Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.
Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.
Methylering af cytosin baser i DNA (5mC) er en stor epigenetisk mærke findes i hvirveldyr genomer forbundet med transkriptionel lyddæmpning 1. 5mC bliver introduceret og vedligeholdes af DNA methyltransferaser 2-5, og er blevet vist at spille en vigtig rolle i en række biologiske processer, herunder genomisk prægning, X-kromosom inaktivering, cellulær differentiering og udvikling 3, 6. Følgelig afbrydelse af 5mC genomiske mønstre er forbundet med en række sygdomme 7, 8-11. På trods af fremskridt i forståelsen 5mC rolle i udviklingen og sygdom, er det stadig stort set ukendt, hvordan dette mærke bliver fjernet i at udvikle og voksne væv. Flere potentielle mekanismer DNA demethylering er for nylig blevet foreslået, herunder aktive og passive demethylering mekanismer 12, 13, 14, 15. Discovery af produkterne af 5mC sekventiel oxidation medieret af 10-11 translokation enzymes (TET1 / 2/3), såsom 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5FC), og 5-carboxylcytosine (5caC) i eukaryotisk DNA 16, 17, 18, 19 bedt spekulationer om de kan tjene som mellemprodukter med DNA demethylering processer eller fungere som stabile epigenetiske mærker i deres egen ret 13. Mens demonstrationen, at komponenten af base excision reparation, kan thymin-DNA glycosylase (TDG) binde og fjerne både 5FC og 5caC fra DNA 19, 20 foreslår en rolle for de modificerede 5mC derivater i en aktiv DNA demethylering. De seneste oplysninger viser, at 5FC / 5caC kan modulere hastigheden af RNA II bearbejdelighed peger på potentielle inddragelse af disse mærker i transkriptionel regulering 29. På grund af denne potentielle biologiske betydning af oxiderede former af 5mC, har en række biokemiske og antistofbaserede teknikker blevet anvendt til at studere deres genomiske fordeling og global indhold 16, 19-24.
Da de fleste af than hvirveldyr organer består af forskellige celletyper, og at fordelingen af modificerede cytosinbaser er væv og celletypespecifik 16-18, 20, 23, 25-27, bestemme den rumlige fordeling af oxiderede 5mC derivater i forskellige væv bliver en vigtig eksperimentel opgave nødvendige for afsløret deres biologiske funktioner. De fleste af de biokemiske og antistof tilgange giver ikke nogen geografisk information om fordelingen af de modificerede former af 5mC i forskellige væv og celletyper. I modsætning hertil kan immunkemiske teknikker giver en hurtig redskab til at vurdere den rumlige fordeling og nuklear lokalisering af 5mC 28 og dets oxiderede derivater 20. Det er sagt, rapporteret meget lav overflod af 5FC (20 i hver 10 6 cytosin) og 5caC (3 i hver 10 6 cytosin) i mus genom 18 udgør en væsentlig udfordring for standard immunkemi.
Her,beskriver vi en meget følsom immunokemisk metode, der giver robust og en hurtig påvisning af oxideret form af cytosin i pattedyrs hjernevæv. Ved at indarbejde peroxidase-konjugeret sekundære antistoffer koblet med et signal forstærkning skridt, denne metode omgår de udfordringer, detektering af de meget små mængder 5FC og 5caC. Derudover kan denne teknik anvendes til at co-detekterer modificerede former af cytosin med linjespecifikke markører, effektivt supplement til andre tilgange i belysningen af de biologiske funktioner af disse epigenetiske mærker.
Selv den rapporterede lave overflod af 5mC oxidation derivater, 5FC og 5caC i nogle væv vil præsentere betydelige begrænsninger for en standard immunkemi-protokol, inkorporeringen af peroxidase-konjugeret sekundære antistoffer tillod detektion af disse cytosin ændringer i faste væv og celler (figur 2) . Imidlertid bør det optimale inkuberingstid med tyramid opløsning optimeres eksperimentelt for hvert enkelt parti af tyramid signal amplifikationskittet hvor et lineært forhold mellem signal intensiteten og varigheden af tyramid baseret signalforstærkning observeres, for detaljer se Almeida et al. 2012 26 . Desuden kan signalet / baggrund-forholdet øges betydeligt ved at de vaske i en Coplin-skål for at tillade effektiv fjernelse af overskydende antistoffer. Efter inkubering med tyramid løsning, er det vigtigt at straks afbryde reaktionen ved vask i PBT løsning på decrease baggrundsfarvning. Det er afgørende ikke at tillade afsnittene tørre på noget tidspunkt under proceduren.
Effektiviteten af DNA-depurinering kan forbedres ved at udføre depurinering reaktionen ved 37 ° C. Mens anvendelse af 4 N HCI i stedet for 2 N forbedrer farvningen af de modificerede former af 5mC anvendelse af 4 N HCI i DNA depurinering ville ikke tillade co-farvning med DAPI, da den udelukkende interagerer med dobbeltstrenget DNA.
Selv om denne teknik kan tilvejebringe robust semi-kvantitativ vurdering af de modificerede former af cytosinbaser hvor detekterbar, kan det ikke anvendes til evaluering af absolutte niveauer af 5mC eller dets oxidation derivater. Derfor anbefaler vi at bruge andre komplementære, men kvantitative metoder 16, 19 -24. Siden opdagelsen af 5mC oxidation derivater i mammale genomer, er der udviklet flere metoder til at studere deres biologiske roller 16, 19-24. Selv om disse approaChes kan være værdifulde i fastlæggelse af de absolutte niveauer af 5mC oxidation derivater, de ikke give oplysninger om deres rumlige fordeling 20, 26. Vi har med succes brugt den her beskrevne fremgangsmåde til at kortlægge den rumlige fordeling og lokalisering af 5mC oxidation derivater i forskellige celletyper af udviklingslandene og voksne hjerne 20
Ved at afsløre deres rumlige fordeling 20, kan denne teknik være afgørende for at forstå de biologiske virkninger og skæbne oxiderede derivater af 5mC i forskellige biologiske sammenhænge, hvor der kan påvises disse modificerede derivater af 5mC herunder celledifferentiering, udvikling og sygdom. Derudover kan fremgangsmåden beskrives her giver semi-kvantitative vurderinger af de oxiderede derivater af 5mC i forskellige væv ved at vurdere kinetikken for peroxidase reaktion (som er proportional med farvningsintensitet) ved forskellige inkubationstider med tyramide 26.
The authors have nothing to disclose.
We thank the Advanced Microscopy Unit (School of Life Sciences, University of Nottingham) and the Histology team of MRC Human Reproductive Sciences Unit (Edinburgh), the Institute of Neuroscience at the ULB and the FNRS for help and support. This work was supported by MRC (MR/L001047/1 to A.D.J.).
Coplin jar | Cole-Parmer | UY-48585-30 | Glass made |
Xylene | Use only in Class II safety cabinet | ||
Phosphate buffer saline (PBS) | Fisher Scientific | 12821680 | pPH 7.5, filtered before use |
4% paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | Once made can be stored at -20°C in aliquotes for several months |
4% formaldehyde (FA) | Sigma Aldrich | F8775 | Once made can be stored at -20°C in aliquotes for several months |
Ethanol, anhydrous denatured, histological grade | Sigma Aldrich | 64-17-5 | 95, 75, 50 % in PBS |
0.01 % Tween 20 in PBS | Sigma Aldrich | P9416 | PBT |
0.5% Triton X-100 in PBS | Sigma Aldrich | X100 | PBX |
2 N HCl | Sigma Aldrich | 71826 | caution extremely toxic |
100 mM Tris-HCl | Promega | H5121 | PH adjusted to 8.5 |
hydrophobic barrier pen | Abcam | ab2601 | for immunohistochemistry |
Slide moisture chamber | Scientific Device Laboratory | 197-BL | |
anti-5mC mouse antibody | Diagenode | C15200081 | monoclonal primary antibody |
Anti-5hmC antibody | Active Motif | 39791 | rabbit polyclonal primary antibody |
Anti-5caC antibody | Active Motif | 61225 | rabbit polyclonal primary antibody |
Peroxidase-conjugated anti-rabbit seconday antibody | Dako | K1497 | |
555-congjuated goat anti-mouse antibody | Molecular probes | A-11005 | secondary antibody |
10% BSA | Sigma Aldrich | A9418 | Blocking solution |
22x32mm Glass cover slips | BDH | 406/0188/24 | |
Tyramide Signal Amplification System | Perkin Elmer | NEL741001KT | Other fluorochome conjugated seconday antibodies can be used for co-detection of oxi-5mC |
Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
Colourless nail polish | |||
chicken polyclonal anti-GFAP polyclonal antibody | Thermo Scientific | PA5-18598 | 1:400 dilution |
anti-NeuN mouse monoclonal antibody | Merck milipore | MAB377B | 1:400 dilution |