Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Omprogrammering Mouse Embryonala fibroblasts med transkriptionsfaktorer att inducera en Hemogenic Program

Published: December 16, 2016 doi: 10.3791/54372
Automatic Translation
1,2,3, 4, 1,2,3, 1,3,5, 1,3
1Department of Developmental and Regenerative Biology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2The Graduate School of Biomedical Science, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Black Family Stem Cell Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 4Center for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra, 5Department of Pharmacology and Systems Therapeutics, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Introduction

Hematopoies är en komplex utvecklingsprocess där hematopoetiska stamceller (HSCs) knoppas av hemogenic endotel närvarande i en mängd av embryonala hematopoietiska platser såsom Aorta-gonad-Mesonephros och placenta 1,2. Oförmågan att kulturen HSCs in vitro hindrar fördjupad analys av denna process samt den kliniska tillämpningen av dessa studier. För att kringgå denna begränsning, har tidigare studier försökt härleda HSCs de novo antingen via differentiering av pluripotenta stamceller (PSC) 3, eller inducerade plasticitet i somatiska celler och riktade differentiering med hjälp av omprogrammering media 4,5. Dessa studier, dock inte genererar kliniskt säkra engraftable celler eller tillåta studie slutgiltiga utvecklings hematopoies "i en skål."

Den nya arbete som fastställts av Yamanaka och kollegor för att generera inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) från somatiska fibroblaster provides en ram för transkriptionsfaktor (TF) baserade överuttryck strategier omprogrammering cell öde 6,7. Detta arbete har lett forskare inom flera områden för att generera celltyper av val via TF omprogrammering av lätt erhållas somatiska celler. Målet med omprogrammeringen strategi som beskrivs här är att framkalla en hemogenic processen från mus somatiska celler med hjälp av en TF baserad omprogrammering tillvägagångssätt med målet att översätta dessa resultat till det mänskliga systemet att programmera patientspecifika fibroblaster för att studera human hematopoes in vitro och generera patientspecifika blodprodukter för sjukdom modellering, drogtester, och stamcellstransplantation.

Det första steget för att säkerställa korrekt omprogrammering i denna mus systemet var att utveckla en reporter linje som fungerade som en utläsning för CD34 uttryck, en känd markör i endotelceller progenitorceller och HSCs. För att göra detta har de huCD34-TTA och TetO-H2BGFP transgen mus linjer som används för att generate dubbel transgen mus embryonala fibroblaster (MEF), nu betecknat 34 / H2BGFP, som fluorescerar grönt vid aktivering av CD34-promotom 8. Detta tillät screening av en mängd olika TF är kända för att krävas vid olika tidpunkter under hematopoetisk specifikation och utveckling. Från och med 18 TF i PMX retrovial vektorer (bestämd genom litteratur utvinning och profilering av GFP etikettkvarhållande HSCs från den tidigare beskrivna 34 / H2BGFP möss), 34 / H2BGFP MEF transducerades med alla faktorer och odlades på AFT024 HSC bärande stromaceller. Efter upptäckt av 34 / H2BGFP aktivering var TF därefter avlägsnas från omprogrammering cocktail tills den optimala uppsättningen av TF för reporter aktivering identifierades. Efter denna inledande skärm, var de faktorer som överförts till en DOX inducerbar pFUW vektorsystem för att möjliggöra reglerbar uttryck för TF. Eftersom dessa två DOX reglerbara system är oförenliga (34 / H2BGFP celler och pFUW inducerbara vektorer), MEF frånvildtyp C57BL / 6-möss som krävs. Det var också nödvändigt att skapa en lämplig mikromiljö för att tillåta hemogenesis att gå vidare och skapa multilineage klonogena stamceller.

Aktuella studier försöker programmera somatiska celler i hematopoetiska stamceller och progenitorceller (HSPCs) har träffat olika nivåer av framgång 9-11. Hittills har alstringen av både mus- och humana transplanterbara HSPCs med lång sikt och självförnyande repopulerande förmåga inte uppnåtts med användning av samma uppsättning av TF: er. I detta protokoll, ger vi en detaljerad beskrivning av den tidigare fastlagda strategin att reproducerbart framkalla hemogenesis i MEF. Vi visar att införandet av en minimal uppsättning TF (Gata2, Gfi1b, cFos och Etv6) är i stånd att anstiftan ett komplext utvecklingsprogram in vitro som ger en plattform genom vilken utvecklings hematopoes och klinisk tillämpning av hematopoetisk omprogrammering kan studeras närmare 12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etik uttalande: Mouse cellinjer härleds följer riktlinjerna för djurskötsel i Icahn School of Medicine vid berget Sinai, och bör göras i enlighet med någon värdinstitution.

1. Mouse embryonala Fibroblast (MEF) Isolering av C57BL / 6 möss

  1. Ställ in tidsinställd parning 13. När en vaginal plugg visualiseras, anser att denna dag 0,5.
  2. Separera pluggade honorna på kontakten datum och kontrollera dem på dag 10-11 för att bekräfta graviditeten.
  3. På dag 13,5-14,5 avliva dräktiga möss via CO 2 inandning följt av halsdislokation.
  4. Blöt gravid kvinnlig buken med 70% etanol, dissekera bukhålan med steril sax och pincett ner mittlinjen, och kirurgiskt avlägsna livmodern hornen som innehåller embryona 14. Ta ut embryon försiktigt samtidigt som man skär bort den kvarvarande bukvävnad.
    OBS: Åter cirka 8 embryon med 4 på varje sida.
  5. Placera livmoder hOrns innehållande embryona i en 10 cm skål med 5-10 ml steril kyld fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
  6. Med steril sax och pincett, gör ett snitt längs livmoderhornen att isolera de sacs bär embryona. Överför säckar till en ny 10 cm skål med 5-10 ml sterilt kyld PBS och placera på is.
  7. Placera några av de säckar i en ny 10 cm skål med 5-10 ml sterilt kyld PBS. Använda steril sax och pincett försiktigt skära upp säckar (utan att klippa alltför djup) för att undvika piercing embryona.
  8. Separera embryon från moderkakan genom att skära av navelsträngen.
  9. Överför embryon till en ny 10 cm skål innehållande 5-10 ml kyld PBS och lämna på is medan slutföra de återstående dissektioner.
  10. Halshugga embryon med hjälp av steril pincett. Skär försiktigt ner mittlinjen av embryot med hjälp av steril sax och pincett, med början från halshuggna området för att öppna upp buken. Positionen pincett under than viscerala organ (inklusive hjärta, lever och lungor) och skrapa ut dem 15.
  11. Skär den återstående vävnaden i små bitar med hjälp av sax och pincett och överföring till en 50 ml koniskt rör innehållande 10 ml trypsin.
  12. Pipettera upp och ner med en 10 ml pipett 20-30 gånger för att blanda och dissociera vävnaden.
  13. Inkubera vävnaden och trypsin blandning i en 37 ° C vattenbad i 45 min, virvlande ibland.
  14. Pipettera upp och ner med en 10 ml pipett under ca 5 minuter för att blanda innehållet.
  15. Lägg trypsiniserade celler till 3x mängd ställd Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) med 10% fetalt bovint serum (FBS), 10 | ig / ml penicillin / streptomycin (P / S), och 1 mM L-glutamin (L-GLUT) i 10 cm skålar (~ 10 ml) och odling vid 37 ° C tills sammanflytande (ca 2-4 dagar). Kultur om 1-2 embryon per 10 cm skål.
    OBS: Freeze-celler en gång plattorna är konfluenta. Frysta celler kan tinas och passe ytterligare 2 gånger. alternativt kan celler varasplit 2 gånger före frysning, och sedan en gång till efter att ha tinats.

2. Viral Produktion

  1. Expandera 293T-celler i 10 cm plattor med 10 ml DMEM med 10% FBS, 1% P / S och 1% L-GLUT för transfektion.
    1. Trypsinize 293T-celler med 2 ml trypsin, inkubera vid 37 ° C under 5 min, samla upp cellerna i 15 ml rör, spinn vid 300 xg, och plattan på lämpligt sätt (10 ml per 10 cm skål).
  2. 24 h före transfektion, delbart sammanflytande 10 cm platta av 293T-celler 1: 6 och utsäde i 10 cm gelatin belagt (0,1% gelatin i PBS) plattor.
    OBS: 4 plattor per virus kommer att krävas.
    1. För att belägga plattorna i gelatin, lägga till minst 2 ml av gelatinlösningen 0,1% för att belägga botten av 10 cm plattor. Inkubera vid 37 ° C under minst 20 min. Sug bort gelatin innan du lägger celler till plattorna.
  3. I en 15 ml rör, tillsätt 84 mikrogram plasmid (t.ex. Gata2, Gfi1b, cFos eller Etv6 (sub-klonades in i pFUW-TetO vecteller 16) eller FUW-M2rtTA 17), 84 ^ g psPAX2, och 42 | j, g pMD2.G. Tillsätt vatten (H2O) för att ge volymen till 2 ml. Förbered ett rör för varje faktor (t ex. Gata2, Gfi1b, cFos, Etv6 och FUW-M2rtTA).
  4. Tillsätt 250 pl av 2M CaCl2 till varje rör innehållande 2 ml blandning bestående av 84 | j, g av den valda genen (Gata2, Gfi1b, cFos, Etv6 eller FUW-M2rtTA) + 84 | ig psPAX2 + 42 | ig pMD2.G + H2O .
  5. Med användning av en Pasteur-pipett införes i pipett-stöd, bubblor utsättning i 2,25 ml DNA + H2O + 2 M CaCl 2-blandning. Som bubblorna produceras, placera spetsen på en P1000 mot glas pipett och långsamt mata ut 2 ml av 100 mM N, N-bis (2-hydroxietyl) -2-aminoetan-sulfonsyra (BES) saltlösning ner Pasteur-pipett 1 ml i taget.
  6. Inkubera alla rör i odlings huven vid rumstemperatur under åtminstone 15 min.
    OBS: 4,25 ml blandning (nu DNA + H2O + 2 M CaCl2
  7. När blandningen ruvar, aspirera media off 293T tallrikar och tillsätt 10 ml DMEM + 10% FBS + 1 mM L-glutamin + 25 nM klorokin.
    OBS: Denna media innehåller inte P / S.
  8. Efter minst 15 minuters inkubation (eller tills föränderliga medie på 293T-celler), tillsätt 4,25 ml DNA + H2O + 2 M CaCl2 + BES saltlösning blandning släppa klokt att de 293T-celler, fördela jämnt över 4 cellplattor per rör (dvs. drygt 1 ml av blandningen per platta).
  9. Inkubera plattorna över natten (O / N) vid 37 ° C.
  10. 24 h efter inkubation, byt media på alla plattor med 4 ml standard DMEM (se steg 1,15).
  11. Håll celler i en 32 ° C inkubator från och med nu.
  12. 24 timmar efter steg 2,10, samla media i separata 50 ml rör. Byt de insamlade media från varje platta med 4 ml av en ställd DMEM.
    OBS: 4 plattor per första rör blandning resulterar i 16 ml insamlade media.
    1. enfter 12 timmar av inkubation, samla media igen i samma 50 ml rör och ersätta med ytterligare 4 ml av en ställd DMEM.
    2. Efter 12 h inkubation, samla media och lägga till samma 50 ml rör.
      OBS: varje rör bör nu innehålla ca 48 ml av media innehållande virus.
  13. Att koncentrera den uppsamlade viruset, första filter de uppsamlade medier genom 0,45 pM lågproteinbindande filter.
  14. Häll de filtrerade media innehållande virus i viruskoncentration centrifugrör (cirka 16 ml åt gången).
  15. Centrifugering vid 4000 xg vid 4 ° C under 25 min och avlägsna genomströmning.
    OBS: En liten volym av koncentrerade medier och virus kommer att vara synlig i filtret.
  16. Lägga till ytterligare 16 ml filtrerat virusinnehållande media till den koncentrerade medier + virus volym som finns kvar i filtret och blanda genom att vända röret.
  17. Rotationsröret igen vid 4000 xg vid 4 ° C under 25 min och kasserings genomströmning.
  18. Tillsätt resterande filtrerassamling till den koncentrerade medier + virus volym kvar i filtret och blanda genom att vända röret.
  19. Spin en gång på 4000 xg vid 4 ° C under 10-20 minuter (beroende på volymen i filtret) och se till att den återstående volymen koncentrerad media + virus kvar i filtret är ca 1 ml. Om mer än 1 ml koncentrerad media + virus kvar i filtret, snurra igen vid 4000 xg under 1 minut och upprepa tills 1 ml kvar i filtret.
  20. Alikvotera 200 ul av det koncentrerade viruset till 1,5 ml rör och frysa vid -80 ° C eller användas direkt.

3. MEF Omprogrammering

  1. Förbeläggning 6-brunnsplattor med 0,5 ml av 0,1% gelatin i PBS per brunn, vilket garanterar att gelatinet täcker hela området av brunnen. Placera i en 37 ° C inkubator och inkubera under åtminstone 20 min. Efter inkubation, ta bort plattorna och aspirera gelatinet.
  2. Platt MEFs med standard DMEM vid en densitet av 25.000 celler per brunn (150.000 cellerper 6-brunnar) på den gelatinerade 6-brunnsplatta (er) från steg 3,1 och låt klarna O / N i en 37 ° C inkubator.
  3. Förbered en 100 pl virus cocktail genom att blanda 50 ^ M2rtTA och de återstående 50 ^ en blandning av Gata2, Gfi1b, cFos och Etv6 (12,5 ul vardera).
  4. Aspirera media från MEF och tillsätt 2 ml standard DMEM med 8 mikrogram / ml hexadimetrinbromid.
  5. Transducera varje brunn i MEF plattor med 15 | il av virus cocktail och inkubera O / N vid 37 ° C.
    OBS: Detta är Dag 0 av omprogrammering processen.
  6. På dag 1, efter 16-20 h inkubation, byt media med 2 ml färsk standard DMEM kompletterat med 1 mikrogram / ml DOX per brunn.
  7. Förbereda hematopoietisk odlingsmedia kompletterat med hydrokortison (10 -6 M), 100 ng / ml stamcellsfaktor (SCF), 100 ng / ml fms-relaterade tyrosinkinas 3-ligand (Flt3L), 20 ng / ml interleukin-3 (IL- 3), 20 ng / ml interleukin-6 (IL-6), och 1 pg / ml DOX.
  8. På dag 4 aspirate media från varje brunn och tvätta cellerna med 1 ml PBS per brunn.
  9. Aspirera PBS, dissociera celler med användning av 1 ml 0,05% trypsin per brunn och samla cellerna.
  10. Räkna celler med en hemocytometer, centrifugering vid 300 xg under 5 min, återsuspendera i 12 ml hematopoietiska medier som beskrivits i steg 3,7 och plattan 60.000 celler per 6-brunnar på 0,1% gelatinbelagda plattor (2 ml per brunn, 10000 celler per brunn ).
  11. Byt media med färska kompletterad hematopoetisk odlingsmedier var 6 dagar så länge kulturen (35 till 36 dagar).
  12. Analysera antingen mellanliggande celler eller framväxande hematopoetiska liknande celler via immunfärgning 12, FACS-analys 8,12, QRT-PCR 12, och mRNA-sekvensering 12 för att bekräfta förvärv av hemogenic endotel eller HSC-liknande markörer och genuttryck.

4. placenta aggregering och kolonibildande enhet (CFU) Analyser i Metylcellulosa

  1. Dissekera moderkakor från gravida C57BL / 6 möss som tidigare beskrivits 18 vid E12.5 och hålla vävnaden på is.
  2. För att starta placenta dissociation 19, tvätta placental vävnad i 2-5 ml 0,2% kollagenas typ I i PBS med 20% FBS och mekaniskt dissociera med en 18G nål monterad i en 5 ml spruta genom att passera moderkakan och PBS genom nålen åtminstone 3 gånger.
  3. Efter mekanisk dissociation, hålla placentaceller i 2-5 ml kollagenas-lösning vid 37 ° C under 1,5 h.
  4. Passage celler genom 20-25 G nålar monterade på 5 ml sprutor flera gånger för att ytterligare mekaniskt dissociera moderkakan celler.
  5. Filter enstaka cellsuspensioner genom 70 um cell silar.
  6. Räkna celler med en hemocytometer och bestråla vid 2000 cGy för mitotiskt inaktive 20.
  7. Tillsätt 10 ml av hematopoetiskt odlingsmedia kompletterat med 100 ng / ml SCF, 100 ng / ml Flt3L, 20 ng / ml IL-3, 20 ng / ml IL-6, och 10 ng / ml trombopoietin (TPO) till en 10 cm maträtt.
    OBS: DOX krävs inte i detta skede.
  8. Placera ett 0,65 ^ m filter direkt på hematopoietiska odlingsmedier i skålen, så att den kan flyta för att skapa en vätske-gas-gränsytan och ställ skålen åt sidan.
  9. Dissociera dag 25 omvandlade MEF (härrörande från steg 3,11) som beskrivs i steg 3.8-3.10 och blanda 33.000 av de omvandlade MEF med 167.000 celler i moderkakan aggregat från steg 4,6 (1: 6 förhållande).
  10. För att generera en sammanlagd 18,21, första spinn ner MEF och placenta cellblandningen från steg 4,9 under 5 minuter vid 300 x g. Aspirera media och resuspendera pelleterat celler i 30-50 pl standard DMEM med hjälp av en P200 pipett, dra en enda cell suspensionen i 200 pl nonbevelled pipettspets.
  11. Ockludera pipettspetsen med paraffinfilm. Placera den blockerade spetsen i ett 15 ml centrifugrör och centrifugera ner under 5 minuter vid 300 xg så ett pelletformer i den täckta änden av spetsen.
  12. Ta bort spetsen från 15 ml rör noga och platsspetsen på änden av P200 pipett. Kasta paraffinfilmen och pressa cellpelleten på den flytande filtret från steg 4,8.
    OBS: Plate högst 3 aggregat per filter.
  13. Kultur aggregaten på flytande 0,65 um filter för 4-5 dagar i 37 ° C med 5% CO2.
  14. Samla aggregat (högst 3 per filter) med en cellskrapa, kombinera dem och smälta med 0,2% kollagenas, enligt samma protokoll som görs med hela moderkakor att dissociera cellerna (steg från 4,2 till 4,5).
  15. Efter dissociation, tvätta aggregaten med 2-5 ml PBS kompletterad med 5% FBS och spinn ner cellerna vid 300 xg under 5 min.
  16. Resuspendera aggregaten i 500 pl DMEM utan FBS, P / S, eller L-GLUT. Ta detta 500 l resuspension och lägga till 3 ml 1% metylcellulosa medium kompletterat med 10 ng / ml av TPO, noga undviker bildandet av bubblor. Plate lika stora volymer av denna blandning i tre 35 x 10 mm icke-behandlade odlingsskålar förCFU-analyser 12.
  17. Som en kontroll, bestrålad kultur moderkakan aggregat utan att blanda i omprogrammeras MEF 4-5 dagar och plats i CFU-analyser som beskrivits ovan i steg 4.7-4.16.
    OBS: Dessa aggregat ensam inte bilda kolonier.
  18. Räkna hematopoietiska kolonier manuellt under mikroskop efter 10-14 dagars odling vid 37 ° C med 5% CO2.
  19. Cytospin 22 plockade kolonier för att visa morfologiska fenotyp av enstaka celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hematopoies är en komplex utvecklingsprocess som börjar i olika embryonala platser. Hemogenic endotelceller uppehålla sig i dessa platser och ge upphov till HSCs via cell spirande 23. Denna process som för närvarande kan inte reproduceras genom att placera HSCs eller hematopoetiska prekursorer i kultur, vilket kräver en metod för att på något sätt få dessa celler in vitro, antingen genom att HSPC expansionen ex vivo eller generation de novo. Detta protokoll visar vår nya teknik som försöker att få dessa celler via TF uttryck i MEF.

Figur 1 illustrerar den övergripande omprogrammering processen. Efter MEF generation och expansion celler transduceras med Gata2, Gfi1b, cFos, Etv6 och FUW-M2rtTA. Efter 3 dagar av expansion och exponering för DOX att börja transgen aktivering celler dissocieras och split Dag 4 på gelatinbelagda plattor ochodlades i kompletterat hematopoetisk medier.

Efter långvarig kultur efter transduktion med omprogrammering medier, celler anta tydliga morfologiska förändringar. Vid dag 20 celler anta endotelceller morfologi skiljer sig från MEF. Ytterligare kultur till dag 35 resulterar i flera runda hematopoetiska-liknande celler som framkommer i endotelceller liknande mellan som GFP + (vid användning av 34 / H2BGFP MEF) och fläck positivt för hematopoetiska markörer Sca1 och CD45 (Figur 2). Denna färgning visar att dessa celler får fenotypiska markörer som tyder på hemogenic induktion. Ytterligare kultur resulterar i celler som uttrycker CD45 bibehållen uttryck av huCD34 reporter. Vid placenta aggregering kulturceller anta klonogen potential och generera kolonier i metylcellulosa innehållande olika hematopoetiska morfologier och blastliknande celler (Figur 3).

ep-together.within-page = "1"> Figur 1
Figur 1: Strategi för hemogenic induktion i MEF. Diagram som illustrerar omprogrammering processen och varje steg i den. Den allmänna omprogrammering processen innebär först MEF expansion, följt av klyvning vid lämplig densitet i gelatinbelagda 6-brunnsplattor. Celler sedan transduceras med cocktail av Gata2, Gfi1b, cFos, Etv6 och FUW-M2rtTA. Celler odlas vidare med standard DMEM kompletterat med DOX. På dag 4-celler trypsineras och delas upp i 6-brunnars plattor. Varje 6 dagar media förändras och vid valda tidpunkter celler kan analyseras genom FACS, CFU, eller gen-expressionsanalyser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

belastning / 54372 / 54372fig2.jpg "/>
Figur 2: Induktion av hematopoietiska celler som fram prekursorer. Celler som är positiva för 34 / H2BGFP färgas för Sca1 och CD45 påvisa induktion av ett hemogenic program. (A) Den här bilden visar en sammanslagning av celler färgade för CD45 och Sca1 medan fluorescerande GFP med en underliggande bright bild av omprogrammerade celler. Endast en delmängd av den plana cellpopulationen uttrycker Sca1, en endotel / hemogenic markör, och endast rundade hematopoietiska-liknande celler framväxande från dessa celler färgas rött för CD45, en pan-hematopoietisk markör. (B) Den här bilden visar de färgade och GFP fluorescerande celler utan bright bilden tydligt visar nära anknytning CD45 + celler med Sca1 + celler. Skalstreck = 100 | iM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.


Figur 3: Framställning av CD45 + hematopoietiska celler. (A) Om 12,7% av 34 / H2BGFP MEF transducerade med Gata2, Gfi1b, cFos och Etv6 är GFP + CD45 + efter 35 dagar av omprogrammering. Tydliga myeloida morfologier och blastliknande celler kan ses efter H & E-färgning (B) efter cytospin av CD45 + sorterade celler utstrukna i metylcellulosa under 10-14 dagar. Detta visar på klon multilineage potentialen hos de omprogrammerade celler som antar hematopoetisk funktion efter transduktion med denna minimal uppsättning TF. Skalstreck = 100 | iM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Generera HSPCs de novo från lätt uppnåeliga somatiska celler erbjuder en unik metod för att studera blodbildningen in vitro, och möjligheten att eventuellt tillämpa denna teknik för att det mänskliga systemet. Denna översättning skulle generera ett nytt verktyg för att studera människans hematologiska sjukdomar i en skål, samt ge drogtester plattformar och gen riktar möjligheter att behandla många sjukdomar med nya behandlingar eller HSC transplantationer. I fältet, har nya studier expanderade på förmågan att generera HSPCs de novo, vilket visar betydelsen av flera funktioner i omprogrammering processen. Dessa inkluderar valet av utgångscellpopulationer och TF cocktails, liksom hur odlingsbetingelser (co-kultur nisch) och tillskott (cytokiner, små molekyler, etc.) signifikant påverka effektiviteten i omprogrammering 24-26. Flera studier ansöker omprogrammering teknik till mänskliga systemet utan att gå viaen pluripotent mellan, 27,28 en oönskad steg i dessa processer.

Här är ett protokoll som var först med att generera HSC-liknande celler från somatiska celler via en utvecklingsprocess samtidigt som man undviker användningen av pluripotens faktorer och bildandet av pluripotenta intermediärer. De genererade HSC-liknande celler verkar utvecklas via en utvecklingsprocess, först kräver celler att resa genom en hemogenic endotel mellan liknar en EHT. Vid dag 20 av omprogrammering endotelceller liknande mellan form som innehåller endotelceller och hematopoetiska genuttrycksprofilerna. HSC-liknande celler fram ur dessa mellanliggande celler vid dag 35 som innehåller cellytan immun fenotyper och genuttrycksprofilerna mycket liknar HSCs och kan producera erytroid och myeloid kolonier i CFU-analyser. Detta tyder på att, till skillnad från de flesta andra studier, rekapitulerar denna omprogrammering protokollet en komplex utvecklingsprocess in vitro, och kan permdet ytterligare studier av hematopoes och hematologisk sjukdomsprocesser som involverar embryonala blodbildningen. Dessa studier möjliggöra ytterligare forskning om hur man kan behandla och bota många av hematologiska sjukdomar som finns, och hur man kan manipulera hematopoes för detta ändamål. Detta kan göras genom att inducera ett hemogenic program i patientspecifika fibroblaster att etablera in vitro sjukdomsmodeller. Med dessa modeller kan normalt och sjuka hematopoes vara fint dissekeras och studeras, liksom utsattes för drogskärmar och gen redigering för att behandla / korrigera hematopoetiska defekter i samband med sjukdomen av intresse.

Använda musfibroblaster stöder olika välgörande egenskaper av denna omprogrammering process. Fibroblaster själva är lätt att få från donatormöss, vilket gör cell förvärv enkelt. Översätta denna teknik för att människor skulle alltså bara kräva patientens hudprover, vilket gör förvärv av patientspecifika blodprodukter och efterföljande cell testicka ett hållbart alternativ för behandling hematologiska sjukdomar. Dessutom fibroblaster är mycket epigenetiskt distinkt från hematopoetiska celler, vilket visar förmågan hos de valda TF: er i denna omprogrammering protokoll både epigenetiskt FÖRTRÄNGA fibroblast identitet, och även för att inleda ett hemogenic program genom att förändra den epigenetiska minnet av utgångsceller 29,30. Även transplantationsstudier ännu inte visar hela multilineage inympning funktion av dessa härledda celler, se om dessa faktorer inducerar en hemogenic program som genererar fullt fungerande hematopoetiska celler i det mänskliga systemet kommer att vara av stort intresse.

Flera steg inom detta protokoll kan modifieras i händelse av svårigheter under omprogrammering, såsom antalet celler pläterade före transduktion och mängden virus som används för transduktion. Optimala resultat sågs med hjälp av 150.000 celler per 6-brunnar (steg 3,2) med den tidigare beskrivna volym VIrus (steg 3,3 och 3,5), men flera celler kan användas i händelse av celldöd efter exponering för viruset. På liknande sätt kan mindre volymer av virus användas bör celldöd vara ett problem, så länge som omprogrammering förfar såsom beskrivits (som kan kontrolleras via FACS-analys, CFU-analyser, och gen profilering). Att se till att steg 2,13-2,19 avkastning lämpliga mängder av virus krävs för att lyckas med resten av protokollet. Steg 3,5-3,7 är också kritisk, är avgörande för att inducera denna hemogenic program som framgångsrik transduktion av celler. Lämplig mängd DOX per brunn av omvandlade celler måste hållas jämn och fräsch för att säkerställa uttryck av transgener (vilket nödvändiggör frekventa byte av medium). Även om det inte är absolut nödvändigt, kan cellodling i mörkret när du använder DOX bidra till att förhindra förlust av DOX funktion. Efter transduktion, bör celler övervakas noggrant under mikroskop genom morfologi och analyseras av olika analysmetoder (t.ex. FACS och CFU analyser) för att säkerställa successful viral transduktion och omprogrammering. Omprogrammerade celler får inte anta så många morfologiska förändringar som förväntat, kräver de tidigare nämnda analysmetoder för att fungera som de bästa indikatorerna på korrekt omprogrammering.

Nyligen genomförda studier har använt olika funktioner i denna omprogrammering protokoll, såsom Gata2 i TF cocktail eller fibroblaster som startcellpopulationen 31-33. Dessa metoder verkar också inducera utvecklingsprogram under omprogrammering processen. Andra strategier har visat vikten av hematopoetisk nisch under omprogrammering 9,10,25,26. Identifiera alla de faktorer som bidrar till omprogrammering kommer att vara avgörande för att utveckla protokoll som genererar bona fide HSCs från lättåtkomliga patientspecifika celler. Sammanfattningsvis, här beskriver vi en strategi för att generera HSC-liknande celler från en inducerad utvecklingsprocess i musfibroblaster via inducerbar Gata2, Gfi1b, cFos, ochEtv6 överuttryck. Denna teknik kommer att översättas till det mänskliga systemet, där, i kombination med andra publicerade studier, kommer att tillåta generering av patientspecifika blodprodukter som lämpar sig för en mängd olika kliniska tillämpningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen 11965-092
0.45 μM filters Corning 430625
Amicon Ultra centrifugal filters Millipore UFC900324
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
L-Glutamine Invitrogen 25030-081
FBS Gemini's Benchmark 100-106
PBS Life Technologies 14190-144
18 G needles BD 305195
20 G needles BD 305175
25 G needles BD 305125
Collagenase Type I Sigma C0130-100MG
TrypLE Express Invitrogen 12605-010
Myelocult media Stem Cell Technologies M5300
SCF R & D Systems 455-MC
Flt3L R & D Systems 427-FL
IL-3 R & D Systems 403-ML
IL-6 R & D Systems 406-ML
TPO R & D Systems 488-TO
Doxycycline Sigma D9891-1G
Polybrene (hexadimethrine bromide) Sigma AL-118
Durapore 0.65 μM membrane filters Millipore DVPP14250
Methylcellulose media Stem Cell Technologies Methocult M3434
Hydrocortisone Stem Cell Technologies 07904
C57BL/6 mice The Jackson Laboratory 000664
Gelatin Sigma G-1890 100g
pFUW-tetO Addgene Plasmid #20321
Gata2 Origene MR226728
Gfi1b Origene MR204861
cFos  Addgene Plasmid #19259
Etv6 Origene MR207053
psPAX2 Addgene Plasmid #12260
pMD2.G Addgene Plasmid #12259
CaCl2 Sigma C5670-100g
FUW-M2rtTA Addgene Plasmid #20342
35 mm x 10 mm culture dishes Thermo Scientific 171099

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).
  2. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
  3. Papapetrou, E. P., Sadelain, M. Reconstructing blood from induced pluripotent stem cells. F1000 Med Rep. 2, (2010).
  4. Szabo, E., et al. Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors. Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).
  5. Mitchell, R., et al. Molecular evidence for OCT4-induced plasticity in adult human fibroblasts required for direct cell fate conversion to lineage specific progenitors. Stem Cells. 32 (8), 2178-2187 (2014).
  6. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  7. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  8. Qiu, J., Papatsenko, D., Niu, X., Schaniel, C., Moore, K. Divisional history and hematopoietic stem cell function during homeostasis. Stem Cell Reports. 2 (4), 473-490 (2014).
  9. Riddell, J., et al. Reprogramming committed murine blood cells to induced hematopoietic stem cells with defined factors. Cell. 157 (3), 549-564 (2014).
  10. Sandler, V. M., et al. Reprogramming human endothelial cells to haematopoietic cells requires vascular induction. Nature. 511 (7509), 312-318 (2014).
  11. Daniel, M. G., Pereira, C. F., Lemischka, I. R., Moore, K. A. Making a Hematopoietic Stem Cell. Trends Cell Biol. , (2015).
  12. Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).
  13. Mader, S. L., Libal, N. L., Pritchett-Corning, K., Yang, R., Murphy, S. J. Refining timed pregnancies in two strains of genetically engineered mice. Lab Anim (NY. 38 (9), 305-310 (2009).
  14. Jain, K., Verma, P. J., Liu, J. Isolation and handling of mouse embryonic fibroblasts). Methods Mol Biol. 1194, 247-252 (2014).
  15. Bryja, V., Bonilla, S., Arenas, E. Derivation of mouse embryonic stem cells. Nat Protoc. 1 (4), 2082-2087 (2006).
  16. Carey, B. W., et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (1), 157-162 (2009).
  17. Hockemeyer, D., et al. A drug-inducible system for direct reprogramming of human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 3 (3), 346-353 (2008).
  18. Taoudi, S., et al. Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs. Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).
  19. Gekas, C., K, E. R., H, K. A. M. Isolation and analysis of hematopoietic stem cells from the placenta. J Vis Exp. (16), (2008).
  20. Lewis, I. D., et al. Umbilical cord blood cells capable of engrafting in primary, secondary, and tertiary xenogeneic hosts are preserved after ex vivo culture in a noncontact system. Blood. 97 (11), 3441-3449 (2001).
  21. Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations. Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).
  22. Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
  23. Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
  24. Martinez-Agosto, J. A., Mikkola, H. K., Hartenstein, V., Banerjee, U. The hematopoietic stem cell and its niche: a comparative view. Genes Dev. 21 (23), 3044-3060 (2007).
  25. Butler, J. M., et al. Development of a vascular niche platform for expansion of repopulating human cord blood stem and progenitor cells. Blood. 120 (6), 1344-1347 (2012).
  26. Gori, J. L., et al. Vascular niche promotes hematopoietic multipotent progenitor formation from pluripotent stem cells. J Clin Invest. 125 (3), 1243-1254 (2015).
  27. Bar-Nur, O., et al. Lineage conversion induced by pluripotency factors involves transient passage through an iPSC stage. Nat Biotechnol. 33 (7), 761-768 (2015).
  28. Maza, I., et al. Transient acquisition of pluripotency during somatic cell transdifferentiation with iPSC reprogramming factors. Nat Biotechnol. 33 (7), 769-774 (2015).
  29. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  30. Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. "Epigenetic memory: phenomenon in induced pluripotent stem cells. Acta Naturae. 5 (4), 15-21 (2013).
  31. Elcheva, I., et al. Direct induction of haematoendothelial programs in human pluripotent stem cells by transcriptional regulators. Nat Commun. 5, 4372 (2014).
  32. Vereide, D. T., et al. An expandable, inducible hemangioblast state regulated by fibroblast growth factor. Stem Cell Reports. 3 (6), 1043-1057 (2014).
  33. Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Rep. 9 (5), 1871-1884 (2014).

Tags

Developmental Biology fibroblaster Blodbildning hematopoietiska stamceller omprogrammering transkriptionsfaktorer cell öde konvertering hemogenesis
Omprogrammering Mouse Embryonala fibroblasts med transkriptionsfaktorer att inducera en Hemogenic Program
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Daniel, M. G., Pereira, C. F.,… More

Daniel, M. G., Pereira, C. F., Bernitz, J. M., Lemischka, I. R., Moore, K. Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program. J. Vis. Exp. (118), e54372, doi:10.3791/54372 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter