semplicità e facilità di utilizzo 33, 34 comparabile. L'approccio microfluidico è utilizzato nel nostro laboratorio in parallelo con il metodo di incisione descritto qui.
Come abbiamo mostrato 5, culture 2D hanno alcun orientamento preferenziale e la loro stimolazione è isotropo e non dipende dall'orientamento del campo applicato. durate più brevi sono necessari per la stimolazione delle culture 2D quando il campo è in rotazione. Al contrario, culture 1D sono molto dipende dall'orientamento del campo. Quando il campo è orientato con il modello (e quindi con la direzione di crescita assonale), la durata di una ampiezza fissa campo necessaria per la stimolazione è molto più breve rispetto a quando il campo è orientecato perpendicolare al modello. Analogamente, se la durata viene mantenuta costante quindi il campo necessaria per eccitare la coltura è minore se il campo e il modello sono paralleli. Quando stimolando perpendicolarmente, l'impulso campo deve essere molto più lungo (dell'ordine di un millisecondo quando la rete è scollegato), e quindi principalmente dendriti vengono stimolati. Quando si utilizzano campi elettrici (dirette o indotte da un campo magnetico) per la stimolazione del cervello, questo è di estrema importanza. Se l'area del cervello mirati è noto per avere fasci di assoni, questi assoni possono essere eccitati orientando il campo nella loro direzione e quindi bisogno di meno energia o una durata più breve del campo per la stimolazione. Se la regione del cervello target non preferito orientamento, quindi un campo rotante è più efficiente per la stimolazione. Se dendriti sono l'obiettivo della stimolazione, impulsi più lunghi sono più efficaci.
I campi magnetici in grado di stimolare l'attività neuronale quando un impulso magnetico induces un campo elettrico che eccita i neuroni. Poiché impulsi magnetici attualmente ottenibili sono microsecondi di durata, dendriti, il cui tempo di risposta è dell'ordine di millisecondi, non dovrebbero essere sensibili alla stimolazione magnetica. Al contrario, gli assoni, il cui tempo di risposta è più veloce, sono il bersaglio di stimolazione 2, 3. La risposta di assoni all'eccitazione elettrica è massima quando sono paralleli al campo elettrico e diminuisce quando sono perpendicolari ad esso 1, 35; pertanto, in eccitazione magnetica, si impegna a dare sistemi dove il campo elettrico indotto orienta parallelamente agli assoni mirati. Pertanto, quando stimolando un anello 1D, il campo deve essere orientato parallelamente agli assoni, e la dimensione dell'anello determina la soglia per la stimolazione. Simile per la stimolazione diretta da elettrodi bagno, per stimolare una cultura 2D, una rotazione indotta eCampo lectric è molto più efficiente.
La combinazione di pattern di neuroni e di eccitazione esterna con campo elettrico o magnetico è una potente tecnologia con molte possibili applicazioni future. Chronaxie e Rheobase, oltre alla soglia per l'attivazione e per l'attivazione, propagano le dinamiche e le velocità sono tutti parametri che stanno parlando di una proprietà intrinseca della cultura neuronale. In particolare, i trattamenti terapeutici e l'effetto di farmaci o di trattamento farmacologico possono essere immediatamente testati direttamente sui neuroni. Ciò consentirebbe un'efficiente indagine di entrambi i neuroni del modello di malattia e di protocolli per la stimolazione TMS. In una direzione più concettuale, la capacità di stimolare le culture neuronali porta esattamente nuove possibilità per quanto riguarda gli aspetti di elaborazione delle informazioni delle configurazioni neurali e ci consentono di prevedere micro circuiti stampati che combinano la stimolazione elettronica con le reti neuronali viventi per fornire un nuovo calcoloAl dispositivi e dispositivi cerebrali interfacciamento nuovi.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Ofer Feinerman, Fred Wolf, Menahem Segal, Andreas Neef e Eitan Reuveny per molto utili discussioni. Gli autori ringraziano Ilan Breskin e Jordi Soriano per sviluppare le prime versioni della tecnologia. Gli autori ringraziano Tsvi Tlusty e Jean-Pierre Eckmann per aiutare con i concetti teorici. Questa ricerca è stata sostenuta dalla Fondazione Minerva, il Ministero della Scienza e della Tecnologia, Israele, e da parte di Israele Science Foundation grant 1320-1309 e la sovvenzione della Fondazione Bi-National Science 2.008.331.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APV | Sigma-Aldrich | A8054 | Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2 |
| B27 supp | Gibco | 17504-044 | Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| bicuculline | Sigma-Aldrich | 14343 | Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2 |
| Borax (sodium tetraborate decahydrate) | Sigma-Aldrich | S9640 | Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2 |
| Boric acid | Frutarom LTD | 5550710 | Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2 |
| CaCl2 , 1 M | Fluka | 21098 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| CNQX | Sigma-Aldrich | C239 | Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2 |
| COMSOL | COMSOL Inc | Multiphysics 3.5 | Numerical simulation. Mentioned in Section 3.5.2 |
| D-(+)-Glucose, 1 M | Sigma-Aldrich | 65146 | Plating medium, Extracellular recording solution. Mentioned in Sections 1.1.1 and 1.5.2 |
| D-PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Cell Cultures. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6 |
| FCS (FBS) | Gibco | 12657-029 | Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6 |
| Fluo4AM | Life technologies | F14201 | Imaging of spontaneous or evoked activity. Mentioned in Sections 1.5.1, 1.5.3, and 1.5.5 |
| FUDR | Sigma-Aldrich | F0503 | Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1 |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1272 | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| GlutaMAX 100x | Gibco | 35050-038 | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
| Hepes, 1 M | Sigma-Aldrich | H0887 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| HI HS | BI | 04-124-1A | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Sections 1.1.1, 1.4.1, and 1.4.2 |
| KCl, 3 M | Merck | 1049361000 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6 |
| MEM x 1 | Gibco | 21090-022 | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.4.1 1.4.2 |
| MgCl2 , 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| NaCl, 4 M | Bio-Lab | 19030591 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| Octadecanethiol | Sigma-Aldrich | 01858 | Cleaning Cr-Au coated coverslips (1D cultures). Mentioned in Section 1.2.3 |
| Pluracare F108 NF Prill | BASF Corparation | 50475278 | Bio-Rejection Coating, Bio Coating. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6 |
| Poly-L-lysine 0.01% solution | Sigma-Aldrich | P47075 | Promote cell division. Mentioned in Section 1.1.4 |
| Sucrose, 1 M | Sigma-Aldrich | S1888 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
| Thiol | Sigma-Aldrich | 1858 | Bio-Rejection Coating. Mentioned in Section 1.2.3 |
| URIDINE | Sigma-Aldrich | U3750 | Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1 |
| Sputtering machine | AJA International, Inc | ATC Orion-5Series | coating glass with thin layers of metal. Mentioned in Section 1.2.2 |
| Pen plotter | Hewlett Packard | HP 7475A | Etching of pattern to the coated coverslip. Mentioned in Section 1.2.5 |
| Electrodes wires | A-M Systems, Carlsborg WA | 767000 | Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Sections 2.1, 2.2, 2.3, and 2.4.5 |
| Signal generator | BKPrecision | 4079 | Shaping of the electric signal. Mentioned in Section 2.3 |
| Amplifier | Homemade | Voltage amplification of the signal from the signal generator to the electrodes. Mentioned in Section 2.3 | |
| Power supply | Matrix | MPS-3005 LK-3 | Power supply to the sputtering machine. Mentioned in Section 1.2.2.3 |
| Transcranial magnetic stimulation | Magstim, Spring Gardens, UK | Rapid 2 | Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Sections 3.1, 3.3, and 3.4 |
| Epoxy | Cognis | Versamid 140 | Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4 |
| Epoxy | Shell | EPON 815 | Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4 |
| Platinum wires 0.005'' thick; A-M Systems, | Carlsborg WA | 767000 | Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1 |
| Circular magnetic coil | Homemade | Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.3 | |
| WaveXpress SW | B&K Precision | Waveform editing software. Mentioned in Section 2.1.32 | |
| Xion Ultra 897 | Andor | Sensitive EMCCD camera. Mentioned in Section 2.4.4 |
References
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