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Bioengineering

बैक्टीरिया के उच्च throughput पहचान चिकित्सा उपकरणों के लिए पॉलिमर से बचाने वाली क्रीम

doi: 10.3791/54382 Published: November 5, 2016
* These authors contributed equally

Introduction

पॉलिमर प्रोटीन उच्च throughput प्लेटफार्मों जिसमें अप करने के लिए 7,000 पॉलिमर 1 prokaryotic या कोशिकाओं 2 के साथ समानांतर विश्लेषण के लिए गिलास स्लाइड पर मुद्रित कर रहे हैं छोटी रहे हैं। यहाँ प्रस्तुत विधि है जो हम पहले 2010 3 में वर्णित है कि पर बनाता है। इस स्क्रीनिंग प्रणाली मानव hepatocytes 4, स्टेम सेल 5, गुर्दे ट्यूबलर उपकला कोशिकाओं 2, 3,6 बैक्टीरिया और प्रोटोजोआ रोगजनकों 7 सहित कई प्रकार की कोशिकाओं के लिए लागू किया गया है। प्रत्येक मामले में, पॉलिमर कि बढ़ावा देने या अध्ययन के तहत कोशिकाओं के बंधन विरोध 8 पहचान की गई। सिंथेटिक polycationic पॉलिमर के साथ डीएनए के परिसरों भी जीन अभिकर्मक उम्मीदवारों 9 के उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए माइक्रोएरे प्रारूप में इस्तेमाल किया गया है। के रूप में अच्छी तरह से सेल सब्सट्रेट बातचीत के लिए स्क्रीनिंग के रूप में, बहुलक प्रोटीन भी सामग्री गुण 10 के मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया गया है।

"> एक सतह पर बैक्टीरिया की कुर्की मिलाना सिंथेटिक पॉलिमर की क्षमता को अच्छी तरह से 3,6,11 की स्थापना की है। प्रभारी, hydrophobicity और बहुलक सतह से सतह खुरदरापन की खोज biomaterials के जीवाणु बंधन। परंपरागत तरीके को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है सहित कई कारकों कि क्रमिक रूप से के माध्यम से बैक्टीरिया के बंधन विरोध या अनुभव से डिजाइन और एक समय में एक सामग्री के परीक्षण श्रम प्रधान, महंगा है और समय लेने वाली प्रक्रिया है पॉलिमर प्रोटीन ऐसी सीमाओं circumventing के लिए एक आकर्षक विकल्प प्रदान करते हैं।।

सतह से जुड़े बैक्टीरिया बढ़ने के रूप में एक जटिल आबादी एक biofilm करार दिया - जैसे biofilms अत्यधिक कई पर्यावरण तनाव और एंटीबायोटिक दवाओं के लिए प्रतिरोधी रहे हैं। यह उनकी घने बाह्य मैट्रिक्स (प्रोटीन, polysaccharides और न्यूक्लिक एसिड से बना) की वजह से 12 और भाग में biofilms 13 में मजबूत "persistor" कोशिकाओं की वृद्धि की उपस्थिति के कारण भाग में है। हालांकिऊ सतह एसोसिएशन और बाद biofilm गठन की सटीक तंत्र को चिह्नित करने के लिए मुश्किल हैं, यह आम तौर पर माना जाता है कि सतह के विकास के 14 में से तीन अलग-अलग चरणों देखते हैं कि - 16। प्रारंभिक, प्रतिवर्ती लगाव कोशिकाओं की मजबूत आसंजन द्वारा पीछा किया जाता है, एक बाह्य प्रोटीन के उत्पादन और polysaccharide मैट्रिक्स और सेल प्रसार द्वारा एक biofilm की स्थापना। अंत में, परिपक्व biofilm विज्ञप्ति planktonic कोशिकाओं है, जो नए संक्रमण अन्यत्र आरंभ कर सकते हैं मुक्त रहने वाले। जीवाणु-repelling पॉलिमर कि बैक्टीरिया की प्रारंभिक लगाव को रोकने, और इसलिए biofilm गठन के प्रारंभिक दौर को रोकने, संभावित संक्रमण के कम करने के लिए एक उत्कृष्ट समाधान प्रतिनिधित्व करते हैं। एंटीबायोटिक प्रतिरोध के उदय को देखते हुए (और भी सतह से जुड़े बैक्टीरिया 12 की आंतरिक रूप से अधिक से अधिक प्रतिरोध), संक्रमण को कम करने के एंटीबायोटिक मुक्त साधन विशेष रुचि के हैं। एक अस्पताल स्थापित करने में, जीवाणु-repelling बहुलककोटिंग्स nosocomial संक्रमण है, जो आमतौर पर चारों ओर प्रत्यारोपित उपकरणों 17 फार्म की कमी में एक प्रत्यक्ष चिकित्सा आवेदन कर सकते हैं।

इधर, nosocomial संक्रमण के साथ जुड़े रोगजनक बैक्टीरिया की एक सीमा के खिलाफ बचाने वाली क्रीम गतिविधि के लिए 381 पॉलिमर की जांच के लिए एक उच्च throughput विधि, हिट सत्यापन और बाद कोटिंग और केंद्रीय शिरापरक कैथेटर सामग्री की परख, द्वारा पीछा (चित्रा 1) में वर्णित है। संक्षेप में, पॉलिमर संपर्क मुद्रण द्वारा agarose लेपित गिलास स्लाइड पर देखा गया था और, सुखाने और नसबंदी के बाद, छोटी सरणियों चिकित्सकीय महत्वपूर्ण बैक्टीरियल संस्कृतियों के साथ incubated रहे थे। ऊष्मायन के बाद, प्रोटीन धीरे धोया गया और पक्षपाती बैक्टीरियल कोशिकाओं दाग और प्रतिदीप्ति द्वारा कल्पना थे। बाद में, पॉलिमर जो बैक्टीरिया बाध्यकारी हिचकते कांच कवर फिसल जाता है पर कोटिंग से एक बड़े पैमाने पर जांच की और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना थे। चुने गए पीछे हटानाव्रत पॉलिमर तो वाणिज्यिक कैथेटर पर लेपित और लगभग 100 गुना से बैक्टीरिया की कुर्की कम करने के लिए दिखाया गया है।

Protocol

1. Agarose लेपित स्लाइड्स की तैयारी

नोट: बहुलक प्रोटीन fabricating से पहले, aminoalkylsilane लेपित गिलास स्लाइड गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि बाध्यकारी को कम करने और पॉलिमर कि बाँध या बैक्टीरिया 6 पीछे हटाना के मूल्यांकन की अनुमति के लिए agarose आईबी के साथ लेपित हैं। Silane कोटिंग स्लाइड्स के लिए agarose के बंधन की सुविधा।

  1. एक 2% कर (डब्ल्यू / वी) एक 250 मिलीलीटर की बोतल में आसुत जल में agarose आईबी का समाधान।
  2. शिथिल बोतल कैपिंग के बाद, 30 सेकंड के समय में एक माइक्रोवेव ओवन में निलंबन गर्मी जब तक भंग कर दिया। सुनिश्चित करें कि टोपी कसकर किसी भी संभावित दबाव निर्माण से बचने के लिए बंद नहीं है। बोतल नियमित रूप से निकालें और धीरे ज़ुल्फ़।
  3. सुनिश्चित करें कि ठोस भंग कर दिया है और समाधान स्पष्ट है। एक तरल समाधान बनाए रखने के लिए एक 65 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में एक 100 मिलीलीटर बीकर में इस agarose समाधान, और जगह डालो।
  4. agarose समाधान में silane लेपित स्लाइड्स डुबकी, समान कोटिंग सुनिश्चित करने, और वाईएक टिशू पेपर के साथ स्लाइड के पीछे पीई।
  5. (उदाहरण के लिए एक अलमारी के अंदर या हुड धूआं) स्लाइड्स सूखी, लेपित पक्ष के साथ, एक धूल से मुक्त वातावरण में 24 घंटा की एक न्यूनतम के लिए।
  6. दृश्य निरीक्षण द्वारा एक समान कोटिंग की पुष्टि करें। संक्षेपण uncoated क्षेत्रों पर बनेगी - कोटिंग आसानी से स्लाइड पर सांस के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। केवल पूरी तरह से और समान रूप से लेपित स्लाइड माइक्रोएरे मुद्रण के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए।

2. मुद्रण के लिए पॉलिमर समाधान की तैयारी

  1. समाधान तैयार (1% w / v) preformed polyacrylates, polyacrylamides और कांच की शीशियों में एन -methylpyrrolidone (एनएमपी) में polyurethanes से मिलकर पॉलिमर की एक चयन की। (प्रत्येक बहुलक के 1 मिलीलीटर तैयार)। बहुलक जब तक भंवर पूरी तरह से भंग कर रहा है। पॉलिमर के संश्लेषण कहीं और 6 में वर्णित है।
  2. एक माइक्रो पिपेट का प्रयोग, 25 μl बहुलक समाधान के साथ एक 384 microwell प्लेट की हर अच्छी तरह से भरने के कोई पार conta है कि वहाँ सुनिश्चितmination और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए एक अनूठा बहुलक शामिल हैं। कम से कम 2 कुओं में एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एन एम पी का प्रयोग करें। एक अच्छी तरह से थाली टेम्पलेट या स्प्रेडशीट फ़ाइल पर प्रत्येक कुएं में बहुलक समाधान की पहचान रिकॉर्ड।

3. मुद्रण पॉलिमर प्रोटीन एक संपर्क प्रिंटर का उपयोग

नोट: प्रोटीन की छपाई एक संपर्क प्रिंटर का उपयोग किया गया था। बहुलक माइक्रोएरे मुद्रण के संबंध में विशिष्ट निर्देश नीचे दिए गए हैं। प्रिंटर और सुरक्षा सिफारिशों के प्रयोग पर सामान्य दिशा निर्देशों के लिए, निर्माता से उपयोगकर्ता के मैनुअल का पालन करें। यद्यपि हम एक संपर्क प्रिंटर का उपयोग करें, एक उपयुक्त मार्गदर्शन मुद्रांकन उपकरण में भी इस्तेमाल किया जा सकता है।

  1. प्रिंटर उपयोगकर्ता के मैनुअल में सलाह दी, एक दिनचर्या (3.3 कदम देखें) कि quadruplicates में 384 तरल पदार्थ (बहुलक समाधान या एनएमपी) के मुद्रण की अनुमति देता है, एक 32-पिन microarraying सिर (8 पंक्तियों और 4 कॉलम के रूप में व्यवस्थित) का उपयोग कर बना सकते हैं।
  2. 1,536 स्पॉट 48 पंक्तियों और 32 कॉलम के रूप में व्यवस्थित प्रिंट। दिनचर्या कार्यक्रम 12 अनुभाग में मुद्रित करने के लिएएस, अर्थात्।, एक समय में 32 समाधान है, ताकि प्रिंटर प्रत्येक अनुभाग मुद्रण पिनों की सफाई के लिए अनुमति देने के लिए बाद बंद कर दिया जा सकता है।
  3. एक प्रिंटिंग दिनचर्या बनाने के लिए:
    1. सॉफ्टवेयर खोलें और से उपलब्ध विकल्पों का चयन 'एक नई दिनचर्या बनाएं'। प्रयोग के इनपुट विवरण के लिए 'विवरण' टैब का चयन करें। 'हेड' टैब का चयन करें और '32 पिन microarraying सिर 'चुनें।
    2. 'स्रोत' टैब का चयन करें और प्लेट धारक (स्रोत प्लेट धारक (1x5)), थाली प्रकार (प्लेट 384 x 6000), कुल प्लेटों का चयन (1) और स्रोत आदेश (कॉलम) के द्वारा।
    3. टैब 'स्लाइड डिजाइन' में, '3x1' 'स्लाइड चुनें' और प्रोटीन चुनें 'फील्ड संख्या'। फिर 'प्रोटीन पैटर्न' का चयन करें। इनपुट 'लेआउट' और 'पंक्ति संख्या' के रूप में 'पैटर्न आयाम' के रूप में 'स्पॉट देखें' (6), 'कॉलम गिनती' (8), 'पंक्ति पिच' (750) और 'कॉलम पिच' (560)। एक अनुभाग एफआइआर मुद्रित करने के लिए चुनेंटी।
    4. 'स्लाइड लेआउट' टैब इनपुट में स्लाइड्स की संख्या मुद्रण के लिए प्रयोग किया जाता है। (:, मौके के अनुसार टिकटों की संख्या 1: 100 मिसे 5, समय मुद्रांकन: 200 मिसे, समय भनक भनक प्रति टिकटों की संख्या) 'प्रिंट' टैब निवेश करने के लिए मुद्रण मापदंडों का चयन करें।
      नोट: एक नियमित अब quadruplicates में 384 तरल पदार्थ (बहुलक समाधान या एनएमपी) मुद्रण, एक 32-पिन microarraying सिर (8 पंक्तियों और 4 कॉलम के रूप में व्यवस्थित) का उपयोग करने के लिए बनाई गई है। कुल में नियमित 1,536 स्पॉट 48 पंक्तियों और 750 माइक्रोन की एक पंक्ति पिच और 560 माइक्रोन के स्तंभ पिच के साथ 32 कॉलम के रूप में व्यवस्थित प्रिंट चाहिए।
  4. मंच पर agarose लेपित स्लाइड प्लेस और यह एक अच्छा वैक्यूम मुहर स्थिति में स्लाइड्स धारण करने के लिए किया जाता है।
  5. प्रिंट सिर इतना है कि सभी पिन एक ही ऊंचाई पर हैं समायोजित करें। स्वयं एक गिलास स्लाइड पर सिर को कम करने और इस बात की पुष्टि है कि पिंस एक ही समय में ऊपर ले जाने के द्वारा इस की जाँच करें। ऊंचाई के साथ कोई फ़र्क नहीं हैं, तो sleev का उपयोग करके समायोजितपिन ऊपर या नीचे पर ई।
  6. सही ओरिएंटेशन में प्लेट धारक, अर्थात्।, अच्छी तरह से A1 धारक के शीर्ष सही करने के लिए है पर अच्छी तरह से थाली प्लेस और यह सुनिश्चित करना अच्छी तरह से थाली मजबूती से तय हो गई है।
  7. ऊंचाई समायोजक का उपयोग करना, यह सुनिश्चित करें कि प्लेट धारक की ऊंचाई ऐसी है कि जब बहुलक समाधान उठा, पिन कुओं के नीचे नहीं टिकते।
    नोट: यह वर्दी बहुलक खोलना के लिए महत्वपूर्ण है और यह भी आसपास के कुओं में बहुलक समाधान के spilling, जिससे पार संक्रमण के कारण से बचने के लिए है।
  8. 'आरंभ' टैब का चयन करें और 'सामान्य' के रूप में 'भागो प्रकार' चुनें। , 'भागो' पर क्लिक करें, और उस स्लाइड, अच्छी तरह से थाली की पुष्टि, आदि जब प्रेरित स्थिति में हैं।
  9. एक समय (एक समय में 32 समाधान, 12 वर्गों) में प्रिंट 1 अनुभाग, वर्गों के बीच पिनों की सफाई के लिए अनुमति देता है। पिन अच्छी तरह से कागज तौलिया के साथ एसीटोन में डूबा हुआ है, यह सुनिश्चित करने के लिए पिन पूरी तरह से सूख रहे हैं सूखी टिशू पेपर के द्वारा पीछा साफ करें।
  10. प्रोटीन की छपाई के पूरा होने पर, उन्हें एक स्लाइड धारक में डाल दिया है और उन्हें ओवन 45 डिग्री सेल्सियस पर सेट बहुलक स्थानों में एनएमपी को हटाने के लिए एक निर्वात में रात भर सूखी। 30 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के साथ नसबंदी के बाद, प्रोटीन बैक्टीरिया का टीका के लिए तैयार हैं।
  11. बैक्टीरिया के साथ स्लाइड inoculating से पहले, (धारा 5 में वर्णित) पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति की एक माप लेते हैं। बैक्टीरियल बाध्यकारी की गणना में इस माप का प्रयोग करें।

बैक्टीरिया के साथ पॉलिमर प्रोटीन की 4. टीका

ध्यान दें: अच्छा सड़न रोकनेवाला तकनीक सुनिश्चित करें। संस्कृतियों के सभी हैंडलिंग एक बाँझ वातावरण में किया जाना चाहिए: या तो एक लेम्प बर्नर का उपयोग कर या एक प्रवाह हुड में। संस्कृतियों ऑक्सीजन की उपलब्धता, मध्यम विकास, और तापमान प्रत्येक प्रजाति की आवश्यकताओं को समायोजित के साथ हो जाना चाहिए।

  1. 5 मिलीलीटर Luria-Bertani शोरबा (पौंड inoculating द्वारा रात भर संस्कृतियों तैयार: 10 जी एल -1 Bacto-tryptone, 5 ग्राम एल -1 NaCl, और 10 ग्राम एल <sup> -1 एक थाली से एक कॉलोनी के साथ खमीर निकालने)। 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं, 200 rpm पर मिलाते हुए।
  2. ग्लिसरॉल (10% एकाग्रता समग्र) के अलावा द्वारा रात भर संस्कृतियों के फ्रीजर शेयरों को तैयार है और -80 डिग्री सेल्सियस पर शेयर की दुकान।
  3. आदेश thawed बैक्टीरियल शेयरों के नमूनों से सेल नंबर निर्धारित करने के लिए, प्रत्येक शेयर के धारावाहिक dilutions प्रदर्शन और ठोस मीडिया पर रात भर बैक्टीरिया बढ़ने। शेयरों में सेल नंबर का सही निर्धारण प्रत्येक प्रजातियों 6 की उचित टीका सुनिश्चित करता है।
  4. माइक्रोएरे के लिए inocula तैयार करें। एक प्रजाति के रूप में संस्कृतियों से ऊपर हो गई है और प्रोटीन के लिए सीधे लागू कर रहे हैं। BacMix -1 क्लेबसिएला निमोनिया (लालकृष्ण निमोनिया), Staphylococcus saprophyticus (एस saprophyticus), और स्ताफ्य्लोकोच्चुस (एस ऑरियस) के एक जीवाणु मिश्रण है। BacMix-2 एक जीवाणु स्ट्रैपटोकोकस अपरिवर्तक (एस अपरिवर्तक) से मिलकर मिश्रण है, एस ऑरियस लालकृष्ण निमोनिया और उदर faecalis (ई faecalis)।
  5. या तो मिश्रित संस्कृति का उत्पादन करने के लिए, बराबर मात्रा (3 मिलीलीटर प्रत्येक) में overnights मिश्रण और ताजा पौंड के साथ (लगभग 50 मिलीलीटर अंतिम मात्रा करने के लिए) चार बार पतला।
  6. आयताकार 4 अच्छी तरह प्लेटों में यूवी निष्फल बहुलक प्रोटीन की जगह और 5 दिनों के लिए कोमल आंदोलन (30 आरपीएम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रित बैक्टीरियल संस्कृतियों के 6 मिलीलीटर के साथ उन्हें सेते हैं।
  7. ऊष्मायन के बाद, धीरे प्रोटीन दो बार फॉस्फेट बफर खारा से कुल्ला (पीबीएस: 137 मिमी NaCl, 2.7 मिमी KCl, 10 मिमी ना 2 HPO 4, 1.8 मिमी के.एच. 2 पीओ 4) और 1 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर की एक समाधान के साथ सेते -1 4 की ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) पीबीएस में 30 मिनट के लिए दाग।
  8. पीबीएस के साथ कवर और धीरे घूमता है, एक बार पीबीएस बदलकर एक ताजा अच्छी तरह से थाली में दाग माइक्रोएरे स्लाइड्स धो लें। हवा का प्रवाह के तहत सूखी। गोंद के साथ जगह में माइक्रोएरे स्लाइड और सील करने के लिए एक गिलास को कवर पर्ची लागू करें। एक बार घry, 70% (v / v) इथेनॉल के साथ बाहरी सतह बाँझ।
  9. सुरक्षित रूप से संस्कृतियों के अपने रोकथाम के स्तर के हिसाब से निपटाने।

5. माइक्रोएरे इमेजिंग और विश्लेषण

  1. brightfield और DAPI (पूर्व / एम = 358 एनएम / 361 एनएम) चैनलों में प्रत्येक बहुलक स्थान के लिए एकल छवियों पर कब्जा। एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप या एक स्वचालित प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी (एक XYZ चरण एक छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर द्वारा नियंत्रित के साथ) का उपयोग कर एक 20x उद्देश्य से सुसज्जित के साथ स्वयं इस प्रदर्शन करना।
    नोट: सॉफ्टवेयर के संचालन और brightfield और DAPI चैनलों का उपयोग कर छवियों को प्राप्त करने के लिए माइक्रोस्कोप एडजस्ट करने के लिए मार्गदर्शन करने के लिए 18 देखें। सुनिश्चित करें कि सभी प्रोटीन के लिए छवि पर कब्जा के लिए लाभ और जोखिम समय में ही हैं।
  2. मौके क्षेत्र को चुनने के लिए और एक इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर के साथ प्रतिदीप्ति बढ़ाता द्वारा DAPI चैनल में प्रत्येक स्थान की औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता प्राप्त करते हैं।
  3. प्रत्येक स्थान की पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के लिए, obtaएक दोहराने माइक्रोएरे पर बहुलक स्पॉट की छवियों में ही कोई बैक्टीरिया के साथ मीडिया के साथ incubated। बैक्टीरिया से प्रतिदीप्ति प्राप्त करने के लिए मौके की तीव्रता से पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति घटा देते हैं।
  4. चार स्थानों से औसत सामान्यीकृत मूल्य की गणना, प्रत्येक बहुलक, विभिन्न पॉलिमर 6 के बंधन बैक्टीरिया की तुलना के लिए इस्तेमाल किया प्रतिनिधित्व।
  5. पॉलिमर कि कम से कम बैक्टीरियल बाध्यकारी (सबसे कम प्रतिदीप्ति) प्रदर्शनी 'हिट' पॉलिमर 6 के रूप में पहचान।

'हिट' सत्यापन के लिए कवर फिसल जाता है 6. कोटिंग

  1. पॉलिमर के साथ कोट coverslips के लिए:
    1. 'हिट' पॉलिमर के समाधान तैयार (~ डब्ल्यू 2% / वी) tetrahydrofuran में (THF), या अन्य उपयुक्त विलायक।
    2. 10 सेकंड के लिए 2000 rpm पर एक स्पिन coater का उपयोग कर बहुलक समाधान के साथ उपयुक्त आकार की स्पिन कोट परिपत्र कांच coverslips।
      नोट: एक स्पिन coater के अभाव में, coverslips या अन्य सामग्री डुबकी लेपित किया जा सकता है, हालांकि स्पिनकोटिंग एक और अधिक समान सतह पैदा करता है।
    3. रात भर 40 डिग्री सेल्सियस पर एक संवहन ओवन में लेपित coverslips सूखी और inoculating बैक्टीरिया से पहले 30 मिनट के लिए पराबैंगनी प्रकाश का उपयोग कर बाँझ।
  2. नकारात्मक नियंत्रण के लिए agarose के साथ कोट coverslips के लिए:
    1. 10 मिनट के लिए या 4 घंटे के लिए 1 एम NaOH में डुबो स्वच्छ coverslips या तो प्लाज्मा उपचार के द्वारा।
    2. रात भर युक्त 1% (3-aminopropyl) triethoxysilane acetonitrile में coverslips विसर्जित कर दिया। एसीटोन के साथ coverslips साफ 3 बार और 1 घंटे के लिए एक ओवन (100 डिग्री सेल्सियस) में डाल दिया।
    3. डुबकी कोट 60 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में बनाए रखा 1% agarose जलीय समाधान के साथ सूखे coverslips। सपाट सतह पर agarose लेपित coverslips 24 घंटे के लिए धूल से मुक्त परिवेश की स्थिति में रखें और inoculating बैक्टीरिया से पहले 30 मिनट के लिए पराबैंगनी प्रकाश का उपयोग कर बाँझ।

7. अनुलग्नक और कवर पर्ची स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग का विश्लेषण (SEM)

  1. बाद30 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के साथ नसबंदी, खंड में वर्णित के रूप में एक मानक 12 अच्छी तरह से थाली या 24 अच्छी तरह से थाली (coverslips के आकार पर निर्भर करता है) में कवर फिसल जाता है (पॉलिमर / agarose लेपित या uncoated ग्लास) जगह और बैक्टीरिया के साथ सेते 4।
  2. बैक्टीरिया के साथ ऊष्मायन के बाद, 0.1 एम cacodylate बफर (7.4 पीएच) के साथ दो बार uncoated और लेपित coverslips धोने और फिर 2 घंटे के लिए 2.5% (w / v) 0.1 एम cacodylate बफर में glutaraldehyde (7.4 पीएच) के साथ तय कर लो।
  3. 1% (w / v) कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए आज़मियम tetroxide और 30 मिनट प्रत्येक के लिए 50, 70, 90 और 100% (वी / वी) पर अनुक्रमिक इथेनॉल washes के साथ निर्जलीकरण के साथ के बाद तय नमूने हैं।
  4. मानक प्रोटोकॉल 19 के अनुसार सीओ 2 में सूखी नमूने हैं। सुखाने समय नमूना की प्रकृति पर निर्भर करेगा।
  5. एक सोना / पैलेडियम मिश्र (60/40%) 0.75 से कम 30 मा वर्तमान और वैक्यूम के साथ एक धूम coater का उपयोग कर Torr में कोट नमूने हैं। मानक प्रोटोकॉल 20 प्रति के रूप में एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के तहत जांच करते हैं।
    नोट: EnsUre पर्याप्त सुरक्षा सावधानियों भंडारण, हैंडलिंग और आज़मियम tetroxide के निपटान से उत्पन्न जोखिम का प्रबंधन करने के लिए है, क्योंकि यह बेहद जहरीला है।
  6. दिखने में uncoated coverslips की छवियों की तुलना और agarose या 'हिट' पॉलिमर के साथ लेपित उन पॉलिमर के जीवाणु बंधन / repelling क्षमताओं की पुष्टि करें।
    नोट: लगाव का प्रतिरोध मौजूद कोशिकाओं की कमी के रूप में आसानी से दिखाई जानी चाहिए।
  7. चुनें सबसे होनहार चिकित्सा उपकरणों (जैसे, केंद्रीय शिरापरक कैथेटर) 6 के साथ कोटिंग के अध्ययन के लिए 'हिट' गैर-बाध्यकारी पॉलिमर।

8. कोटिंग कैथेटर के लिए एक विलायक का चयन

  1. कैथेटर की निबाह भाग के साथ अपनी संगतता, साथ ही उनके 'हिट' बहुलक भंग करने की क्षमता के लिए विभिन्न सॉल्वैंट्स का मूल्यांकन। लंबाई में कैथ -1 की और बेलनाकार टुकड़ों में 5 मिमी भागों में कटौती, और एक डिजिटल वर्नियर कैलिपर के साथ मापने।
  2. इस तरह के ए सी इ टी के रूप में विभिन्न सॉल्वैंट्स का मूल्यांकनआईसी एसिड, अमोनिया, एसीटोन, acetonitrile, diethyl ईथर, tetrahydrofuran (THF), dimethylformamide (DMF), एन -methyl-2-pyrrolidone (एनएमपी), इथेनॉल, मेथनॉल, इथाइलीन ग्लाइकॉल, टोल्यूनि और xylene। 12 घंटे के लिए सॉल्वैंट्स में कैथेटर टुकड़े को विसर्जित कर दिया और कैथेटर और विलायक की स्पष्टता की अखंडता के लिए नेत्रहीन मूल्यांकन।
    नोट: एक विलायक कि कैथेटर प्रफुल्लित या बिखर या एक पंकिल विलायक में परिणाम के लिए कारण नहीं है चुनें। विलायक 'हिट' पॉलिमर भंग करना चाहिए।

9. confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा पर कैथेटर्स बैक्टीरियल लगाव का विश्लेषण

  1. 2.5% तैयार (w / v) एसीटोन, या अन्य उपयुक्त विलायक में बहुलक समाधान एक छोटे कांच की शीशियों (5 एमएल) में खंड में निर्धारित 8. प्लेस 5 मिमी कैथेटर टुकड़े और 2 मिनट के लिए बहुलक समाधान के 1 मिलीलीटर में उन्हें विसर्जित कर के रूप में । अतिरिक्त बहुलक समाधान निकालें और 40 डिग्री सेल्सियस पर एक वैक्यूम ओवन में रात भर कैथेटर टुकड़े सूखी।
  2. Thawed बैक्टीरियल सेंट मिश्रण से तैयार inoculumocks 50 मिलीलीटर लेग 6 में प्रत्येक प्रजातियों में से लगभग 10 6 कोशिकाओं देने के लिए।
  3. 30 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के साथ लेपित और uncoated कैथेटर टुकड़े जीवाणुरहित और, 3 दिनों के लिए, एक 24 अच्छी तरह से थाली में पौंड टीका 1 मिलीलीटर के साथ सेते कोमल आंदोलन 6 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर।
  4. ऊष्मायन के बाद, पीबीएस (2x, 2 एमएल) के साथ कैथेटर धोने के 30 मिनट के लिए पीबीएस में 10% paraformaldehyde के साथ बैक्टीरिया ठीक है, और पीबीएस (1 मिलीलीटर) से धो लें। DAPI के साथ कैथेटर टुकड़े पर बैक्टीरिया (1 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर - 1) दाग 20 मिनट के लिए और पीबीएस (1 मिलीलीटर) से धो लें।
  5. - Airy1, छवि का आकार - 1024 × 1024 पिक्सल, voxel चौड़ाई - 105.2 एनएम, जेड ढेर 0.5μ मीटर रिक्ति 405nm डायोड लेजर नीले, डिटेक्टर रेंज 414 502 एनएम के लिए, पिन होल: निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग कैथेटर टुकड़े के confocal छवियों को प्राप्त , बढ़ाई - 40X 1.25।
  6. जेड-स्टैकिंग कैथेटर की 100 माइक्रोन लंबाई भर में 50 छवियों द्वारा confocal इमेजिंग पूरा करें।
  7. suitab का उपयोग कर छवियों का विश्लेषण करेंLe विश्लेषण सॉफ्टवेयर: जेड विमान में जेड-खड़ी छवियों को समतल, समारोह का उपयोग कर क्षेत्र की गहराई का विस्तार करने के लिए, एक कैथेटर टुकड़े के लिए एक एकल छवि बनाने के लिए।
    नोट: इस छवि को तो कैथेटर बैक्टीरिया द्वारा कवर के क्षेत्र प्राप्त करने के लिए, पृष्ठभूमि सुधार 'समतल पृष्ठभूमि' समारोह का उपयोग करने के बाद विश्लेषण किया जाना चाहिए।

10 SEM द्वारा कैथेटर्स पर बैक्टीरियल लगाव का विश्लेषण

  1. 10% एसीटोन में (v / डब्ल्यू) बहुलक समाधान तैयार है।
  2. कैथेटर की कटौती टुकड़े के मध्य भाग में (200 μl micropipette के लिए) इसे पकड़ और लगभग 30 सेकंड के लिए बहुलक समाधान में टुकड़ा डुबकी के लिए एक विंदुक टिप दबाएँ। 30 मिनट के लिए परिवेश की स्थिति में लेपित टुकड़ा सूखी। बहुलक समाधान और परिवेश की स्थिति में सूखे रात भर में फिर से डुबो कर एक दूसरे कोटिंग लागू होते हैं।
  3. यूवी उपचार और बैक्टीरिया के साथ ऊष्मायन के बाद टुकड़े (एन = 3) पीबीएस के साथ (2x, 1 मिलीलीटर) और उन्हें 48 अच्छी तरह प्लेटें 1 युक्त में स्थानांतरित धोने30 मिनट के लिए पीबीएस में 0% formaldehyde। फिक्सिंग के बाद, पीबीएस (1 मिलीलीटर), कमरे के तापमान पर सूखी रातोंरात के साथ टुकड़े धोने प्रवाहकीय कार्बन डिस्क के साथ स्टब्स पर माउंट, और सोने की एक धूम coater का उपयोग कर कोट (कदम 7.5 देखें)।
  4. एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप 6 का उपयोग कर छवियों प्राप्त करते हैं।

Representative Results

चित्रा 2 के रूप में माइक्रोएरे विश्लेषण द्वारा निर्धारित पॉलिमर के एक नंबर के लिए बैक्टीरियल लगाव (सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता) से पता चलता है। बहुलक बिना मुद्रित स्पॉट (एनएमपी केवल) नकारात्मक नियंत्रण, के रूप में agarose दृढ़ता से बाध्यकारी 6 जीवाणु को तैयार नहीं हैं - दर्ज की रोशनी बहुत कम है। पॉलिमर से प्रदर्शित सभी कम बाध्यकारी हैं, हालांकि ज्यादातर मामलों में, एक बहुलक का प्रतिकारक गुण परीक्षण किया बैक्टीरियल प्रजातियों के बीच काफी भिन्न होता है। यह अलग प्रजातियों भर लगाव तंत्र के बीच व्यापक अंतर को दर्शाता है। एक उपयुक्त बहुलक का चयन इसलिए आवेदन पर निर्भर है, लेकिन कम से बाध्यकारी पॉलिमर आसानी से agarose के साथ तुलना द्वारा पहचाने जाते हैं। उच्च बाध्यकारी पॉलिमर एक सरणी में पहचान होने की संभावना है, और बाद के प्रयोगों के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। पॉलिमर कि DAPI चैनल में ऑटो प्रतिदीप्ति दिखाने के लिए नहीं है के लिए, गुणात्मक सह(के रूप में 3 चित्र में दिखाया गया है, एक प्रतिनिधि उच्च बाध्यकारी बहुलक और तीन उदाहरण कम बाध्यकारी पॉलिमर पर प्रकाश डाला) की मौके छवियों के mparison नेत्रहीन बनाया जा सकता है। इस तरह की तुलना, सांख्यिकीय विश्लेषण से भी कम समय में जानकारी प्रदान करते हुए, गणना की तीव्रता मूल्यों का एक उपयोगी दृश्य सत्यापन हो सकता है।

22 उचित पॉलिमर के साथ माइक्रोएरे का उपयोग कर पहचाना, पैमाने अप प्रयोगों जब कोटिंग बड़ा सतहों के लिए इस्तेमाल के लिए अपने बैक्टीरिया से बचाने वाली क्रीम संपत्ति पुष्टि करने के लिए किया जाता है। दिखाया गया है सबसे अच्छा प्रदर्शन उदाहरण, कोट कांच कवर फिसल जाता है (SEM द्वारा विश्लेषण (आंकड़े 4 और 5)) और कैथेटर स्लाइस (confocal माइक्रोस्कोपी (चित्रा 6) और SEM द्वारा विश्लेषण (चित्रा 7)) करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। दोनों सूक्ष्म तरीकों सतह पर सीधा कोशिकाओं की गिनती की इजाजत दी, स्पष्ट डेटा उपलब्ध कराने का लाभ उठा रहे हैं; सेल लगाव में कमी को आसानी से visibl हैई। उन कोटिंग्स जो सबसे अच्छा के रूप में अच्छी तरह से बड़े पैमाने पर कोटिंग तकनीक के लिए उत्तरदायी होने के रूप में बड़े पैमाने अप पर अपने प्रतिकारक गुण को बनाए रखा, आगे की जांच की गई। दिखाए गए परिणामों प्रत्येक मंच से सबसे अच्छा प्रदर्शन पॉलिमर को दर्शाते हैं।

आकृति 1
चित्रा 1:। जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए बहुलक प्रोटीन के माध्यम से बैक्टीरिया से बचाने वाली क्रीम पॉलिमर की पहचान करने में शामिल कदम SEM = स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी।

चित्र 2
चित्रा 2:। बैक्टीरियल पॉलिमर की एक श्रृंखला, माइक्रोएरे विश्लेषण द्वारा निर्धारित पर बाध्यकारी कम बैक्टीरियल बाध्यकारी polyacrylates / acrylamides (पीए) और polyurethanes (पु) के एक नंबर पर देखा जाता है। बहुलक प्रोटीन से परिणाम कई जीवाणु के साथ जांच PECIES (सी जेजुनी, सी बेलगाम, सी perfringens, एस अपरिवर्तक, और दो भागीदारी; BacMix -1 और BacMix -2) दिखाए जाते हैं। बैक्टीरियल व्यक्त बंधन के रूप में पृष्ठभूमि को सही मतलब DAPI प्रतिदीप्ति तीव्रता (सामान्यीकृत)। त्रुटि सलाखों के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते। संदर्भ 6 से अनुकूलित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। BacMix -2 के बहुलक स्पॉट के उदाहरण छवियों प्रतिदीप्ति (DAPI) और brightfield माइक्रोस्कोपी छवियों प्रतिनिधि पॉलिमर पर बैक्टीरियल लगाव दिखा। एक जोरदार बाध्यकारी बहुलक कई गैर बाध्यकारी पॉलिमर (पु-20, पीए 336 और पु-179) की तुलना के लिए शामिल है। स्केल बार = 100 माइक्रोन। संदर्भ 6 से अनुकूलित।: //www.jove.com/files/ftp_upload/54382/54382fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: कांच कवर फिसल जाता है के साथ बड़े पैमाने अप प्रयोगों uncoated कांच और कांच 'हिट' पॉलिमर (तालिका 1 में से चुना उदाहरण) के साथ लेपित पर बैक्टीरियल लगाव दिखा SEM छवियों।। स्केल सलाखों = 20 माइक्रोन।

चित्रा 5
चित्रा 5:। बैक्टीरियल SEM छवियों से कोशिकाओं की गिनती द्वारा मात्रा बंधन सर्वश्रेष्ठ 'हिट' पॉलिमर के साथ लेपित सतहों की प्रति इकाई क्षेत्र जुड़ी कोशिकाओं की तुलना करें। Agarose एक नियंत्रण बाध्यकारी सतह के रूप में कांच के साथ, एक नियंत्रण 'गैर बाध्यकारी' सतह के रूप में इस्तेमाल किया गया था। त्रुटि सलाखों प्रतिनिधित्वमानक विचलन।

चित्रा 6
चित्रा 6: लेपित और uncoated कैथेटर स्लाइस पर बैक्टीरियल बंधन की तुलना Confocal छवियों BacMix-2 के साथ इलाज कैथेटर (कैथ-1) (ए) और कैथेटर PA13 (बी) के साथ लेपित ऊष्मायन के बाद की तुलना।। एक 40x उद्देश्य (स्केल बार = 20 माइक्रोन) के साथ लिया छवियाँ। संदर्भ 6 से अनुकूलित।

चित्रा 7
चित्रा 7:। लेपित और uncoated कैथेटर स्लाइस पर बैक्टीरियल बंधन की तुलना SEM छवियों इलाज कैथेटर (कैथ-1) (ए) और कैथेटर एक जीवाणु कॉकटेल BacMix -2 से मिलकर साथ ऊष्मायन के बाद PA13 (बी) के साथ लेपित की तुलना दिखाने स्केल। सलाखों = 101; मी। संदर्भ 6 से अनुकूलित।

पॉलिमर monomer 1 monomer 2 monomer 3 Monomers के अनुपात
PA465 MEMA DEAEMA HEA 8 1 1
PA475 MEMA DEAEA हेमा 6 1 3
PA513 MEMA DEAEMA एमएमए 8 1 1
PA515 MEMA DEAEA एमएमए 6 1 3
PA13 DMAA - 9 1 -
PU1 PEG2000 एचडीआई - 4.9 5.2 -
PU16 PEG2000 एमडीआई - 4.9 5.2 -
PU161 PEG2000 एमडीआई बी.डी. 2.5 5.2 2.3
PU7 PEG900 Bich - 4.9 5.2 -
PU83 PEG900 HMDI बी.डी. 2.5 5.2 2.3
PU227 PPG खूंटी 1900 एचडीआई - 4.9 5.2 -
PU129 PPG425 Bich DMAPD 2.5 5.2 2.3
PU10 PTMG2000 Bich - 4.9 5.2 -
PU179 PTMG2000 एचडीआई NMAPD 2.5 5.2 2.3
PU20 PTMG2000 एमडीआई - 4.9 5.2 -
PU5 PTMG2000 एचडीआई - 4.9 5.2 -

तालिका 1: बैक्टीरिया की संरचना गैर बाध्यकारी चित्रा 2 में पॉलिमर 'हिट'।

Discussion

एक सतह पर बैक्टीरिया की कुर्की के लिए एक जटिल बैक्टीरियल प्रजातियों पर निर्भर कारकों की एक विस्तृत श्रृंखला के द्वारा निर्धारित प्रक्रिया है, सतह के आसपास के मध्यम और भौतिक वातावरण के गुणों। हालांकि कुछ रासायनिक समूहों बैक्टीरियल बाध्यकारी को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है (Polyglycols, उदाहरण के लिए, आम तौर पर कुर्की 11 का विरोध), उनकी रासायनिक संरचना के साथ पॉलिमर के जैविक प्रभाव correlating मुश्किल है, चुनौतीपूर्ण विशिष्ट कार्यों के लिए पॉलिमर के तर्कसंगत डिजाइन कर रही है। विस्तृत लगाव तंत्र के अभाव में, अन्य अध्ययनों से प्राकृतिक रूप से पाए बचाने वाली क्रीम सतहों, लंबा और व्यापक अनुकूलन प्रक्रियाओं 21 के साथ नकल करने का प्रयास किया है। छोटी उच्च throughput यहाँ प्रस्तुत विधि पॉलिमर के सैकड़ों की समानांतर जांच की सुविधा आगे के अध्ययन के लिए सुराग की पहचान करने के लिए इन चुनौतियों पर काबू।

माइक्रोएरे विधि से परिणाम मुख्यतः आईडीई के लिए की सेवासंभावना नेतृत्व उम्मीदवारों ntify। चित्रा 2 दिखाता है कम से कम एक प्रजाति के कम बाध्यकारी के साथ 22 उम्मीदवारों, जबकि चित्रा 3 क्षमता बंधन में स्पष्ट कमी को दर्शाता है। चित्रा 2 में दिखाया गया में सभी 22 कम बाध्यकारी पॉलिमर पैमाने अप प्रयोगों के दौरान जो सबसे अच्छा (repellence और कोटिंग गुण के संदर्भ में) PU83, PA13, और PA515 होने के लिए निर्धारित किया गया है में आगे ले जाया गया (आंकड़े 4 और 5)। Polyacrylates polymerization के तरीकों के संदर्भ में अधिक से अधिक लचीलापन प्रदान करते हैं और इतने कम बाध्यकारी polyacrylate, PA13, कैथेटर कोटिंग के अध्ययन के लिए चुना गया था (आंकड़े 6 और 7)। अन्य उम्मीदवारों पर अधिक विस्तृत आगे काम बाहर किया गया था और कहीं और 6 सूचित किया गया है।

प्रयोगात्मक पुनरावृत्तियों के एक नंबर के माध्यम से हम पाया नाबालिग कदम के एक नंबर सफलता और reproducibility के लिए महत्वपूर्ण थे। साथ ही आसंजन की सुविधागिलास स्लाइड के लिए पॉलिमर, एक agarose के तहत कोटिंग, एक साफ पृष्ठभूमि प्रदान करता है के रूप में agarose अत्यधिक बैक्टीरियल उपनिवेशवाद के लिए प्रतिरोधी है का उपयोग कर। इसी तरह बहुलक में स्थिरता के लिए खुद को स्पॉट, दोनों एक ही सरणी के भीतर और सरणियों के बीच, महत्वपूर्ण है और इसलिए सरणियों की छपाई सावधानी से नियंत्रित किया जाना चाहिए। प्रिंट सिर में पिन और 384 अच्छी तरह से थाली की भी वर्दी भरने की सावधानी से समायोजन वर्दी खोलना सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैं। पॉलिमर हम इस्तेमाल से कुछ के रूप autofluorescence के एक डिग्री का प्रदर्शन किया, प्रत्येक स्लाइड के लिए पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति डेटा ले बैक्टीरिया के साथ ऊष्मायन से पहले महत्वपूर्ण था। बदलाव के लिए खाते में करने के लिए और प्राप्त करने के लिए प्रोटीन की मजबूत डेटा प्रतिकृति सलाह दी जाती है।

दाग यहां कार्यरत (DAPI) बैक्टीरियल प्रजातियों, डीएनए के लिए बाध्य गैर विशेष के लिए कोई चयनात्मकता है। इसलिए, अच्छा सड़न रोकनेवाला तकनीक आवश्यक है एक बार बैक्टीरियल संस्कृतियों पेश कर रहे हैं के रूप में दूषित पदार्थों को किसी का ध्यान नहीं जा सकते हैं, interpre भ्रमितपरिणामों की tation। एक ही प्रयोगों बाद स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, जहां यह छड़ और COCCI भेद करने के लिए, लेकिन जीनस या प्रजातियों संभव ही नहीं है का उपयोग करने का सच है।

माइक्रोएरे स्क्रीनिंग के बाद, होनहार पॉलिमर आगे सत्यापन के लिए चुना जाना चाहिए। यहाँ प्रस्तुत उदाहरण में, ब्याज की सात पॉलिमर माइक्रोएरे पर प्रतिदीप्ति में उनके स्पष्ट कमी से पहचान की गई और लगाव के अपने अवरोध बड़ा सतहों पर उन्हें कोटिंग द्वारा पुष्टि की गई। 4 आंकड़े और 5 कांच coverslips, एक पर हासिल बंधन में कमी दिखाने व्यावहारिक अर्थ थोक कोटिंग्स के रूप में करने के बजाय माइक्रोएरे धब्बे के रूप में पॉलिमर के व्यवहार का परीक्षण करने के लिए। बाद में, इन पॉलिमर पूरी तरह से बैक्टीरियल लगाव में कमी यों के लिए चिकित्सा उपकरणों पर लेपित किया गया। यह महत्वपूर्ण है कि विलायक चुना (प्रोटोकॉल धारा 8 देखें) इन कोटिंग की पढ़ाई के लिए वांछित सब्सट्रेट करने के लिए सौम्य है (यहाँ, कैथेटर), जबकि बनाए रखने केआदेश कोटिंग अनुमति देने के लिए, ब्याज की बहुलक भंग करने की क्षमता हैैं। यहाँ, हम एसीटोन, जो गुण का उल्लेख करने के साथ ही, एक कम उबलते बिंदु है और जल्दी evaporates एक समान कोटिंग छोड़ने के लिए इस्तेमाल किया।

विशिष्ट अनुप्रयोग पर निर्भर करेगा चुना सत्यापन के साधनों का अध्ययन किया जा रहा है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और प्रतिदीप्ति द्वारा कोशिकाओं के अवलोकन के अलग-अलग सेल लगाव के प्रत्यक्ष मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है के रूप में, हम थोक धुंधला माइक्रोएरे परख के लिए एक पूरक के रूप में इन तकनीकों को चुना है। परिणाम आंकड़े 6 और 7, जो मानार्थ सत्यापन के तरीकों के महत्व को प्रदर्शित में दिखाया जाता है। चित्रा 6 में confocal छवियों, व्यक्ति की कोशिकाओं की बहुत स्पष्ट छवियों प्रदान करते हुए SEM बहुलक है, जो यहाँ चिकनी और एक समान है की सतह के एक आकलन के लिए अनुमति देने के अतिरिक्त लाभ है। इन तरीकों का इस्तेमाल माइक्रोस्कोप के मद्देनजर क्षेत्र द्वारा सीमित हैं, और इसलिए यह importa हैNT स्नैपशॉट की एक श्रृंखला लेने के लिए परिणामों में विश्वास है। ऊपर वर्णित विधि पूरी सतह पर जीवाणु पालन quantitate नहीं कर सकते, केवल छोटे क्षेत्रों के एक नंबर से कवरेज अनुमान। हम मानते हैं कि यह वर्णित आवेदन के लिए पर्याप्त है। बैक्टीरियल बंधन में कमी के रूप में कहीं और 22 में वर्णित विधियों का उपयोग कर पूरे लेपित और uncoated कैथेटर टुकड़े पर सतह पालन बैक्टीरिया की गणना कर रहा द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। हालांकि इस तरह के तरीकों biomaterial एक वर्दी सतह क्षेत्र है, जो बनाए रखने के लिए जब assays चिकित्सा उपकरणों, जो अक्सर जटिल ज्यामिति के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं मुश्किल है की जांच की सतहों की आवश्यकता होती है।

जाहिर है, नैदानिक ​​इस्तेमाल के लिए करना किसी भी उपकरण सुरक्षा और मानव में प्रभावकारिता सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त आगे के परीक्षण के माध्यम से जाना चाहिए। यहाँ प्रस्तुत विधि इस प्रक्रिया को और आगे काम की शुरुआत का प्रतिनिधित्व विवो गतिविधि की पुष्टि शामिल करना चाहिए। इस मामले में, पढ़ाई शिरापरक गatheters, प्रारंभिक काम रक्त घटकों और बहुलक करने के लिए पूरे कोशिकाओं के बंधन की जांच कर सकता है। बैक्टीरियल बंधन पर रक्त घटकों का प्रभाव भी विचार किया जाना चाहिए संभवतः निष्क्रिय सीरम या डी-fibrinated रक्त 23 की उपस्थिति में बाध्यकारी assays दोहरा द्वारा। प्रौद्योगिकी के निश्चित परीक्षण इस तरह के एक चमड़े के नीचे प्रत्यारोपण संक्रमण मॉडल 24 के रूप में एक विवो मॉडल में होगा।

हम सतह फेरबदल पॉलिमर की स्क्रीनिंग के लिए बहुलक माइक्रोएरे विधि की क्षमता प्रदर्शित करता है। ऐसे पॉलिमर (दोनों का विरोध और बाध्यकारी जीवाणु को बढ़ावा देने) दवा, खाद्य उद्योग और जैव प्रौद्योगिकी में आवेदनों की एक बड़ी संख्या है, इस विधि अर्थ अनुसंधान के कई क्षेत्रों में उपयोगी हो सकता है। हालांकि यहां काम बैक्टीरिया का उपयोग करता है, विधि अन्य प्रकार की कोशिकाओं और इसी तरह अन्य रासायनिक प्रोटीन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma 05066 
Silane-prep slides Sigma S4651
Polymers Synthesised in-house Not applicable
NMP Sigma 494496
LB Broth Oxoid CM1018
DAPI Thermo Fisher D1306
Tetrahydrofuran Sigma 401757
(3-aminopropyl) triethoxysilane coated glass slides Sigma Silane-prep
Cacodylate buffer Sigma 97068
Catheter 1 Arrow International CS12123E
Catheter 2 Baxter Healthcare ECS1320
Osmium tetroxide Sigma 201030
Equipment
Contact printer Genetix Qarraymini
Microarray microscope IMSTAR Pathfinder
Spin Coater Speedline Technologies 6708D
Confocal microscope Leica SP5
Image analysis software Media Cybernetics Image-Pro Plus
Scanning electron microscope Philips XL30CP
Sputter coater Bal-Tec SCD050

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References

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बैक्टीरिया के उच्च throughput पहचान चिकित्सा उपकरणों के लिए पॉलिमर से बचाने वाली क्रीम
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Venkateswaran, S., Gwynne, P. J., Wu, M., Hardman, A., Lilienkampf, A., Pernagallo, S., Blakely, G., Swann, D. G., Bradley, M., Gallagher, M. P. High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices. J. Vis. Exp. (117), e54382, doi:10.3791/54382 (2016).More

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