Omprogrammering Mouse Embryonala fibroblasts med transkriptionsfaktorer att inducera en Hemogenic Program
Summary
The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.
Abstract
This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis “in a dish,” allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.
Introduction
Hematopoies är en komplex utvecklingsprocess där hematopoetiska stamceller (HSCs) knoppas av hemogenic endotel närvarande i en mängd av embryonala hematopoietiska platser såsom Aorta-gonad-Mesonephros och placenta 1,2. Oförmågan att kulturen HSCs in vitro hindrar fördjupad analys av denna process samt den kliniska tillämpningen av dessa studier. För att kringgå denna begränsning, har tidigare studier försökt härleda HSCs de novo antingen via differentiering av pluripotenta stamceller (PSC) 3, eller inducerade plasticitet i somatiska celler och riktade differentiering med hjälp av omprogrammering media 4,5. Dessa studier, dock inte genererar kliniskt säkra engraftable celler eller tillåta studie slutgiltiga utvecklings hematopoies "i en skål."
Den nya arbete som fastställts av Yamanaka och kollegor för att generera inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) från somatiska fibroblaster provides en ram för transkriptionsfaktor (TF) baserade överuttryck strategier omprogrammering cell öde 6,7. Detta arbete har lett forskare inom flera områden för att generera celltyper av val via TF omprogrammering av lätt erhållas somatiska celler. Målet med omprogrammeringen strategi som beskrivs här är att framkalla en hemogenic processen från mus somatiska celler med hjälp av en TF baserad omprogrammering tillvägagångssätt med målet att översätta dessa resultat till det mänskliga systemet att programmera patientspecifika fibroblaster för att studera human hematopoes in vitro och generera patientspecifika blodprodukter för sjukdom modellering, drogtester, och stamcellstransplantation.
Det första steget för att säkerställa korrekt omprogrammering i denna mus systemet var att utveckla en reporter linje som fungerade som en utläsning för CD34 uttryck, en känd markör i endotelceller progenitorceller och HSCs. För att göra detta har de huCD34-TTA och TetO-H2BGFP transgen mus linjer som används för att generate dubbel transgen mus embryonala fibroblaster (MEF), nu betecknat 34 / H2BGFP, som fluorescerar grönt vid aktivering av CD34-promotom 8. Detta tillät screening av en mängd olika TF är kända för att krävas vid olika tidpunkter under hematopoetisk specifikation och utveckling. Från och med 18 TF i PMX retrovial vektorer (bestämd genom litteratur utvinning och profilering av GFP etikettkvarhållande HSCs från den tidigare beskrivna 34 / H2BGFP möss), 34 / H2BGFP MEF transducerades med alla faktorer och odlades på AFT024 HSC bärande stromaceller. Efter upptäckt av 34 / H2BGFP aktivering var TF därefter avlägsnas från omprogrammering cocktail tills den optimala uppsättningen av TF för reporter aktivering identifierades. Efter denna inledande skärm, var de faktorer som överförts till en DOX inducerbar pFUW vektorsystem för att möjliggöra reglerbar uttryck för TF. Eftersom dessa två DOX reglerbara system är oförenliga (34 / H2BGFP celler och pFUW inducerbara vektorer), MEF frånvildtyp C57BL / 6-möss som krävs. Det var också nödvändigt att skapa en lämplig mikromiljö för att tillåta hemogenesis att gå vidare och skapa multilineage klonogena stamceller.
Aktuella studier försöker programmera somatiska celler i hematopoetiska stamceller och progenitorceller (HSPCs) har träffat olika nivåer av framgång 9-11. Hittills har alstringen av både mus- och humana transplanterbara HSPCs med lång sikt och självförnyande repopulerande förmåga inte uppnåtts med användning av samma uppsättning av TF: er. I detta protokoll, ger vi en detaljerad beskrivning av den tidigare fastlagda strategin att reproducerbart framkalla hemogenesis i MEF. Vi visar att införandet av en minimal uppsättning TF (Gata2, Gfi1b, cFos och Etv6) är i stånd att anstiftan ett komplext utvecklingsprogram in vitro som ger en plattform genom vilken utvecklings hematopoes och klinisk tillämpning av hematopoetisk omprogrammering kan studeras närmare 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Generera HSPCs de novo från lätt uppnåeliga somatiska celler erbjuder en unik metod för att studera blodbildningen in vitro, och möjligheten att eventuellt tillämpa denna teknik för att det mänskliga systemet. Denna översättning skulle generera ett nytt verktyg för att studera människans hematologiska sjukdomar i en skål, samt ge drogtester plattformar och gen riktar möjligheter att behandla många sjukdomar med nya behandlingar eller HSC transplantationer. I fältet, har nya studier expa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by an NHLBI grant to K.M. and I.R.L. (1RO1HL119404). Carlos-Filipe Pereira was the recipient of a Revson Senior Biomedical Fellowship. We gratefully acknowledge the Mount Sinai hESC/iPSC Shared Resource Facility and S. D’Souza for assistance with materials and protocols. We also thank the Mount Sinai Flow Cytometry, Genomics, and Mouse facilities.
Materials
| DMEM | Invitrogen | 11965-092 | |
| 0.45uM filters | Corning | 430625 | |
| Amicon Ultra centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| FBS | Gemini's Benchmark | 100-106 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| 18G needles | BD | 305195 | |
| 20G needles | BD | 305175 | |
| 25G needles | BD | 305125 | |
| Collagenase Type I | Sigma | C0130-100MG | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12605-010 | |
| Myelocult media | Stem Cell Technologies | M5300 | |
| SCF | R & D Systems | 455-MC | |
| Flt3L | R & D Systems | 427-FL | |
| IL-3 | R & D Systems | 403-ML | |
| IL-6 | R & D Systems | 406-ML | |
| TPO | R & D Systems | 488-TO | |
| Doxycycline | Sigma | D9891-1G | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma | AL-118 | |
| Durapore 0.65uM membrane filters | Millipore | DVPP14250 | |
| Methylcellulose media | Stem Cell Technologies | Methocult M3434 | |
| Hydrocortisone | Stem Cell Technologies | 07904 | |
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Gelatin | Sigma | G-1890 100g | |
| pFUW-tetO | Addgene | Plasmid #20321 | |
| Gata2 | Origene | MR226728 | |
| Gfi1b | Origene | MR204861 | |
| cFos | Addgene | Plasmid #19259 | |
| Etv6 | Origene | MR207053 | |
| psPAX2 | Addgene | Plasmid #12260 | |
| pMD2.G | Addgene | Plasmid #12259 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670-100g | |
| FUW-M2rtTA | Addgene | Plasmid #20342 | |
| 35 x 10 mm culture dishes | Thermo Scientific | 171099 |
References
- Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
- Papapetrou, E. P., Sadelain, M. Reconstructing blood from induced pluripotent stem cells. F1000 Med Rep. 2, (2010).
- Szabo, E., et al. Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors. Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).
- Mitchell, R., et al. Molecular evidence for OCT4-induced plasticity in adult human fibroblasts required for direct cell fate conversion to lineage specific progenitors. Stem Cells. 32 (8), 2178-2187 (2014).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Qiu, J., Papatsenko, D., Niu, X., Schaniel, C., Moore, K. Divisional history and hematopoietic stem cell function during homeostasis. Stem Cell Reports. 2 (4), 473-490 (2014).
- Riddell, J., et al. Reprogramming committed murine blood cells to induced hematopoietic stem cells with defined factors. Cell. 157 (3), 549-564 (2014).
- Sandler, V. M., et al. Reprogramming human endothelial cells to haematopoietic cells requires vascular induction. Nature. 511 (7509), 312-318 (2014).
- Daniel, M. G., Pereira, C. F., Lemischka, I. R., Moore, K. A. Making a Hematopoietic Stem Cell. Trends Cell Biol. , (2015).
- Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).
- Mader, S. L., Libal, N. L., Pritchett-Corning, K., Yang, R., Murphy, S. J. Refining timed pregnancies in two strains of genetically engineered mice. Lab Anim (NY. 38 (9), 305-310 (2009).
- Jain, K., Verma, P. J., Liu, J. Isolation and handling of mouse embryonic fibroblasts). Methods Mol Biol. 1194, 247-252 (2014).
- Bryja, V., Bonilla, S., Arenas, E. Derivation of mouse embryonic stem cells. Nat Protoc. 1 (4), 2082-2087 (2006).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (1), 157-162 (2009).
- Hockemeyer, D., et al. A drug-inducible system for direct reprogramming of human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 3 (3), 346-353 (2008).
- Taoudi, S., et al. Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs. Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).
- Gekas, C., K, E. R., H, K. A. M. Isolation and analysis of hematopoietic stem cells from the placenta. J Vis Exp. (16), (2008).
- Lewis, I. D., et al. Umbilical cord blood cells capable of engrafting in primary, secondary, and tertiary xenogeneic hosts are preserved after ex vivo culture in a noncontact system. Blood. 97 (11), 3441-3449 (2001).
- Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations. Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).
- Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
- Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
- Martinez-Agosto, J. A., Mikkola, H. K., Hartenstein, V., Banerjee, U. The hematopoietic stem cell and its niche: a comparative view. Genes Dev. 21 (23), 3044-3060 (2007).
- Butler, J. M., et al. Development of a vascular niche platform for expansion of repopulating human cord blood stem and progenitor cells. Blood. 120 (6), 1344-1347 (2012).
- Gori, J. L., et al. Vascular niche promotes hematopoietic multipotent progenitor formation from pluripotent stem cells. J Clin Invest. 125 (3), 1243-1254 (2015).
- Bar-Nur, O., et al. Lineage conversion induced by pluripotency factors involves transient passage through an iPSC stage. Nat Biotechnol. 33 (7), 761-768 (2015).
- Maza, I., et al. Transient acquisition of pluripotency during somatic cell transdifferentiation with iPSC reprogramming factors. Nat Biotechnol. 33 (7), 769-774 (2015).
- Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
- Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. “Epigenetic memory: phenomenon in induced pluripotent stem cells. Acta Naturae. 5 (4), 15-21 (2013).
- Elcheva, I., et al. Direct induction of haematoendothelial programs in human pluripotent stem cells by transcriptional regulators. Nat Commun. 5, 4372 (2014).
- Vereide, D. T., et al. An expandable, inducible hemangioblast state regulated by fibroblast growth factor. Stem Cell Reports. 3 (6), 1043-1057 (2014).
- Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Rep. 9 (5), 1871-1884 (2014).
