A high-throughput microarray method for the identification of polymers which reduce bacterial surface binding on medical devices is described.
Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as contributing to antimicrobial resistance. One possible avenue for the reduction of device-associated infections is the identification of bacteria-repellent polymer coatings for these devices, which would prevent bacterial binding at the initial attachment step. A method for the identification of such repellent polymers, based on the parallel screening of hundreds of polymers using a microarray, is described here. This high-throughput method resulted in the identification of a range of promising polymers that resisted binding of various clinically relevant bacterial species individually and also as multi-species communities. One polymer, PA13 (poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide)), demonstrated significant reduction in attachment of a number of hospital isolates when coated onto two commercially available central venous catheters. The method described could be applied to identify polymers for a wide range of applications in which modification of bacterial attachment is important.
पॉलिमर प्रोटीन उच्च throughput प्लेटफार्मों जिसमें अप करने के लिए 7,000 पॉलिमर 1 prokaryotic या कोशिकाओं 2 के साथ समानांतर विश्लेषण के लिए गिलास स्लाइड पर मुद्रित कर रहे हैं छोटी रहे हैं। यहाँ प्रस्तुत विधि है जो हम पहले 2010 3 में वर्णित है कि पर बनाता है। इस स्क्रीनिंग प्रणाली मानव hepatocytes 4, स्टेम सेल 5, गुर्दे ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं 2, 3,6 बैक्टीरिया और प्रोटोजोआ रोगजनकों 7 सहित कई प्रकार की कोशिकाओं के लिए लागू किया गया है। प्रत्येक मामले में, पॉलिमर कि बढ़ावा देने या अध्ययन के तहत कोशिकाओं के बंधन विरोध 8 पहचान की गई। सिंथेटिक polycationic पॉलिमर के साथ डीएनए के परिसरों भी जीन अभिकर्मक उम्मीदवारों 9 के उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए माइक्रोएरे प्रारूप में इस्तेमाल किया गया है। के रूप में अच्छी तरह से सेल सब्सट्रेट बातचीत के लिए स्क्रीनिंग के रूप में, बहुलक प्रोटीन भी सामग्री गुण 10 के मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया गया है।
"> एक सतह पर बैक्टीरिया की कुर्की मिलाना सिंथेटिक पॉलिमर की क्षमता को अच्छी तरह से 3,6,11 की स्थापना की है। प्रभारी, hydrophobicity और बहुलक सतह से सतह खुरदरापन की खोज biomaterials के जीवाणु बंधन। परंपरागत तरीके को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है सहित कई कारकों कि क्रमिक रूप से के माध्यम से बैक्टीरिया के बंधन विरोध या अनुभव से डिजाइन और एक समय में एक सामग्री के परीक्षण श्रम प्रधान, महंगा है और समय लेने वाली प्रक्रिया है पॉलिमर प्रोटीन ऐसी सीमाओं circumventing के लिए एक आकर्षक विकल्प प्रदान करते हैं।।सतह से जुड़े बैक्टीरिया बढ़ने के रूप में एक जटिल आबादी एक biofilm करार दिया – जैसे biofilms अत्यधिक कई पर्यावरण तनाव और एंटीबायोटिक दवाओं के लिए प्रतिरोधी रहे हैं। यह उनकी घने बाह्य मैट्रिक्स (प्रोटीन, polysaccharides और न्यूक्लिक एसिड से बना) की वजह से 12 और भाग में biofilms 13 में मजबूत "persistor" कोशिकाओं की वृद्धि की उपस्थिति के कारण भाग में है। हालांकिऊ सतह एसोसिएशन और बाद biofilm गठन की सटीक तंत्र को चिह्नित करने के लिए मुश्किल हैं, यह आम तौर पर माना जाता है कि सतह के विकास के 14 में से तीन अलग-अलग चरणों देखते हैं कि – 16। प्रारंभिक, प्रतिवर्ती लगाव कोशिकाओं की मजबूत आसंजन द्वारा पीछा किया जाता है, एक बाह्य प्रोटीन के उत्पादन और polysaccharide मैट्रिक्स और सेल प्रसार द्वारा एक biofilm की स्थापना। अंत में, परिपक्व biofilm विज्ञप्ति planktonic कोशिकाओं है, जो नए संक्रमण अन्यत्र आरंभ कर सकते हैं मुक्त रहने वाले। जीवाणु-repelling पॉलिमर कि बैक्टीरिया की प्रारंभिक लगाव को रोकने, और इसलिए biofilm गठन के प्रारंभिक दौर को रोकने, संभावित संक्रमण के कम करने के लिए एक उत्कृष्ट समाधान प्रतिनिधित्व करते हैं। एंटीबायोटिक प्रतिरोध के उदय को देखते हुए (और भी सतह से जुड़े बैक्टीरिया 12 की आंतरिक रूप से अधिक से अधिक प्रतिरोध), संक्रमण को कम करने के एंटीबायोटिक मुक्त साधन विशेष रुचि के हैं। एक अस्पताल स्थापित करने में, जीवाणु-repelling बहुलककोटिंग्स nosocomial संक्रमण है, जो आमतौर पर चारों ओर प्रत्यारोपित उपकरणों 17 फार्म की कमी में एक प्रत्यक्ष चिकित्सा आवेदन कर सकते हैं।
इधर, nosocomial संक्रमण के साथ जुड़े रोगजनक बैक्टीरिया की एक सीमा के खिलाफ बचाने वाली क्रीम गतिविधि के लिए 381 पॉलिमर की जांच के लिए एक उच्च throughput विधि, हिट सत्यापन और बाद कोटिंग और केंद्रीय शिरापरक कैथेटर सामग्री की परख, द्वारा पीछा (चित्रा 1) में वर्णित है। संक्षेप में, पॉलिमर संपर्क मुद्रण द्वारा agarose लेपित गिलास स्लाइड पर देखा गया था और, सुखाने और नसबंदी के बाद, छोटी सरणियों चिकित्सकीय महत्वपूर्ण बैक्टीरियल संस्कृतियों के साथ incubated रहे थे। ऊष्मायन के बाद, प्रोटीन धीरे धोया गया और पक्षपाती बैक्टीरियल कोशिकाओं दाग और प्रतिदीप्ति द्वारा कल्पना थे। बाद में, पॉलिमर जो बैक्टीरिया बाध्यकारी हिचकते कांच कवर फिसल जाता है पर कोटिंग से एक बड़े पैमाने पर जांच की और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना थे। चुने गए पीछे हटानाव्रत पॉलिमर तो वाणिज्यिक कैथेटर पर लेपित और लगभग 100 गुना से बैक्टीरिया की कुर्की कम करने के लिए दिखाया गया है।
एक सतह पर बैक्टीरिया की कुर्की के लिए एक जटिल बैक्टीरियल प्रजातियों पर निर्भर कारकों की एक विस्तृत श्रृंखला के द्वारा निर्धारित प्रक्रिया है, सतह के आसपास के मध्यम और भौतिक वातावरण के गुणों। हालांकि कुछ रासायनिक समूहों बैक्टीरियल बाध्यकारी को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है (Polyglycols, उदाहरण के लिए, आम तौर पर कुर्की 11 का विरोध), उनकी रासायनिक संरचना के साथ पॉलिमर के जैविक प्रभाव correlating मुश्किल है, चुनौतीपूर्ण विशिष्ट कार्यों के लिए पॉलिमर के तर्कसंगत डिजाइन कर रही है। विस्तृत लगाव तंत्र के अभाव में, अन्य अध्ययनों से प्राकृतिक रूप से पाए बचाने वाली क्रीम सतहों, लंबा और व्यापक अनुकूलन प्रक्रियाओं 21 के साथ नकल करने का प्रयास किया है। छोटी उच्च throughput यहाँ प्रस्तुत विधि पॉलिमर के सैकड़ों की समानांतर जांच की सुविधा आगे के अध्ययन के लिए सुराग की पहचान करने के लिए इन चुनौतियों पर काबू।
माइक्रोएरे विधि से परिणाम मुख्यतः आईडीई के लिए की सेवासंभावना नेतृत्व उम्मीदवारों ntify। चित्रा 2 दिखाता है कम से कम एक प्रजाति के कम बाध्यकारी के साथ 22 उम्मीदवारों, जबकि चित्रा 3 क्षमता बंधन में स्पष्ट कमी को दर्शाता है। चित्रा 2 में दिखाया गया में सभी 22 कम बाध्यकारी पॉलिमर पैमाने अप प्रयोगों के दौरान जो सबसे अच्छा (repellence और कोटिंग गुण के संदर्भ में) PU83, PA13, और PA515 होने के लिए निर्धारित किया गया है में आगे ले जाया गया (आंकड़े 4 और 5)। Polyacrylates polymerization के तरीकों के संदर्भ में अधिक से अधिक लचीलापन प्रदान करते हैं और इतने कम बाध्यकारी polyacrylate, PA13, कैथेटर कोटिंग के अध्ययन के लिए चुना गया था (आंकड़े 6 और 7)। अन्य उम्मीदवारों पर अधिक विस्तृत आगे काम बाहर किया गया था और कहीं और 6 सूचित किया गया है।
प्रयोगात्मक पुनरावृत्तियों के एक नंबर के माध्यम से हम पाया नाबालिग कदम के एक नंबर सफलता और reproducibility के लिए महत्वपूर्ण थे। साथ ही आसंजन की सुविधागिलास स्लाइड के लिए पॉलिमर, एक agarose के तहत कोटिंग, एक साफ पृष्ठभूमि प्रदान करता है के रूप में agarose अत्यधिक बैक्टीरियल उपनिवेशवाद के लिए प्रतिरोधी है का उपयोग कर। इसी तरह बहुलक में स्थिरता के लिए खुद को स्पॉट, दोनों एक ही सरणी के भीतर और सरणियों के बीच, महत्वपूर्ण है और इसलिए सरणियों की छपाई सावधानी से नियंत्रित किया जाना चाहिए। प्रिंट सिर में पिन और 384 अच्छी तरह से थाली की भी वर्दी भरने की सावधानी से समायोजन वर्दी खोलना सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैं। पॉलिमर हम इस्तेमाल से कुछ के रूप autofluorescence के एक डिग्री का प्रदर्शन किया, प्रत्येक स्लाइड के लिए पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति डेटा ले बैक्टीरिया के साथ ऊष्मायन से पहले महत्वपूर्ण था। बदलाव के लिए खाते में करने के लिए और प्राप्त करने के लिए प्रोटीन की मजबूत डेटा प्रतिकृति सलाह दी जाती है।
दाग यहां कार्यरत (DAPI) बैक्टीरियल प्रजातियों, डीएनए के लिए बाध्य गैर विशेष के लिए कोई चयनात्मकता है। इसलिए, अच्छा सड़न रोकनेवाला तकनीक आवश्यक है एक बार बैक्टीरियल संस्कृतियों पेश कर रहे हैं के रूप में दूषित पदार्थों को किसी का ध्यान नहीं जा सकते हैं, interpre भ्रमितपरिणामों की tation। एक ही प्रयोगों बाद स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, जहां यह छड़ और COCCI भेद करने के लिए, लेकिन जीनस या प्रजातियों संभव ही नहीं है का उपयोग करने का सच है।
माइक्रोएरे स्क्रीनिंग के बाद, होनहार पॉलिमर आगे सत्यापन के लिए चुना जाना चाहिए। यहाँ प्रस्तुत उदाहरण में, ब्याज की सात पॉलिमर माइक्रोएरे पर प्रतिदीप्ति में उनके स्पष्ट कमी से पहचान की गई और लगाव के अपने अवरोध बड़ा सतहों पर उन्हें कोटिंग द्वारा पुष्टि की गई। 4 आंकड़े और 5 कांच coverslips, एक पर हासिल बंधन में कमी दिखाने व्यावहारिक अर्थ थोक कोटिंग्स के रूप में करने के बजाय माइक्रोएरे धब्बे के रूप में पॉलिमर के व्यवहार का परीक्षण करने के लिए। बाद में, इन पॉलिमर पूरी तरह से बैक्टीरियल लगाव में कमी यों के लिए चिकित्सा उपकरणों पर लेपित किया गया। यह महत्वपूर्ण है कि विलायक चुना (प्रोटोकॉल धारा 8 देखें) इन कोटिंग की पढ़ाई के लिए वांछित सब्सट्रेट करने के लिए सौम्य है (यहाँ, कैथेटर), जबकि बनाए रखने केआदेश कोटिंग अनुमति देने के लिए, ब्याज की बहुलक भंग करने की क्षमता हैैं। यहाँ, हम एसीटोन, जो गुण का उल्लेख करने के साथ ही, एक कम उबलते बिंदु है और जल्दी evaporates एक समान कोटिंग छोड़ने के लिए इस्तेमाल किया।
विशिष्ट अनुप्रयोग पर निर्भर करेगा चुना सत्यापन के साधनों का अध्ययन किया जा रहा है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और प्रतिदीप्ति द्वारा कोशिकाओं के अवलोकन के अलग-अलग सेल लगाव के प्रत्यक्ष मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है के रूप में, हम थोक धुंधला माइक्रोएरे परख के लिए एक पूरक के रूप में इन तकनीकों को चुना है। परिणाम आंकड़े 6 और 7, जो मानार्थ सत्यापन के तरीकों के महत्व को प्रदर्शित में दिखाया जाता है। चित्रा 6 में confocal छवियों, व्यक्ति की कोशिकाओं की बहुत स्पष्ट छवियों प्रदान करते हुए SEM बहुलक है, जो यहाँ चिकनी और एक समान है की सतह के एक आकलन के लिए अनुमति देने के अतिरिक्त लाभ है। इन तरीकों का इस्तेमाल माइक्रोस्कोप के मद्देनजर क्षेत्र द्वारा सीमित हैं, और इसलिए यह importa हैNT स्नैपशॉट की एक श्रृंखला लेने के लिए परिणामों में विश्वास है। ऊपर वर्णित विधि पूरी सतह पर जीवाणु पालन quantitate नहीं कर सकते, केवल छोटे क्षेत्रों के एक नंबर से कवरेज अनुमान। हम मानते हैं कि यह वर्णित आवेदन के लिए पर्याप्त है। बैक्टीरियल बंधन में कमी के रूप में कहीं और 22 में वर्णित विधियों का उपयोग कर पूरे लेपित और uncoated कैथेटर टुकड़े पर सतह पालन बैक्टीरिया की गणना कर रहा द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। हालांकि इस तरह के तरीकों biomaterial एक वर्दी सतह क्षेत्र है, जो बनाए रखने के लिए जब assays चिकित्सा उपकरणों, जो अक्सर जटिल ज्यामिति के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं मुश्किल है की जांच की सतहों की आवश्यकता होती है।
जाहिर है, नैदानिक इस्तेमाल के लिए करना किसी भी उपकरण सुरक्षा और मानव में प्रभावकारिता सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त आगे के परीक्षण के माध्यम से जाना चाहिए। यहाँ प्रस्तुत विधि इस प्रक्रिया को और आगे काम की शुरुआत का प्रतिनिधित्व विवो गतिविधि की पुष्टि शामिल करना चाहिए। इस मामले में, पढ़ाई शिरापरक गatheters, प्रारंभिक काम रक्त घटकों और बहुलक करने के लिए पूरे कोशिकाओं के बंधन की जांच कर सकता है। बैक्टीरियल बंधन पर रक्त घटकों का प्रभाव भी विचार किया जाना चाहिए संभवतः निष्क्रिय सीरम या डी-fibrinated रक्त 23 की उपस्थिति में बाध्यकारी assays दोहरा द्वारा। प्रौद्योगिकी के निश्चित परीक्षण इस तरह के एक चमड़े के नीचे प्रत्यारोपण संक्रमण मॉडल 24 के रूप में एक विवो मॉडल में होगा।
हम सतह फेरबदल पॉलिमर की स्क्रीनिंग के लिए बहुलक माइक्रोएरे विधि की क्षमता प्रदर्शित करता है। ऐसे पॉलिमर (दोनों का विरोध और बाध्यकारी जीवाणु को बढ़ावा देने) दवा, खाद्य उद्योग और जैव प्रौद्योगिकी में आवेदनों की एक बड़ी संख्या है, इस विधि अर्थ अनुसंधान के कई क्षेत्रों में उपयोगी हो सकता है। हालांकि यहां काम बैक्टीरिया का उपयोग करता है, विधि अन्य प्रकार की कोशिकाओं और इसी तरह अन्य रासायनिक प्रोटीन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
The authors thank EASTBIO (the East of Scotland BioScience Doctoral Training Partnership funded by the BBSRC) (S. V.) and the Medical Research Council (P.J.G) for funding.
Agarose | Sigma | 05066 | |
Silane-prep slides | Sigma | S4651 | |
Polymers | Synthesised in-house | Not applicable | |
NMP | Sigma | 494496 | |
LB Broth | Oxoid | CM1018 | |
DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
Tetrahydrofuran | Sigma | 401757 | |
(3-aminopropyl) triethoxysilane coated glass slides | Sigma | Silane-prep | |
Cacodylate buffer | Sigma | 97068 | |
Catheter 1 | Arrow International | CS12123E | |
Catheter 2 | Baxter Healthcare | ECS1320 | |
Osmium tetroxide | Sigma | 201030 | |
Equipment | |||
Contact printer | Genetix | Qarraymini | |
Microarray microscope | IMSTAR | Pathfinder | |
Spin Coater | Speedline Technologies | 6708D | |
Confocal microscope | Leica | SP5 | |
Image analysis software | Media Cybernetics | Image-Pro Plus | |
Scanning electron microscope | Philips | XL30CP | |
Sputter coater | Bal-Tec | SCD050 |