Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.
Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.
Метилирование цитозина в ДНК (5mC) представляет собой крупный эпигенетическую знак найденный в геномах позвоночных животных , связанных с транскрипционных глушителей 1. 5mC внедряется и поддерживается метилтрансферазам ДНК 2-5, и было показано , играют важную роль в ряде биологических процессов , в том числе геномного импринтинга, инактивации Х-хромосомы, клеточной дифференцировки и развития 3, 6. Следовательно, разрушение 5Mc геномные паттерны ассоциируется с целым рядом заболеваний , 7, 8-11. Несмотря на прогресс в понимании 5mC роль в развитии и болезни, она до сих пор остаются в значительной степени неизвестно, каким образом эта метка удаляется в разработке и тканях взрослого организма. Несколько потенциальных механизмов деметилирования ДНК недавно были предложены включая активные и пассивные механизмы деметилирования 12, 13, 14, 15. Обнаружение продуктов последовательного окисления 5mC , опосредованных десяти одиннадцать транслокации ЭнзимES (tet1 / 2/3) , такие , как 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5FC) и 5-carboxylcytosine (5caC) в эукариотических ДНК 16, 17, 18, 19 предложено домыслы могут ли они быть использованы в качестве промежуточных продуктов процессы деметилирования ДНК или действуют как стабильные эпигенетические маркеры в их собственном праве 13. В то время как демонстрация того, что компонент базовой эксцизионной репарации, тимин-ДНК гликозилаза (TDG) могут связывать и удалять как 5FC и 5caC из ДНК 19, 20 указывают на роль модифицированных производных 5mC в качестве активного деметилирования ДНК. Последние данные показывают , что 5FC / 5caC может модулировать скорость точек процессивности РНК II с потенциальным вовлечением этих марок в регуляции транскрипции 29. Из – за этой потенциальной биологической важности окисленных форм 5mC, ряд биохимических и антител на основе методов были использованы для изучения их геномного распределения и глобального содержания 16, 19-24.
Учитывая, что большинство тон позвоночным органы состоят из различных типов клеток , и что распределение модифицированных оснований цитозина тканей и клеток типа конкретных 16-18, 20, 23, 25-27, определяют пространственное распределение окисленных производных 5Mc в различных тканях становится важным экспериментальным задачу, необходимую для открытия их биологические функции. Большинство биохимических и антител на основе подходов не обеспечивают какой-либо пространственной информации о распределении модифицированных форм 5Mc в различных тканей и типов клеток. В отличие от этого , иммунохимии на основе методики могут обеспечить быстрый инструмент для оценки пространственного распределения и ядерной локализации 5Mc 28 и его окисленных производных 20. Об этом сказано, сообщили очень низкое обилие 5FC (20 в каждые 10 6 цитозин) и 5caC (3 в каждые 10 6 цитозина) в геноме мыши 18 представляет собой серьезную проблему для стандартного иммунохимии.
Вот,мы опишем высокочувствительный иммунохимического метод, который обеспечивает надежную и быстрое обнаружение окисленной формы цитозина в ткани головного мозга млекопитающих. Включив, конъюгированных с пероксидазой вторичных антител в сочетании со стадией амплификации сигнала, этот метод обходит проблемы обнаружения очень малых количеств 5FC и 5caC. Кроме того, этот метод может быть использован для совместного выявления модифицированные формы цитозина с линиеспецифический маркеров, эффективно дополняя другие подходы в выяснении биологические функции этих эпигенетических.
Хотя сообщалось низкое содержание производных окисления 5Mc, 5FC и 5caC в некоторых тканях представит существенные ограничения для стандартного протокола иммунохимии, включение пероксидаза-конъюгированными вторичными антителами позволяет детектировать эти модификации цитозина в фиксированных тканей и клеток (рисунок 2) , Тем не менее, оптимальное время инкубации с раствором tyramide должны быть экспериментально оптимизированы для каждой отдельной партии tyramide комплекта усиления сигнала , где наблюдается линейная зависимость между интенсивностью сигнала и длительности на основе усиления сигнала tyramide, для получения подробной информации см Алмейда и др. 2012 26 , Кроме того, отношение сигнал / фон может быть значительно повышена путем проведения промывок в банку Коплин, чтобы обеспечить эффективное удаление избытка антител. После инкубации с раствором tyramide, важно немедленно прекратить реакцию путем промывки в растворе PBT к гecrease фоновое окрашивание. Крайне важно не допустить, чтобы секции сохнуть в любой момент во время процедуры.
Эффективность депуринизации ДНК может быть улучшена путем проведения реакции депуринизации при 37 ° С. В то время как с помощью 4 N HCl вместо 2 N увеличивает окрашивание модифицированных форм 5Mc с использованием 4 N HCl в течение депуринизации ДНК не позволило бы совместным окрашиванием DAPI, как он взаимодействует исключительно с двухцепочечной ДНК.
Хотя этот метод может обеспечить надежную полуколичественный оценку модифицированных форм цитозина где обнаруживается, оно не может быть использовано для оценки абсолютных уровней 5Mc или его производных окисления. Поэтому мы рекомендуем использовать взаимодополняющие , но количественные подходы 16, 19 -24. С момента открытия производных окисления 5mC в геномах млекопитающих, несколько подходов были разработаны с целью изучить их биологические роли 16, 19-24. Хотя эти approaчес может быть ценным при определении абсолютных уровней производных окисления 5mC, они не предоставляют информацию относительно их пространственного распределения 20, 26. Мы успешно использовали метод , описанный здесь , чтобы отобразить пространственное распределение и локализацию производных окисления 5mC в различных типах клеток Проявочной и взрослого мозга 20
Раскрывая их пространственное распределение 20, этот метод может иметь решающее значение для понимания биологических последствий и судьбы окисленных производных 5mC в различных биологических контекстах , где эти модифицированные производные 5mC могут быть обнаружены в том числе клеточной дифференцировки, развития и болезни. Кроме того, метод, который мы описываем здесь могут дать полу-количественные оценки окисленных производных 5Mc в различных тканях путем оценки кинетики пероксидазной реакции (которая пропорциональна интенсивности окрашивания) в разное время инкубации с tyramiде – 26.
The authors have nothing to disclose.
We thank the Advanced Microscopy Unit (School of Life Sciences, University of Nottingham) and the Histology team of MRC Human Reproductive Sciences Unit (Edinburgh), the Institute of Neuroscience at the ULB and the FNRS for help and support. This work was supported by MRC (MR/L001047/1 to A.D.J.).
Coplin jar | Cole-Parmer | UY-48585-30 | Glass made |
Xylene | Use only in Class II safety cabinet | ||
Phosphate buffer saline (PBS) | Fisher Scientific | 12821680 | pPH 7.5, filtered before use |
4% paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | Once made can be stored at -20°C in aliquotes for several months |
4% formaldehyde (FA) | Sigma Aldrich | F8775 | Once made can be stored at -20°C in aliquotes for several months |
Ethanol, anhydrous denatured, histological grade | Sigma Aldrich | 64-17-5 | 95, 75, 50 % in PBS |
0.01 % Tween 20 in PBS | Sigma Aldrich | P9416 | PBT |
0.5% Triton X-100 in PBS | Sigma Aldrich | X100 | PBX |
2 N HCl | Sigma Aldrich | 71826 | caution extremely toxic |
100 mM Tris-HCl | Promega | H5121 | PH adjusted to 8.5 |
hydrophobic barrier pen | Abcam | ab2601 | for immunohistochemistry |
Slide moisture chamber | Scientific Device Laboratory | 197-BL | |
anti-5mC mouse antibody | Diagenode | C15200081 | monoclonal primary antibody |
Anti-5hmC antibody | Active Motif | 39791 | rabbit polyclonal primary antibody |
Anti-5caC antibody | Active Motif | 61225 | rabbit polyclonal primary antibody |
Peroxidase-conjugated anti-rabbit seconday antibody | Dako | K1497 | |
555-congjuated goat anti-mouse antibody | Molecular probes | A-11005 | secondary antibody |
10% BSA | Sigma Aldrich | A9418 | Blocking solution |
22x32mm Glass cover slips | BDH | 406/0188/24 | |
Tyramide Signal Amplification System | Perkin Elmer | NEL741001KT | Other fluorochome conjugated seconday antibodies can be used for co-detection of oxi-5mC |
Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
Colourless nail polish | |||
chicken polyclonal anti-GFAP polyclonal antibody | Thermo Scientific | PA5-18598 | 1:400 dilution |
anti-NeuN mouse monoclonal antibody | Merck milipore | MAB377B | 1:400 dilution |