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Bioengineering

High-throughput identificazione di batteri Polimeri repellente per dispositivi medici

doi: 10.3791/54382 Published: November 5, 2016
* These authors contributed equally

Introduction

Microarrays polimeri sono miniaturizzati piattaforme high-throughput in cui fino a 7.000 polimeri 1 sono stampati su vetrini per l'analisi in parallelo con le cellule procariote o eucariote 2. Il metodo presentato qui si basa su ciò che abbiamo prima descritto nel 2010 3. Questo sistema di screening è stato applicato a numerosi tipi di cellule tra cui epatociti umani 4, cellule staminali 5, tubulare renale cellule epiteliali 2, batteri e agenti patogeni 3,6 protozoi 7. In ogni caso, i polimeri che promuovono o resistere legame delle cellule in fase di studio sono stati identificati 8. Complessi di DNA con polimeri sintetici policationici sono stati utilizzati anche nel formato microarray per high-throughput screening di candidati gene trasfezione 9. Così come screening per le interazioni cellula-substrato, microarrays polimeri sono stati utilizzati anche per valutare le proprietà del materiale 10.

"> La capacità di polimeri sintetici per modulare attacco di batteri su una superficie è ben definito 3,6,11. Numerosi fattori, tra cui carica, idrofobicità e rugosità superficiale della superficie polimerica sono noti per influenzare batteriche. Gli approcci convenzionali vincolanti biomateriali scoperta che resistono legame di batteri attraverso la sequenza o empiricamente progettare e testare un materiale alla volta sono, costosi e processi in termini di tempo ad alta intensità di manodopera. microarray polimeri offrono una valida alternativa per aggirare tali limitazioni.

batteri superficiali associati crescere come popolazione complesso definito un biofilm - tali biofilm sono altamente resistenti a molti stress ambientali e antibiotici. Ciò è in parte dovuto alla loro matrice extracellulare densa (composto da proteine, polisaccaridi e acidi nucleici) 12 e in parte a causa della maggiore presenza di robusti "persistor" cellule in biofilm 13. although i precisi meccanismi di associazione di superficie e la successiva formazione di biofilm sono difficili da caratterizzare, in genere si ritiene che ci sono tre diverse fasi di crescita della superficie 14 - 16. , Attaccamento reversibili iniziale è seguita da forte adesione delle cellule, la creazione di un biofilm per la produzione di una proteina extracellulare e della matrice polisaccaride e la proliferazione cellulare. Infine, i rilasci biofilm maturi cellule planctonici, che possono avviare nuove infezioni altrove a vita libera. Batteri-repellente polimeri che impediscono l'attacco iniziale di batteri, e quindi impediscono prime fasi di formazione del biofilm, potenzialmente rappresentano un'ottima soluzione per minimizzare le infezioni. Dato l'aumento della resistenza agli antibiotici (e anche l'intrinseca maggiore resistenza dei batteri di superficie associati 12), mezzi antibiotici libera di ridurre le infezioni sono di particolare interesse. In un ambiente ospedaliero, polimero batteri-repellenterivestimenti possono avere una applicazione medica diretta nella riduzione delle infezioni nosocomiali, che comunemente si formano intorno dispositivi impiantati 17.

Qui, un metodo ad alta produttività per la proiezione di 381 polimeri per l'attività repellente contro una serie di batteri patogeni associati alle infezioni nosocomiali, seguita da convalida colpo e successivo rivestimento e dosaggio dei materiali dei cateteri venosi centrali, è descritto (Figura 1). In breve, i polimeri sono stati avvistati su agarosio rivestite vetrini di stampa a contatto e, dopo l'essiccazione e la sterilizzazione, gli array miniaturizzati sono state incubate con clinicamente importanti colture batteriche. Dopo l'incubazione, i microarray sono state delicatamente lavati e le cellule batteriche aderenti erano macchiate e visualizzate mediante fluorescenza. Successivamente, polimeri che inibito batterica vincolanti sono stati studiati su scala più vasta stendendo su copertura in vetro scivola e visualizzati al microscopio elettronico. respingono selezionatipolimeri prestati sono stati poi rivestiti su cateteri commerciali e dimostrato di ridurre l'attaccamento dei batteri di quasi 100 volte.

Protocol

1. Preparazione di vetrini rivestiti Agarose

NOTA: prima di fabbricare i microchip polimero, vetrini aminoalkylsilane rivestite sono rivestiti con agarosio IB per ridurre al minimo non specifici sfondo vincolanti e consentire la valutazione dei polimeri che si legano o respingono batteri 6. Rivestimento silano facilita il legame di agarosio alle diapositive.

  1. Portare a 2% (w / v) di agarosio IB in acqua distillata in una bottiglia da 250 ml.
  2. Dopo tappatura la bottiglia in modo impreciso, riscaldare la sospensione in un forno a microonde in 30 periodi sec fino alla dissoluzione. Assicurarsi che il tappo non è ben chiuso per evitare ogni potenziale accumulo di pressione fino. Rimuovere la bottiglia regolarmente e miscelare delicatamente.
  3. Assicurarsi che il solido si è sciolto e la soluzione è limpida. Versare questa soluzione di agarosio in un becher da 100 ml, e posto in un bagno d'acqua a 65 ° C per mantenere una soluzione liquida.
  4. Immergere i vetrini rivestiti di silano nella soluzione di agarosio, assicurando rivestimento uniforme, e wipe il retro del vetrino con carta velina.
  5. Essiccare i vetrini, con il lato rivestito up, in un ambiente privo di polvere (ad esempio, all'interno di un armadio o fumi cappa) per un minimo di 24 ore.
  6. Confermare un rivestimento uniforme mediante ispezione visiva. Rivestimento può essere facilmente valutata respirando sul vetrino - condensa si formerà sulle regioni non rivestiti. Solo vetrini rivestiti interamente e in modo uniforme devono essere utilizzati per la stampa di microarray.

2. Preparazione di Polymer Solutions per la stampa

  1. Preparare soluzioni (1% w / v) di una selezione di polimeri preformati costituiti da poliacrilati, poliacrilammidi e poliuretani a N -methylpyrrolidone (NMP) in fiale di vetro. (Preparare 1 ml di ciascun polimero). Vortex finché il polimero è completamente dissolto. Sintesi di polimeri è descritta altrove 6.
  2. Usando una micro-pipetta, riempire ogni pozzetto di una piastra 384 pozzetto con soluzione polimerica 25 ml, garantendo che non vi è alcuna conta croceminazione e ogni pozzetto contiene un polimero unico. Utilizzare NMP come controllo negativo in almeno 2 pozzi. Registrare l'identità di soluzione polimerica in ciascun bene su un file di modello piatto o foglio di calcolo bene.

3. Stampa polimeri Microarrays mediante un contatto stampante

NOTA: La stampa del microarray è stata eseguita utilizzando una stampante contatto. Le istruzioni specifiche per quanto riguarda la stampa di microarray polimero sono riportati di seguito. Per le linee guida generali su come utilizzare le raccomandazioni di stampa e di sicurezza, seguire il manuale utente del produttore. Anche se usiamo una stampante contatto, un idoneo dispositivo di stampaggio manuale potrebbe anche essere usato.

  1. Come consigliato nel manuale utente della stampante, creare una routine (vedi punto 3.3) che permette la stampa di 384 liquidi (le soluzioni polimeriche o NMP) in quadruplicates, utilizzando una testa microarraying 32-pin (organizzato come 8 righe e 4 colonne).
  2. Stampa 1.536 punti disposti come 48 righe e 32 colonne. Programmare la routine di stampare in 12 seziones, cioè., 32 soluzioni alla volta, in modo che la stampante può essere fermato dopo la stampa di ogni sezione per consentire la pulizia di spilli.
  3. Per creare una routine di stampa:
    1. Apri il programma e tra le opzioni disponibili scegliere 'Crea una nuova routine'. Selezionare il 'Descrizione' scheda per i dettagli di ingresso dell'esperimento. Selezionare la scheda 'capo' e scegliere '32 pin testa microarraying '.
    2. Selezionare la scheda 'Source' e scegliere il portatarga (Portatarga fonte (1x5)), targhetta (piatto 384 x 6.000), le piastre totali (1) e l'ordine fonte (da colonne).
    3. Nella scheda 'disegno Slide', scegliere '3x1' 'scivolo' e scegliere arraying da 'Numero di campo'. Quindi selezionare 'modello arraying'. Input 'vista Spot' come 'Layout' e 'le dimensioni del modello' come 'count Row' (6), 'count colonna' (8), 'passo Row' (750) e 'passo colonna' (560). Scegli una sezione per la stampa abetit.
    4. Nella ingresso scheda 'Layout Slide' il numero di diapositive utilizzata per la stampa. Selezionare la scheda 'Stampa' per inserire i parametri di stampa (numero di francobolli per inchiostrazione: 1, numero di francobolli per spot: 5, tempo di stampaggio: 200 msec, tempo di inchiostrazione: 100 msec).
      NOTA: Una routine è stato creato per la stampa di 384 liquidi (le soluzioni polimeriche o NMP) in quadruplicates, utilizzando una testa microarraying 32-pin (organizzato come 8 righe e 4 colonne). In totale la routine deve stampare 1.536 punti disposti come 48 righe e 32 colonne con un passo di fila di 750 micron e il passo della colonna di 560 micron.
  4. Porre i vetrini agarosio rivestite sulla piattaforma e garantire una buona tenuta di vuoto per tenere i vetrini in posizione.
  5. Regolare la testina di stampa in modo che tutti i perni sono alla stessa altezza. Controlla questo abbassando manualmente la testa su un vetrino e confermando che i perni salgono contemporaneamente. Se ci sono delle discrepanze con l'altezza, regolare utilizzando il sleeve sul perno verso l'alto o verso il basso.
  6. Posizionare la piastra bene sul portatarga con l'orientamento corretto, vale a dire., Ben A1 è in alto a destra del titolare e garantire la piastra ben viene fissata saldamente.
  7. Utilizzando il regolatore in altezza, garantire che l'altezza del supporto piastra è tale che quando la raccolta delle soluzioni polimeriche, i perni non toccare il fondo dei pozzetti.
    NOTA: Questo è importante per avvistamento polimero uniforme e anche per evitare fuoriuscite di soluzioni polimeriche nei pozzetti adiacenti, causando così la contaminazione incrociata.
  8. Selezionare la scheda 'Start' e scegliere il 'tipo Run' 'Normale'. Fare clic su 'Run', e confermare che slitta, pozzetti, ecc, sono in posizione quando richiesto.
  9. Stampa 1 sezione alla volta (32 soluzioni alla volta; 12 sezioni), consentendo la pulizia dei perni tra le sezioni. Pulire i perni accuratamente con un tovagliolo di carta imbevuto di acetone, seguita da carta velina a secco per garantire i perni sono completamente asciutti.
  10. Al termine della stampa dei microarray, metterli in un portavetrini e asciugare durante la notte in un vuoto a 45 ° C per rimuovere l'NMP nei punti polimero. Dopo la sterilizzazione con luce UV per 30 minuti, i microarray sono pronti per l'inoculazione di batteri.
  11. Prima di inoculare diapositive con i batteri, effettuare una misurazione della fluorescenza di fondo (come descritto nella sezione 5). Utilizzare questa misura nel calcolo batterica vincolante.

4. L'inoculazione di polimero microarray con i batteri

NOTA: Garantire una buona tecnica asettica. Tutti movimentazione delle culture deve essere eseguita in un ambiente sterile: o utilizzando un becco Bunsen o in una cappa a flusso. Colture devono essere coltivate con la disponibilità di ossigeno, mezzo di crescita, e la temperatura adeguata alle esigenze di ciascuna specie.

  1. Preparare culture durante la notte inoculando 5 ml di Luria-Bertani brodo (LB: 10 g L -1 Bacto-triptone, 5 g L -1 NaCl, e 10 g L <sup> -1 estratto di lievito) con una colonia da una piastra. Incubare per una notte a 37 ° C, agitando a 200 rpm.
  2. Preparare le scorte freezer di culture durante la notte con l'aggiunta di glicerolo (10% globale di concentrazione) e conservare lo stock a -80 ° C.
  3. Al fine di determinare il numero di cellule da campioni dei ceppi batterici scongelati, eseguire diluizioni seriali di ogni stock e far crescere i batteri durante la notte su terreni solidi. Determinazione accurata di numero di cellule in azioni assicura adeguata inoculazione di ogni specie 6.
  4. Preparare inoculi per microarray. Singole culture specie sono coltivate come sopra e applicate direttamente ai microarray. BacMix-1 è una miscela batterica di Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae), Staphylococcus saprophyticus (S. saprophyticus), e Staphylococcus aureus (S. aureus). BacMix-2 è una miscela batterica costituito da Streptococcus mutans (S. mutans), S. aureola K. pneumoniae e Enterococcus faecalis (E. faecalis).
  5. Per produrre o cultura mista, mescolare pernottamenti in volumi uguali (3 ml ciascuna) e diluire quattro volte con fresca LB (a circa 50 ml di volume finale).
  6. Posizionare microarrays polimero UV-sterilizzato in rettangolari piastre 4 pozzetti e incubare con 6 ml di colture batteriche miste a 37 ° C con agitazione (30 rpm) per 5 giorni.
  7. Dopo l'incubazione, risciacquare delicatamente i microarrays due volte con tampone fosfato salino (PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4) e incubare con una soluzione di 1 mg ml -1 di 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) macchia in PBS per 30 min.
  8. Lavare i vetrini microarray macchiati in un piatto ben fresco coprendo con PBS e vorticoso delicatamente, cambiando il PBS una volta. Essiccare sotto un flusso di aria. Applicare un vetrino di vetro alla diapositiva microarray e la tenuta in posizione con colla. Una volta che dry, sterilizzare la superficie esterna con il 70% (v / v) etanolo.
  9. Gettare culture in base al loro livello di contenimento.

5. microarray Imaging e analisi

  1. Cattura immagini singole per ogni spot polimero in campo chiaro e DAPI (/ Em = 358 nm / 361 nm Ex) i canali. Eseguire manualmente con un microscopio a fluorescenza o utilizzando un microscopio a fluorescenza automatico (con una fase XYZ controllato da un software di acquisizione immagini) munito di un obiettivo 20X.
    NOTA: Fare riferimento al manuale di 18 per il funzionamento del software e regolando il microscopio per ottenere immagini utilizzando canali campo chiaro e DAPI. Assicurarsi che il tempo di guadagno e di esposizione per la cattura delle immagini per tutti i microarray sono gli stessi.
  2. Ottenere l'intensità media di fluorescenza di ogni spot nel canale DAPI scegliendo l'area dello spot e quantificare la fluorescenza con un software di elaborazione delle immagini.
  3. Per la fluorescenza di fondo di ogni spot, obtain immagini dei punti di polimero su un microarray replicare incubati solo con supporti senza batteri. Sottrarre la fluorescenza di sfondo dall'intensità della macchia per ottenere la fluorescenza da batteri.
  4. Calcolare il valore medio normalizzato dai quattro punti, che rappresenta ogni polimero, utilizzato per confrontare i batteri legame di vari polimeri 6.
  5. Identificare i polimeri che presentano il minor batterica vincolante (fluorescenza basso) come polimeri 'hit' 6.

6. Rivestimento di copertura scivola per la convalida 'Hit'

  1. Per Coprioggetto cappotto con polimeri:
    1. Preparare soluzioni di polimeri HIT (~ 2% w / v) in tetraidrofurano (THF), o altro solvente appropriato.
    2. cappotto Spin coprioggetto di vetro circolare di dimensioni adeguate con le soluzioni polimeriche usando un dispositivo a induzione far girare a 2000 rpm per 10 sec.
      NOTA: In assenza di un dispositivo a induzione di spin, coprioggetto o altri materiali possono essere rivestiti tuffo, anche se di rotazionerivestimento produce una superficie più uniforme.
    3. Essiccare le coprioggetto rivestiti in forno ventilato a 40 ° C per una notte e sterilizzare usando la luce UV per 30 minuti prima di batteri inoculazione.
  2. Per Coprioggetto cappotto con Agarosio per i controlli negativi:
    1. Coprioggetto pulita o di trattamento al plasma per 10 minuti o l'immersione in 1 M NaOH per 4 ore.
    2. Immergere i coprioggetti in acetonitrile contenente 1% (3-amminopropil) triethoxysilane durante la notte. Pulire i coprioggetti con acetone 3 volte e messo in un forno (100 ° C) per 1 ora.
    3. cappotto Dip i coprioggetti secchi con 1% soluzione acquosa di agarosio mantenuti in un bagno di acqua a 60 ° C. Posizionare i rivestito agarosio coprioggetto su superficie piana in condizioni ambientali senza polvere per 24 ore e sterilizzare usando la luce UV per 30 minuti prima di batteri inoculazione.

7. Attaccamento e analisi di vetrino Utilizzando microscopio elettronico a scansione (SEM)

  1. Doposterilizzazione con luce UV per 30 minuti, porre i vetrini (polimero / vetro agarosio rivestite o non rivestite) in un 12-pozzetti standard o 24-pozzetti (a seconda delle dimensioni delle coprioggetto) e incubare con i batteri come descritto nel paragrafo 4.
  2. Dopo incubazione con batteri, lavare i coprioggetti trattati e non due volte con 0,1 M tampone cacodilato (pH 7,4) e poi fissare con 2,5% (w / v) glutaraldeide in 0,1 M tampone cacodilato (pH 7,4) per 2 ore.
  3. campioni post-fix 1% (w / v) tetrossido di osmio per 1 ora a temperatura ambiente e disidratare con lavaggi etanolo sequenziali a 50, 70, 90 e 100% (v / v) per 30 minuti ciascuno.
  4. Campioni a secco di CO 2 secondo protocolli standard 19. Il tempo di essiccazione dipenderà dalla natura del campione.
  5. campioni Coat in una lega di oro / palladio (60/40%) utilizzando una spalmatrice polverizzazione da corrente a 30 mA e vuoto a 0,75 Torr. Esaminare con un microscopio elettronico come da protocolli standard 20.
    NOTA: Ensure adeguate misure di sicurezza per la gestione dei rischi derivanti dallo stoccaggio, la movimentazione e lo smaltimento di osmio tetrossido, in quanto è altamente tossico.
  6. confrontare visivamente le immagini dei vetrini non rivestiti e quelli rivestiti con agarosio o polimeri 'hit' per confermare batteriche / respingono le capacità di legame dei polimeri.
    NOTA: La resistenza di fissaggio deve essere facilmente visibile come una riduzione di cellule presenti.
  7. Scegli il più promettente 'hit' polimeri non vincolanti per gli studi di rivestimento con dispositivi medici (ad esempio, cateteri venosi centrali) 6.

8. La selezione di un solvente per il rivestimento di cateteri

  1. Valutare vari solventi per la loro compatibilità con la parte interiore del catetere, e la loro capacità di sciogliere il polimero 'colpito'. Tagliare le parti di Cath-1 e in pezzi cilindrici 5 mm di lunghezza, e misurare con un calibro Vernier digitale.
  2. Valutare vari solventi come acetAcido ic, ammoniaca, acetone, acetonitrile, etere dietilico, tetraidrofurano (THF), dimetilformammide (DMF), N-metil-2-pirrolidone (NMP), etanolo, metanolo, glicole etilenico, toluene e xilene. Immergere pezzi catetere nei solventi per 12 ore e valutare visivamente per l'integrità del catetere e chiarezza di solvente.
    NOTA: scegliere un solvente che non causano i cateteri a gonfiarsi o disintegrare o si traducono in un solvente torbido. Il solvente deve sciogliere i polimeri 'hit'.

9. Analisi di attaccamento batterica sui cateteri per Microscopia confocale

  1. Preparare 2,5% (w / v) soluzioni polimeriche in acetone, o altro solvente idoneo, come determinato al punto 8. Posizionare 5 pezzi mm catetere in un piccolo fiale di vetro (5 ml) e immergerli in 1 ml di soluzione di polimero per 2 minuti . Rimuovere la soluzione di polimero in eccesso e asciugare i pezzi catetere durante la notte in un forno sotto vuoto a 40 ° C.
  2. Preparare inoculo mescolando scongelati batterica stgreggi per dare circa 10 6 cellule di ogni specie in 50 ml di LB 6.
  3. Sterilizzare pezzi catetere rivestiti e non rivestiti con luce UV per 30 minuti e incubare con 1 ml inoculati LB in un 24-pozzetti, a 37 ° C per 3 giorni, con agitazione 6.
  4. Dopo l'incubazione, lavare i cateteri con PBS (2x, 2 ml), fissare i batteri con 10% paraformaldeide in PBS per 30 minuti, e lavare con PBS (1 ml). Colorare i batteri su pezzi catetere con DAPI (1 mcg ml - 1) per 20 minuti e lavare con PBS (1 ml).
  5. Ottenere immagini confocale dei pezzi catetere utilizzando le seguenti impostazioni: 405nm diodo laser blu, campo rilevatore di 414-502 nm, hole pin - Airy1, immagine Dimensioni - 1.024 × 1.024 pixel, larghezza voxel - 105.2 nm, Z-stack spaziatura 0.5μ m , ingrandimento - 40X 1,25.
  6. Completa il confocale da Z-stacking 50 immagini in tutta la lunghezza 100 micron del catetere.
  7. Analizzare le immagini utilizzando suitabsoftware di analisi le: appiattire le immagini Z-stack nel piano Z, utilizzando la funzione di estendere la profondità di campo, per creare una singola immagine di un pezzo catetere.
    NOTA: Questa immagine dovrebbe quindi essere analizzata per ottenere l'area del catetere coperta da batteri, dopo background-correzione usando la funzione 'appiattire sfondo'.

Analisi 10. dell'Allegato batterica su cateteri da SEM

  1. Preparare 10% soluzione polimerica (w / v) in acetone.
  2. Premere un puntale (per 200 microlitri micropipetta) nella porzione intermedia del pezzo tagliato del catetere per tenerlo e immergere il pezzo nella soluzione polimerica per circa 30 sec. Essiccare il pezzo rivestito in condizioni ambiente per 30 min. Applicare un secondo rivestimento immergendo nuovamente nella soluzione polimerica e asciugare per una notte in condizioni ambientali.
  3. Dopo il trattamento UV e l'incubazione con i batteri lavare i pezzi (n = 3) con PBS (2x, 1 ml) e trasferirli in piastre da 48 pozzetti contenenti 10% formaldeide in PBS per 30 min. Dopo il fissaggio, lavare i pezzi con PBS (1 ml), asciugare per una notte a temperatura ambiente, montare su stub con dischi in carbonio conduttive, e il cappotto oro utilizzando un dispositivo a induzione polverizzazione (vedi punto 7.5).
  4. Ottenere immagini utilizzando un microscopio elettronico a scansione 6.

Representative Results

La figura 2 mostra attaccamento batterica (intensità di fluorescenza normalizzato) per un numero di polimeri come determinato mediante analisi microarray. Macchie stampate senza polimero (solo NMP) sono il controllo negativo, come agarosio resiste fortemente vincolante 6 batterica - fluorescenza registrata è molto bassa. I polimeri mostrate sono tutti a basso legame sebbene nella maggior parte dei casi, le proprietà repellenti di un polimero varia significativamente tra specie batteriche testate. Ciò riflette le ampie differenze tra i meccanismi di attacco tra le specie diverse. La selezione di un polimero appropriato è pertanto dipende dall'applicazione, ma i polimeri a basso vincolante sono facilmente identificabili dal confronto con agarosio. polimeri alti vincolante sono suscettibili di essere identificati in un array, e possono essere utilizzati come controlli positivi per successivi esperimenti. Per i polimeri che non mostrano auto-fluorescenza nel canale DAPI, co qualitativamparison delle immagini spot può essere fatta visivamente (come mostrato in figura 3, evidenziando un rappresentante ad alto legame polimero e tre esempio polimeri a bassa vincolanti). Tale confronto, fornendo meno informazioni rispetto all'analisi statistica, può essere un utile convalida visiva dei valori di intensità calcolati.

Con 22 polimeri appropriati identificati utilizzando il microarray, esperimenti di scale-up vengono effettuati per confermare la loro proprietà batteri repellente quando viene utilizzato per il rivestimento di grandi superfici. Sono riportati gli esempi migliori risultati, utilizzate per scivola copertura in vetro cappotto (analizzati al SEM (figure 4 e 5)) e fette catetere (analizzati al microscopio confocale (Figura 6) e SEM (Figura 7)). Entrambi i metodi microscopici hanno il vantaggio di consentire la conta delle cellule diretti sulla superficie, fornendo dati inequivocabile; riduzione adesione cellulare è facilmente visible. Tali rivestimenti che meglio mantenuto il loro proprietà repellenti su scale-up, così come essere suscettibili di tecniche di rivestimento su larga scala, sono stati studiati ulteriormente. I risultati riportati illustrano i polimeri migliori risultati di ogni fase.

Figura 1
Figura 1:. Passi coinvolti nella identificazione dei polimeri batteri repellenti mediante microarrays polimerici per applicazioni biomediche SEM = microscopia elettronica a scansione.

figura 2
Figura 2:. Batterica impegna una serie di polimeri, determinata mediante analisi microarray basso batterica vincolante è visto su una serie di poliacrilati / acrilammidi (PA) e poliuretani (PU). I risultati di microarray polimeri sondato con diversi s batteriche sono mostrati; pecies (BacMix-1 e BacMix-2 C. jejuni, C. difficile, C. perfringens, S. mutans, e due consorzi). Batterica legame espresso come correzione del fondo media DAPI fluorescenza intensità (normalizzato). barre di errore rappresentano la deviazione standard. Adattato da riferimento 6. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3:. Immagini di esempio di macchie polimerici fluorescenza (DAPI) e microscopia in campo chiaro immagini di BacMix-2 che mostrano attaccamento batterica di polimeri rappresentativi. Un polimero fortemente vincolante è incluso per il confronto di diversi polimeri non vincolanti (PU-20, PA-336 e PU-179). Barra di scala = 100 micron. Adattato da riferimento 6.: //www.jove.com/files/ftp_upload/54382/54382fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4: esperimenti di scale-up con ormeggi copertura in vetro immagini SEM mostrano attaccamento batterica su vetro non rivestito e vetro rivestito con polimeri 'hit' (esempi scelti dalla Tabella 1).. Barre di scala = 20 micron.

Figura 5
Figura 5:. Batterica legame quantificato mediante conteggio delle cellule da immagini SEM Confronto di cellule attaccate per unità di superficie di superfici rivestite con le migliori polimeri 'hit'. Agarose è stata utilizzata come superficie 'non vincolante' un controllo, con vetro come superficie vincolante controllo. Le barre di errore rappresentanodeviazione standard.

Figura 6
Figura 6: Confronto tra batterica vincolante su fette catetere patinati e non patinati immagini confocale a confronto catetere non trattata (cath-1) (A) e il catetere rivestito con PA13 (B), dopo incubazione con BacMix-2.. Le immagini scattate con un obiettivo 40X (Scala bar = 20 micron). Adattato da riferimento 6.

Figura 7
Figura 7:. Confronto tra batterica vincolante su fette cateteri rivestiti e non rivestiti immagini SEM mostrano confronto catetere greggia (cath-1) (A) e il catetere rivestito con PA13 (B), dopo incubazione con un cocktail batterica costituito da BacMix-2 Scale. bar = 101; m. Adattato da riferimento 6.

Polimero monomero 1 monomero 2 monomero 3 Rapporto di monomeri
PA465 MEMA DEAEMA HEA 8 1 1
PA475 MEMA DEAEA HEMA 6 1 3
PA513 MEMA DEAEMA MMA 8 1 1
PA515 MEMA DEAEA MMA 6 1 3
PA13 DMAA - 9 1 -
PU1 PEG2000 HDI - 4.9 5.2 -
PU16 PEG2000 MDI - 4.9 5.2 -
PU161 PEG2000 MDI BD 2.5 5.2 2.3
PU7 PEG900 BICH - 4.9 5.2 -
PU83 PEG900 HMDI BD 2.5 5.2 2.3
PU227 PPG-PEG-1900 HDI - 4.9 5.2 -
PU129 PPG425 BICH DMAPD 2.5 5.2 2.3
PU10 PTMG2000 BICH - 4.9 5.2 -
PU179 PTMG2000 HDI NMAPD 2.5 5.2 2.3
PU20 PTMG2000 MDI - 4.9 5.2 -
PU5 PTMG2000 HDI - 4.9 5.2 -

Tabella 1: Composizione dei batteri non vincolanti 'hit' polimeri in figura 2.

Discussion

Attachment di batteri ad una superficie è un processo complesso determinato da una vasta gamma di fattori dipende dalle specie batteriche, le proprietà della superficie, il mezzo circostante e l'ambiente fisico. Sebbene alcuni gruppi chimici sono noti per influenzare vincolanti batteriche (poliglicoli, per esempio, resistere tipicamente allegato 11), correlando l'impatto biologico di polimeri con le loro strutture chimiche è difficile, rendendo progettazione razionale di polimeri per funzioni specifiche impegnative. In assenza di meccanismi dettagliati di attacco, altri studi hanno tentato di imitare le superfici repellenti presenti naturalmente, con lungo e ottimizzazione vasta processi 21. Il metodo high-throughput miniaturizzato qui presentata supera queste sfide per facilitare lo screening parallelo di centinaia di polimeri per identificare i cavi per ulteriori studi.

I risultati del metodo microarray principalmente servono a identify probabili candidati piombo. La Figura 2 illustra 22 candidati con bassa vincolante di almeno una specie, mentre la figura 3 illustra la netta riduzione della capacità di legame. Tutte le 22 polimeri a basso vincolante mostrati in figura 2 sono stati portati avanti in esperimenti di scale-up, durante i quali il migliore (in termini di repellenza e rivestimento proprietà) sono stati determinati per essere PU83, PA13 e PA515 (figure 4 e 5). Poliacrilati offrono una maggiore flessibilità in termini di metodi di polimerizzazione e quindi il poliacrilato basso vincolante, PA13, è stato scelto per studi di rivestimento del catetere (figure 6 e 7). Più dettagliate ulteriori lavori su altri candidati è stata effettuata ed è stato riportato altrove 6.

Attraverso una serie di iterazioni sperimentali abbiamo trovato un certo numero di passi minori sono stati fondamentali per il successo e la riproducibilità. Oltre ad agevolare l'adesione dellapolimeri ai vetrini, utilizzando un agarosio sotto-rivestimento fornisce un fondo pulito, come agarosio è altamente resistente alla colonizzazione batterica. Allo stesso modo la coerenza nel polimero stessi visto, sia all'interno della stessa matrice e tra gli array, è vitale e quindi la stampa delle matrici deve essere attentamente controllato. regolazione accurata dei perni della testina di stampa e di riempimento anche uniforme del piatto 384 pozzetti sono tenuti a garantire macchia uniforme. Come alcuni dei polimeri che abbiamo usato in mostra un grado di autofluorescenza, prendendo i dati fluorescenza di fondo per ogni diapositiva prima di incubazione con i batteri era vitale. Per tenere conto di variazioni e di ottenere sono invitati robusti replica i dati di microarray.

La macchia impiegato qui (DAPI) non ha selettività per specie batteriche, vincolanti non specificamente al DNA. Pertanto, buona tecnica asettica è essenziale una volta colture batteriche sono introdotti come contaminanti possono passare inosservati, confondendo l'interprezione dei risultati. Lo stesso vale per esperimenti successivi utilizzando la microscopia elettronica a scansione, dove è possibile solo distinguere aste e cocchi ma non genere o specie.

Dopo lo screening microarray, polimeri promettenti dovrebbero essere scelti per un ulteriore convalida. Nell'esempio qui presentato, sette polimeri di interesse sono stati identificati dal loro netta riduzione della fluorescenza sul microarray e loro inibizione di fissaggio è stata confermata da loro rivestimento su superfici di grandi dimensioni. Figure 4 e 5 mostrano la riduzione legame realizzato su vetrino, un mezzi pratici per testare il comportamento dei polimeri come rivestimenti di massa piuttosto che come macchie di microarray. Successivamente, questi polimeri sono stati rivestiti su dispositivi medici per quantificare con riduzione attacco batterico. È importante che il solvente scelto (vedi sezione protocollo 8) per questi studi rivestimento è benigna al substrato desiderato (qui, il catetere) mentre conservanoing capacità di sciogliere il polimero di interesse, per permettere rivestimento. Qui, abbiamo utilizzato acetone che, così come le proprietà menzionate, ha un punto di ebollizione basso ed evapora rapidamente per lasciare un rivestimento uniforme.

I mezzi di convalida scelto dipenderà dalla specifica applicazione in fase di studio. Come osservazione delle cellule al microscopio elettronico e fluorescenza permette la quantificazione diretta di attaccamento singola cella, abbiamo scelto queste tecniche come complemento per il test colorazione microarray di massa. I risultati sono mostrati nelle figure 6 e 7, che dimostrano l'importanza di tali metodi gratuiti. Le immagini confocali in figura 6 fornisce chiare immagini delle singole celle, mentre il SEM ha il vantaggio di consentire una valutazione della superficie del polimero, che è qui liscia ed uniforme. Questi metodi sono limitati dal campo di vista dei microscopi utilizzati, e quindi è important a prendere una serie di istantanee di avere fiducia nei risultati. Il metodo sopra descritto non può quantificare l'adesione batterica su tutta la superficie, solo dedurre la copertura da un certo numero di piccole regioni. Crediamo che questo sia sufficiente per l'applicazione descritta. Riduzione batterica vincolante potrebbe essere valutata enumerando batteri aderito superficiali sui pezzi interi catetere patinati e non patinati con metodi come descritto altrove 22. Tuttavia tali metodi richiedono superfici biomateriali schermati avere una superficie uniforme, che è difficile da mantenere quando saggi sono eseguiti con dispositivi medici, che spesso hanno una geometria complessa.

Chiaramente, qualsiasi dispositivo destinato ad uso clinico deve passare attraverso sostanziale ulteriori test per garantire la sicurezza e l'efficacia negli esseri umani. Il metodo qui presentato rappresenta l'inizio di questo processo e ulteriore lavoro deve includere conferma di attività in vivo. In questo caso, lo studio c venosaatheters, il lavoro iniziale potrebbe indagare il legame di componenti del sangue e cellule intere al polimero. L'effetto dei componenti del sangue sulla batterica vincolante dovrebbe essere considerata, eventualmente ripetendo i saggi di legame in presenza di siero inattivato o di sangue de-fibrinated 23. La prova definitiva della tecnologia sarà in un modello in vivo, come una infezione modello di impianto sottocutaneo 24.

Dimostriamo il potenziale del metodo microarray polimero per lo screening di polimeri di superficie che alterano. Tali polimeri (entrambi resistenti e promuovere batterica vincolante) hanno un gran numero di applicazioni in medicina, l'industria alimentare e delle biotecnologie, che significa questo metodo può essere utile in molti settori della ricerca. Anche se il lavoro qui utilizza batteri, il metodo potrebbe essere adattato ad altri tipi di cellule e analogamente altri microarray chimici.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma 05066 
Silane-prep slides Sigma S4651
Polymers Synthesised in-house Not applicable
NMP Sigma 494496
LB Broth Oxoid CM1018
DAPI Thermo Fisher D1306
Tetrahydrofuran Sigma 401757
(3-aminopropyl) triethoxysilane coated glass slides Sigma Silane-prep
Cacodylate buffer Sigma 97068
Catheter 1 Arrow International CS12123E
Catheter 2 Baxter Healthcare ECS1320
Osmium tetroxide Sigma 201030
Equipment
Contact printer Genetix Qarraymini
Microarray microscope IMSTAR Pathfinder
Spin Coater Speedline Technologies 6708D
Confocal microscope Leica SP5
Image analysis software Media Cybernetics Image-Pro Plus
Scanning electron microscope Philips XL30CP
Sputter coater Bal-Tec SCD050

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References

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High-throughput identificazione di batteri Polimeri repellente per dispositivi medici
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Venkateswaran, S., Gwynne, P. J., Wu, M., Hardman, A., Lilienkampf, A., Pernagallo, S., Blakely, G., Swann, D. G., Bradley, M., Gallagher, M. P. High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices. J. Vis. Exp. (117), e54382, doi:10.3791/54382 (2016).More

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