Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

عالية الإنتاجية تحديد البكتيريا البوليمرات طارد للمستلزمات الطبية

doi: 10.3791/54382 Published: November 5, 2016
* These authors contributed equally

Introduction

والمنمنمة المجهرية البوليمر منصات عالية الإنتاجية التي تطبع حتى 7000 البوليمرات 1 على الشرائح الزجاجية لتحليل بالتوازي مع خلايا بدائية النواة أو حقيقية النواة 2. الطريقة المعروضة هنا يبني على ما وصفنا أولا في عام 2010 3. وقد طبق هذا النظام الفحص إلى العديد من أنواع الخلايا بما في ذلك خلايا الكبد البشرية والخلايا الجذعية الكلى الخلايا الظهارية أنبوبي والبكتيريا والجراثيم 3،6 الأوالي 7. في كل حالة، تم تحديد البوليمرات التي تعزز أو تقاوم ملزمة للخلايا قيد الدراسة 8. كما تم استخدام المجمعات الحمض النووي مع البوليمرات الاصطناعية polycationic في شكل ميكروأري لفحص عالية الإنتاجية من المرشحين ترنسفكأيشن الجينات 9. وكذلك الكشف عن التفاعلات خلية الركيزة، كما تم استخدام المجهرية البوليمر لتقييم خصائص المواد 10.

"> القدرة البوليمرات الاصطناعية لتعديل المرفق من البكتيريا على سطح راسخة 3،6،11. وهناك عوامل عديدة بما في ذلك رسوم، للا مائية وخشونة سطح سطح البوليمر والمعروفة بتأثيرها، والأساليب التقليدية ملزمة البكتيرية الحيوية اكتشاف تقاوم ملزم من البكتيريا من خلال بالتتابع أو تصميم تجريبيا واختبار المواد في وقت واحد هي كثيفة العمالة ومكلفة والعمليات تستغرق وقتا طويلا. ميكروأرس بوليمر توفر بديلا جذابا للتحايل على هذه القيود.

تنمو البكتيريا المرتبطة السطح كما يطلق عليه السكان معقدة بيوفيلم - هذه الأغشية الحيوية هي شديدة المقاومة للعديد من الضغوط البيئية والمضادات الحيوية. هذا ويرجع ذلك جزئيا إلى المصفوفة خارج الخلية كثيفة على (تتكون من البروتينات والسكريات والأحماض النووية) 12 ويرجع ذلك جزئيا إلى وجود زيادة قوية "persistor" الخلايا في الأغشية الحيوية 13. Althoلاف آليات دقيقة لجمعية السطحية وتشكيل بيوفيلم لاحق من الصعب توصيف ويعتقد عموما أن هناك ثلاثة مراحل مختلفة من النمو سطح 14-16. ويتبع الأولي، مرفق عكسها من خلال التصاق أقوى من الخلايا، وإنشاء بيوفيلم من إنتاج بروتين الخلية ومصفوفة السكاريد وتكاثر الخلايا. وأخيرا، فإن النشرات بيوفيلم ناضجة خلايا العوالق، والتي يمكن الشروع إصابات جديدة في أماكن أخرى خالية من يعيش. البكتيريا صد البوليمرات التي تحول دون التعلق الأولي من البكتيريا، وبالتالي منع المراحل المبكرة من تشكيل بيوفيلم، ويحتمل أن تمثل حلا ممتازا لتقليل العدوى. ونظرا لارتفاع مقاومة المضادات الحيوية (وكذلك مقاومة أكبر جوهريا من البكتيريا المرتبطة سطح 12)، وسائل مجانا المضادات الحيوية للحد من إصابات ذات أهمية خاصة. في المستشفى، البكتيريا صد البوليمريمكن الطلاء لها استخدامات الطبية المباشر في الحد من عدوى المستشفيات، والتي تشكل عادة الأجهزة حول زرع 17.

هنا، يتم وصف طريقة الإنتاجية العالية لفحص 381 البوليمرات لنشاط طارد ضد مجموعة من البكتيريا المسببة للأمراض المرتبطة عدوى المستشفيات، تليها التحقق من صحة ضرب وطلاء لاحق وفحص المواد القسطرة الوريدية المركزية، (الشكل 1). باختصار، كانت رصدت البوليمرات على الشرائح الزجاجية المغلفة الاغاروز عن طريق الطباعة الاتصال، وبعد التجفيف والتعقيم، وحضنت صفائف المنمنمة مع الثقافات البكتيرية مهمة سريريا. بعد الحضانة، وكانت ميكروأرس غسلها برفق وكانت ملطخة الخلايا البكتيرية ملتصقة وتصور من قبل مضان. وفي وقت لاحق، وقد تم التحقيق البوليمرات التي تحول دون بكتيريا ملزمة على نطاق أوسع من جانب طلاء على الزجاج غطاء زلات وتصور بواسطة المجهر الإلكتروني. صد مختارةثم تم المغلفة البوليمرات قدمت على القسطرة التجارية وأظهرت للحد من الحجز على البكتيريا عن طريق ما يقرب من 100 أضعاف.

Protocol

1. إعداد الشرائح الاغاروز المغلفة

ملاحظة: قبل أن افتعال المجهرية البوليمر، والمغلفة الشرائح الزجاجية المغلفة aminoalkylsilane مع الاغاروز IB للحد من خلفية غير محددة ملزمة ويسمح بتقييم البوليمرات التي تربط أو صد البكتيريا 6. طلاء سيلاني يسهل ربط الاغاروز على الشرائح.

  1. يشكلون 2٪ (ث / ت) حل الاغاروز IB في الماء المقطر في زجاجة 250 مل.
  2. بعد تحديد سقف لزجاجة فضفاضة، والحرارة تعليق في فرن الميكروويف في 30 ثانية فترات حتى يذوب. ضمان أن الحد الأقصى ليست مغلقة بإحكام لتجنب أي ضغط محتمل بناء ما يصل. إزالة زجاجة بانتظام ودوامة بلطف.
  3. تأكد من أن تذوب المادة الصلبة والحل واضح. صب هذا الحل الاغاروز في كوب 100 مل، ومكان في 65 ° C حمام الماء للحفاظ على حل السائل.
  4. تراجع الشرائح المغلفة سيلاني في حل الاغاروز، وضمان طلاء موحد، ووايالمؤسسة العامة الجزء الخلفي من الشريحة مع المناديل الورقية.
  5. تجفيف الشرائح، مع الجانب حتى المغلفة، في بيئة خالية من الغبار (على سبيل المثال، داخل خزانة أو دخن غطاء محرك السيارة) لمدة لا تقل عن 24 ساعة.
  6. تأكيد طلاء موحد عن طريق التفتيش البصري. طلاء يمكن تقييمها بسهولة عن طريق التنفس على الشريحة - التكثيف ستشكل في المناطق غير المصقول. الشرائح الوحيدة المغلفة تماما وبشكل متساو وينبغي أن تستخدم للطباعة ميكروأري.

2. إعداد حلول البوليمر للطباعة

  1. إعداد الحلول (1٪ ث / ت) من مجموعة مختارة من البوليمرات متشكلة تتكون من polyacrylates، بولي أكريلمد والبولي يوريثان في N -methylpyrrolidone (NMP) في قوارير زجاجية. (إعداد 1 مل من كل البوليمر). يذوب تماما الدوامة حتى البوليمر. ووصف تركيب البوليمرات في أي مكان آخر 6.
  2. باستخدام ماصة الصغيرة، وملء كل بئر من لوحة 384 microwell مع 25 ميكرولتر حل البوليمر، وضمان أنه لا يوجد أي عبر حساب المشتركmination وكل بئر يحتوي على البوليمر فريدة من نوعها. استخدام NMP كعنصر تحكم السلبية في 2 على الأقل الآبار. تسجيل هوية حل البوليمر في كل بئر على طبق قالب أو جدول ملف جيدا.

3. الطباعة ميكروأرس البوليمر باستخدام طابعة الاتصال

ملاحظة: تم تنفيذ الطباعة من المجهرية باستخدام طابعة للإتصال به. وفيما يلي تعليمات محددة بشأن الطباعة البوليمر ميكروأري. للحصول على إرشادات عامة حول استخدام توصيات الطابعة والسلامة واتباع دليل المستخدم من قبل الشركة المصنعة. على الرغم من أننا استخدام طابعة الاتصال، ويمكن أيضا أن تستخدم يدوي جهاز ختم مناسبة.

  1. كما نصحت في دليل المستخدم الخاص بالطابعة، إنشاء روتين (راجع الخطوة 3.3) التي تسمح للطباعة 384 السوائل (الحلول البوليمر أو NMP) في quadruplicates، وذلك باستخدام رأس microarraying 32 دبوس (كما رتبت 8 الصفوف والأعمدة 4).
  2. طباعة 1536 البقع كما رتبت 48 الصفوف والأعمدة 32. البرنامج الروتين لطباعة في الباب 12الصورة، أي، 32 حلول في وقت واحد، بحيث يمكن للطابعة أن يتوقف بعد طباعة كل قسم للسماح لتنظيف المسامير.
  3. إنشاء روتين الطباعة:
    1. افتح البرنامج واختر من بين الخيارات المتاحة اختيار "إنشاء روتين جديد. حدد علامة التبويب "الوصف" إلى تفاصيل المدخلات من التجربة. حدد علامة التبويب "رأس" واختيار '32 دبوس رئيس microarraying ".
    2. اختر علامة التبويب "المصدر" واختيار حامل لوحة (حامل لوحة المصدر (1x5))، نوع لوحة (لوحة 384 س 6000)، مجموع لوحات (1) والنظام المصدر (أعمدة).
    3. في "تصميم الشرائح" علامة التبويب، اختر "3X1" "الشرائح" واختيار تنظيم كتبها 'عدد الميدان. ثم اختر 'نمط تنظيم ". الإدخال 'عرض بقعة "على أنه" تخطيط "و" أبعاد نمط' باسم 'العد الصف "(6)،" العد العمود' (8)، "صف الملعب" (750) و "الملعب العمود" (560). اختر قسم واحد لطباعة التنوبت.
    4. في "تخطيط الشريحة" إدخال التبويب عدد الشرائح المستخدمة للطباعة. حدد علامة التبويب "طباعة" لإدخال المعلمات الطباعة (عدد الطوابع في التحبير: 1، عدد من الطوابع في بقعة: 5، وختم الوقت: 200 ميللي ثانية، التحبير الوقت: 100 مللي ثانية).
      ملاحظة: يتم الآن إنشاء روتين للطباعة 384 السوائل (الحلول البوليمر أو NMP) في quadruplicates، وذلك باستخدام رأس microarraying 32 دبوس (كما رتبت 8 الصفوف والأعمدة 4). في المجموع يجب أن الروتين طباعة 1536 البقع كما رتبت 48 الصفوف والأعمدة 32 مع الملعب صف من 750 ميكرون والعمود الملعب من 560 ميكرون.
  4. ضع الشرائح المغلفة الاغاروز على منصة وضمان وجود ختم فراغ جيد لعقد الشرائح في الموقف.
  5. ضبط رأس الطباعة حتى يتسنى لجميع دبابيس هي في نفس الارتفاع. التحقق من ذلك عن طريق خفض يدويا وجها لوجه لشريحة زجاجية والتأكد من دبابيس تتحرك صعودا في نفس الوقت. إذا كان هناك أي اختلافات مع ارتفاع، وضبط باستخدام sleevه على ما يصل دبوس أو لأسفل.
  6. وضع لوحة جيدا على حامل لوحة في الاتجاه الصحيح، أي، كذلك A1 إلى اليمين العلوي من حامل وضمان يتم إصلاح لوحة جيدا بحزم.
  7. استخدام المكيف ارتفاع، تأكد من أن ذروة حامل لوحة هو من النوع الذي عند اختيار الحلول البوليمر، دبابيس لا تلمس الجزء السفلي من الآبار.
    ملاحظة: هذا أمر مهم لاكتشاف البوليمر موحد وأيضا لتجنب إراقة حلول البوليمر في الآبار المجاورة، مما تسبب انتقال التلوث.
  8. حدد علامة التبويب "ابدأ" واختيار "نوع تشغيل" بوصف "طبيعي". انقر 'تشغيل'، وتؤكد هذه الشريحة، وأيضا لوحة، وما إلى ذلك، في موقف عند المطالبة.
  9. طباعة 1 القسم في وقت واحد (32 حلول في وقت واحد؛ 12 أجزاء)، مما يسمح للتنظيف من الدبابيس بين الأقسام. تنظيف المسامير بدقة مع منشفة ورقية مغموسة في الأسيتون، تليها المناديل الورقية الجافة لضمان دبابيس جافة تماما.
  10. عند الانتهاء من الطباعة من القطع الصغيرة، ووضعها في حامل الشرائح وتجفيفها بين عشية وضحاها في فراغ وضع الفرن على 45 درجة مئوية لإزالة NMP في البقع البوليمر. بعد التعقيم مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة، وميكروأرس جاهزة للتلقيح البكتيريا.
  11. قبل بتلقيح الشرائح مع البكتيريا، واتخاذ قياس مضان الخلفية (كما هو موضح في القسم 5). استخدام هذا القياس في حساب ملزمة بكتيريا.

4. تلقيح ميكروأرس بوليمر مع البكتيريا

ملاحظة: تأكد تقنية العقيم جيدة. يجب أن يتم تنفيذ جميع التعامل مع الثقافات في بيئة معقمة: إما باستخدام موقد بنسن أو في غطاء تدفق. يجب أن تنمو الثقافات مع توافر الأكسجين والمتوسطة النمو، ودرجة الحرارة تعديلها لمتطلبات كل الأنواع.

  1. إعداد الثقافات بين عشية وضحاها، فحقن 5 مل لوريا، Bertani مرق (LB: 10 ز L -1 bacto-تريبتون، 5 ز L -1 كلوريد الصوديوم، و 10 ز L <سوب> -1 خلاصة الخميرة) مع مستعمرة من لوحة. احتضان ليلا 37 درجة مئوية، والهز في 200 دورة في الدقيقة.
  2. إعداد مخزون الثلاجة الثقافات بين عشية وضحاها من إضافة الجلسرين (10٪ تركيز عموما) وتخزين السهم عند -80 درجة مئوية.
  3. من أجل تحديد أعداد الخلايا من عينات من الأسهم البكتيرية إذابة، نفذ التخفيفات التسلسلية لكل سهم وتنمو البكتيريا بين عشية وضحاها على وسائل الاعلام الصلبة. تحديد دقيق لأعداد الخلايا في الأسهم يضمن التلقيح المناسب من كل الأنواع 6.
  4. إعداد قائح لميكروأري. تزرع ثقافات نوع واحد على النحو الوارد أعلاه وتطبيقها مباشرة إلى المجهرية. BacMix-1 هو خليط من البكتيريا الكلبسيلة الرئوية (ك الرئوية)، المكورات العنقودية المترممة (س. saprophyticus)، والمكورات العنقودية الذهبية (S. الذهبية). BacMix-2 هو مزيج البكتيريا تتكون من العقدية الطافرة (س. الطافرة)، س. الذهبية K. الرئوية والمعوية البرازية (E. البرازية).
  5. أما لانتاج ثقافة مختلطة، مزيج ليلة مبيت في أحجام متساوية (3 مل لكل منهما) وتمييع أربع مرات مع LB الطازجة (لحوالي 50 مل الحجم النهائي).
  6. وضع المجهرية البوليمر تعقيم الأشعة فوق البنفسجية في مستطيلة لوحات 4-جيدا واحتضان لهم مع 6 مل من الثقافات البكتيرية المختلطة في 37 درجة مئوية مع الإثارة لطيف (30 دورة في الدقيقة) لمدة 5 أيام.
  7. بعد الحضانة، وشطف بلطف المجهرية مرتين مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS: 137 مم كلوريد الصوديوم، 2.7 ملي بوكل، 10 ملي نا 2 هبو 1.8 مم KH 2 PO 4)، واحتضان بمحلول مكون من 1 ميكروغرام مل -1 من 4 '6 diamidino-2-phenylindole (دابي) وصمة عار في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة.
  8. تغسل الشرائح ميكروأري الملون في لوحة جيدا جديدة من خلال تغطية مع برنامج تلفزيوني ويحوم بلطف، وتغيير برنامج تلفزيوني مرة واحدة. الجافة تحت تدفق الهواء. تطبيق زلة غطاء زجاجي إلى الشريحة ميكروأري والختم في مكان مع الغراء. مرة واحدة دراي، تعقيم السطح الخارجي مع 70٪ (ت / ت) الإيثانول.
  9. التخلص الآمن من الثقافات وفقا لمستوى الاحتواء.

5. ميكروأري التصوير والتحليل

  1. التقاط الصور واحدة لكل بقعة البوليمر في brightfield ودابي (خروج / م = 358 نانومتر / 361 نانومتر) القنوات. تنفيذ هذا يدويا مع المجهر الفلورسنت أو باستخدام مجهر مضان الآلي (مع مرحلة XYZ تسيطر عليها البرنامج الحصول على صورة) مزودة الهدف 20X.
    ملاحظة: يرجى الرجوع إلى دليل 18 لتشغيل البرنامج وضبط المجهر للحصول على الصور باستخدام قنوات brightfield ودابي. ضمان الربح والتعرض لفترة لالتقاط الصور لجميع المجهرية هي نفسها.
  2. الحصول على متوسط ​​كثافة مضان من كل بقعة في قناة دابي عن طريق اختيار منطقة البقعة وقياس مضان مع برنامج معالجة الصور.
  3. لمضان الخلفية من كل بقعة، obtaفي الصور من البقع البوليمر على ميكروأري تكرار المحتضنة فقط مع وسائل الإعلام مع عدم وجود البكتيريا. خصم مضان الخلفية من شدة الفور للحصول على مضان من البكتيريا.
  4. حساب متوسط قيمة تطبيع من أربع نقاط، تمثل كل البوليمر، وتستخدم للمقارنة بين البكتيريا ملزمة من البوليمرات المختلفة 6.
  5. التعرف على البوليمرات التي تظهر أقل البكتيرية ملزم (أدنى مضان)، والبوليمرات 'ضرب' 6.

6. طلاء الغطاء زلات أجل التحقق من صحة "هيت"

  1. لCoverslips معطف مع البوليمرات:
    1. إعداد حلول البوليمرات 'ضرب' (~ 2٪ ث / ت) في رباعي هيدرو الفوران (THF)، أو مذيب مناسب آخر.
    2. معطف تدور coverslips الزجاج الدائرية ذات حجم مناسب مع حلول البوليمر باستخدام المغطي تدور في 2000 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثانية.
      ملاحظة: في حالة عدم وجود المغطي تدور، coverslips أو مواد أخرى قد تكون تهبط إلى المغلفة، على الرغم من زيادة ونقصانطلاء تنتج سطح أكثر اتساقا.
    3. تجفيف coverslips المغلفة في الفرن الحراري عند 40 درجة مئوية خلال الليل وتعقيم باستخدام الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة قبل البكتيريا بتلقيح.
  2. لCoverslips معطف مع الاغاروز لضوابط السلبية:
    1. coverslips نظيفة إما عن طريق العلاج البلازما لمدة 10 دقيقة أو الغطس في 1 M هيدروكسيد الصوديوم لمدة 4 ساعة.
    2. تزج لل coverslips في الأسيتونتريل تحتوي على 1٪ (3-أمينو) triethoxysilane بين عشية وضحاها. تنظيف لل coverslips مع الأسيتون 3 مرات ووضعها في الفرن (100 درجة مئوية) لمدة 1 ساعة.
    3. تراجع معطف لل coverslips المجففة مع 1٪ محلول مائي الاغاروز المحافظة في حمام مائي عند 60 درجة مئوية. وضع الاغاروز المغلفة coverslips على سطح مستو في ظروف خالية من الغبار المحيط لمدة 24 ساعة وتعقيم باستخدام الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة قبل البكتيريا بتلقيح.

7. مرفق وتحليل زلة تغطية باستخدام مجهر المسح الإلكتروني (SEM)

  1. بعدالتعقيم مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة، ضع زلات غطاء (البوليمر / المغلفة الاغاروز أو غير المصقول والزجاج) في لوحة 12-جيدا القياسية أو لوحة 24-جيدا (اعتمادا على حجم لل coverslips)، واحتضان مع البكتيريا النحو الموضح في القسم 4.
  2. بعد الحضانة مع البكتيريا، وغسل لل coverslips غير المصقول والمطلي مرتين مع 0.1 M عازلة كاكوديلات (7.4 درجة الحموضة) ومن ثم إصلاح مع 2.5٪ (ث / ت) غلوتارالدهيد في 0.1 م العازلة كاكوديلات (الرقم الهيدروجيني 7.4) لمدة 2 ساعة.
  3. عينات ما بعد الإصلاح مع 1٪ (ث / ت) رباعي أكسيد الأوزميوم لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة ويذوى مع الإيثانول يغسل متتابعة في 50 و 70 و 90 و 100٪ (ت / ت) لمدة 30 دقيقة لكل منهما.
  4. العينات الجافة في CO 2 وفقا لبروتوكولات القياسية 19. تجفيف الوقت سوف تعتمد على طبيعة العينة.
  5. عينات معطف في سبائك الذهب / البلاديوم (60/40٪) باستخدام المغطي تفل مع التيار في 30 مللي أمبير والفراغ عند 0.75 عربة. فحص تحت المجهر الإلكترون حسب البروتوكولات القياسية 20.
    ملاحظة: ENSلدى عودتهم احتياطات السلامة الكافية لإدارة المخاطر الناجمة عن التخزين والمناولة والتخلص من رباعي أكسيد الأوزميوم، كما أنها شديدة السمية.
  6. بصريا مقارنة الصور لل coverslips غير المصقول وتلك المغلفة مع الاغاروز أو البوليمرات 'ضرب' لتأكيد قدراتهم البكتيرية ملزمة / صد من البوليمرات.
    ملاحظة: المقاومة التعلق يجب أن يكون مرئيا بسهولة كنقص في الخلايا الحالية.
  7. اختيار الواعدة 'ضرب' البوليمرات غير ملزمة للدراسات طلاء مع الأجهزة الطبية (على سبيل المثال، والقسطرة الوريدية المركزية) 6.

8. اختيار مذيب لطلاء القسطرة

  1. تقييم المذيبات المختلفة لتوافقها مع الجزء الساكن القسطرة، وكذلك قدرتها على حل 'ضرب' البوليمر. قطع أجزاء من القسطرة-1 وإلى قطع اسطوانية 5 ملم في الطول، وقياس مع مسماك رنيه الرقمية.
  2. تقييم المذيبات المختلفة مثل ACETحمض جيم، والأمونيا، والأسيتون، الأسيتونتريل، ايثر، رباعي هيدرو الفوران (THF)، ثنائي ميثيل الفورماميد (DMF)، N -methyl-2-pyrrolidone (NMP)، والإيثانول والميثانول وجلايكول الإثيلين، التولوين والزيلين. تزج قطع القسطرة في المذيبات لمدة 12 ساعة وتقييم بصريا لسلامة القسطرة والوضوح من المذيبات.
    ملاحظة: اختيار المذيبات التي لا تسبب القسطرة إلى تضخم أو تتفكك أو يؤدي إلى مذيب العكرة. المذيب يجب إذابة البوليمرات 'ضرب'.

9. تحليل التصاق البكتيريا على القسطرة عن طريق الميكروسكوب متحد البؤر

  1. تحضير 2.5٪ (ث / ت) حلول البوليمر في الأسيتون، أو غيرها من المذيبات مناسبة كما هو محدد في المادة 8. مكان 5 قطع ملم القسطرة في قارورة زجاجية صغيرة (5 مل)، وتزج بهم في 1 مل من محلول البوليمر لمدة 2 دقيقة . إزالة حل البوليمر الزائد وتجف القطع القسطرة بين عشية وضحاها في فرن الفراغ عند 40 درجة مئوية.
  2. تحضير اللقاح عن طريق خلط إذابة البكتيري الواحدocks لإعطاء ما يقرب من 10 6 خلايا من كل الأنواع في 50 مل LB 6.
  3. تعقيم قطع القسطرة المغلفة وغير المغلفة للأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة واحتضان مع 1 مل تلقيح LB في 24 لوحة جيدا، عند 37 درجة مئوية لمدة 3 أيام، مع الإثارة لطيف 6.
  4. بعد مرور فترة الحضانة، وغسل القسطرة مع برنامج تلفزيوني (2X، 2 مل)، وتحديد البكتيريا بنسبة 10٪ لامتصاص العرق في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة، ويغسل مع برنامج تلفزيوني (1 مل). وصمة عار على البكتيريا على قطع القسطرة مع دابي (1 ميكروغرام مل - 1) لمدة 20 دقيقة ويغسل مع برنامج تلفزيوني (1 مل).
  5. الحصول على الصور مبائر من القطع القسطرة باستخدام الإعدادات التالية: 405NM الأزرق ليزر ديود، للكشف عن مدى 414-502 نانومتر، ثقب دبوس - Airy1، صورة الحجم - 1024 × 1024 بكسل، عرض فوكسل - 105.2 نانومتر، Z-مداخن تباعد 0.5μ م ، التكبير - 40X 1.25.
  6. استكمال التصوير متحد البؤر التي التراص Z 50 صورة في 100 ميكرون طول القسطرة.
  7. تحليل الصور باستخدام suitabلو برامج التحليل: تسطيح الصور مكدسة Z في الطائرة Z، وذلك باستخدام وظيفة تمديد عمق الميدان، لخلق صورة واحدة من قطعة القسطرة.
    ملاحظة: يجب أن ثم يتم تحليل هذه الصورة للحصول على مجال القسطرة عن طريق البكتيريا مغطاة، بعد خلفية تصحيح باستخدام "تتسطح خلفية 'وظيفة.

10. تحليل التصاق البكتيريا على القسطرة بواسطة SEM

  1. إعداد 10٪ من محلول البوليمر (ث / ت) في الأسيتون.
  2. الضغط على طرف ماصة (لmicropipette 200 ميكرولتر) في منتصف جزء من قطع قطعة من القسطرة لأنه عقد وتراجع قطعة في حل البوليمر لحوالي 30 ثانية. تجفيف قطعة مغلفة في الظروف المحيطة لمدة 30 دقيقة. تطبيق طلاء الثاني عن طريق غمر مرة أخرى في حل البوليمر وبين عشية وضحاها الجاف في الظروف المحيطة.
  3. بعد العلاج بالأشعة فوق البنفسجية والحضانة مع البكتيريا غسل قطعة (ن = 3) مع برنامج تلفزيوني (2X، 1 مل)، ونقلها إلى لوحات 48-جيدا تحتوي على 10٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة. بعد إصلاح، وغسل القطع مع برنامج تلفزيوني (1 مل)، بين عشية وضحاها جاف في درجة حرارة الغرفة، وجبل على بذرة مع الأقراص الكربون موصل، والذهب معطف باستخدام المغطي تفل (راجع الخطوة 7.5).
  4. الحصول على الصور باستخدام المجهر الالكتروني الماسح 6.

Representative Results

ويبين الشكل 2 التصاق البكتيريا (تطبيع كثافة مضان) لعدد من البوليمرات على النحو الذي يحدده تحليل ميكروأري. البقع المطبوعة دون البوليمر (NMP فقط) هي السيطرة السلبية، كما الاغاروز تقاوم بقوة بكتيريا ملزم 6 - مضان سجلت منخفضة جدا. البوليمرات عرض كلها منخفضة ملزم على الرغم من أن في معظم الحالات، خصائص مضادة للمن البوليمر تتفاوت تفاوتا كبيرا بين الأنواع البكتيرية المختبرة. وهذا يعكس اختلافات واسعة بين آليات التعلق بين الأنواع المختلفة. اختيار البوليمر المناسب هو بالتالي تعتمد على التطبيق، ولكن هي البوليمرات منخفضة ملزم التعرف عليها بسهولة من خلال المقارنة مع الاغاروز. هي البوليمرات عالية ملزمة المرجح أن يتم تحديدها من خلال مجموعة، ويمكن استخدامها كما الضوابط الإيجابية لتجارب لاحقة. للبوليمرات التي لا تظهر لصناعة السيارات في مضان في قناة دابي، وشارك النوعيmparison من الصور بقعة يمكن إجراء بصريا (كما هو موضح في الشكل (3)، يسلط الضوء على أحد تمثيلي البوليمر ملزمة عالية وثلاثة سبيل المثال البوليمرات ملزمة المنخفضة لل). هذه المقارنة، مع توفير معلومات أقل من التحليل الإحصائي، يمكن أن يكون التحقق من صحة البصرية مفيدا للقيم الكثافة المحسوبة.

مع حددت 22 البوليمرات المناسبة باستخدام ميكروأري، يتم تنفيذ التجارب على نطاق يصل إلى تأكيد ممتلكاتهم البكتيريا طارد عندما تستخدم لطلاء الأسطح الكبيرة. أظهرت هي الأمثلة الأفضل أداء، وتستخدم لتغطية زلات معطف الزجاج (تحليلها من قبل SEM (الأرقام 4 و 5)) وشرائح القسطرة (تحليلها بواسطة المجهر متحد البؤر (الشكل 6) ووزارة شؤون المرأة (الشكل 7)). كلتا الطريقتين مجهرية لديها مصلحة في السماح عدد الخلايا مباشرة على السطح، وتوفير البيانات لا لبس فيه. انخفاض في مرفق الخلية بسهولة للعيانه. هذه الطلاءات التي احتفظت أفضل خصائص مضادة على نطاق والمتابعة، فضلا عن كونها قابلة للتقنيات الطلاء على نطاق واسع، وقد تم التحقيق أبعد من ذلك. أظهرت النتائج توضح البوليمرات الأفضل أداء من كل مرحلة.

شكل 1
الشكل 1: الخطوات المتبعة في تحديد البوليمرات البكتيريا طارد خلال المجهرية البوليمر للتطبيقات الطبية ووزارة شؤون المرأة = مسح الإلكترون المجهري.

الشكل 2
الشكل 2: البكتيرية ملزمة على سلسلة من البوليمرات، والتي يحددها التحليل ميكروأري منخفضة بكتيريا وينظر في عدد من polyacrylates / أكريلاميد (PA) والبولي يوريثان (PU) ملزمة. نتائج المجهرية البوليمر بحث مع عدة ق البكتيرية وترد، PECIES (BacMix-1 وBacMix-2 جيم الصائمية، C. صعب، المطثية الحاطمة، الطافرة S.، واتحادين). بكتيريا ملزمة كما أعرب عن تصحيح خلفية متوسط ​​دابي مضان شدة (تطبيع). أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري. مقتبس من الإشارة 6. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): صور مثال على البقع البوليمر الإسفار (دابي) والمجهر brightfield صور BacMix-2 تبين التصاق البكتيريا على البوليمرات التمثيلية. يتم تضمين البوليمر ملزمة بقوة لمقارنة عدة البوليمرات غير ملزمة (PU-20، PA-336 و PU-179). شريط مقياس = 100 ميكرون. مقتبس من الإشارة 6.: //www.jove.com/files/ftp_upload/54382/54382fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: التجارب النطاق مع زلات غطاء زجاجي الصور SEM تبين التصاق البكتيريا على الزجاج غير المصقول والزجاج المطلي مع البوليمرات 'ضرب' (أمثلة المختار من الجدول 1). الحانات النطاق = 20 ميكرون.

الرقم 5
الرقم 5: البكتيرية ملزمة كميا بواسطة عدد الخلايا من الصور ووزارة شؤون المرأة مقارنة الخلايا المرفقة في وحدة المساحة من الأسطح المطلية مع أفضل البوليمرات 'ضرب'. وقد استخدم الاغاروز كما سطح "غير ملزم" عنصر تحكم، مع الزجاج كسطح ملزمة السيطرة. تمثل أشرطة الخطأالانحراف المعياري.

الشكل (6)
الشكل 6: مقارنة بين بكتيريا ملزمة للشرائح القسطرة المغلفة وغير المغلفة الصور متحد البؤر مقارنة القسطرة غير المعالجة (القسطرة-1) (أ) والقسطرة المغلفة مع PA13 (ب) بعد الحضانة مع BacMix-2. الصور التي اتخذت مع الهدف 40X (مقياس بار = 20 ميكرون). مقتبس من الإشارة 6.

الرقم 7
الرقم 7: مقارنة بين ملزمة البكتيرية على شرائح القسطرة المغلفة وغير المغلفة تظهر الصور ووزارة شؤون المرأة مقارنة القسطرة غير المعالجة (القسطرة-1) (أ) والقسطرة المغلفة مع PA13 (ب) بعد الحضانة مع كوكتيل البكتيريا تتكون من BacMix-2 مقياس. الحانات = 101؛ م. مقتبس من الإشارة 6.

البوليمر مونومر 1 مونومر 2 مونومر 3 نسبة مونمرات
PA465 MEMA DEAEMA هيئة التعليم العالي 8 1 1
PA475 MEMA DEAEA HEMA 6 1 3
PA513 MEMA DEAEMA مجلس العمل المتحد 8 1 1
PA515 MEMA DEAEA مجلس العمل المتحد 6 1 3
PA13 DMAA - 9 1 -
PU1 PEG2000 HDI - 4.9 5.2 -
PU16 PEG2000 MDI - 4.9 5.2 -
PU161 PEG2000 MDI دينار بحريني 2.5 5.2 2.3
PU7 PEG900 BICH - 4.9 5.2 -
PU83 PEG900 HMDI دينار بحريني 2.5 5.2 2.3
PU227 PPG-PEG-1900 HDI - 4.9 5.2 -
PU129 PPG425 BICH DMAPD 2.5 5.2 2.3
PU10 PTMG2000 BICH - 4.9 5.2 -
PU179 PTMG2000 HDI NMAPD 2.5 5.2 2.3
PU20 PTMG2000 MDI - 4.9 5.2 -
PU5 PTMG2000 HDI - 4.9 5.2 -

الجدول 1: تكوين البكتيريا غير ملزمة "ضرب" البوليمرات في الشكل 2.

Discussion

الحب البكتيريا على سطح هي عملية معقدة تحددها مجموعة واسعة من العوامل التي تعتمد على الأنواع البكتيرية، وخصائص السطح، والوسط المحيط والبيئة المادية. وعلى الرغم من مجموعات كيميائية معينة المعروفة بتأثيرها البكتيرية ملزمة (polyglycols، على سبيل المثال، عادة مقاومة مرفق 11)، ربط الأثر البيولوجي للبوليمرات ذات البنية الكيميائية لهم أمر صعب، مما يجعل التصميم الرشيد من البوليمرات لمهام محددة الصعبة. في غياب آليات مرفق مفصلة، وقد حاولت دراسات أخرى لتقليد طبيعيا السطوح طارد، مع طويلة وتطويري مكثف يعالج 21. والمنمنمة طريقة الإنتاجية العالية المعروضة هنا يتغلب على هذه التحديات من خلال تسهيل الفرز الموازي للمئات من البوليمرات لتحديد يؤدي لمزيد من الدراسة.

نتائج من طريقة ميكروأري تكون أساسا لبيئة تطوير متكاملةntify المرشحين الرصاص المرجح الشكل 2 يوضح 22 مرشحا مع انخفاض ملزمة من نوع واحد على الأقل، في حين يوضح الشكل (3) انخفاض واضح في قدرة ملزمة. وقد تم نقل كل 22 البوليمرات منخفضة ملزم هو مبين في الشكل 2 إلى الأمام في التجارب على نطاق ويصل، تم خلالها تحديد أفضل (من حيث الصادة وطلاء خصائص) لتكون PU83، PA13، وPA515 (الأرقام 4 و 5). Polyacrylates توفر قدرا أكبر من المرونة من حيث أساليب البلمرة وهكذا تم اختيار polyacrylate أدنى ملزم، PA13، للدراسات القسطرة طلاء (أرقام 6 و 7). تم تنفيذ مزيد من العمل أكثر تفصيلا عن المرشحين الآخرين من وتم الإبلاغ عن أي مكان آخر 6.

من خلال عدد من التكرارات التجريبية وجدنا أن عددا من الخطوات الصغيرة مفتاح النجاح والتكاثر. فضلا عن تسهيل التصاقالبوليمرات على الشرائح الزجاجية، وذلك باستخدام الاغاروز تحت طلاء يوفر الخلفية نظيفة، كما الاغاروز شديدة المقاومة للاستعمار الجرثومي. وبالمثل الاتساق في البوليمر البقع أنفسهم، سواء داخل نفس المنظومة وبين المصفوفات، هو أمر حيوي، وبالتالي طباعة المصفوفات يجب أن تسيطر عليها بعناية. يطلب تعديل حذرا من المسامير في رأس الطباعة وملء أيضا موحد لوحة 384 جيدا لضمان اكتشاف موحد. وبعض من البوليمرات كنا أظهر درجة من تألق ذاتي، مع البيانات الأساسية مضان لكل شريحة قبل الحضانة مع البكتيريا الحيوية. لحساب الاختلافات والحصول على وينصح مكررات بيانات قوية من القطع الصغيرة.

وصمة عار يعملون هنا (دابي) لا يوجد لديه الانتقائية لأنواع البكتيريا، غير ملزم على وجه التحديد إلى الحمض النووي. لذلك، تقنية العقيم الجيدة ضرورية مرة يتم إدخال الثقافات البكتيرية كما الملوثات قد تمر مرور الكرام، الخلط بين interpreالكساء للنتائج. وينطبق الشيء نفسه على تجارب لاحقة باستخدام المجهر الإلكتروني، حيث أنه من الممكن فقط للتمييز بين قضبان ومكورات لكن ليس جنس أو الأنواع.

بعد الفحص ميكروأري، وينبغي اختيار البوليمرات واعدة لمزيد من التحقق من الصحة. في المثال المعروضة هنا، تم تحديد سبعة البوليمرات من الفائدة عن طريق الحد منها واضحا في مضان على ميكروأري وأكد تثبيط من الحجز عن طريق طلائها على الأسطح الكبيرة. أرقام 4 و 5 تظهر انخفاض ملزمة تحقق coverslips على الزجاج، ل وسائل عملية لاختبار سلوك البوليمرات مثل الطلاء الأكبر بدلا من البقع ميكروأري. وفي وقت لاحق، وقد تم طلاء هذه البوليمرات على الأجهزة الطبية لتحديد تماما انخفاض في التصاق البكتيريا. من المهم أن المذيب اختيار (انظر القسم بروتوكول 8) لهذه الدراسات طلاء غير حميدة على الركيزة المطلوب (هنا، القسطرة)، في حين تحتفظجي القدرة على حل البوليمر من الفائدة، من أجل السماح للطلاء. هنا، كنا الأسيتون التي، كما كذلك ذكر خصائص، لديه نقطة غليان منخفضة ويتبخر بسرعة لترك طلاء موحد.

وسائل التحقق من صحة اختياره سيعتمد على تطبيق معين قيد الدراسة. كما رصد الخلايا الإلكترون ومضان المجهر تسمح الكمي المباشر للمرفق الخلية الفردية، اخترنا هذه التقنيات كعنصر مكمل لمعظم فحص تلطيخ ميكروأري. وتظهر النتائج في أرقام 6 و والتي تدل على أهمية أساليب التحقق من صحة مجانية. الصور مبائر في الشكل (6) توفر صور واضحة جدا من الخلايا الفردية، في حين أن وزارة شؤون المرأة له فائدة إضافية تتمثل في السماح للتقييم من سطح البوليمر، وهو هنا على نحو سلس وموحدة. تقتصر هذه الأساليب من مجال الرؤية من المجاهر المستخدمة، وبالتالي فمن importaNT إلى اتخاذ سلسلة من اللقطات لدينا ثقة في النتائج. الطريقة المذكورة أعلاه لا يمكن quantitate التقيد البكتيرية على سطح كامل، إلا الاستدلال على تغطية من عدد من المناطق الصغيرة. ونحن نعتقد أن هذا يكفي لتطبيق وصفها. يمكن تقييم انخفاض ملزمة البكتيرية بواسطة تعداد سطح البكتيريا الالتزام على القطع القسطرة المغلفة وغير المغلفة بأكملها باستخدام الأساليب كما هو موضح في مكان آخر (22). ولكن هذه الأساليب تتطلب السطوح بيولوجية فحص لديك مساحة موحدة، وهو أمر صعب للحفاظ عندما يتم تنفيذ المقايسات مع الأجهزة الطبية، والتي غالبا ما يكون الهندسة المعقدة.

ومن الواضح أن أي جهاز معد للاستخدام السريري يجب أن تذهب من خلال إجراء مزيد من التجارب كبير لضمان سلامة وفعالية في البشر. الطريقة المعروضة هنا يمثل بداية هذه العملية، وإلى مزيد من العمل يجب أن يتضمن تأكيدا لفي الجسم الحي النشاط. في هذه الحالة، ودراسة ج الوريديةatheters، يمكن العمل الأولي بالتحقيق في ربط مكونات الدم والخلايا الكاملة للبوليمر. وينبغي أيضا أن يؤخذ في الاعتبار تأثير مكونات الدم على ملزمة بكتيريا، وربما عن طريق تكرار المقايسات ملزمة في وجود المصل المعطل أو الدم دي fibrinated-23. وسيكون الاختبار النهائي للتكنولوجيا أن يكون في نموذج في الجسم الحي مثل نموذج عدوى الزرع تحت الجلد 24.

ونحن لشرح إمكانيات طريقة البوليمر ميكروأري لفحص البوليمرات أرض يغير. هذه البوليمرات (على حد سواء مقاومة وتعزيز بكتيريا ملزمة) لديها عدد كبير من التطبيقات في مجال الطب، وصناعة المواد الغذائية والتكنولوجيا الحيوية، وهذا يعني هذه الطريقة قد تكون مفيدة في العديد من المجالات البحثية. على الرغم من أن العمل هنا يستخدم البكتيريا، ويمكن تعديل هذه الطريقة لأنواع الخلايا الأخرى وغيرها من بالمثل ميكروأرس الكيميائية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma 05066 
Silane-prep slides Sigma S4651
Polymers Synthesised in-house Not applicable
NMP Sigma 494496
LB Broth Oxoid CM1018
DAPI Thermo Fisher D1306
Tetrahydrofuran Sigma 401757
(3-aminopropyl) triethoxysilane coated glass slides Sigma Silane-prep
Cacodylate buffer Sigma 97068
Catheter 1 Arrow International CS12123E
Catheter 2 Baxter Healthcare ECS1320
Osmium tetroxide Sigma 201030
Equipment
Contact printer Genetix Qarraymini
Microarray microscope IMSTAR Pathfinder
Spin Coater Speedline Technologies 6708D
Confocal microscope Leica SP5
Image analysis software Media Cybernetics Image-Pro Plus
Scanning electron microscope Philips XL30CP
Sputter coater Bal-Tec SCD050

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hansen, A., Mjoseng, H. K., et al. High-Density Polymer Microarrays: Identifying Synthetic Polymers that Control Human Embryonic Stem Cell Growth. Adv. Healthc. Mat. 3, (6), 848-853 (2014).
  2. Tourniaire, G., Collins, J., et al. Polymer microarrays for cellular adhesion. Chem. Commun. (20), 2118-2120 (2006).
  3. Pernagallo, S., Wu, M., Gallagher, M. P., Bradley, M. Colonising new frontiers-microarrays reveal biofilm modulating polymers. J. Mat. Chem. 21, (1), 96-101 (2010).
  4. Hay, D. C., Pernagallo, S., et al. Unbiased screening of polymer libraries to define novel substrates for functionala hepatocytes with inducible drug metabolism. Stem Cell Res. 6, (2), 92-102 (2011).
  5. Anderson, D. G., Levenberg, S., Langer, R. Nanoliter-scale synthesis of arrayed biomaterials and application to human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 22, (7), 863-866 (2004).
  6. Venkateswaran, S., Wu, M., et al. Bacteria repelling poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide) coatings for biomedical devices. J. Mat. Chem. B. 2, (39), 6723-6729 (2014).
  7. Pickering, H., Wu, M., Bradley, M., Bridle, H. Analysis of Giardia lamblia Interactions with Polymer Surfaces Using a Microarray Approach. Environ.l Sci. Technol. 46, (4), 2179-2186 (2012).
  8. Mizomoto, H. The Synthesis and Screening of Polymer Libraries using a High Throughput Approach. (2004).
  9. How, S. E., Yingyongnarongkul, B., Fara, M. A., Díaz-Mochón, J. J., Mittoo, S., Bradley, M. Polyplexes and lipoplexes for mammalian gene delivery: from traditional to microarray screening. Comb. Chem. High Throughput Screen. 7, (5), 423-430 (2004).
  10. Thaburet, J. -F., Mizomoto, H., Bradley, M. High-Throughput Evaluation of the Wettability of Polymer Libraries. Macromol. Rapid Commun. 25, (1), 366-370 (2004).
  11. Hook, A. L., Chang, C. -Y., et al. Combinatorial discovery of polymers resistant to bacterial attachment. Nat. Biotechnol. 30, (9), 868-875 (2012).
  12. Hall-Stoodley, L., Stoodley, P. Evolving concepts in biofilm infections. Cell. Microbiol. 11, (7), 1034-1043 (2009).
  13. Lewis, K. Persister Cells. Ann. Rev. Microbiol. 64, (1), 357-372 (2010).
  14. Sauer, K., Camper, A. K., Ehrlich, G. D., Costerton, J. W., Davies, D. G. Pseudomonas aeruginosa Displays Multiple Phenotypes during Development as a Biofilm. J. Bacteriol. 184, (4), 1140-1154 (2002).
  15. Reisner, A., Haagensen, J. A. J., Schembri, M. A., Zechner, E. L., Molin, S. Development and maturation of Escherichia coli K-12 biofilms. Mol. Microbiol. 48, (4), 933-946 (2003).
  16. Watnick, P. I., Kolter, R. Steps in the development of a Vibrio cholerae El Tor biofilm. Mol. Microbiol. 34, (3), 586-595 (1999).
  17. Campoccia, D., Montanaro, L., Arciola, C. R. A review of the biomaterials technologies for infection-resistant surfaces. Biomaterials. 34, (34), 8533-8554 (2013).
  18. Imstar. Pathfinder Technology for High Content Cellular Screening in Cell Biology and Genetoxicity Software version: 6.04I. (2012).
  19. Williams, J. R., Clifford, A. A. Supercritical Fluid Methods and Protocols. 13, Humana Press. New Jersey. (2000).
  20. Kuo, J. Electron microscopy methods and protocols. Humana Press. Totowa, NJ. (2007).
  21. Leslie, D. C., Waterhouse, A., et al. A bioinspired omniphobic surface coating on medical devices prevents thrombosis and biofouling. Nat. Biotechnol. 32, (11), 1134-1140 (2014).
  22. Bechert, T., Steinrücke, P., Guggenbichler, J. P. A new method for screening anti-infective biomaterials. Nat. Med. 6, (9), 1053-1056 (2000).
  23. May, R. M., Magin, C. M., et al. An engineered micropattern to reduce bacterial colonization, platelet adhesion and fibrin sheath formation for improved biocompatibility of central venous catheters. Clin. Transl. Med. 4, (2015).
  24. Chen, R., Willcox, M. D. P., Ho, K. K. K., Smyth, D., Kumar, N. Antimicrobial peptide melimine coating for titanium and its in vivo antibacterial activity in rodent subcutaneous infection models. Biomaterials. 85, 142-151 (2016).
عالية الإنتاجية تحديد البكتيريا البوليمرات طارد للمستلزمات الطبية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Venkateswaran, S., Gwynne, P. J., Wu, M., Hardman, A., Lilienkampf, A., Pernagallo, S., Blakely, G., Swann, D. G., Bradley, M., Gallagher, M. P. High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices. J. Vis. Exp. (117), e54382, doi:10.3791/54382 (2016).More

Venkateswaran, S., Gwynne, P. J., Wu, M., Hardman, A., Lilienkampf, A., Pernagallo, S., Blakely, G., Swann, D. G., Bradley, M., Gallagher, M. P. High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices. J. Vis. Exp. (117), e54382, doi:10.3791/54382 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter