Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.
Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.
Metylering av cytosin baser i DNA (5mC) utgör en stor epigenetisk märke finns i ryggradsdjur genom i samband med transkriptions tysta en. 5mC införs och underhålls av DNA-metyltransferaser 2-5, och har visat sig spela en viktig roll i ett antal biologiska processer, inklusive genetisk prägling, X-kromosominaktivering, celldifferentiering, och utveckling 3, 6. Följaktligen avbrott i 5mC iska mönster är associerad med ett antal sjukdomar 7, 8-11. Trots de framsteg i förståelsen 5mC roll i utveckling och sjukdom, är det fortfarande till stor del okänt hur detta märke tas bort för att utveckla och vuxna vävnader. Flera potentiella mekanismer för DNA-demetylering har nyligen föreslagit att aktiva och passiva demetylering mekanismer 12, 13, 14, 15. Upptäckten av produkterna från 5mC sekventiell oxidation förmedlade av 1011 sloka enzymes (tet1 / 2/3), såsom 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5FC), och 5-carboxylcytosine (5caC) i eukaryot DNA 16, 17, 18, 19 uppmanas spekulationer om de kan tjäna som mellanprodukter med DNA-demetylering processer eller fungera som stabila epigenetiska märken i sin egen rätt 13. Medan demonstrationen att den del av basen excision reparation kan tymin-DNA-glykosylas (TDG) binda och avlägsna både 5FC och 5caC från DNA 19, antyder 20 en roll för de modifierade 5mC derivat i en aktiv DNA demetylering. Senaste bevis som visar att 5FC / 5caC kan modulera graden av RNA II processivitet pekar på potentiell inblandning av dessa märken i transkriptionsreglering 29. På grund av denna potential biologiska betydelsen av oxiderade former av 5mC har en rad biokemiska och antikroppsbaserade tekniker använts för att studera deras genomisk distribution och globalt innehåll 16, 19-24.
Med tanke på att de flesta av than ryggradsdjur organ består av olika celltyper och att fördelningen av modifierade cytosin baser är vävnad och celltyp specifik 16-18, 20, 23, 25-27, bestämma den geografiska fördelningen av oxiderade 5mC derivat i olika vävnader blir en viktig experimentell uppgiften är nödvändig för att avslöja sina biologiska funktioner. De flesta av de biokemiska och antikroppsbaserade metoder ger inte någon spatial information beträffande fördelningen av de modifierade formerna av 5mC i olika vävnader och celltyper. Däremot kan immunbaserade tekniker ger en snabb verktyg för att bedöma den rumsliga fördelningen och nukleär lokalisering av 5mC 28 och dess oxiderade derivat 20. Som sagt, rapporterade mycket låg förekomst av 5FC (20 i varje 10 6 cytosin) och 5caC (3 i varje 10 6 cytosin) i musgenomet 18 utgör en betydande utmaning för standardimmun.
Här,beskriver vi en mycket känslig immunokemisk metod som ger robust och en snabb upptäckt av oxiderad form av cytosin i däggdjurshjärnvävnad. Genom att införliva peroxidaskonjugerade sekundära antikroppar kopplade med en signal amplifieringssteg, kringgår de utmaningar som att detektera mycket små mängder av 5FC och 5caC denna metod. Dessutom kan denna teknik användas för att samtidigt detektera modifierade former av cytosin med härstamning specifika markörer, effektivt komplement till andra metoder i att belysa de biologiska funktionerna hos dessa epigenetiska märken.
Även om den rapporterade låg förekomst av 5mC oxidation derivat, 5FC och 5caC i vissa vävnader skulle innebära betydande begränsningar för en standardimmunprotokoll, införlivandet av peroxidaskonjugerade sekundära antikroppar tillät detektering av dessa cytosin ändringar i fasta vävnader och celler (Figur 2) . Dock bör den optimala inkubationstiden med tyramide lösning optimeras experimentellt för varje enskilt parti tyramide signalförstärkning kit där ett linjärt samband mellan signalstyrka och varaktighet tyramide baserad signalförstärkning observeras, för mer information se Almeida et al. 2012 26 . Dessutom kan signal / bakgrundsförhållandet förbättras avsevärt genom att utföra de tvättar i ett Coplin-kärl för att medge effektivt avlägsnande av överskott av antikroppar. Efter inkubation med tyramide lösning, är det viktigt att omedelbart stoppa reaktionen genom att tvätta i PBT lösning decrease bakgrundsfärgning. Det är kritiskt att inte tillåta sektionerna torka vid vilken punkt som helst under förfarandet.
Effektiviteten av DNA depurinering kan förbättras genom att utföra depurinering reaktionen vid 37 ° C. Medan användning av 4 N HCl i stället för 2 N förbättrar färgningen av de modifierade formerna av 5mC använder 4 N HCl för DNA depurinering skulle inte tillåta samtidig färgning med DAPI, eftersom det interagerar endast med dubbelsträngat DNA.
Även om denna teknik kan ge robust semi-kvantitativ bedömning av modifierade former av cytosin baser där detekterbara, kan det inte användas för att utvärdera de absoluta nivåerna av 5mC eller dess oxidation derivat. Därför rekommenderar vi att använda andra kompletterande men kvantitativt närmar 16, 19 -24. Sedan upptäckten av 5mC oxidation derivat i däggdjursgenom, har flera metoder utvecklats för att studera deras biologiska roller 16, 19-24. Även om dessa approaches kan vara värdefull för att bestämma de absoluta nivåerna av 5mC oxidation derivat, de inte lämna information om deras rumsliga fördelning 20, 26. Vi har framgångsrikt använt den metod som beskrivs här för att kartlägga den geografiska fördelningen och lokaliseringen av 5mC oxidation derivat i olika celltyper av att utveckla och vuxna hjärnan 20
Genom att avslöja deras rumsliga fördelning 20, kan denna teknik vara avgörande för att förstå de biologiska effekterna och ödet av oxiderade derivat av 5mC i olika biologiska sammanhang där dessa modifierade derivat av 5mC kan detekteras inbegripet celldifferentiering, utveckling och sjukdom. Dessutom kan den metod som vi beskriver här ge halv kvantitativa bedömningar av de oxiderade derivaten av 5mC i olika vävnader genom att bedöma kinetiken av peroxidasreaktion (som är proportionell mot färgningsintensitet) vid olika inkubationstider med tyramide 26.
The authors have nothing to disclose.
We thank the Advanced Microscopy Unit (School of Life Sciences, University of Nottingham) and the Histology team of MRC Human Reproductive Sciences Unit (Edinburgh), the Institute of Neuroscience at the ULB and the FNRS for help and support. This work was supported by MRC (MR/L001047/1 to A.D.J.).
Coplin jar | Cole-Parmer | UY-48585-30 | Glass made |
Xylene | Use only in Class II safety cabinet | ||
Phosphate buffer saline (PBS) | Fisher Scientific | 12821680 | pPH 7.5, filtered before use |
4% paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | Once made can be stored at -20°C in aliquotes for several months |
4% formaldehyde (FA) | Sigma Aldrich | F8775 | Once made can be stored at -20°C in aliquotes for several months |
Ethanol, anhydrous denatured, histological grade | Sigma Aldrich | 64-17-5 | 95, 75, 50 % in PBS |
0.01 % Tween 20 in PBS | Sigma Aldrich | P9416 | PBT |
0.5% Triton X-100 in PBS | Sigma Aldrich | X100 | PBX |
2 N HCl | Sigma Aldrich | 71826 | caution extremely toxic |
100 mM Tris-HCl | Promega | H5121 | PH adjusted to 8.5 |
hydrophobic barrier pen | Abcam | ab2601 | for immunohistochemistry |
Slide moisture chamber | Scientific Device Laboratory | 197-BL | |
anti-5mC mouse antibody | Diagenode | C15200081 | monoclonal primary antibody |
Anti-5hmC antibody | Active Motif | 39791 | rabbit polyclonal primary antibody |
Anti-5caC antibody | Active Motif | 61225 | rabbit polyclonal primary antibody |
Peroxidase-conjugated anti-rabbit seconday antibody | Dako | K1497 | |
555-congjuated goat anti-mouse antibody | Molecular probes | A-11005 | secondary antibody |
10% BSA | Sigma Aldrich | A9418 | Blocking solution |
22x32mm Glass cover slips | BDH | 406/0188/24 | |
Tyramide Signal Amplification System | Perkin Elmer | NEL741001KT | Other fluorochome conjugated seconday antibodies can be used for co-detection of oxi-5mC |
Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
Colourless nail polish | |||
chicken polyclonal anti-GFAP polyclonal antibody | Thermo Scientific | PA5-18598 | 1:400 dilution |
anti-NeuN mouse monoclonal antibody | Merck milipore | MAB377B | 1:400 dilution |