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Developmental Biology

La reprogramación de fibroblastos embrionarios de ratón con factores de transcripción para inducir un programa Hemogenic

Published: December 16, 2016 doi: 10.3791/54372
Automatic Translation
1,2,3, 4, 1,2,3, 1,3,5, 1,3
1Department of Developmental and Regenerative Biology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2The Graduate School of Biomedical Science, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Black Family Stem Cell Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 4Center for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra, 5Department of Pharmacology and Systems Therapeutics, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Introduction

La hematopoyesis es un proceso de desarrollo complejo en el que las células madre hematopoyéticas (HSC) brote fuera endotelio hemogenic presente en una variedad de sitios hematopoyéticas embrionarias tales como la aorta-gónada-Mesonefros y la placenta 1,2. La incapacidad de la cultura HSCs in vitro impide el análisis en profundidad de este proceso, así como la aplicación clínica de estos estudios. Para evitar esta limitación, los estudios anteriores han intentado derivar HSCs de novo ya sea a través de la diferenciación de células pluripotentes madre (PSC) 3, o plasticidad inducida en las células somáticas y diferenciación dirigida usando medios de reprogramación 4,5. Estos estudios, sin embargo, no generan células engraftable clínicamente seguras o permiten el estudio de la hematopoyesis definitiva del desarrollo "en un plato."

La novela de trabajo establecido por Yamanaka y sus colegas para generar células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) a partir de fibroblastos somática provides un marco para el factor de transcripción (TF) las estrategias basadas en la sobreexpresión de la reprogramación de células suerte 6,7. Este trabajo ha llevado a los investigadores en varios campos para generar tipos de células de elección a través de la reprogramación de las células somáticas TF fácilmente obtenibles. El objetivo de la estrategia de reprogramación se describe aquí es inducir un proceso hemogenic a partir de células somáticas de ratón utilizando un enfoque reprogramación basado TF con el objetivo de trasladar estas conclusiones al sistema humano para reprogramar fibroblastos específicos del paciente con el fin de estudiar la hematopoyesis humana in vitro y generar productos sanguíneos específicos del paciente para el modelado de la enfermedad, las pruebas de drogas, y el trasplante de células madre.

El primer paso para asegurar la reprogramación adecuada en este sistema de ratón fue desarrollar una línea reportero que sirvió como una lectura para la expresión de CD34, un marcador conocido en las células progenitoras endoteliales y células madre hematopoyéticas. Para ello, las líneas de ratones transgénicos huCD34-TTA y teto-H2BGFP se utilizaron para gfibroblastos enerate dobles de ratón transgénico embrionarias (MEFs), ahora denotados 34 / H2BGFP, que presentan fluorescencia verde después de la activación del promotor de CD34 8. Esto permitió la detección de una variedad de TFS sabe que son necesarios en diferentes puntos durante la especificación y el desarrollo hematopoyético. Comenzando con 18 TFS en pMX vectores retrovial (determinados a través de la literatura minera y el perfilado de la etiqueta GFP retener las HSC de la anteriormente descrita 34 ratones / H2BGFP), 34 / H2BGFP MEFs fueron transducidas con todos los factores y se cultivan en AFT024 HSC-apoyar las células del estroma. Después de la detección de 34 activación / H2BGFP, TFS se retiraron posteriormente de la reprogramación cóctel hasta que se identificó el conjunto óptimo de TFS para la activación de reportero. Después de esta pantalla inicial, los factores se transfirieron a un sistema de vector inducible pFUW DOX para permitir la expresión controlable de la TFS. Dado que estos dos sistemas controlables DOX son incompatibles (las 34 células / H2BGFP y los vectores inducibles pFUW), MEFs deSe requiere C57BL / 6 ratones de tipo salvaje. También era necesario para proporcionar un microambiente apropiado para permitir hemogenesis proceder y crear progenitores clonogénicos multilinaje.

Los estudios actuales que tratan de reprogramar células somáticas en células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPCs) se han reunido variados niveles de éxito 9-11. Hasta la fecha, la generación de ratón y humanos con HSPCs trasplantables a largo plazo y la capacidad de repoblación de auto-renovación no se ha conseguido utilizando el mismo conjunto de TFS. En este protocolo, se realiza una descripción detallada de la estrategia previamente establecida para inducir de forma reproducible hemogenesis en MEFs. Se demuestra que la introducción de un conjunto mínimo de TFS (GATA2, Gfi1b, directores financieros, y ETV6) es capaz de instigar un programa complejo de desarrollo in vitro que proporciona una plataforma en la que la hematopoyesis en el desarrollo y aplicación clínica de reprogramación hematopoyéticas pueden ser estudiados más a fondo 12.

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Protocol

declaración de la ética: líneas celulares de ratón se derivan siguiendo las pautas de cuidado de animales de la Escuela de Medicina de Icahn en el Monte Sinaí, y debe hacerse de acuerdo con cualquier institución de destino.

1. fibroblastos de embriones de ratón (MEF) Aislamiento de C57BL / 6 ratones

  1. Configurar el apareamiento cronometrado 13. Una vez que se visualiza un tapón vaginal, considere este Día 0,5.
  2. Se separan las hembras enchufados en la fecha enchufe y comprobar en ellos el día 10-11 para confirmar el embarazo.
  3. En el Día 13,5-14,5 eutanasia a los ratones hembras embarazadas mediante inhalación de CO 2 seguido por dislocación cervical.
  4. Remojar embarazada abdomen femenino 70% de etanol, diseccionar la cavidad abdominal con tijeras estériles y fórceps abajo de la línea media, y retirar quirúrgicamente los cuernos uterinos que contienen los embriones 14. Sacar los embriones suavemente mientras cortando el tejido abdominal restante.
    NOTA: Recuperar aproximadamente 8 embriones con 4 en cada lado.
  5. Coloque el útero hORNs que contienen los embriones en una placa de 10 cm con 5-10 ml de solución salina estéril tamponada con fosfato fría (PBS).
  6. Con tijeras y pinzas estériles, hará una incisión a lo largo de los cuernos uterinos para aislar los sacos que llevan los embriones. La transferencia de los sacos a una nueva placa de 10 cm con 5-10 ml de PBS estéril enfriado y colocar en hielo.
  7. Colocar algunos de los sacos en una nueva placa de 10 cm con 5-10 ml de PBS enfriado estéril. Con unas tijeras estériles y fórceps de corte suavemente abierto los sacos (sin cortar demasiado profundo) con el fin de evitar la perforación de los embriones.
  8. Separar los embriones de la placenta por cortar el cordón umbilical.
  9. La transferencia de los embriones a una nueva placa de 10 cm que contiene 5-10 ml de PBS enfriado en hielo y dejar al completar las disecciones restantes.
  10. Decapitar a los embriones utilizando pinzas estériles. Corte con cuidado por la línea media del embrión utilizando tijeras y pinzas estériles, a partir de la zona decapitado a abrir el abdomen. Posición fórceps debajo tque los órganos viscerales (incluyendo el corazón, el hígado y los pulmones) y raspar a cabo 15.
  11. Cortar el tejido restante en trozos pequeños con unas tijeras y fórceps y transferir a un tubo cónico de 50 ml que contiene 10 ml de tripsina.
  12. Pipetear arriba y abajo con una pipeta de 10 ml 20-30 veces para mezclar y se disocia el tejido.
  13. Incubar el tejido y la mezcla de tripsina en un baño de agua a 37 ° durante 45 min, agitando de vez en cuando.
  14. Pipetear arriba y abajo con una pipeta de 10 ml durante aproximadamente 5 minutos para mezclar el contenido.
  15. Añadir células tripsinizadas a 3x volumen de estándar de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con suero bovino fetal al 10% (FBS), 10 mg / ml de penicilina / estreptomicina (P / S), y 1 mM de L-glutamina (L-GLUT) en platos de 10 cm (~ 10 ml) y cultivo a 37 ° C hasta la confluencia (aproximadamente 2-4 días). Cultura acerca de 1-2 embriones por placa de 10 cm.
    NOTA: una vez las células Freeze placas son confluentes. Las células congeladas se pueden descongelar y se pasaron 2 veces más. Las células pueden ser, alternativamente,dividir 2 veces antes de la congelación, y luego una vez más después de ser descongelados.

2. Producción viral

  1. Expandir las células 293T en placas con 10 ml de DMEM con 10% FBS, 1% P / S, y 1% de L-GLUT para la transfección de 10 cm.
    1. Trypsinize células 293T con 2 ml de tripsina, se incuba a 37 ° C durante 5 min, recoger las células en tubos de 15 ml, vuelta a 300 xg, y la placa de forma apropiada (10 ml por placa de 10 cm).
  2. 24 horas antes de la transfección, se dividió confluentes 10 cm placa de células 293T 1: 6 y semillas en 10 cm recubierto de gelatina (gelatina al 0,1% en PBS) placas.
    NOTA: Se requieren 4 placas por el virus.
    1. Para placas de capa en gelatina, añadir por lo menos 2 ml de la solución de gelatina al 0,1% para cubrir el fondo de placas de 10 cm. Incubar a 37 ° C durante al menos 20 min. Aspirar la gelatina antes de la adición de las células a las placas.
  3. En un tubo de 15 ml, añadir 84 g de plásmido (por ejemplo GATA2, Gfi1b, cFos o ETV6 (sub-clonado en el vect pFUW-tetoo 16) o FUW-M2rtTA 17), 84 mg psPAX2, y 42 mg pMD2.G. Se añade agua (H2O) para compensar el volumen de 2 ml. Preparar un tubo para cada factor (por ejemplo. GATA2, Gfi1b, directores financieros, ETV6 y FUW-M2rtTA).
  4. Añadir 250 l de 2 M CaCl 2 a cada tubo que contiene la mezcla 2 ml compuesta de 84 g del gen elegido (GATA2, Gfi1b, cFos, ETV6 o FUW-M2rtTA) + 84 g psPAX2 + 42 g pMD2.G + H 2 O .
  5. Con una pipeta Pasteur insertado en la pipeta auxilios, la liberación de burbujas en el 2,25 ml de ADN + H 2 M CaCl mezcla de O + 2 2. A medida que las burbujas se producen, colocar la punta de un P1000 contra la pipeta de vidrio y lentamente expulsar 2 ml de 100 mM de N, N-bis (2-hidroxietil) -2-aminoetano solución salina de ácido sulfónico (BES) por la pipeta Pasteur 1 ml a la vez.
  6. Incubar todos los tubos en la campana de cultivo a temperatura ambiente durante al menos 15 min.
    NOTA: La mezcla de 4,25 ml (ahora ADN + H2O + 2 M de CaCl2
  7. A medida que la mezcla se incuba, medios de aspirado placas 293T despegue y añadir 10 ml de DMEM + 10% FBS + 1 mM de L-glutamina + 25 nM cloroquina.
    NOTA: Este medio no contiene P / S.
  8. Después de al menos 15 min de incubación (o hasta que el cambio de medios de comunicación en las células 293T), añadir el 4,25 ml de ADN + H 2 O + 2 M CaCl 2 + BES mezcla de solución salina gota a gota a las células 293T, distribuyendo de manera uniforme a través de 4 placas de células por tubo (es decir, ligeramente más de 1 ml de la mezcla por plato).
  9. Incubar las placas durante la noche (O / N) a 37 ° C.
  10. 24 horas después de la incubación, en lugar de los medios de comunicación en todas las placas con 4 ml de DMEM estándar (véase el paso 1.15).
  11. Mantener las células en una incubadora a 32 ° a partir de ahora.
  12. 24 horas después del paso 2.10, recogen los medios de comunicación independientes en tubos de 50 ml. Reemplazar los medios recogidos de cada placa con 4 ml de DMEM estándar.
    NOTA: 4 placas por los resultados iniciales de la mezcla del tubo en 16 ml de medio recogido.
    1. UNespués de 12 horas de la incubación, recoger soporte de nuevo en los mismos tubos de 50 ml y reemplazar con otros 4 ml de DMEM estándar.
    2. Después de 12 horas de incubación, recoger los medios de comunicación y añadir a los mismos tubos de 50 ml.
      NOTA: cada tubo debe contener ahora unos 48 ml de medio que contiene virus.
  13. Para concentrar el virus recogido, primer filtro de los medios recogidos a través de filtros de 0,45 M de unión bajas en proteínas.
  14. Verter los medios filtrados que contienen virus en tubos de centrífuga concentración viral (alrededor de 16 ml a la vez).
  15. Giran a 4000 xga 4 ° C durante 25 min y retirar de flujo a través.
    NOTA: Un pequeño volumen de medios concentrados y el virus será visible en el filtro.
  16. Añadir otros 16 ml de medio que contiene el virus se filtró para el volumen de medio + virus concentrado que queda en el filtro y se mezcla invirtiendo el tubo.
  17. tubo de centrifugado a 4.000 xga 4 ° C durante 25 minutos y el descarte de flujo continuo.
  18. Agregue el resto se filtracolección para los medios de comunicación volumen concentrado + virus queda en el filtro y se mezcla invirtiendo el tubo.
  19. Girar una vez más en 4000 xga 4 ° C durante 10 a 20 min (dependiendo del volumen en el filtro) y asegúrese de que el volumen restante de concentrado medios + virus que queda en el filtro es de aproximadamente 1 ml. Si es mayor que 1 ml de concentrado de medios + virus permanece en el filtro, girar de nuevo a 4.000 xg durante 1 min y repetir hasta que se deja de 1 ml en el filtro.
  20. Alícuota de 200 l de virus concentrado en tubos de 1,5 ml y se congelan a -80 ° C o usar inmediatamente.

3. La reprogramación MEF

  1. Pre-capa 6 placas de pocillos con 0,5 ml de gelatina al 0,1% en PBS por pozo, asegurando que la gelatina cubre toda el área del pozo. Colocar en una incubadora a 37 ° C y se incuba durante al menos 20 min. Después de la incubación, retirar las placas y aspirar la gelatina.
  2. MEFs placa con DMEM estándar a una densidad de 25.000 células por pocillo (150.000 célulaspor placa de 6 pocillos) en la placa de 6 pocillos gelatinizada (s) de la etapa 3.1 y dejar reposar hasta la O / N en una incubadora a 37ºC.
  3. Preparar un cóctel de virus de 100 l mediante la mezcla de 50 l M2rtTA y los restantes 50 l de una mezcla de GATA2, Gfi1b, directores financieros, y ETV6 (12,5 l cada una).
  4. Aspirar los medios de MEFs y añadir 2 ml de DMEM estándar con 8 mg de bromuro de hexadimetrina / ml.
  5. Transducir cada pocillo de las placas MEF con 15 l de cóctel de virus e incubar O / N a 37 ° C.
    NOTA: Este es el Día 0 del proceso de reprogramación.
  6. En el Día 1, después de 16-20 horas de incubación, sustitución de los medios con 2 ml de DMEM estándar fresco suplementado con 1 mg / ml DOX por pocillo.
  7. Preparar medios de cultivo hematopoyético complementado con hidrocortisona (10 -6 M), 100 ng / ml de factor de células madre (SCF), 100 ng / ml Fms relacionadas con tirosina quinasa 3 ligando (Flt3L), 20 ng / ml de interleucina-3 (IL- 3), 20 ng / ml de interleucina-6 (IL-6), y 1 mg / ml DOX.
  8. En el Día 4 aspirate medios de cada pocillo y lavar las células con 1 ml de PBS por pocillo.
  9. Aspirar PBS, se disocian las células utilizando 1 ml de tripsina al 0,05% por pocillo y recoger las células.
  10. Recuento de células con un hemocitómetro, centrifugado a 300 xg durante 5 min, se resuspenden en 12 ml de medio hematopoyéticas descrito en la etapa 3.7 y la placa 60.000 células por placa de 6 pocillos en placas recubiertas de gelatina 0,1% (2 ml por pocillo, 10.000 células por pocillo ).
  11. Reemplazar los medios con medio de cultivo fresco complementado hematopoyético cada 6 días durante la duración del cultivo (35 a 36 días).
  12. Analizar cualquiera de las células intermedias o emergentes células hematopoyéticas similares a través de inmuno-tinción 12, análisis FACS 8,12, QRT-PCR 12, y la secuencia de ARNm 12 para confirmar la adquisición de hemogenic endotelial o marcadores HSC-como y la expresión génica.

4. La formación de la unidad (CFU) Los ensayos de agregación de la placenta y de colonias en metilcelulosa

  1. Diseccionar las placentas de embarazadas C5/ 6 ratones 7BL descrito previamente 18 en E12.5 y mantener el tejido en hielo.
  2. Para iniciar la disociación placenta 19, lavado de tejido de la placenta en 2-5 ml de 0,2% de colagenasa tipo I en PBS con 20% de SFB y disociar mecánicamente con una aguja 18G montado en una jeringa de 5 ml haciendo pasar la placenta y PBS a través de la aguja, al menos, 3 veces.
  3. Después de disociación mecánica, mantener las células placentarias en 2-5 ml de solución de colagenasa a 37 ° C durante 1,5 horas.
  4. células paso a través de las agujas 20-25 g preparado en jeringas de 5 ml varias veces para más disociar mecánicamente las células de la placenta.
  5. Filtro de suspensiones de células individuales a través de 70 micras coladores celulares.
  6. Contar las células con un hemocitómetro y irradiar a 2000 cGy para la inactivación mitótica 20.
  7. Añadir 10 ml de medio de cultivo hematopoyético suplementado con 100 ng SCF / ml, 100 ng ml Flt3L /, 20 ng / ml de IL-3, 20 ng / ml de IL-6, y 10 ng / trombopoyetina ml (TPO) a una 10 cm plato.
    NOTA: DOX no se requiere en esta etapa.
  8. Colocar un filtro de 0,65 micras directamente en medios de cultivo hematopoyético en el plato, lo que le permite flotar para crear una interfaz de gas-líquido y fijar el plato a un lado.
  9. Disociar día 25 MEFs transducidas (derivados de paso 3,11) como se describe en los pasos 3.8-3.10 y mezclar 33000 de los MEFs transducidas con 167.000 células de los agregados de la placenta de la etapa 4.6 (relación 1: 6).
  10. Para generar un agregado 18,21, primera vuelta por la MEF y la mezcla de células de la placenta de la etapa 4.9 durante 5 minutos a 300 x g. Aspirar los medios de comunicación y resuspender las células sedimentadas en 30 a 50 l de DMEM estándar utilizando una pipeta P200, dibujo de la suspensión de células individuales en el 200 l punta de la pipeta nonbevelled.
  11. Ocluir la punta de la pipeta con la película de parafina. Coloque la punta bloqueado en un tubo de centrífuga de 15 ml y centrifugar durante 5 minutos a 300 xg por lo que se forma un pellet en el extremo cubierto de la punta.
  12. Retire la punta del tubo de 15 ml con cuidado y lugarla punta en el extremo de la pipeta P200. Desechar la película de parafina y extruir el sedimento de células en el filtro flotante desde el paso 4.8.
    NOTA: La placa como máximo 3 agregados por filtro.
  13. La cultura de los agregados en las flotantes 0,65 micras filtros para 4-5 días en 37 ° C con 5% de CO2.
  14. Recoger los agregados (como máximo 3 por filtro) con un raspador de células, combinarlos, y digerir con 0,2% de colagenasa, siguiendo el mismo protocolo que realiza con todo el placentas para disociar las células (pasos 4.2 a 4.5).
  15. Después de la disociación, lavar los agregados con 2-5 ml de PBS suplementado con FBS al 5% y centrifugar las células a 300 xg durante 5 min.
  16. Volver a suspender los agregados en 500 l de DMEM sin FBS, P / S, o L-GLUT. Tome este 500 l resuspensión y añadirlo a los medios de metilcelulosa 3 ml 1% suplementado con 10 ng / ml de TPO, evitando cuidadosamente la formación de burbujas. Placa volúmenes iguales de esta mezcla en placas de cultivo de 3 35 x 10 mm no tratado paraEnsayos de UFC 12.
  17. Como control, la cultura irradió agregados de la placenta sin mezclar en MEFs reprogramadas 4-5 días y el lugar en ensayos de CFU como se describió anteriormente en los pasos 4.7-4.16.
    NOTA: Estos agregados solos no forman colonias.
  18. Recuento de las colonias hematopoyéticas manualmente bajo el microscopio después de 10-14 días de cultivo a 37 ° C con 5% de CO 2.
  19. Cytospin 22 recogió colonias para mostrar el fenotipo morfológico de células individuales.

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Representative Results

La hematopoyesis es un proceso complejo del desarrollo que se inicia en varios sitios embrionarias. Células endoteliales Hemogenic residen en estos sitios y dan lugar a través de las CMH de células en ciernes 23. Este proceso actualmente no puede ser reproducido mediante la colocación de HSCs o precursores hematopoyéticos en cultivo, lo que exige una metodología para obtener de alguna manera estas células in vitro, ya sea por HSPC expansión ex vivo o la generación de novo. Este protocolo demuestra nuestra novedosa tecnología que intenta obtener estas células a través de la sobreexpresión de TF en MEFs.

La Figura 1 ilustra el proceso general de la reprogramación. Después de la generación MEF y expansión, las células son transducidas con GATA2, Gfi1b, directores financieros, ETV6 y FUW-M2rtTA. Después de 3 días de la expansión y la exposición a DOX para comenzar la activación del transgén, las células se disocian y se dividió el día 4 en placas recubiertas de gelatina ycrecido en medios suplementados hematopoyético.

Después del cultivo después de transducción prolongado con medios de reprogramación, las células adoptan cambios morfológicos claros. En el día 20 las células endoteliales adoptan la morfología distinta de MEFs. Además de cultivo para el día 35 los resultados en varias células hematopoyéticas similar redondas que salen de los intermedios de tipo endotelial que son GFP + (cuando se utiliza el 34 / H2BGFP MEF) y la tinción positiva para el Sca1 marcadores hematopoyéticos y CD45 (Figura 2). Esta tinción demuestra que estas células adquieren marcadores fenotípicos sugestivos de inducción hemogenic. Además cultura da lugar a células que expresan CD45 manteniendo al mismo tiempo la expresión del reportero huCD34. Al células de cultivo de agregación de la placenta adoptan potencial clonogénico y generan colonias en metilcelulosa que contienen diversas morfologías hematopoyéticas y células blásticas similar (Figura 3).

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Figura 1: Estrategia para la inducción hemogenic en MEFs. Diagrama que ilustra el proceso de reprogramación y cada paso dentro de ella. El proceso de reprogramación en general implica en primer lugar la expansión MEF, seguido de la división en la densidad adecuada en placas de 6 pocillos recubiertas con gelatina. Después las células se transdujeron con el cóctel de GATA2, Gfi1b, directores financieros, ETV6, y FUW-M2rtTA. Las células son cultivadas adicionalmente con DMEM estándar suplementado con DOX. En el día 4 se tratan con tripsina y las células se dividieron en placas de 6 pocillos. Cada medios 6 días se cambia y en los puntos de tiempo seleccionados células puede analizarse por FACS, CFU, o ensayos de expresión de genes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Inducción de células hematopoyéticas emergentes a partir de precursores. Las células positivas para el 34 / H2BGFP teñidos para CD45 y Sca1 demuestran la inducción de un programa hemogenic. (A) Esta imagen muestra una combinación de células teñidas para CD45 y Sca1 mientras fluorescente GFP una imagen de campo claro subyacente de las células reprogramadas con. Sólo un subconjunto de la población de células expresa plana Sca1, una endotelial / marcador hemogenic, y sólo redondeado células hematopoyéticas-como que salen de estas células mancha roja para CD45, un marcador pan-hematopoyético. (B) Este archivo representa las células teñidas y fluorescentes GFP sin la imagen de campo claro, mostrando claramente estrecha asociación de células CD45 + con el Sca1 + células. Barra de escala = 100 mM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.


Figura 3: Generación de células CD45 + hematopoyéticos. (A) aproximadamente el 12,7% de 34 / H2BGFP MEFs transducidas con GATA2, Gfi1b, directores financieros, y son ETV6 GFP + CD45 + después de 35 días de reprogramación. Morfologías mieloides claras y blastos-como se puede ver después de la tinción con H & E (B) después de citospina de CD45 + células clasificadas en placas en metilcelulosa durante 10-14 días. Esto demuestra el potencial multilinaje clonal de las células reprogramadas que adoptan la función hematopoyética después de la transducción con este conjunto mínimo de TFS. Barra de escala = 100 mM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Generación de HSPCs de novo a partir de células somáticas fácilmente alcanzables ofrece un método único para estudiar la hematopoyesis in vitro, y la oportunidad de aplicar esta tecnología potencialmente para el sistema humano. Esta traducción generaría una nueva herramienta para estudiar la enfermedad hematológica humano en un plato, así como proporcionar las plataformas de pruebas de drogas y la orientación de genes oportunidades para tratar numerosos trastornos con nuevas terapias o transplantes de HSC. En el campo, los estudios recientes se han expandido en la capacidad de generar HSPCs de novo, lo que demuestra la importancia de varias características del proceso de reprogramación. Estos incluyen la elección de las poblaciones de células de partida y cócteles TF, así como la forma condiciones de cultivo (nichos de co-cultivo) y la suplementación (citoquinas, moléculas pequeñas, etc.) afectar significativamente la eficiencia de la reprogramación de 24-26. En varios estudios se están aplicando tecnología de reprogramación para el sistema humano sin tener que viajar a travésa, 27,28 un paso intermedio indeseable pluripotente en estos procesos.

Aquí es un protocolo que fue el primero en generar células HSC-como a partir de células somáticas a través de un proceso de desarrollo, evitando el uso de los factores de pluripotencia y la formación de productos intermedios pluripotentes. Las células generadas HSC-como parecen desarrollarse a través de un proceso de desarrollo, en primer lugar que requiere células que viajar a través de un intermedio similar a un EHT endotelial hemogenic. En el día 20 de forma reprogramación intermedios similares a las endoteliales que contiene los perfiles de expresión de genes endoteliales y hematopoyéticas. células HSC-como emergen de estas células intermedias en el día 35 que contienen superficie de las células inmuno-fenotipos y perfiles de expresión génica altamente similares a las CMH y pueden producir eritroide y mieloide colonias en ensayos de CFU. Esto sugiere que, a diferencia de la mayoría de los otros estudios, este protocolo reprogramación recapitula un complejo proceso de desarrollo in vitro, y puede ondulación permanenteque un mayor estudio de los procesos de la hematopoyesis y la enfermedad hematológica que implican la hematopoyesis embrionaria. Estos estudios permiten una mayor investigación sobre la manera de tratar y curar la multitud de trastornos hematológicos que existen, y cómo manipular la hematopoyesis con este fin. Esto se puede hacer mediante la inducción de un programa de hemogenic en fibroblastos de pacientes específicos para establecer en modelos de enfermedad in vitro. Con estos modelos, la hematopoyesis normal y enfermo puede ser finamente diseccionado y estudiado, así como someterse a pruebas de drogas y la edición génica para tratar / defectos hematopoyéticos correctos asociados con la enfermedad de interés.

El uso de fibroblastos de ratón es compatible con diversas cualidades beneficiosas de este proceso de reprogramación. Los fibroblastos mismos son fáciles de obtener a partir de ratones donantes, por lo que la adquisición de célula simple. La traducción de esta tecnología para los seres humanos sería por lo tanto sólo requerir muestras de piel de pacientes, por lo que la adquisición de los productos sanguíneos específicos del paciente y la posterior te celularpicar una opción viable para el tratamiento de enfermedades hematológicas. Además, los fibroblastos son muy epigenetically distinta de células hematopoyéticas, lo que demuestra la capacidad de los TFS elegidos en este protocolo reprogramación para tanto la identidad de fibroblastos epigenetically reprimir, y también para instigar un programa hemogenic mediante la alteración de la memoria epigenética de las células de partida 29,30. Aunque los estudios de trasplante siguen sin demostrar la función completa el injerto multilinaje de estas células derivadas, viendo si estos factores inducen un programa hemogenic que genera células hematopoyéticas completamente funcionales en el sistema humano será de gran interés.

Varios pasos dentro de este protocolo pueden ser modificados en caso de dificultad durante la reprogramación, tal como el número de células sembradas antes de la transducción y la cantidad de virus usado para la transducción. Los resultados óptimos se observaron utilizando 150.000 células por placa de 6 pocillos (paso 3.2) con el volumen anteriormente descrita de virus (pasos 3.3 y 3.5), pero más células se pueden utilizar en caso de muerte celular tras la exposición al virus. Del mismo modo, volúmenes más pequeños de virus se pueden utilizar deben muerte celular sea un problema, siempre y cuando procede de reprogramación como se describe (que se puede comprobar a través de análisis FACS, ensayos de CFU, y perfiles de genes). Asegurar que los pasos 2.13 a 2.19 de rendimiento cantidades adecuadas de virus es necesario para el éxito del resto del protocolo. Los pasos 3,5-3,7 también son críticos, la transducción de células tan exitoso es crucial para la inducción de este programa hemogenic. La cantidad apropiada de DOX por pocillo de células transducidas debe mantenerse constante y fresco para asegurar la expresión de los transgenes (necesitando por lo tanto los cambios de medio frecuentes). Aunque no es absolutamente necesario, el cultivo de células en la oscuridad cuando se utiliza DOX puede ayudar a prevenir la pérdida de la función de DOX. Después de la transducción, las células deben ser estrechamente monitorizados bajo el microscopio para determinar su morfología y se ensayaron mediante diversos métodos analíticos (como FACS y ensayos de CFU) para asegurar stransducción viral uccessful y reprogramación. células reprogramadas no pueden adoptar como muchos cambios morfológicos como se esperaba, lo que requiere los métodos de análisis mencionados anteriormente para servir como los mejores indicadores de reprogramación adecuada.

Estudios recientes han utilizado diferentes características de este protocolo de reprogramación, como GATA2 en el cóctel TF o fibroblastos como la población de células de partida 31-33. Estas metodologías también parecen inducir programas de desarrollo durante el proceso de reprogramación. Otras estrategias han demostrado la importancia del nicho hematopoyéticas durante la reprogramación 9,10,25,26. La identificación de todos los factores que ayudan a la reprogramación será esencial para desarrollar el protocolo que genera las CMH de buena fe a partir de células fácilmente alcanzables específicos para cada paciente. En resumen, aquí se describe una estrategia para generar células HSC-como de un proceso de desarrollo inducido en fibroblastos de ratón vía inducible GATA2, Gfi1b, directores financieros, ysobreexpresión ETV6. Esta tecnología será traducido al sistema humano, donde, en combinación con otros estudios publicados, permitirá la generación de productos de la sangre de pacientes específicos adecuado para una variedad de aplicaciones clínicas.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen 11965-092
0.45 μM filters Corning 430625
Amicon Ultra centrifugal filters Millipore UFC900324
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
L-Glutamine Invitrogen 25030-081
FBS Gemini's Benchmark 100-106
PBS Life Technologies 14190-144
18 G needles BD 305195
20 G needles BD 305175
25 G needles BD 305125
Collagenase Type I Sigma C0130-100MG
TrypLE Express Invitrogen 12605-010
Myelocult media Stem Cell Technologies M5300
SCF R & D Systems 455-MC
Flt3L R & D Systems 427-FL
IL-3 R & D Systems 403-ML
IL-6 R & D Systems 406-ML
TPO R & D Systems 488-TO
Doxycycline Sigma D9891-1G
Polybrene (hexadimethrine bromide) Sigma AL-118
Durapore 0.65 μM membrane filters Millipore DVPP14250
Methylcellulose media Stem Cell Technologies Methocult M3434
Hydrocortisone Stem Cell Technologies 07904
C57BL/6 mice The Jackson Laboratory 000664
Gelatin Sigma G-1890 100g
pFUW-tetO Addgene Plasmid #20321
Gata2 Origene MR226728
Gfi1b Origene MR204861
cFos  Addgene Plasmid #19259
Etv6 Origene MR207053
psPAX2 Addgene Plasmid #12260
pMD2.G Addgene Plasmid #12259
CaCl2 Sigma C5670-100g
FUW-M2rtTA Addgene Plasmid #20342
35 mm x 10 mm culture dishes Thermo Scientific 171099

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References

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Biología del Desarrollo No. 118 fibroblastos hematopoyesis de células madre hematopoyéticas reprogramación factores de transcripción la conversión del destino celular hemogenesis
La reprogramación de fibroblastos embrionarios de ratón con factores de transcripción para inducir un programa Hemogenic
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