Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

전기 단일 및 두 개 차원 문화에 자기장을 사용하여 신경 세포의 외부인가 전압

doi: 10.3791/54357 Published: May 7, 2017

Summary

신경 세포의 문화는 하나의 신경 세포에 대한 효과 나 신경 세포의 인구를 통해 새로운 뇌 자극 기술을 연구하는데 좋은 모델입니다. 목욕 전극에 의해 직접 생산 또는 시변 자기장에 의해 유도되는 전계에 의해 패터닝 신경 배양 자극하는 다른 방법들이 여기에 제시 하였다.

Abstract

뉴런은 멤브레인 전위가 특정 임계 값을 초과 할 때 활동 전위를 발화시킵니다. 뇌의 전형적인 활동에서, 이것은 시냅스에 대한 화학 물질 투입의 결과로서 발생합니다. 그러나 뉴런은 부과 된 전기장에 의해 흥분 될 수도 있습니다. 특히 최근의 임상 응용은 외부에서 전기장을 만들어 뉴런을 활성화시킵니다. 따라서 신경 세포가 외부 장에 어떻게 반응하는지 그리고 활동 잠재력을 유발하는 원인을 조사하는 것이 중요합니다. 다행히도, 외부 전기장의 정밀하고 제어 된 적용은 배양에서 절제되고, 해리되고 성장되는 배아 신경 세포에 대해 가능하다. 이를 통해 매우 재현 가능한 시스템에서 이러한 질문을 조사 할 수 있습니다.

이 논문에서는 신경 세포 배양에 외부 전계의 제어 된 적용을 위해 사용되는 기술의 일부가 재검토된다. 네트워크는 1 차원 일 수 있으며, 선형으로 패턴 화 될 수 있습니다R 양식 또는 상기 기판의 전체면 상에 성장시키고, 따라서 이차원. 또한, 음원은 유체 (욕 전극) 또는 자기 펄스 원격 생성을 이용하여 전계를 유도하여 침지 전극을 통하여 전계를 직접 애플리케이션에 의해 생성 될 수있다.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

신경 세포와 외부 전기장 사이의 상호 작용은 근본적인 의미뿐만 아니라 실제 사람이있다. 이 외부인가 전계 조직을 자극 할 수있는 볼타 시대부터 알려져 있지만, 뉴런에서 얻어진 활동 전위의 제조를 담당하는 기전은 최근 4 3 2 1 풀어되기 시작한다. 이 전기장 2, 5에 응답하는 신경 세포의 막전위의 탈분극, 막 특성 및 이온 채널의 역할, 심지어 지역을 유발하는 메커니즘에 관한 질문에 대한 답을 찾는 포함되어 있습니다. 신경 자극 6, 7, 8, 9, 치료

생체 내에서 의 상호 작용을 측정하는 것은 이러한 이해에 중요한 요소를 추가하지만, 두개골 내 측정의 부정확성과 낮은 제어 가능성으로 인해 방해 받는다. 대조적으로, 배양 물에서의 측정은 고정밀, 우수한 신호 대 잡음 성능 및 고도의 재현성 및 제어로 대량으로 용이하게 수행 될 수있다. 문화를 사용하여 집단 네트워크 행동의 다양한 연결 특성을 밝혀 낼 수 있습니다 11 , 12 , 13 , 14 , 15, 16. 마찬가지로,이 또한 제어 시스템 optogenetically 활성 뉴런 17, 18의 광 자극 동안의 채널 개구부 (19)가 활동 전위를 생성 할 책임이 방법, 예를 들면 다른 자극 방법이 작동하는 메커니즘을 해명에 매우 효율적일 것으로 예상된다.

여기에 초점을 효율적으로 외부 전기장을 통해 신경 세포를 자극 수있는 도구의 개발과 이해를 설명에 있습니다. 본 연구에서 우리는 하나 차원 배양 상이한 구성 및 목욕 전극에 의해 직접인가 전계의 방향 및 2 차원의 마지막 자극을 이용하여 자극, 2 차원 일차원 패터닝 해마 배양의 제조를 설명하고 패터닝 시변 전기장을 유도하는 자기장을5, 20, 21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

윤리 문 : 동물 취급을 포함하는 절차는 과학의 와이즈만 연구소의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC), 적절한 이스라엘 법의 원칙에 의거하여 이루어졌다. 와이즈만 연구소 실험 동물 관리 국제 평가 및 인증 협회 (AAALAC)의 인증을 받았으며. 와이즈만 기관 동물 케어 및 사용위원회는 해마 신경 세포와 수행이 연구를 승인했다.

(2D) 2 차원 일차원 (1D) 해마 배양 1. 제조

  1. 2D 문화에 대한 커버 슬립의 준비.
    1. 0.9 mL의 최소 필수 매체 (MEM) + 3G, 0.05 ㎖의 소 태아 혈청 (FCS), 0.05 mL의 열 불 활성화 된 말 혈청 (HI HS) 및 B27 보충제 1 μL : 도금 매체 이루어지는 (PM)을 준비한다. 주 : MEM + 세대 MEM 1 × 500 ㎖마다 위해 포함 겐타 마이신 1 ㎖, 안정화 L 글루타민 100X 5 ㎖ (참조
    2. 200mL의 증류수 (DDW) (60 ℃에서 혼합)와 1.24g의 붕산 (200mL DDW)에 1.9g의 붕사 (sodium tetraborate decahydrate)를 준비한다. 1 M HCl을 사용하여 최종 용액을 pH 8.5로 적정한다. 참고 : 최종 솔루션은 400 ML 0.1 M 붕산염 버퍼입니다.
    3. 65 % 질산에 유리 coverslips을 2 시간 동안 담그십시오. DDW에서 3 번 헹구고 절대 분석 시약 (ABS AR) 에탄올로 3 회 헹구십시오.
    4. 1 - 2 초 동안 분젠 버너의 화염을 통해 각 coverslip을 잠시 통과시킨 후 붕산염 완충액에서 1 : 5로 희석 한 1 mL poly-L-lysine 0.01 % 용액이 들어있는 24 개의 웰 플레이트에서 밤새 배양합니다 ( 0.1 M, pH 8.4). 그런 다음 DDW에서 coverslips를 세 번 헹구고 표준 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 웰 당 1 mL PM으로 밤새 두십시오.
  2. 1D 문화에 대한 coverslips의 준비.
    1. 클린 g75 mL의 DDW, 25 mL의 25 % 암모니아 수용액 및 25 ㎖의 30 % 과산화수소로 이루어진베이스 피라니아 용액에 침지하여 아가씨 커버 슬립. ~ 50 ℃에서 가열 플레이트에 커버 글라스 30 분 후 질소와 커버 글라스를 놓고 건조와 용액.
    2. 제 1 증착 또는 스퍼터 증착을 사용하여 금 (99.999 %)의 30 층 뒤에 6 개 Å 두께의 얇은 크롬 막 (99.999 %), 코트 커버 슬립.
      1. 0.05 스퍼터링 속도 달성하는 -을 1 Å / s 2 전자 빔 진공 타겟 260 리터 / S의 시스템 (2) 크기 "4"인 스퍼터링 장치를 사용한다. 분 (RPM) 당 100 원 - 0에서 갈 수있는 회전 무대를 사용합니다. 750 와트 - 0의 스퍼터 전력 직류 (DC)를 사용합니다.
      2. 30 rpm의 회전을 사용하여 10 mTorr의 챔버 압력에서 플라즈마를 얻을 99.999 %의 아르곤.
      3. 선도의 크롬 DC 스퍼터 전력 W 40 스퍼터링 총 전력 공급을 작동 ~ 0.12 Å / s 범위의 속도 및 10 DC W ~ 0.28 Å / s에 이르는 금 전력 스퍼터.
    3. 30 분 동안 초음파를 사용하여 100 ㎖ ABS AR 에탄올 0.1 g -1- octadecanethiol 녹인다. 다음 에탄올 ABS AR의 건조 질소로 씻어,이 용액에 2 시간 동안 CR-Au로 코팅 된 커버 슬립을 놓는다.
    4. 700 RPM - 600에서 2 시간 - 100 ㎖ 둘 베코 인산염 완충 식염수 (D-PBS) 및 트라이 블록 공중 합체 3.5 g의 용액을 제조 한 교반 (자재 / 시약의 도표 참조). 1 시간 동안 용액에 커버 슬립을 놓는다. 질소로 건조 커버 슬립.
    5. 기계적 바이오 거부 층 (22)에 의해 긁 원하는 패턴을 에칭. 펜이 에칭 바늘로 대체 펜 플로터를 사용하여이를 수행. 하부 글라스에 도달하는 금속 층을 통하여 패턴 스크래치. 복제에 원하는 패턴을 달성하기 위해 컴퓨터에 의해이 처리를 제어한다. 이 공정에 의해 형성된 패턴은 입증되어 도 2 및도 3의 (D).
    6. 100 ㎖의 PBS-D, 3.5 g 트리 블록 공중 합체, 35.7 μL / ㎖ 피브로넥틴 29 μL / ㎖ 라미닌의 생체 적합성 층을 준비한다.
      1. 적어도 10 분 동안 자외선에 커버 슬립 멸균. 제조 된 바이오 호환 솔루션 하룻밤에 커버 슬립을 품어.
        참고 : 바이오 호환 층은 바이오 거부 층이 이전 단계에서 떨어져 에칭 된 경우에만 형성됩니다.
      2. 다음날 세척에 P-DBS로 2 회를 ​​커버 슬립. 하룻밤 오후에 커버 슬립을 품어. 커버 슬립 이제 세포 도금을위한 준비가되어 있습니다.
  3. 이전 23, 24 광범위하게 게시 된 표준 절차에 따라 절개를 수행합니다.
    1. 일반적으로 하루에 E19 쥐 배아에서 간단히 추출 해마 또는 피질에서, 또는 일반적 날 마우스 E17 23,클래스 = "외부 참조"> 24.
    2. 그 팁 화재 연마 유리 피펫으로 기계적 분쇄 한 다음 24 분, 30 - 제 20 파파인 용액에 세포를 해리.
      주 : 다음 세포 유전자 변형 마우스로부터 나오면 각각의 배아 조직이 전체 공정 동안 별도 150 mL의 플라스틱 튜브로 유지되어야한다.
    3. 파종 전에 트리 판 블루 세포를 계산합니다.
      참고 : 유전자 변형 동물의 경우 계수는 각각의 배아에 대해 개별적으로 수행해야합니다.
    4. 물론 당 850,000 세포에서 75 개 쥐의 뉴런에서 2D 문화, 종자 마우스 뉴런하십시오. 1D의 경우, 물론 당 650,000 세포에 씨앗. 커버 슬립의 균일 한 커버리지를 보장하기 위해 약간의 시딩 후 즉시 플레이트를 흔들어.
  4. 신경 문화의 유지.
    1. 중간 길이 (ML 당)으로 이루어지는 (CM) 변경 준비한다. 0.9 ㎖의 MEM + 3G, 0.1 mL의 HI HS 10 μL 딘의 100X와 5- 플루오로 -2'- 데 옥시 우리 딘 (FUDR)를 </ 리>
    2. 0.9 mL의 MEM + 3G 및 0.1 mL의 HI HS : 최종 (ML 당)으로 이루어지는 매체 (FM)을 준비한다.
    3. 체외에서 사일 (DIV) 후 1.5 mL의 CM과 PM을 교체합니다. 6 DIV에서 신선한 CM과 CM의 50 %를 대체합니다. DIV 8에서, 2 일마다 FM의 50 %의 변화에 ​​이어 1.5 ㎖의 FM에 매체를 변경. 일주일 정도 후에 자발적인 동기 활동이 나온다.
  5. 형광 염료와의 연결을 문화에 자발적 또는 유발 된 활동의 영상.
    1. 50 μg의 형광 칼슘 민감 염료 용액을 제조 50 μL DMSO (디메틸 술폭 시드)에 (재료 / 시약의 도표 참조).
    2. 세포 외 기록 용액 (EM) (단위 : mm) 10 HEPES, (4)의 KCl을 함유 준비 CaCl2를 2, 1의 MgCl 2, 139의 NaCl, 10 D 글루코오스, 수크로오스 45 (PH 7.4).
    3. 1 시간 동안 형광 칼슘 민감 염료 용액 8 μL 2 EM 용액에서 배양 신경 세포를 인큐베이션. 빛으로부터 보호하고 부드럽게 homogen을 보장하기 위해 회전세포에 염료의 확산.
    4. 이미징 전에 새로운 EM으로 용액을 교체하십시오. 형광 이미징은 그림 4나와 있습니다.
    5. 시야 내의 관심 영역 (ROI)의 강도를 정량화 할 수있는 카메라와 소프트웨어를 사용하여 칼슘 형광 이미지 (488 nm에서 여기 피크, 520 nm에서 방출 피크)를위한 광학 필터가있는 형광 현미경 이미지 현미경.

2. 문화의 전기 자극

참고 : 전기 자극의 기본 설정은 그림 1나와 있습니다. 신경 세포 배양이 약 14 일 동안 성장한 커버 슬립을 형광 현미경하에 페트리 접시에 둔다. 뉴런의 전기적 활동은 칼슘에 민감한 염료를 사용하여 영상화되는 반면, 전압은 배양 물 외부에 위치한 2 쌍의 욕 전극을 통해인가된다. 전극은 다음과 같이 구동된다.출력이 듀얼 채널 증폭기에 의해 증폭된다 ignal 발생기. 자극 전압 제어 따라서 간단 벡터 덧셈 및 조합을 가능하게 더 기준 전류 제어부 (25), 전계 벡터를 직접 결정하기 때문에 (26) 위에 바람직하다. 이것은 전압 제어의 경우의 샘플 전체에 걸쳐 수행 될 수있는 전계의 균일 성을주의 깊게 검사를 필요로한다. 사용 전압 제어 관리 어떤 접지 루프를 피하기 위해주의해야한다 전계의 균질성을 확인해야하는 경우 (아래 2.2 참조).

  1. 균일 한 전기장과 전기 자극 평행 전극 와이어 쌍을 사용한다.
    1. 0.005 ''(127 μm의) 정도의 두께를 갖는 백금 전극을 사용한다. 13 밀리 커버 슬립으로 사용될 때, 두 전극 사이의 거리가 약 11 mm로되도록, 상기 전극 위치상기의 배양 1mm.
      주 : 전극 홀더 (도 5A6A)을 사용하여 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE)을 확인한다. 전극을 삽입 PTFE 통해 좁은 구멍을 뚫는다. 전극이 노출되는 상단은, 용액과 접촉하지 않도록 장치는 세포 외 솔루션보다 더 높아야한다. 절연 노광 될 수있는 전극 리드의 일부에 에폭시 접착제를 사용한다.
    2. 전기를 피할 수없는 DC 구성 요소와, 50 % 듀티 사이클 사각 펄스 형태를 사용합니다. 문화를 굽기없이 효과적인 자극을 유발하는 10 μs의 4 MS 사이의 기간을 펄스 다릅니다. 진폭이 ± 22 V (도 5 참조)의 순서로되어 있는지 확인. 사각 펄스가 전극에 병렬로 접속 된 오실로스코프에서 관찰 될 수있다.
      참고 : 원하는 파형을 쉽게 프로그래밍, 상업 파형 편집 소프트웨어를 사용하십시오 (재료 목록을 보려면
  2. 전계 균일 성을 테스트하려면 프로브 전극을 사용하십시오. 적어도 1mm x 1mm의 그리드를 사용하여 전극 사이의 영역에서 프로브를 움직여 전위를 측정하십시오.
    1. 전위를 측정하십시오. 용도 방정식 1 전기장을 계산합니다. 전극 중 하나를 기준 전극으로 사용하십시오. 필드가 자극 지속 시간의 범위 내에서 균질하다는 것을 확인하기 위해 100 μs에서 4 ms 사이의 다양한 펄스 지속 시간 (100 μs 펄스 지속 시간의 예는 그림 5B 참조)으로 전기장을 측정하십시오.
      참고 : 펄스 지속 시간이 1ms 일 때 측정 된 전계 균일 성의 예는 그림 5D 를 참조하십시오.
  3. 더 복잡한 전계 형태를 생성하기 위해 2 개의 수직 쌍의 배쓰 전극을 사용하고(도.도 6b를 참조) 다른 방향으로 필드를 배향 할 수. 2 전극 쌍 장치가 사용되며, 각 전극 쌍의 두 개의 신호는 오실로스코프에서 관찰된다.
    1. 서로 11mm - 전극을 상기 배양하고 (10)의 거리에서 1mm의 위치. 두 전극 쌍 (에는 접지가없는) 플로팅되고, 전극들 중 어느 집합 사이의 저항을 측정하고, 전극 중 하나 사이의 단락의 유무를 확인하여 어떤 공통점을 갖고 있지 않은 것을 확인. 확인하여 (등과 오실로스코프, 증폭기, 신호 발생기 등) 전극에 연결되어 사용되는 모든 설비는 접지에 대해 플로팅되고 있는지 확인 모든 장비는 부동과 기준 전극의 어느 것도 터치 없는지 어떤 접지 장비.
    2. 전계 방향을 변경, 입술과 두 전극 쌍에 공급되는 전압의 진폭을 변화서로 pect (도 7a 참조). 예를 들어, 0 °를 사용하여 전극 쌍에 대해 ± 22 V 패턴과 직교하고있는 다른 쪽의 전극에 대한 0 V. 45 °의 경우, 15.6 15.6 (2) 2 = 22 (2)의 진폭의 벡터 합의 경우, 위상 지연이 양 전극 쌍에 15.6 ± V 사용.
    3. 회전 필드 전계 회전 고정 된 진폭을 생성하는 정현파 전압 펄스의 어느 하나의 파형과 전극의 두 쌍 코사인 전압 펄스의 어느 하나의 파형을 사용하여 적용하도록 (도 6b 참조).
      주 : ± 22 한쪽 전극에 V 다른 쪽의 전극에 ± 22 V와 코사인 파의 한 사이클 사인파의 한 사이클을 사용하는 경우도 6b에서 볼 수있는 바와 같이, 벡터 합과 회전 전기 필드 사인 및 코사인 파 동일하고, ± 22 V.의 진폭과주기 기간
  4. 역대을 측정하고 계산하려면동일한 배양 수지상 대 배양 신경 축삭 axie Rheobase 및 다음 단계를 수행한다.
    1. 10mm) 라인 (가늘고 긴 (170 ㎛의 패터닝에 1 차원 배양)과 함께) 재료 / 시약의 표에 기재된 1.5 칼슘 이미징 칼슘 민감한 형광 염료를 사용한다. 칼슘 민감성 염료는 배양에 적용하고 45 분 동안 인큐베이션한다. 염료는 기록 신선한 용액으로 교체하여 세척한다.
    2. 시냅스 전달의 영향없이, 전기 자극에 직접 응답의 인구 통계를 달성하기 위해 네트워크 연결을 해제. 이를 위해, 40 μM bicuculline 블록 감마 - 아미노 부티르산-A의 억제 작용 (GABA A) 수용체의 조합을 적용한 10 6- 시아 노 -7- 퀴녹 살린 -2,3- 디온 μM (CNQX) 상기 α 아미노 -3- 히드 록시 -5- 메틸 -4- isoxazolepropionic (AMPA)과 발생한 kainate 수용체 및 (2R)의 20 μM 아미노 -5- phosphonovale을 차단RIC 산 (APV)하는 블록 N- 메틸 -D- 아스파 테이트 (NMDA) 수용체. 차단제는 기록 액에 첨가된다.
    3. 100 μS 4 개 단말 사이의 지속 시간을 가변으로 2.1 및 2.3에 기술 된 바와 같이 사각형 펄스를인가. 신호는 오실로스코프에서 관찰 할 수있다.
    4. 여러 로아에서 칼슘 과도의 강도를 모니터링하기 위해 (1.5 참조) 이미지 수집 프로그램을 형광 현미경을 사용하여 몇 백 뉴런을 포함하는 각. 적어도 초당 20 프레임의 영상 획득 속도 가능한 EMCCD 민감한 카메라를 사용하여 이미지 (자재 목록 참조) 획득. 빛의 강도의 변화는 자극 하였다 뉴런의 양에 비례한다. 상대 강도의 변화를 자극하여 신경 세포의 비율을 추정한다.
    5. 각 펄스 기간 (4 MS 100 μS)의 경우, 강도에 변화 (몇 볼트) 보이지 않는 전압에서 시작하는 전극에인가되는 전압의 진폭을 변경 토륨(22 V 최대 ±) 때문에,인가 전압의 강도의 변화가 포화 전압 E있다.
      주 : 강도 변화는 전압 펄스 각각의 지속 시간에 대한 자극인가 전압에 대한 누적 가우시안 5로 배포한다.
    6. 각 기간에 대한인가 전압 대 강도의 누적 가우스 분포에 맞는이 맞는에서 가우스 평균을 추출한다.
      참고 :이 평균은 신경 세포가 반응하는에 대표 전압이다.
    7. 이 프로세스의 마지막에있는 신경 세포가 반응하는 각 자극 동안의 평균 전압을 얻었다. 힘 - 시간 곡선을 플롯 기간과 강점이 쌍을 사용합니다 (그림 7 참조).

문화의 3. 자기 자극

주 : 자기 자극의 기본 설정이도 2에 도시되어있다. 오른쪽 상단에 표시됩니다뉴런의 영상 칼슘에 민감한 염료로 사용되는 거꾸로 형광 현미경. 자기 코일 (청색 원)가 동심 링 신경 배양 (청색 윤곽)보다 약 5mm에 위치된다. 페트리 접시의 외주에 픽업 코일 (적색 원)의 자기 펄스에 의해 유도 된 전압을 모니터한다. 픽업 코일로부터 집적 같이 왼쪽 상단 5000 kV의 커패시터의 전압 부하와 자기 자극기 (MS) 코일의 측정 동력학을 나타낸다. 자기장은 청색에 도시 된 상태 (14mm의 링 반경 계산)에 유도 전기장이 녹색으로 도시되어있다. 하단에있는 신경 세포 문화의 이미지를 표시됩니다. 왼쪽 하단 패터닝 24 mm의 커버 슬립의 야상이다. 흰색 영역은 뉴런이다. 촬영 패턴은 서로 다른 반경 동심 링 문화로 구성되어 있습니다. 오른쪽 하단에서 개별 뉴런을 보여 반지의 짧은 세그먼트 상으로 크게된다. 규모를 들어, 고리 '떨어 졌th는 약 200㎛이다.

  1. 1D 문화 자극에 대한 원형 링 패턴 (1.2.5에 설명 된대로 에칭)에서 뉴런을 성장. 얇은 (170 μm), 길이가 긴 (10 mm) 라인에 패턴 화 된 1D 배양 물을 사용하여 칼슘 이미징 (1.5 절에서 설명)에 칼슘 민감 형광 염료를 사용하십시오.
    1. 원형 마그네틱 코일을 사용하고 페트리 접시를 코일과 대략 동심 5mm 아래에 위치시킵니다. 최대 전압이 5 kV 인 수제 또는 상업용 MS로 구동되는 인덕턴스가 L = 90 mH 인 약 30 mm (내경, 46 mm 외경) 코일의 맞춤 코일을 사용하십시오.
    2. 고전류 - 고전압 스위치를 사용하여 전도성 코일을 통해 고전압 및 전류를 방출하여 신경 세포 배양을 자기 자극합니다. 자기 자극기 (MS)는 1 ~ 5 kV의 고전압을 얻기 위해 100 mF 정도의 커다란 커패시터를 사용하여 21에 설명 된대로 제작할 수 있습니다. 또는 상업적으로 사용하십시오.가능한 MS (참조 재료 / 시약 표).
      주 : 제 코일 (21)을 제조하기 위해 0.254 mm 두께 6.35 mm 폭 폴리 에스테르 코팅 직사각형 구리 와이어를 사용한다. 에폭시 유리 섬유 캐스트 절연 주문품 프레임에 와이어를 켜고 (자재 / 시약의 도표 참조). 또는 (재료 / 시약의 표 참조) 상업적으로 이용 가능한 코일을 사용합니다.
  2. 2D 문화를 자극하는 자기장을 회전합니다.
  3. 이제 2D의 문화를 자극하는 회전 자기장을 사용합니다. 강도와 코일 독서의 선형 상관 관계를 보여주고, 다른 강도에서 접시에 어떤 문화와 TMS 화재.
  4. 뉴런 배양 칼슘 과도 녹화 중 다음에, 칼슘, 과도 코일 모두를 기록하면서 강도 증가에 TMS 소성 시작. 먼저, 네트워크 버스트 SHO 큰 칼슘 과도 관찰uld가 코일 TMS 스파이크를 집어 올리는 것과 동기화되지 않습니다. 강도를 계속해서 증가 시키면 어느 시점에서 칼슘 과도 현상이 TMS 스파이크와 동기화되기 시작합니다. 대안으로, 또는 추가적으로, 동기화 된 응답을 달성 한 후, 동기화가 폐지 될 때까지 강도를 감소시켜 TMS 임계 값을 결정할 수있다.
    참고 : 매번 정확한 볼륨을 사용하여 동일한 용기와 정확한 코일 위치 및 방향을 사용하여 각 설정에 대해 조건을 엄격하게 고정해야합니다.
    1. 기록 접시의 바닥에 픽업 코일을 장착하여 그것이 연결 문화와 평행 한 평면에 있고 문화와 관련하여 고정 된 위치에 있도록하십시오.
      참고 : 이것은 자석에 대한 픽업 코일의 위치의 의존성이 배양체의 위치에 충실하고 포지셔닝의 불일치가 픽업 코일 판독 값에서 무시할 수 있음을 보장합니다.
      1. 두 개의 독립적 인 코일을 사용하십시오.서로 수직 위치 (도 8b)은 회전 자기장과 유도 전기장을 생성한다. 자신의 MS에 각각 코일을 연결합니다. 자극제가 ~ 270 V / m의 최대 필드 (도 10b)에, 실 공간의 270도 스캔 회 전자계 결과 90 ° (도 10a)의 위상 지연에 유사한 전류를 토출하는 것이 확인.
      2. 외부 기록 용액 (EM)로 채워진 구면 유리 용기 내에 신경 배양을 위치.
      3. 단계 2.4.4에서 설명 된 바와 같이 카메라 자극 (뉴런의 형광 강도의 변화)를 모니터링.
      4. 크로스 코일 (도 8B)의 경우에는, 픽업 코일과 평행하게 위치시키고 신경 배양 아래 특정 거리. 조심스럽게 실험에 걸쳐이 구성을 유지한다.
  5. 분석적 1 차원 형 구성에 대한 전기장을 계산E는 최대 유도 전기장의 최대 진폭이고 반경 (r)을 가진 링의 접선을 따라 지향 E 최대 K = 1 브롬에 의해 기. B는 자기 펄스의 진폭이고, k (1)는 픽업 코일 (도 8A)를 이용하여 측정 할 수있는 치수의 비례 상수이다.
  6. 수치 전기장 (21)을 시뮬레이션 수치 시뮬레이션 패키지를 (자료 목록을 참조)를 사용합니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

제시된 프로토콜은의 연결 문화의 쉬운 patterning 수 있습니다. 우리가 자극을 위해 개발 한 여러 가지 방법과 결합되면 Chronaxie 및 Rheobase 5 와 같은 일부 고유 신경 세포 특성을 측정하고 건강한 사람과 질병이있는 뉴런의 특성을 비교하고 문화를 자극하는 최적의 방법을 찾기 위해 사용할 수 있습니다. 그들의 구조와 더 많은 새로운 접근 방식을 제공합니다. 몇 가지 예가 다음 그림에 나와 있습니다.

그림 3 1D 패턴 구성은 바이오 거부 레이어로 에칭된다. 약 170 μm 너비의 얇은 선은 전형적으로 다양한 반경 ( 그림 3A ) 또는 평행선, 일반적으로 길이가 ~ 11 mm 인 동심원 고리가 될 수 있습니다 ( 그림 3B ).

NT "FO : 킵 together.within 페이지는 ="1 ">도 4의 상단 패널에 표시된 전형적인 전하 결합 소자 (CCD)로 촬영 배양 형광 활성의 화상과 형광의 이미지를 보여주는 도시 2 차원 배양 신경. 세 가지의 ROI가 표시되는 예에서는, 흑색, 녹색과 빨간색. 통합 형광 강도 흔적으로 표시된 이들 세 가지의 ROI 측정도 (4)의 바닥 판에 나타낸다 (미량의 해당 색상에 ROI 영역)의. 인셋에서 보듯이 특별한 데이터가 촬영 된 때의 프레임 획득 시간의 200 밀리 초 해상도 내에서 ROI를 세 가지의 모든 신경 세포가 동시에 버스트.

단방향 일정한 전계에 의한 자극에 사용되는 기본 장치는도 5a에 도시된다. 전극 와이어는, 상기 기록 매체에 상기 배양 신경 약 1mm를 담근다.전기 자극에 사용되는 기본 펄스 형상은도 5b에 도시된다. 이 전압 펄스가인가 될 때의주기의 절반 후에 180도 방향을 뒤집 일정한 전기장을 생성한다. 반주기 후 전계 방향의 변화는 전극에 전기 및 손상을 방지하기 위해 사용된다. 전극에인가 전형적인 전압은 ± 22 V이고, 2 차원 배양의 자극의 일반적인 펄스 지속 시간 (100)의 순서 인 - 500 μS.

신경 돌기의 성장에 어떤 이방성를 통제하기 위해, 우리는 2D 문화의 자극이 등방성 확인했습니다. 수동 15 ° 해상도 모두 360 °의 전극을 회전하여 (도 5c)은 그 자극에 대한 방향의 어떠한 선호도가없는 것을 알 수있다. 도 5c에 각각 색이 다른 문화의 자극을 나타낸다. 원점에서의 거리가 최소 뒤를 나타낸다사료는 일정한 진폭으로 자극이 필요했다. 좋은 근사치로, 2D 문화가 전기 자극에 대한 선호 방향이없는 것을 알 수있다.

전극의 단일 쌍 (이 대칭 될 수 있지만) 필드에 대해 하나 개의 정의 된 방향을 갖는 한정되어 있기 때문에, 우리는 두 쌍의 전극 (도 6a)와 전기 자극 장치를 개발했다. 배양의 개략 (회색 원형 배경이 어두운 반점 세포체이다) 및 전극 (병렬 굵은 선)으로도 6b에 도시된다. 도 6b에서, 청색 및 녹색 인서트로 나타낸 파형은 사인파와 코사인이며 회전 E 벡터 필드가 생성되는 다음 함께 적용될 때. 전압 펄스가 사각형 인 경우, 서로 다른 진폭을 가지고 있고이 R에 의해 결정되는 소정 방향으로 일정한 필드를 생성 한 후 그 사이에 제로 위상 지연을전극이 두 쌍 사이 elative 진폭. 이 회전 전기는도 5c에 자극 강도의 각도 분포를 얻기 위해 사용 된 수동 기계식 회전 위에 명백한 개선이다. 도 6C와 같이 물론, 이는 전극의 한 쌍을 활성화하여, 제어 가능한 바와 같이 하나의 고정 된 방향으로 자극이 구성을 사용하는 것도 가능하다.

이러한 구성은 의미 동일한 루트로, 회전 필드 또는 고정 된 각도 필드 중 하나에 평방 (RMS) 전압을 2 차원의 연결을 문화를 자극하는 데 사용 된 후 진폭이 고정되면 문화를 자극하기 위해 필요한 펄스 지속 시간을 비교. 우리는 ± 22 V, 150 ± 14 μS의 평균 지속 기간의 일정 진폭으로 회전 전계를 사용할 때 자극을 달성하기 위해 필요한 것을 발견 동안 한 방향으로 전계의 평균 지속 기간과290 ± 30 μS가 필요했다. ㄱ 고정 각 필드에 비해 회전하는 흥미로운 배양에 필요한 지속 기간 사이의 비율은 따라서, 0.53 ± 0.02이다.

2 차원 문화 축삭은 모든 방향으로 확장하기 때문에, 회전 필드는 축삭의 대부분을 자극 할 수 있습니다. 대조적으로, 단일 방향 필드에 특정 각도로 지향 축삭 여기가 달성되지 않은 경우에만 몇 축삭있다. 지속 시간이 증가되면, 수상 돌기 특히뿐만 아니라, 신경 세포의 흥분 다른 부분의 가능성이있다. 이것은 상기 Chronaxie 측정을 설명하기에 설명한다. 펄스 지속 시간에 종종 기술적 인 한계가 있기 때문에, 뇌 자극에 대한 외부 필드를 사용하는 경우 회전 필드를 사용하면 훨씬 더 짧은 기간이 같은 문화의 여기에 필요한 사실은 높은 중요하다.

그림 7에 표시됩니다. 도 7a에서, 1D 끊긴 네트워크는 문화 연선 (수지상 자극을 90 °에서) 배양의 라인 또는 수직 (축삭 자극 0 °에서)의 2 세트의 전극에 의해 하나의 전기장 자극된다. 전압이 증가함에 따라 더 많은 뉴런이 자극되고, 이는 독감에 의해 반사되어신경 자극의 수에 비례 orescence 강도 (도 7b 참조). 증가 전압 진폭은 점차 전체 문화를 자극하는 데 사용됩니다. 각 신경 세포는 응답 것 (특정 펄스 폭에 대한) 최소 임계 전압을 가지고 있으며, 많은 수의 법칙에 의해, 이러한 임계 값의 분포는 가우스가 될 것으로 예상된다. 우리는 반응 뉴런의 수를보고인가 전압에 대해 플롯하는 경우를 따라서 분포는 에러 함수 (ERF) 5 누적 가우스 분포 될 것이다. 전계 특정 진폭 응답 뉴런의 수는 대략 가우시안 분포를 가지며, 따라서 형광도 적분하여 그 설명 - 자극 필드 (도 7C)의 진폭의 오차 함수.

도 7c 내지 E 사용xtract는 하나 개의 파라미터, 기대가 분포 (평균). 이것은 누적 가우스 분포를 피팅하고 가장 적합한을 획득하여 수행됩니다. 이 예상은 세포의 50 %에 대응되는인가 전압이다. 이 프로세스 (100 μS 4 밀리 초 범위) 여러 펄스 지속 시간 동안 반복된다. 배양은 대응되는 평균 전압은 강도 - 시간 곡선을 얻기 위해서 펄스 폭 대 도시된다. 측정 두 세트의 수행 하였다. 최초의 필드는 패턴에 평행이고, 상기 제에 그것과 직교 하였다. 수상 돌기는 모든 방향으로 성장하면서는 이전에, 15, 축삭 패턴으로 정렬 (23)을 보였다. 이것은 축삭과 수상 돌기 여기 사이에 명확한 차이를 얻기위한 매우 유용한 두 개의 서로 다른 강도 - 시간 곡선을 제공합니다. 수지상 및 축삭의 기여에 전체 분리가 축삭은 그 알려진 사실에 의해 달성된다여기에 대한 시간 상수는 수지상 인 2 , 3 , 4 보다 훨씬 짧다.

Strength-Duration 곡선은 Chronaxie decay 방정식에 적합합니다 등식 2 여기서 V rh 는 Rheobase 전압이고 C는 Chronaxie입니다. t <1ms의 ​​펄스 지속 시간에서 그것은 먼저 자극되어 신경 세포를 발화시키는 축삭이고 강도 - 지속 시간 곡선에서 여기 전압에 대한 값은 더 낮습니다. Axonal Chronaxie는 110 μs로 계산되었다. 현저한 대조적으로, 장시간의 자극 (t> 1ms)에서 수상 돌기 구획은 900μs에서 계산 된 돌기 Chronaxie를 갖는 뉴런에 대한 여기 원입니다.

2 차원 및 1D 문화를 자극하는 기본 원리는cular 코일은도 8에 설명된다. 실제 상황의 더 나은 이해를 얻기 위해, 자기와 유도 전기장의 수치 시뮬레이션은 COMSOL 패키지를 사용하여 생산됩니다. 동심 페트리 접시 위에 위치 원형 자기 코일이 사용되는 1 차원 배양을 자극. 뉴런 기록 용 페트리 접시 내에 배치 된 원형의 원형 링 커버 슬립에서 배양된다. 이 경우에 유도 전기장이 분석적으로 계산 E는 최대 유도 전기장의 최대 진폭이고 반경 (r)을 가진 링의 접선을 따라 지향 E 최대 K = 1 브롬, 요오드와 동일 할 수있다. B는 자기 펄스의 진폭이고, k (1)는 픽업 코일을 사용하여 측정 할 수있는 치수의 비례 상수이다.

자기장 (C)의 수치 계산 COMSOL1 차원 배양의 코일 reated도 8A (적색 유선)의 상부 패널에 도시되어있다. 도 8a의 하부 패널의 계산은 유도 전기장을 위해 제공된다. 교차 코일 형태를 갖는 2 차원 배양의 자극은도 8b에 도시되어있다. 크로스 코일 기록 매체 (EM)로 채워진다 구형 유리 용기에 넣고 그 안에 차원 신경 배양 위치 자계 회전 생산하고 사용 된 2 차원 배양을 자극. 이 경우에 유도 전기장은 더 이상 분석적으로 계산 될 수 없다. 크로스 코일은 2 개 개의 코일 및 상기 용기의 바닥에 배치 된 2 차원 배양을지지하는 유리 커버 슬립 내에 배치 구면 용기와도 8b의 상단 패널에 도시되어있다. 스케일의 경우, 내부 코일의 내경은 65mm이다. 와전류 3D 모델과 COMSOL을 사용하여 수치 시뮬레이션, 하단 패널에 표시됩니다구면 용기의 내면에 유도 된 전계를 묘사. 자극에 사용되는 전형적인 1D 신경 배양 유리 커버 슬립의 명 시야 현미경 이미지는도 8c에 도시되어있다. 백색 라인은 방향성의 영향에 대한 실험과 비교 제어 방사상 모두 접선 방향으로 배향되고, 상기 패터닝 된 라인에 신경을 나타낸다.

1 차원 문화의 기하학은 문화가 자기 자극에 반응 발생 여부를 결정하는 데 큰 역할을한다. 1 차원 환 배양은 22 %의 자기 자극에 반응. 성공적인 여기 속도는 강하게 문화의 직선 길이에 의존하고, 그림 9A 쇼로, 자기 자극에 이상 80mm 응답 있습니다 문화의 60 % 이상. 이 특별한 조건이 자기 반응에 필요한 것을 의미한다. w이 기하학적 의존 문화를 알아보고자감수는 고리의 일부이다 구성 성장 - 오히려 완전한 원에 비해 호에이를 패터닝함으로써 동일한 반경하지만 서로 다른 길이를 갖는 (도 8C 참조)

1D 링 배양의 반경의 함수로서 임계 자기장의 광범위한 조사는도 9b에 도시된다. 컬러 코딩이 여기 임계 값을 측정하는 확률 계산을 나타낸다 동안 백색 원은, 자극 임계 실험 측정치를 나타낸다. 자극의 임계치는 여전히 주어진 신경 배양 응답을 이끌어 약한 필드로 정의된다.

도 9B는 링의 반경과 자극 임계치 사이에 명확한 역 상관이 큰 링 하부 자극 임계 값을 갖는 경향을 강조한다. 예를 들어, 평균 14mm 링에 응답 MAGN1.5 T의 펄스 진폭 etic 평균 7mm 링 만 T 이상의 3 응답있다. 이것은 코딩 된 컬러 화재의 가능성을 예측하는 것으로 도시되는 유도 전기장의 이론적 계산으로부터 예상된다. 실제로, 7mm의 반경 (3T)에 의해 유도되는 전기장이 반경 2 배에서 1.5 T에 의해 유발 된 것과 동일하다. 요약하면, 평균 임계 전기장 링 배양 반경 독립적 301 ± 128 (표준 편차)의 v / m이다.

계자 자극의 회전에 의해 자극 하였다 (30 명) 2 차원 배양의 15 신경 자극 붕괴와 반응, 2 차원 배양의 반응을 유도 할 수없는 단일 원형 코일 대조적. 서로 (도 8b)에 수직으로 위치하는 두 개의 독립적 인 코일과 자기 유도 전기장을 생성하는 회전. 각 코일은 DISCH 둘 다 자신의 MS에 연결되어90 °의 위상 지연에 유사한 전류 아게. 크로스 코일 형상으로 2 개 개의 코일 각각에 의해 유도 된 전기장의 진폭은도 10a에 도시된다와 같은 흔적은 모두 코일의 중첩 된 전기장의 극성 방향의 표현과 진폭에 의해도 10b에 나타낸다 . 얻어진 유기 전계 ~ 270 V / m의 최대 필드를 실 공간의 270도 스캔한다.

그림 1
그림 1 : 신경 세포 배양의 전기 자극에 사용되는 설정의 도식. 원하는 신호는 공통 접지가없는 두 개의 출력의 신호 발생기에 의해 생성된다. 이러한 신호는 TW에서 배양 신경을 자극하는 전기 신호는 다음의 두 개의 전극 쌍을 통해 공급되는 30 V. 최대 ± 출력 전압을 제공하기 위해 증폭되는O에 직교하는 방향과 무관. 신경의 자극은 볼 칼슘 염료에 의해 모니터링 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : 신경 세포 배양의 자기 자극에 사용되는 설정의 도식. 상단 A.는 페트리 접시 (블루 윤곽)에 배치 된 링 신경 배양 이상 5mm 동심있는 자기 코일 (청색 원)를 도시한다. 페트리 접시의 주위에 배치 된 픽업 코일 (적색 원)의 자기 펄스에 의해 유도 된 전압을 측정한다. 픽업 코일로부터 집적 같이 하단에서 자기 자극기 코일의 측정 역학 (5000 kV의 MS의 캐패시터 전압의 부하를 사용하는) 도시되어있다. 유도 전기장 (calculat자기장이 푸른 B. 거꾸로 현미경 이미지에서 자기 펄스에 반응하는 신경 세포의 칼슘 과도 성 염료 형광등 도시 동안 14mm의 링의 반경)에 대한 ED 녹색으로 도시되어있다. C. 뉴런 링 자기 자극에 의한 효과적인 자극을 위해 사용, 동심원 패턴에 성장. 뉴런의 D 브라이트 필드 현미경 이미지 패턴의 한 줄에 성장. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : 축삭 성장의 방향으로 전기장을 정위에 사용 1D 신경 세포 문화의 패턴의 예. A. 원형 패턴은 원형 자석 코일의 유도에 사용되는 ELE ctric 필드는 원형 방향을 갖는다. 유도 또는 직접 전계 단일 배향을 갖는 경우 B. 라인 패턴이 사용된다.

그림 4
그림 4 : 동기식 네트워크 버스트 동안 몇 군데 칼슘 과도의 예 흔적. A. 칼슘 염료 실험에 이전 염색 된 신경 세포의 이미지입니다. B. 네트워크 버스트를 나타낸다 A.에서 ROI 세 개의 ROI 내에 동기화 강도의 큰 증가의 테두리의 색을 나타내는 추적의 색 A의 ROI 영역의 강도 대 시간의 흔적. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

54357fig5.jpg "/>
그림 5 : 전기 자극에 대한 기본 설정, 병렬 목욕 한 쌍의 전극을 사용하여이 2D 문화는 전기 자극의 더 선호하는 방향이 없다고 확인합니다. 배양에 사용 A. 자극 장치. 전계는 백금 와이어 전극에 전압을인가함으로써 생성된다. 두 개의 와이어 사이의 거리는 13 mm이다. 전압 신호의 B. 예에서는 바이폴라 펄스의 형상은 전극에서의 기록 액의 전기 분해를 방지 A.의 전극에인가된다. 전극의 상이한 회전에서의 2 차원 배양을 자극하면 C.는 신경 반응의 등방성이있다. D. 단계 2.2에서 기술 된 프로브를 사용하여 전계 측정의 예. 전계는 최대 10 %의 오차로 균일하다. 이 그림은 5에서 수정되었습니다./ 54,357 / 54357fig5large.jpg "대상 ="_ 빈 "을 업로드>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
그림 6 : 전기 자극 전극의 두 쌍은 전기장의 회전과 원하는 각도에서 자극을 허용합니다. 전기장의 더 복잡한 형상을 생산 A., 두 개의 독립적 인 전극 쌍이 필요하다. B. 하나 개의 전극에 전압 형 코사인 펄스를인가하고 제 2 전극에 사인파 펄스는 일정한 진폭을 가진 회전 전기 필드를 생성한다. 전극의 한 쌍의 단방향 균일 한 전기장을 생성에 C.는 사각 전압 펄스를인가하는 단계를 포함한다. 이 그림은 5에서 수정되었습니다. 카스티하세요이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7
그림 7 : 시냅스 입력을 차단하여 네트워크 단절 (2.4.2에서 설명) 주어진 전기장에 의해 자극되는 단일 세포의 총 개체 수를 관찰 할 수 있습니다. A. 두 쌍의 전극에 서로 다른 진폭의 전압 펄스를 적용하여 수동으로 배양 물을 돌릴 필요없이 모든 각도로 전 향할 수 있습니다. B. 서로 다른인가 된 전압에서 전기 자극이있는 칼슘 과도 전류의 기록 예. 네 개의 흔적이 보이고 수직으로 약간 기울어 져 보여집니다. 전압 값은 파란색 트레이스 아래에 기록됩니다. C. 일정한 전계 지속 기간을 적용 할 때, 전계에 반응하여 발사 할 뉴런의 수는 누적 거리ribution 기능 (전계 강도에 비례)의 전압의 진폭의 함수로서 가우스 분포의 누적 (또는 ERF 함수)이다 (CDF). D.이 프로토콜을 이용하면서 얻어진 강도 - 시간 곡선의 예. 이 그림은 5에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8
그림 8 : 자기 코일의 구성과 유도 전기장의 계산. 상단 A. 한 차원의 연결 고리 배양 이상 5mm에 위치하는 원형 코일 (청색 원) (블루 디스크)이다. 고리는 빨강 라인을 따라 배향되어 자기 펄스를 생성하는 코일과 평행 동심이다. 으로 패러데이의 법칙은 유도 전기장은 동심 고리를 따라 코일에 평행 한 평면에 놓여있다. 하단 배양 링의 평면을 따라 수평 단면도이다. 전계의 상대 값은 화살표로 도시 된 방향으로, 컬러 코딩된다. 큰 고리 광속의 큰 영역을 둘러싸고 따라서, 높은 전계가 유도. 크로스 코일 자기 자극기 (위)과에 의해 유도되는 전계 시뮬레이션 B. 이미지. 원형 또는 전계 방사 전계 어느 자극 할 수 신경 성장 사용 C. 패턴.수치는, 28 (21)로부터 변형되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

9 "SRC ="/ 파일 / ftp_upload / 54357 / 54357fig9.jpg "/>
그림 9 : 자기장에 링 문화의 응답. A. 자극의 성공률은 문화의 반경 성장한다. 오류 막대는 표준 오차 (SE)를 나타냅니다. 링의 크기와 자계 강도의 B. 관계가 도시되어있다. 문화를 자극 할 수있는 확률은 색상 코드입니다. 실제로 문화의 가장 성공적인 기진는 실험적 접근 위상 공간 (흰색 사각형)와 확률이 매우 높은 지역 (빨간색) 사이의 중첩에 거짓말. 이는도 21에서 수정되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 10
그림 10 : 자기장 설정 필드를 회전. </ 강해는> A.는 크로스 코일 자기 자극기로 자극시 회전 전계를 유도하기 위해, 90도 위상 시프트는 2 개 개의 코일 사이에 필요하다. 도시는 클로버 잎 2 개 코일의 인접 측면에 배치 된 픽업 코일에 유기 전계이다. 코일은 2 상업 자극에 의해 개별적으로 구동되었다. B. 재건, 클로버 잎 코일의 펄스 동안 생성 된 전기장 진폭 및 방향 (A)에 나타내는 곡선을 이용하여. 이 수치는, 28 (21)로부터 변형되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1D 패턴은 다양한 애플리케이션에 사용될 수있는 중요한 도구입니다. 예를 들어, 우리는 신경 세포의 배양 물 (29)로부터 논리 게이트를 생성하고 최근 래트 해마 뉴런 5 Chronaxie 및 Rheobase를 측정하고, 상기 비교 다운 증후군 해마 뉴런 소성 활동 신호 전파 속도의 감속을위한 1 차원 패턴을 사용한 야생형 (WT) 해마의 뉴런 (27). 1 차원 패터닝 제안 된 프로토콜은 강력한이며 원하는 패턴을 형성하기 쉽다. 우리는 측정의 기능에 영향을 미칠 수있는 네트워크의 가능한 모든 단선, 알고 있어야하기 전에 1D 문화를 관찰하는 것이 좋습니다.

신경 구성 화학 패터닝은 유서 30, 31, 32가있다. 우리는 발견 우리의 접근 수율화학 패턴과 유사한 결과를이야, 아직 그들은 더 강력하고 달성하기가 더 쉽습니다. 최근 신경 세포의 미세 패턴에 대한 옵션은 우리가 비교 단순하고 사용하기 (33), (34)의 용이성과 함께 제공하는 방법에 대한 흥미로운 대안이되고있다. 마이크로 유체 접근법은 여기에 기재된 에칭 방법에 평행 우리 실험실에서 사용되고있다.

우리가 5를 켰을 때, 2 차원 배양에는 바람직한 방향이없고 그 자극은 등방성이고 걸리는 전계의 방향에 의존하지 않는다. 필드가 회전 할 때 짧은 기간은 2D 문화의 자극이 필요합니다. 대조적으로,도 1d 배양 분야의 배향에 크게 의존한다. 필드가 (축삭 성장의 방향을 따라서 등) 패턴으로 지향 될 때, 자극에 필요한 일정한 진폭 필드 기간은 필드의 방향 인 경우보다 훨씬 짧다패턴에 직각이된다. 유사하게, 기간이 일정하게 유지되면, 필드와 패턴이 평행하다면 문화를 자극하는 데 필요한 필드가 더 작아집니다. 수직으로 자극 할 때, 필드 펄스는 훨씬 길어야하며 (네트워크 연결이 끊어지면 밀리 초 정도), 주로 수상 돌기가 자극을받습니다. 전장 (직접 또는 자기장에 의해 유도 된)이 뇌 자극에 사용되는 경우, 이것은 극히 중요합니다. 목표로하는 뇌 영역에 축색 돌기가있는 것으로 알려진 경우,이 축색 돌기는 자기장을 자신의 방향으로 향하게하여 자극을받을 수 있으며, 자극을 위해 더 적은 전력이나 더 짧은 지속 시간을 필요로합니다. 목표로하는 뇌 영역에 선호 방향이 없다면, 회전하는 필드가 자극에 더 효율적입니다. 수상 돌기가 자극의 대상이면 긴 펄스가 더 효과적입니다.

자기장은 자기 펄스가 발생하면 신경 세포 활동을 자극 할 수 있습니다.신경 세포를 흥분 전기장을 nduces. 현재 달성 자기 펄스 응답 시간 (밀리 초) 정도의 시간이며, 수상 돌기의 마이크로이기 때문에, 자기 자극에 민감 할 것으로 예상되지 않는다. 그 응답 시간이 빠르다 반면, 축삭에서, 자극 (2), (3)의 목표이다. 전기 자극에 축삭의 반응은 전기장에 평행 할 때 최대이고 그들이 1 (35)에 수직 할 때 감소; 따라서, 자기 여기에서 우리는 유도 전기장이 대상 축삭 평행 배향 여기서 시스템을 설정하기 위해 노력. 1 차원 환을 자극 할 때 따라서, 상기 필드는 축색 돌기에 평행하게 배향되어야하며, 링의 크기는 자극에 대한 임계 값을 결정한다. 목욕 전극에 의해 직접 자극과 유사하게, 2 차원 배양, 회전 전자 유도를 자극lectric 필드는 훨씬 더 효율적입니다.

뉴런의 전기 또는 자기장의 외부 구동 패턴의 조합은 다수의 가능한 미래의 애플리케이션은 강력한 기술이다. Chronaxie 및 Rheobase뿐만 아니라 활성화 및 활성화 전파 역학에 대한 임계 값과 속도는 신경 세포 문화의 고유 특성으로 말하는 모든 매개 변수입니다. 특히, 치료 학적 치료 및 약물 또는 약리학 적 치료 효과를 즉시 신경 세포에 직접 테스트 할 수있다. 이 두 질병 모델 뉴런의 및 TMS 자극에 대한 프로토콜의 효율적인 설문 조사를 허용합니다. 보다 개념적 방향에서 신경 배양을 자극하는 능력을 정확하게 신경 구성의 정보 처리 양태에 관한 새로운 가능성에 이르게하고, 우리는 새로운 연산을 제공하는 신경 네트워크를 거주와 전자 자극을 결합한 마이크로 인쇄 회로를 예상 할 수 있도록알 기기 및 신규 한 뇌 인터페이싱 장치.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

Acknowledgments

저자는 매우 도움이 토론 오퍼 펜어맨, 프레드 울프, 메나헴 시걸, 안드레아스 니프과 에이 탄 Reuveny 감사합니다. 저자는 기술의 초기 버전을 개발 일란 브레스킨와 조르디 소리아노 감사합니다. 저자는 이론적 인 개념에 도움을 트비 틀러스티와 장 피에르 에크 만 감사합니다. 이 연구는 미네르바 재단, 과학 기술, 이스라엘의 교육부와 이스라엘 과학 재단 보조금 1320년에서 1309년까지과 양성 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 교부금 2,008,331에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APV Sigma-Aldrich A8054 Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
B27 supp Gibco 17504-044 Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1
bicuculline Sigma-Aldrich 14343 Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
Borax (sodium tetraborate decahydrate) Sigma-Aldrich S9640 Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2
Boric acid Frutarom LTD 5550710 Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2
CaCl2 , 1 M Fluka  21098 Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
CNQX Sigma-Aldrich C239 Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
COMSOL COMSOL Inc Multiphysics 3.5 Numerical simulation. Mentioned in Section 3.5.2
D-(+)-Glucose, 1 M Sigma-Aldrich 65146 Plating medium, Extracellular recording solution. Mentioned in Sections 1.1.1 and 1.5.2
D-PBS Sigma-Aldrich D8537 Cell Cultures. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6
FCS (FBS) Gibco 12657-029 Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141 Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6
Fluo4AM Life technologies F14201 Imaging of spontaneous or evoked activity. Mentioned in Sections 1.5.1, 1.5.3, and 1.5.5
FUDR Sigma-Aldrich F0503 Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1
Gentamycin Sigma-Aldrich G1272 Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1
GlutaMAX 100x Gibco 35050-038 Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1
Hepes, 1 M Sigma-Aldrich H0887 Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
HI HS BI 04-124-1A Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Sections 1.1.1, 1.4.1, and 1.4.2
KCl,  3 M Merck 1049361000 Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Laminin  Sigma-Aldrich L2020 Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6
MEM x 1 Gibco 21090-022 Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.4.1    1.4.2
MgCl2 , 1 M Sigma-Aldrich M1028 Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
NaCl, 4 M Bio-Lab 19030591 Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Octadecanethiol Sigma-Aldrich 01858 Cleaning Cr-Au coated coverslips (1D cultures). Mentioned in Section 1.2.3
Pluracare F108 NF Prill BASF Corparation  50475278 Bio-Rejection Coating, Bio Coating. Mentioned in Sections 1.2.4 and 1.2.6
Poly-L-lysine 0.01% solution  Sigma-Aldrich  P47075 Promote cell division. Mentioned in Section 1.1.4
Sucrose, 1 M Sigma-Aldrich S1888 Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Thiol  Sigma-Aldrich 1858 Bio-Rejection Coating. Mentioned in Section 1.2.3
URIDINE Sigma-Aldrich U3750 Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1
Sputtering machine AJA International, Inc ATC Orion-5Series  coating glass with thin layers of metal. Mentioned in Section 1.2.2
Pen plotter  Hewlett Packard  HP 7475A Etching of pattern to the coated coverslip. Mentioned in Section 1.2.5
Electrodes wires  A-M Systems, Carlsborg WA 767000 Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Sections 2.1, 2.2, 2.3, and 2.4.5
Signal generator BKPrecision 4079 Shaping of the electric signal. Mentioned in Section 2.3
Amplifier Homemade Voltage amplification of the signal from the signal generator to the electrodes. Mentioned in Section 2.3
Power supply Matrix  MPS-3005 LK-3  Power supply to the sputtering machine. Mentioned in Section 1.2.2.3
Transcranial magnetic stimulation Magstim, Spring Gardens, UK Rapid 2 Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Sections 3.1, 3.3, and 3.4
Epoxy Cognis Versamid 140 Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4
Epoxy Shell EPON 815  Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4
Platinum wires 0.005'' thick; A-M Systems,   Carlsborg WA  767000 Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1
Circular magnetic coil Homemade Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.3
WaveXpress SW B&K Precision  Waveform editing software. Mentioned in Section 2.1.32
Xion Ultra 897 Andor Sensitive EMCCD camera. Mentioned in Section 2.4.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nagarajan, S. S., Durand, D. M., Warman, E. N. Effects of induced electric fields on finite neuronal structures: a simulation study. IEEE Trans Biomed Eng. 40, (11), 1175-1188 (1993).
  2. Nowak, L. G., Bullier, J. Axons but not cell bodies, are activated by electrical stimulation in cortical gray matter. II. Evidence from selective inactivation of cell bodies and axon initial segments. Exp Brain Res. 118, (4), 489-500 (1998).
  3. Ranck, J. B. Which elements are excited in electrical stimulation of mammalian central nervous system: a review. Brain Res. 98, (3), 417-440 (1975).
  4. Rattay, F. The basic mechanism for the electrical stimulation of the nervous system. Neuroscience. 89, (2), 335-346 (1999).
  5. Stern, S., Agudelo-Toro, A., Rotem, A., Moses, E., Neef, A. Chronaxie Measurements in Patterned Neuronal Cultures from Rat Hippocampus. PLoS One. 10, (7), e0132577 (2015).
  6. Brunelin, J., et al. Examining transcranial direct-current stimulation (tDCS) as a treatment for hallucinations in schizophrenia. Am J Psychiatry. 169, (7), 719-724 (2012).
  7. Cruccu, G., et al. EFNS guidelines on neurostimulation therapy for neuropathic pain. Eur J Neurol. 14, (9), 952-970 (2007).
  8. Kennedy, S. H., et al. Canadian Network for Mood and Anxiety Treatments (CANMAT) Clinical guidelines for the management of major depressive disorder in adults. IV. Neurostimulation therapies. J Affect Disord. 117, Suppl 1. S44-S53 (2009).
  9. Minzenberg, M. J., Carter, C. S. Developing treatments for impaired cognition in schizophrenia. Trends Cogn Sci. 16, (1), 35-42 (2012).
  10. Vaidya, N. A., Mahableshwarkar, A. R., Shahid, R. Continuation and maintenance ECT in treatment-resistant bipolar disorder. J ECT. 19, (1), 10-16 (2003).
  11. Bartlett, W. P., Banker, G. A. An electron microscopic study of the development of axons and dendrites by hippocampal neurons in culture. II. Synaptic relationships. J Neurosci. 4, (8), 1954-1965 (1984).
  12. Bartlett, W. P., Banker, G. A. An electron microscopic study of the development of axons and dendrites by hippocampal neurons in culture. I. Cells which develop without intercellular contacts. J Neurosci. 4, (8), 1944-1953 (1984).
  13. Beggs, J. M., Plenz, D. Neuronal avalanches in neocortical circuits. J Neurosci. 23, (35), 11167-11177 (2003).
  14. Breskin, I., Soriano, J., Moses, E., Tlusty, T. Percolation in living neural networks. Phys Rev Lett. 97, (18), (2006).
  15. Feinerman, O., Moses, E. Transport of information along unidimensional layered networks of dissociated hippocampal neurons and implications for rate coding. J Neurosci. 26, (17), 4526-4534 (2006).
  16. Soriano, J., Rodriguez Martinez,, Tlusty, M., T,, Moses, E. Development of input connections in neural cultures. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (37), 13758-13763 (2008).
  17. Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8, (1), 26-29 (2011).
  18. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu Rev Neurosci. 34, 389-412 (2011).
  19. Williams, S. C., Deisseroth, K. Optogenetics. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (41), 16287 (2013).
  20. Rotem, A., Moses, E. Magnetic stimulation of curved nerves. IEEE Trans Biomed Eng. 53, (3), 414-420 (2006).
  21. Rotem, A., Moses, E. Magnetic stimulation of one-dimensional neuronal cultures. Biophys J. 94, (12), 5065-5078 (2008).
  22. Feinerman, O., Moses, E. A picoliter 'fountain-pen' using co-axial dual pipettes. J Neurosci Methods. 127, (1), 75-84 (2003).
  23. Feinerman, O., Segal, M., Moses, E. Signal propagation along unidimensional neuronal networks. J Neurophysiol. 94, (5), 3406-3416 (2005).
  24. Papa, M., Bundman, M. C., Greenberger, V., Segal, M. Morphological analysis of dendritic spine development in primary cultures of hippocampal neurons. J Neurosci. 15, (1 Pt 1), 1-11 (1995).
  25. Bikson, M., et al. Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro. J Physiol. 557, (1), 175-190 (2004).
  26. Rahman, A., et al. Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects. J Physiol. 591, (10), 2563-2578 (2013).
  27. Stern, S., Segal, M., Moses, E. Involvement of Potassium and Cation Channels in Hippocampal Abnormalities of Embryonic Ts65Dn and Tc1 Trisomic Mice. EBioMedicine. 2, (9), 1048-1062 (2015).
  28. Rotem, A., et al. Solving the orientation specific constraints in transcranial magnetic stimulation by rotating fields. PLoS One. 9, (2), e86794 (2014).
  29. Feinerman, O., Rotem, A., Moses, E. Reliable neuronal logic devices from patterned hippocampal cultures. Nat Phys. 4, (12), 967-973 (2008).
  30. Kleinfeld, D., Kahler, K. H., Hockberger, P. E. Controlled outgrowth of dissociated neurons on patterned substrates. J Neurosci. 8, (11), 4098-4120 (1988).
  31. Bugnicourt, G., Brocard, J., Nicolas, A., Villard, C. Nanoscale surface topography reshapes neuronal growth in culture. Langmuir. 30, (15), 4441-4449 (2014).
  32. Roth, S., et al. Neuronal architectures with axo-dendritic polarity above silicon nanowires. Small. 8, (5), 671-675 (2012).
  33. Peyrin, J. M., et al. Axon diodes for the reconstruction of oriented neuronal networks in microfluidic chambers. Lab Chip. 11, (21), 3663-3673 (2011).
  34. Renault, R., et al. Combining microfluidics, optogenetics and calcium imaging to study neuronal communication in vitro. PLoS One. 10, (4), e0120680 (2015).
  35. Roth, B. J., Basser, P. J. A model of the stimulation of a nerve fiber by electromagnetic induction. IEEE Trans Biomed Eng. 37, (6), 588-597 (1990).
전기 단일 및 두 개 차원 문화에 자기장을 사용하여 신경 세포의 외부인가 전압
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stern, S., Rotem, A., Burnishev, Y., Weinreb, E., Moses, E. External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures. J. Vis. Exp. (123), e54357, doi:10.3791/54357 (2017).More

Stern, S., Rotem, A., Burnishev, Y., Weinreb, E., Moses, E. External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures. J. Vis. Exp. (123), e54357, doi:10.3791/54357 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter