Introduction
대장은 외부 환경에 노출되어 상기 몸체의 큰 표면이다. 상주 균의 광대 한 배열 장내 미생물 (또는 미생물)를 형성하는 인간의 장내 정착. 이는 최대 100 조 미생물 세포로 구성되어 것으로 추정 생물학 1-3에 알려진 가장 인구 밀도가 세균의 서식지 중 하나 구성된다. 망할 놈의 박테리아는 생존과 4를 곱 장내 틈새 시장을 식민지화. 반환에서, 미생물은 유전자 1 인코딩되지 않은 추가 기능 기능 호스트를 부여한다. 예를 들어, 미생물은 상피 세포의 증식을 자극 스스로 호스트가 생성 할 수없는 비타민을 생산하고, 신진 대사를 조절하고 병원균 4-6을 방지합니다. 이 유익한 관계를 감안할 때, 몇몇 저자는 인간이 박테리아와 인간의 유전자 7,8의 혼합이다 "슈퍼 유기체"또는 "holobionts"것을 제안했다. 제 (인간) 호스트에있는 미생물의 수익에 미치는 영향을 감안할 때, 장내 면역 시스템은 루멘에서 자신의 존재를 가능하게뿐만 아니라 내강 측 9-11에서 침입 병원균을 죽일 공생 미생물을 허용 할 필요가있다. 장내 면역 시스템은 무해하고 잠재적으로 유해한 내강 미생물을 구별하는 메커니즘을 개발했다; 그러나 이러한 메커니즘은 아직 잘 (12)을 이해하지 않습니다. 장 무결성을 유지하는 것은 관용과 면역 (13) 사이의 균형을 유지하기 위해 엄격하게 규제 면역 항상성을 필요로한다. 면역 항상성의 불균형은 염증성 장 질환 (IBD) 3,14로 장 질환의 유도에 기여한다.
크론 병 (CD)과 궤양 성 대장염 (UC) : 두 가지 주요 IBD의 유형이있다. 이러한 질병을 가진 환자는 일반적으로 직장 출혈, 심한 설사와 복통 15, 16 겪는다. IBD의 하나의 원인은 아직유전 적 요인, 환경 적 영향 및 조절 이상 면역 반응의 알 수없는,하지만 조합이 질병 개발 (15)의 키 이벤트가 될 수 있습니다.
IBD에 대한 동물 모델은 50 년 이상 사용되어왔다. 지난 수십 년에 새로운 IBD 모델 시스템은 IBD (17, 18)의 발병 기전에 관련된 여러 가지 가설을 테스트하기 위해 개발되었다. 만성 대장염의 가장 특징으로하는 모델은 T 세포의 항상성 (19, 20)의 붕괴를 유도 T 세포 전달 모델이다. 16,21이 모델은 T 및 - (- / SCID 마우스와 같은 RAG 같은) B 세포가 부족 호스트로 면역 된 마우스에서 나이브 T 세포 전사 포함한다. 이 모델에서 질병의 발달은 체중 설사 존재 감소 신체 활동과 손실을 평가 3-10 주 동안 모니터링된다. 이 때문에 낭비 증후군 (16)이라고합니다. 건강한 쥐에 비해 이식 호스트의 대장 조직 thicke입니다R, 짧고 (16) 무거운. T 개의 셀의 전송 모델을 사용하면, T 세포 개체군은 22 IBD의 병인에 기여할 수있는 다른 방법을 이해할 수있다. T 개의 셀 전송 모델은 항원 특이 적 방식으로 질병 과정에 장갑차 및 T 세포 사이의 상호 작용을 분석하지 않는다. 또한 골수 세포 및 림프구 세포 간의 상호 작용은 염증 창자 (23)의 개발을 담당 할 수 있음을 보여왔다. IBD의 많은 부분이 밝혀져 있지만, 질환의 개발로 이어질 초기 사건은 여전히 명확하게 이해되어야한다.
이는 미생물 전송 대장염이없는 것을 도시하고있다 (24)를 확립 할 수 없다. 최근 몇 이론 IBD는 공생 세균 (25)에 대한 면역 반응의 결과 일 수 있음을 시사한다. 저자는 공생 박테리아 말단 부위에 염증을 유발하는 데 필수적인 것이 제안26. 세균 무연 (GF) 동물 장 면역 체계는 일반적으로 (27, 28)을 손상되지만 완전 권한 장 면역계 (29)의 발전에 관련되는 무균 박테리아 결과의 혼합물이 마우스의 집락. 따라서, 미생물은에 걸리기 또는 장내 염증 30, 31의 개발에 대해 보호하는 메커니즘으로 하나, IBD의 발병 기전에 중요한 요소가 될 것으로 보인다. 현재의 이론에서는 유전 적 소인이 IBD 환자 32, dysbiosis 불리는 미생물 불균형의 결과임을 암시하지만, 분명하지 아직 dysbiosis가 원인 또는 병 (12)의 결과 인 경우. IBD의 개발 미생물의 역할을 고려하여, 시험 관내 실험에서 CD4 + T 세포는 장내 세균 (33, 34)와 펄스 장갑차에 의해 활성화 될 수 있음을 보여 주었다.
또한, 항원은 그 도시 된같은 E. 등 다양한 공생 박테리아 종, 대장균, 박 테로이드, Eubacterium 및 테우스는 CD4 + T 세포 (35)를 활성화 할 수 있습니다. 이 세포를 T로 세균의 항원 제시는 IBD의 개발에 대한 중요성을 나타냅니다. 질병 과정에서 미생물에 의해 도출 된 여러 항원의 복잡성을 줄이기 위하여, 대장균 균주은 OVA 항원을 생성하는 생성되었다. - / - 전송 대장염은 RAG에 OVA 특이 적 T 세포를 주입하여 유도 하였다 OVA 동물 발현 E. 집락 대장균.
이 모델은 3 CR1 CX + 의원, 대장 점막 고유 층 (CLP) (36)의 주요 세포 서브 세트가 전송 중에 CD4 + T 세포와 상호 작용하는 것을 암시하는 최근 증거에 기초 37 대장염. 의원은 돌기 (36), (38, 39)를 이용하여 박테리아 등의 미립자 항원 창자 내강, 샘플링. 이전의 연구의원도 40, 41 루멘 장 도입 등의 OVA와 같은 수용성 항원을, 걸릴 수 있음을 보여 주었다. CLP를에 CX (3) CR1 + 의원의 풍요 로움을 감안할 때, 이러한 세포 내강 박테리아를 샘플링하고 CD4 T 세포와 상호 작용할 수있는 가능성이있다. E. 집락 OVA 특이 적 CD4 + T 세포를 이식 한 생쥐의 공 초점 화상 대장균 CFP-OVA는, CX (3) CR1 + 의원은 항원 중심 대장염의 개발 과정 OT-II CD4 + T 세포와 접촉하는 것을 보여준다. 이 모델은 장내 장갑차 만 장내 루멘에 특정 항원을 발현하는 박테리아에 특이적인 T 세포의 항원 제시 공정을 연구 할 수있다.
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Protocol
마우스는 사육과 울름 대학 (울름, 독일)의 동물 시설에서 특정 병원균이없는 (SPF) 조건에서 보관 하였다. 모든 동물 실험은 지역 동물 사용 및 관리위원회와 국립 동물 복지법의 지침에 따라 수행 하였다.
pCFP - OVA 플라스미드 1. 건설
- 플라스미드 PCI-OVA (저항 암피실린) 템플릿으로 42을 사용하여 프라이머 Ova_SpeI_fw (3'-GACCAACTAGTATGGAATTTTGTTTTGATGTATT-5 ') 및 Ova_ClaI_rev (3'- GACCAGATCGATTAAGGGGAAACACATCTGCC-5') (37)를 사용하여 풀 사이즈 OVA 유전자를 증폭. 특정 OVA 플라스미드를 생성하기 위해 프라이머 및 벡터를 SpeI와 라이터 시험 제한 부위를 사용하여 시판의 파지 미드 벡터 내로 (난자 코딩 서열 IE) PCR 산물을 복제.
- 플라스미드 패드 1을 사용하여 강한 구성 적 프로모터 P 하이퍼과 함께 CFP 코딩하는 유전자를 증폭 43 CFP_SpeI_rev (3'-GATCGAACTAGTACCACCACCACCACCACCTTTGTAGAGTTCATCCATGC-5') 37.
- 프라이머 및 벡터 (37)의를 SpeI 및 SacI로 제한 부위를 사용하여 특정 OVA-플라스미드 (암피실린 내성)에 CFP 코딩 유전자를 복제. 이 OVA - 코딩 서열에서 CFP 코딩 사이 6 글리신 잔기의 스페이서를 소개합니다.
대장균 pCFP - OVA 2. 건설
- 하룻밤 동안 회전 진탕 기에서 37 ℃에서 호기 루리아 베르 타니 (LB) 배지 100 ㎖에 콜라이 균주 DH10B 성장.
- -80 ° C에서 글리세롤 주식과 상점을 작성하는 글리세롤의 200 μL와 세균 배양 800 μl를 섞는다.
- LB 배지 5ml에 글리세롤 스톡으로부터 대장균 균주 DH10B의 50 μl를 넣고 회전 진탕 비켜 37 ℃에서 호 기적으로 그들을 성장rnight.
- 회전 진탕하에 37 ℃에서 LB 배지 250㎖를 가진 당황 1 L 삼각 플라스크에서 배양 전송.
- 600 nm에서 광학 밀도 박테리아 성장 (OD 600) 0.5의 다음 30 분 동안 얼음에 문화를 진정. 4 ℃에서 10 분 동안 5,000 XG에서 박테리아를 원심 분리기.
- 빙냉 10 % 글리세롤 및 원심 균 100㎖로 4 ℃에서 재현 탁 박테리아에서 10 분 동안 5,000 XG에 빙냉 멸균 H 2 O 원심 균 100㎖로 재현 탁 박테리아를 10 분 동안 5,000 XG에 4 ° C에서. 두 번이 마지막 단계를 반복합니다.
- 최종 세척 단계 후, 10 % 글리세롤 700 μL 세균을 재현 탁. -80 ° C에서 액체 질소와 저장소에 50 μL 씩 동결.
- 미리 냉장 전기 큐벳 (2mm 전극 거리)에 얼음과 전송에 50 μL 나누어지는을 녹여.
- 50 μl의 E.에 플라스미드 DNA (100 NG)의 5 μl를 추가 대장균 aliquoTS. 25 μF, 200 옴 (Ω) 2.5 kV의에 하나의 펄스로 전기를 수행합니다.
- 1 ㎖의 사전 가온 SOC 배지 (5g / L의 효모 추출물, 2g / L의 트립 톤, 10 mM 염화나트륨, 2.5 mM의 염화칼륨, 10 mM 염화 마그네슘, 10 mM의 마그네슘 설페이트)에 재현 탁 박테리아 및 37 ° C에서 부화 기적 1 시간 동안.
- LB 한천 플레이트에 플레이트 박테리아는 앰피 실린 100 ㎍ / ㎖ (LB 한천의 100 ㎖에 100 ㎎ / ㎖ 암피실린 주식 100 μl를 추가) 하룻밤 호기 37 ° C에서 부화로 보충.
- 암피실린 100 μg의 / ㎖로 보충 LB 한천 플레이트에서 하나의 식민지가 다시 행진을 선택합니다. 하룻밤 호기 37 ° C에서 품어.
- 단일 콜로니를 선택하고, 플라스미드 아이솔레이션 용 앰피 실린 100 ㎍ / ㎖로 보충 된 LB 배지 10ml에 밤새 그들을 성장. 시중에서 판매하는 플라스미드 미니 준비 키트를 사용하여 30 μl의 DH 2 O (증류수) 제조 업체에 따라 '로 플라스미드 DNA를 용출;의 프로토콜입니다. 제한 분석 및 DNA 시퀀싱 37,42,43하여 플라스미드를 확인합니다.
- E.의 긍정적 인 클론의 문화를 설정 LB 배지 100 mL에 대장균 pCFP-OVA는 암피실린 100 μg의 / ㎖로 보충. 회전 진탕 하룻밤에 37 ° C에서 기적 성장.
- -80 ° C에서 순수 글리세롤 및 저장의 200 μL와 세균 배양 800 μl를 섞는다.
- 실온 (RT)에서 10 분 동안 5,000 XG에서 밤새 배양 나머지 원심 분리하고 인산염 완충 식염수 (PBS)에 펠렛을 재현 탁. 유리 슬라이드에 현탁액의 10 μl를 배치하고, 커버 슬립으로 커버.
- CFP-OVA의 발현 형광 (450 nm에서 CFP 여기, 480 nm에서 방출)를 확인하기 위해 표준 형광 현미경으로 샘플을 관찰한다. 배율 400X로 시작하는 박테리아를 분석합니다.
- 원심 분리기 10 분, RT 5,000 XG에 하룻밤 문화 박테리아 1 ㎖. 40 μL에 펠렛을 재현 탁PBS 10 분 동안 95 ° C에서 끓인다.
- 10 분 동안 30,000 XG에서 샘플을 원심 분리기 및 웨스턴 블롯 분석 (37)의 상층 액을 사용합니다. 400 : 1로 희석 토끼-발생 방지 OVA 폴리 클로 날 항체를 사용합니다.
OT-II의 3 세대 / 레드 마우스
- 구약-II / 레드 마우스 (37)을 생성하기 위해 적색 형광 단백질을 발현 여성 / 남성 마우스로 남성 / 여성 OT-II 마우스 (두 균주 시중에서 판매)을 교차.
4. 비장 세포 분리
- 어떤 할로겐화 에테르의 흡입 마취 후 자궁 전위에 의해 OT-II / 레드 쥐를 안락사 상업적으로 이용 가능한 (최대 유도 5 %).
- 마우스의 왼쪽 우수한 복부 부분을 잘라 가위를 사용합니다. 이 복부 부분에서 비장 (어두운 붉은 색 타원형 모양)이있다. 그것을 제거하기 위해 가위와 핀셋을 사용합니다.
- 구약-II / 레드 마우스의 비장의 압축을 해제하고 (100)를 통해 통과μm의 셀 스트레이너는 단일 세포 현탁액을 수득하기 위해 1 mL의 주사기의 플런저를 사용하여 50 ㎖ 튜브에 위치. PBS 중 2 회 10 ㎖의 1 % 열 불 활성화 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 된 여과기를 세척한다.
- RT에서 5 분 동안 390 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기. 적혈구를 용해시키기 위해 예열 용해 완충액 (144 mM의 NH 4 CL, 17 mM 트리스, pH는 7.2) 5 ㎖로 펠렛을 재현 탁. 37 ° C에서 10 분을 품어.
- PBS 25 ㎖의 1 % FBS로 보충하여 시료를 세척 하였다. RT에서 5 분 동안 390 XG에 원심 분리기. PBS 10 ㎖의 1 % FBS로 보충 된 상기 펠렛을 재현 탁.
- 노이 바 우어 계산 챔버를 사용하여 세포를 계산합니다. 0.4 % 트립 판 블루 용액 10 μL와 세포 현탁액 10 μL를 혼합한다. 1-2 분 동안 품어.
- 염색 된 세포의 10 μL와 혈구 챔버를 입력합니다. 사 1 × 1mm 하나의 챔버와 determin의 2 제곱을 현미경으로 세포를 계산평방 당 세포의 평균 수를 전자. 실행 가능한 세포는 흰색, 죽은 세포 파란색 표시가 나타납니다. 세포의 수를 결정 / 희석 인자에 의해 세포 수를 ml로 곱한다. 2 ~ 4 사분면이 계산되는 경우, 사분면의 숫자로 나눕니다.
5. CD4 + CD62 L + T 세포 농축
- 제외 또는 선택의 원리를 이용하여 자기 분리 키트를 통한 CD4 + CD62L + T 세포, 비장 세포를 풍부. 여기서, CD4 + T 세포를 분리하고, 상기 CD4 + T 세포의 풀 내의 CD62L + 인구 풍부 양성 선별을 사용하여 음성 선별을 사용한다.
주 : 음의 선택 과정에서 고립되지는 않습니다 세포, (여기에 모든 CD4 음성 세포가) 자기 마이크로 비드과 함께 특정 항체로 표시되어 있습니다. 컬럼 세척 단계에서 그들이 EASI 수 있도록 CD4 + T 세포가 컬럼을 통해 통과 할 것이다LY 수집. 긍정적 인 선택 절차 세포에 자성 마이크로 비드과 함께 적절한 항체로 표시되어 격리된다. 열 세척 단계 동안 표지 세포는 열에있을 것입니다 그리고 그들은 자기 분야에서 열을 제거하고 버퍼로 세척하여 수집 할 수 있습니다. - 음 선택 절차를 들어, 0.5 % 소 혈청 알부민 (BSA)이 보충 된 차가운 PBS에 40 ㎕의 10 7 전체 비장 세포를 재현 탁. (비 CD4 + T 세포를 특이 적으로 결합하는 항체) (10) 자기 분리 키트와 함께 제공 비오틴 표지 된 항체 칵테일의 μl를 추가하고 얼음에 15 분을 품어.
- 차가운 PBS 30 ㎕를 0.5 %의 BSA 및 안티 비오틴 마이크로 비드의 20 μL를 추가로 보충. 얼음에 20 분을 품어.
- PBS 10 ml를 5 분 동안 390 XG에 0.5 % BSA와 원심 보충 샘플 추가. 두 번이 단계를 반복합니다. 0.5 % BS 보충 차가운 PBS 1 ml의 세포를 재현 탁에이.
- 자기장의 음성 선별 과정의 특정 열을 배치하고 차가운 PBS 3 ㎖로 세정 칼럼에 0.5 % BSA로 보충. 차가운 PBS 3 ㎖로 3 차례 칼럼에 세포 현탁액을 추가 세척은 0.5 % BSA로 보충.
- 5 분 390 XG에 유출의 원심 분리기 세포. 컬럼을 통해 유출 통과는 레이블이없는 CD4 + T 세포가 포함되어 있습니다. 0.5 % BSA로 보충 된 1 ml의 PBS에 펠렛을 재현 탁하고, 세포를 계산.
- 노이 바 우어 계산 챔버를 사용하여 세포를 계산합니다. 0.4 % 트립 판 블루 용액 10 μL와 세포 현탁액 10 μL를 혼합한다. 1-2 분 동안 품어.
- 염색 된 세포의 10 μL와 혈구 챔버를 입력합니다. 사 1 × 1mm 하나의 챔버의 2 제곱을 현미경으로 세포를 세어 평방 당 세포의 평균 수를 결정합니다. 실행 가능한 세포는 흰색, 죽은 세포 파란색 표시가 나타납니다. 세포 / ㎖ CEL 곱셈의 수를 결정희석 요인에 의해 리터 번호. 2 ~ 4 사분면이 계산되는 경우, 사분면의 숫자로 나눕니다.
- 긍정적 인 선택 절차는 107 미리 풍부한 CD4 + T 세포 분획 당 CD62L 마이크로 비즈의 10 μl를 추가합니다. 얼음에 15 분을 품어.
- PBS 10 ml를 5 분 동안 390 XG에 0.5 % BSA와 원심 보충 샘플 추가. 두 번이 단계를 반복합니다. 차가운 PBS 500 μL에 재현 탁은 0.5 % BSA로 보충.
- 자기장에 부정적인 선택 과정에 대한 구체적인 럼 놓고 칼럼에 0.5 % BSA로 보충 된 차가운 PBS 500 μL로 헹군다. 차가운 PBS 500 ㎕를 3 회 칼럼에 세포 현탁액을 추가 세척은 0.5 % BSA로 보충.
- 자기장에서 열을 제거하고 적절한 포집 관에 놓습니다. 컬럼에 0.5 % BSA와 보충 PBS 1 ㎖를 추가하고 CD4 + CD62L + T 세포를 세척단단히 열에 플런저를 밀어 열에 s의 유지.
참고 : 격리 된 CD4 + CD62L + T 세포는 이제 생체 실험 등 다운 스트림 응용 프로그램에 대한 준비가되어 있습니다. CD4 + CD62L + T 세포 분리 키트 제조업체의 지시에 따라, 마이크로 비드 독성 아니다. 작은 크기 (약 50 ㎚)으로 인해, 그들은 세포를 활성화하지 않는 그들은 세포 표면 항원 결정기를 포화되지 않습니다. 따라서, 분리 된 세포는 대장염 37,44,45을 유도하는 면역 결핍 쥐에 전달 될 수있다. - 노이 바 우어 계산 챔버를 사용하여 세포를 계산합니다. 0.4 % 트립 판 블루 용액 10 μL와 세포 현탁액 10 μL를 혼합한다. 1-2 분 동안 품어.
- 염색 된 세포의 10 μL와 혈구 챔버를 입력합니다. 사 1 × 1mm 하나의 챔버의 2 제곱을 현미경으로 세포를 세어 평방 당 세포의 평균 수를 결정합니다. 가능한 세포의 appea흰색, 죽은 세포 파란색 나타납니다 r에. 세포의 수를 결정 / 희석 인자에 의해 세포 수를 ml로 곱한다. 이 경우 - 4 사분면이 계산되고, 사분면의 숫자로 나눕니다.
항원 중심 대장염 6. 유도
- - / - 생쥐 CX 3 CR1 GFP / + X RAG에 복강 3 × 105 OT-II / 레드 CD4 + CD62L + T 세포를 주입한다. 항원 특이 대장염의 유도, E. 관리 대장균 pCFP-OVA 앞니 뒤에 위관 또는 구두 점안하여 동물 당 PBS 100 ㎕의 1 × 10 8 콜로니 형성 단위 (CFU)의 용량에 모든 둘째 날.
- 일주일에 두 번 몸에 이식 된 쥐의 체중과 임상 조건 (마우스의 대변, 대변 일관성과 활동에 혈액의 존재)를 모니터링합니다.
조직 병리학 적 검사 7. 조직 샘플
- 일에서 조직 샘플을 채취이전 36, 46 설명 된대로 마우스의 전자 대장은 파라핀에 중성 완충 포르말린 (10 %) 및 embed에 고정합니다.
- 제 마이크로톰에 파라핀 샘플은 슬라이드에 장착하고, H & E 염색 (47, 48)을 수행합니다.
- 이전에 (47, 48)이 공표 한 대장의 조직 학적 분류 : 일반 (0 점수); 가벼운 대장염 (1 득점), 중간 대장염 (2 득점)과 중증 대장염 (3 득점).
대장 얇은 판의 propria 세포의 8. 분리
- 시중에서 판매하는 자궁 경부 전위 어떤 할로겐화 에테르의 흡입 마취 후 (유도 최대 5 %)에 의해 이식 된 쥐를 안락사.
- 배면이 위를 향하도록하여 동물을 놓습니다. 요도 개구부에 전방으로 피부를 잡아 집게를 사용합니다. 가슴에 사타구니에서 복부 정중선을 따라 피부를 잘라 가위를 사용합니다. 측면에 피부를 뒤로 잡아 당깁니다.
- 투명 복막 근육 벽을 통해 잘라체강을 개방. 맹장 (49) 항문에서 진행 대장을 확인합니다. 2 사지를 절단하고 지방에서 조직을 확보.
- 길이 방향 해부 가위를 사용하여 대장을 엽니 다. PBS 25 ml에 포함 된 배양 접시에서 파편과 점액을 제거하기 위해 1 % FBS와 보충 결장 조직을 흔들 핀셋을 사용합니다. 8mm 조각 - 5로 결장을 잘라.
- 워시 완충액 20 ㎖를 함유하는 50 ㎖ 튜브에서 결장 세그먼트를 배치했다. 세척 버퍼 500 ML의 DPBS, 10 mM이 헤 페스 mm로 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)가 포함되어 있습니다.
- 최대 속도에서 30 초 동안 튜브를 소용돌이.
- 200 rpm으로 10 분간 진탕하면서 37 ℃에서 수욕에서 대장 세그먼트 튜브 부화.
- 배양 후, 최대 속도에서 30 초 동안 튜브를 소용돌이.
- 상청액을 폐기하고, 세척 완충액 20 ㎖를 함유하는 새로운 50 ㎖ 튜브에서 조직 샘플을 놓는다. 반복 6-9 세 번 단계
- 의 S 폐기upernatants와 PBS의 25 ml에 포함 된 배양 접시에서 조직 샘플을 배치합니다. 몇 초 잔여 상피 세포를 제거하는 페트리 접시에 부드럽게 조직 샘플을 흔들 핀셋을 사용합니다. 이 단계를 세 번 반복합니다.
- 2 × 2mm 2 조각으로 결장 조직을 잘라 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI) 클로스 트리 디움 histolyticum 0.5 ㎎ / ㎖ 콜라게나 제 타입 VIII 및 DNaseI 10 U / ㎖와 매체의 10ml에 배양을 소화.
- 최대 속도에서 30 초 동안 튜브를 소용돌이.
- 200 rpm으로 35 분간 진탕하면서 37 ℃에서 수욕에서 대장 단편 부화 최대 속도에서 30 초마다 5 분간 튜브 소용돌이.
- 배양의 마지막에, 최대 속도에서 30 초 동안 튜브를 소용돌이.
- 새로운 50 ML 튜브에 위치 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 전달하여 소화 조각을 수집합니다.
- 5 분간 400 g에서 20 DPBS ml의 원심 분리를 첨가하여 시료를 세척 하였다. 그런 다음에 resuspend tDPBS 1 ㎖에서 그는 세포.
- 노이 바 우어 계산 챔버를 사용하여 세포를 계산합니다. 0.4 % 트립 판 블루 용액 10 μL와 세포 현탁액 10 μL를 혼합한다. 1-2 분 동안 품어.
- 염색 된 세포의 10 μL와 혈구 챔버를 입력합니다. 사 1 × 1mm 하나의 챔버의 2 제곱을 현미경으로 세포를 세어 평방 당 세포의 평균 수를 결정합니다. 실행 가능한 세포는 흰색, 죽은 세포 파란색 표시가 나타납니다. 세포의 수를 결정 / 희석 인자에 의해 세포 수를 ml로 곱한다. 2 ~ 4 사분면이 계산되는 경우, 사분면의 숫자로 나눕니다.
FCM 분석 9. 세포 외 염색
- 원심 분리기 390 × g으로의 CLP 세포 5 분. FACS (A)의 1 ml의 세포를 재현 탁 (PBS에 1 % BSA 및 0.1 % 아 지드 화 나트륨으로 보충)
주 : 아 지드 화 나트륨은 매우 독성이다. 그것은 저혈압, 냉증, 두통 발작이나 사망의 원인이 될 수 있습니다. (0, 아 지드 화 나트륨의 희석액0.1 % ~ 1.0) 일반적으로 사용자에게 특별한 위험을 제시하지만, 그들은 눈과 피부에 자극을하지 않습니다. 실험실 코트와 일회용 니트릴 장갑의 두 쌍을 입고있는 동안 따라서, 단지 화학 후드에서 아 지드 화 나트륨을 사용합니다. - FACS A에 희석 FcγRIII / II CD16 / CD32에 대한 감독 단일 클론 항체 (단클론 항체) 2.4G2 (0.5 μg의 단클론 항체 / 10 6 세포)로 실온에서 15 분 동안 세포를 품어
- 390 X g에서 세포를 원심 분리기 5 분에 FACS (A)의 200 μl를 추가합니다. 두 번이 단계를 반복합니다. 0.5 4 ° C에서 20 분 동안 관련 단클론 항체의 / 10 6 세포를 ng를 가진 세포를 품어. FACS A의 항체 희석
- 390 X g에서 세포를 원심 분리기 5 분에 FACS (A)의 200 μl를 추가합니다. 두 번이 단계를 반복합니다. FACS의 A. 100 ㎕의 샘플을 재현 탁
- CX (3)으로부터 T 세포를 분석 CR1 GFP / + X RAG - / - OT-II / 37 흐름 cytometer 적색 CD4 T 세포로 재구성 쥐.
10. 공 초점 현미경 분석
- OT-II / 레드 CD4 + CD62L + T 세포로 재구성 여부 CX (3) CR1 GFP / + 마우스의 결장을 분석하고 E. 1 × 10 8 CFU로 모든 둘째 날 구두로 공급 대장균 균주 DH10B pCFP-OVA.
- 가위와 핀셋을 사용하여 마우스의 결장을 제거합니다. 이 길이 방향으로 해부 가위를 사용하여 엽니 다.
- 가위를 사용하여 대장 샘플의 5-8mm 조각을 잘라 유리 슬라이드에 넣고 된 커버와 커버.
- 40 / 1.30의 확대에 공 초점 현미경으로 대장 샘플을 분석 할 수 있습니다.
- 509 nm에서 488 nm에서 여기 및 방출 세트 필터를 사용하여 녹색 형광 단백질 (GFP)이 표시된 CX (3) CR1 + 의원을 감지합니다.
- 58에서 554 nm에서의 여기 및 방출 세팅 된 필터를 사용하여 적색 단백질을 발현하는 CD4 + T 세포를 검출6 나노 미터.
- 480 nm에서 450 nm에서 여기 및 방출 세트 필터를 사용하여 대장균 pCFP-OVA를 감지합니다.
- 관심 영역을 정의하고, 이전에 공동 위치 파악 분석을 수행하기 위해 50 바와 같이 분산도를 생성한다. 은 Manders와 피어슨의 계수에 따라 중첩 계수 : 2 개의 다른 공식을 사용합니다.
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Representative Results
항원 중심 대장염 모델 E.을 설정하려면 콜라이 균주 강한 구성 적 프로모터 P 하이퍼 (도 1a)의 제어 하에서 발현되는 CFP 유전자가 닭 오브 알부민 단백질과 융합 구조체에 대한 코딩 서열에 융합 된 플라스미드를 포함하는 구성되었다. 형광 현미경 보여줍니다 재조합 E. 대장균 pCFP-OVA가 아니라 부모의 E. 대장균 DH10B는 CFP (그림 1B)를 표현한다. E.을 생산하는 CFP-OVA- 대장균은 시험 관내 OT-II 세포를 활성화 및 E. 대조적으로 IFN-γ의 생산을 유도 할 수있다 CFP를 표현하는 대장균 균주 만 (그림 2 참조). 그림 3a는 E.가 공급 CX (3) CR1 GFP / + 마우스의 대장 조직의 생체 3D 공 촛점 영상을 보여줍니다 대장균 pCFP-OVA. E. 대장균 pCFP-OVA 수상피 세포 및 장 가까이있는 대장 지하실 내에서 검출 될 CX (3) CR1 + 식세포와 공동-지역화. E.의 상대적 비율을 확인하려면 대장균 pCFP-OVA 3 CR1 + 식세포가, 파란색과 녹색의 형광 강도가 산란 말에 의해 결정되었다 정의 CX에 의해 내면화. 분석은 CX (3) CR1 + 세포가 E.의 11.9 ± 1.5 %를 샘플링 것으로 나타났다 대장균 pCFP-OVA는 콜론. OT-II에서 (그림 3B) / 레드 동물에서 발견, CD4 + T 세포 레드 표현과 Vβ 특징으로 유동 세포 계측법 (그림 4)로 표시 5.1 표현은.도 5a는 일반적인 개요를 보여줍니다 항원 구동 대장염 모델입니다. OT-II / 레드 + CD4 + T CD62L는 + 세포는 적응 적 CX (3)에 전송 된 CR1 GFP / + X RAG - / - 다음 E.으로 매초마다 하루 gavaged 된받는 사람대장균 pCFP-OVA. E.에 도전 할 때 대장균 pCFP-OVA는, CX (3) 전송 CR1 GFP / + X RAG - / - 마우스가 체중을 잃고 대장염 (그림 5B)의 임상 증상을 개발 6은 생체 3D 대장 조직 7 일, 14 일, 21 일 후의 공 초점 이미징 그림. 이형 CX의 재구성은 3 CR1 GFP / + X RAG - / - OT-II와받는 사람 / 레드 + 세포 E.에 도전 대장균 pCFP-OVA. 이레 셀 전송 후 몇 CX (3) CR1 + 식세포는 E. 샘플링 한 대장균 pCFP-OVA 및 OT-II는 / 레드 + 세포는 검출되지 않았다. 셀 전송 후 열네 일, CX E. 샘플링 3 CR1 + 식세포를 대장균 pCFP-OVA는 OT-II에 가까운 / 레드 + 세포에 있었다. 스물 일일 전지 후 E. 샘플링 한 3 CR1 + 세포는 CX의 높은 숫자를 전송 대장균 pCFP-OVA 및 OT-II / R근접 CLP를 통해 분산 에디션 + 세포는 3 CR1 + 식세포를 CX합니다.
그림 1 : CFP-OVA을 일으키기 E. 관련 제한 사이트와 pCFP - OVA의 대장균. (A)지도, OVA와 밝은 푸른 형광 단백질 CFP를 코딩하는 유전자. (B) 밝은 필드와 야생형 E.의 형광 현미경 이미지 대장균 DH10B, E. 대장균 DH10B pCFP 및 E. 대장균 DH10B pCFP-OVA. 스케일 바 :. 10 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : OTCFP-OVA로 자극 -II 세포는 IFN-γ를 생성합니다. 비장에서 분리 한 후, OT-II 세포는 E.의 지정된 번호로 자극 하였다 대장균 DH10B pCFP-OVA. 세균 세포는 5 μg의 / ㎖ 겐타 마이신 2 시간 배양 한 다음 불 활성화되었다. 배양 72 시간 후에, 상등액을 수집하고, IFN-γ의 농도는 ELISA에 의해 결정된다. 실험은 SEM ± 평균으로 제시 삼중 데이터에서 수행 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : CX (3) CR1 + 식세포 샘플 E. 대장균 pCFP-OVA. (A) CX (3) CR1의 CLP 조직GFP / + 마우스는 1 × 8 E.으로 gavaged 대장균 pCFP-OVA 7 일간 및 생체 공 초점 현미경으로 분석 하였다. 배율 40 배 / 1.30. 스케일 바는 30 μm의 =. (B) 내면화 E.의 비율 대장균 pCFP-OVA는 정량 데이터는 SEM ± 평균으로 제시했다. 맨 - 휘트니 테스트 페이지에서 <0.05가 통계적으로 유의 한 것으로 간주 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4 :. OT-II / 적색 + CD4 + T 세포의 특성 (A) OT-II 유전자 변형 동물 OT-II을 수득하는 적색 형광 단백질을 발현하는 동물과 교배 / 적색 +세포. OT-II는 / 레드 + 세포는 OT-II / 레드의 비장에서 분리 하였다 형질 전환 동물, CD4 및 Vß5.1에 대한 염색 및 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : OVA 기반 전송 대장염 (A) 항원 구동 대장염 모델의 도식 표현.. E.으로 마우스와 호스트 gavaged 된 모든 둘째 날 - / - OT-II / 레드 + CD4 + T CD62L는 + 세포는 적응 적 3 CR1 GFP / + X RAG는 CX로 옮겨졌다 대장균 pCFP-OVA. 지정된 그룹 (B) 체중은 일주일에 두 번 측정 하였다. ± SEM 체중 감소 (%)을 의미하는 것이 제공된다. 맨 - 휘트니 테스트에서P는 <0.05가 통계적으로 유의 한 것으로 간주 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 :. CX 3 CR1 + 의원은 OVA 기반 전송 대장염 동안 OT-II 셀과 통신 (A) 대장 조직 샘플 OT-II / 레드의 전송 후 7 일, 14 및 21에서 생체 3D 공 초점 영상으로 조사 하였다 - / -받는 사람 CX (3) CR1 GFP / + X RAG에서 + CD4 + T CD62L는 + 세포. 배율 40 배 / 1.30. 스케일 바는 30 μm의 =.
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Discussion
다른 모든 모델과 같이, 상술 한 항원 구동 대장염 모델 기술을 수행하는 연구자는 유의해야 할 몇 가지 문제점을 제시 할 수있다. 구약-II 호스트에서 / 레드 + CD4 + T CD62L + 세포를 주입 할 때, 연구자는 복강에 주사 바늘을 삽입하는 것은 매우 온화하고주의해야합니다. 그렇게하지 않으면 사망에이를 수있는 마우스 또는 질병을 유발하지 않습니다 세포의 피하 투여의 소장의 파열 될 수 있습니다.
일반적으로 마우스는 셀 전송 후 첫 주 동안 체중이 증가 할 것이다. 연구자는 각각 중량 시점에서 동시에 마우스 무게 및 전체 공정에 걸쳐 동일한 무게 저울을 사용한다. 때로는 실험 쥐 실험의 시작에서 그 무게가 18g 이하이며, 특히 낭비 증후군의 징후를 개발하지 않는다. 그러나 이러한 동물 might는 여전히 거시적 평가에서 중요한 장내 염증을 개발한다.
유전자 변형 박테리아로 작업 할 때, 오염이 발생할 수 있습니다. 가 높은 박테리아가 막대 모양 (전형적인 대장균 모양) 형광하고 있는지 분석하기 위해 형광 현미경을 이용하여 CFP-OVA를 발현하는 대장균을 확인하는 것이 좋습니다 이러한 문제를 방지 할 수 있습니다.
제안 된 항원 피구 대장염 관찰에 의존하는 정상 상태 및 염증성 질환 (36, 37) 중 3 CR1 CX + 의원 샘플 내강 공생 박테리아. 항원 구동 대장염 모델에서 T 세포 반응의 유도는 CX 3 CR1 GFP의 콜론에서 OT-II CD4 + T 세포의 고도로 활성화 된 표현형에 의해 입증되었다 / + X RAG - / - 항원과 도전 생쥐 CX는 3 CR1 GFP / + X RAG에서 격리 T 세포에 비해
공 촛점 영상은 E.를 샘플링 할 수 있도록 CX (3) CR1 + 식세포가 장 상피 세포에 가까이 위치하고 있습니다 제안 대장균 pCFP-OVA는 및 OT-II / 레드 + CD4 + T 세포와 상호 작용합니다. CX (3) CR1 + 식세포는 E. 샘플링 한 후 대장균 pCFP-OVA 내강 항원 CX (3) CR1 + 식세포에 의해 CD103 + 수지상 세포 (DC가)에 전달된다. CD103 + 수지상 프라임 CD4 T 세포 37,52에 장간막 림프절 (MLN)로 마이그레이션 할 수 있습니다. 프라임 T 세포는 CX (3) CR1 + 식세포가 전자하기 위해 OVA 항원을 보여 CLP에서 조립ffector T 세포가 염증을 유도한다. CX에 의한 항원의 전달 및 프리젠 테이션 3 CR1 + 식세포는 대장염의 개발에서 중요한 이벤트가 될 수있다.
특정 항원을 발현 정의 된 박테리아로 대장염을 유발하는 능력은 대장염 (24)의 발전에 필요한 조건을 연구 할 수있는 기회를 제공한다. T 세포는 장내 미생물의 특이 적 항원에 반응 할 수 있음을 시사 호스트 - / -이 모델은 항원 성 펩티드 (E. coli에 의해 표현 OVA)에 대한 특정 응답 RAG 장내 염증을 유도하기에 충분한 것으로 나타났다. 단일 항원은 동물 모델에서 장내 염증을 유도 할 수 있지만, 단일 항원 인간 IBD의 원인이라고 가정 할 수 없다. 또한, 전사 성 대장염 모델에서 아직 미확인 된 항원과 같은 여러 반응성 일 수있다 따라서, 미지의 특이성을 갖고 나이브 CD4 + T 세포에서 존재미생물. 주요 분석과 연구가 잘 점막 염증 병인에서 특정 항원의 역할을 규명하기 위해 필요하다.
최근 대장염의 다른 동물 모델의 사용은 IBD (53)의 발병 기전의 지식을 확장하게되었다. 복잡성과 질병의 병인에 기인하지만, 최종 경화 (54)이 없다. 상술 한 모델을 이용하여, 이러한 단핵구와 수상 세포 사이의 (I)의 상호 작용뿐만 아니라 아직 명확하지 IBD의 여러 측면을 해결하는 것이 가능하다은 MLN에 장내 수지상 (II)의 이동, (ⅲ) 항원 제시, CX + 3 CR1 식세포에 의한 점막 고유 층의 고유 판 및 이펙터 T 세포 (V) 활성화에 MLN에서 이펙터 T 세포 (IV) 원점. 그러나 추가 연구는 CX (3) CR1 +의 식세포가 / CD4 + T 세포의 상호 작용이 중요한 역할을 담당하는 경우 확인 필요IBD의 발병 기전. 마우스는 인간의 진정으로 대표 할 수 없으며 마우스 모델 인간 IBD이 연구하는 데 사용하는 경우이 염두에 보관해야합니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Difco | 244620 | |
| Rotary Shake | Reiss Laborbedarf e. K. | Model 3020 GFL | |
| 2 mm gap couvettes | Peqlab Biotechnologie GmbH | 71-2020 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-100ML | |
| Gene Pulser Xcell system | BioRad Laboratories GmbH | 1652660 | |
| LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Difco | 244510 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-5G | |
| SOC Medium | Sigma-Aldrich | S1797-100ML | |
| High Pure Plasmid Isolation Kit | Roche | 11754777001 | |
| Agarose | Carl Roth GmbH & Co | 3810.1 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884-100G | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 537020 | |
| Gel chamber | PEQLAB Biotechnology GmbH | 40-0708 | |
| Loading Dye | Thermo Fisher | R0611 | |
| GeneRuler 1 kb DNA Ladder | Thermo Fisher | SM0312 | |
| Ethidium bromide solution | Carl Roth GmbH & Co. KG | 2218.3 | |
| Photo-documentation system | Decon Science Tech GmbH | DeVision G | |
| DNA sequencing | MWG-Biotech GmbH | ||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom | L182-50 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | HBO 100 | |
| Mini-PROTEAN Tetra System | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1658005 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Fermentas, St. Leon-Rot, Germany | ||
| IstanBlue Solution | Expedeon, Cambridgeshire, United Kingdom | ||
| Nitrocellulose membrane | Macherey-Nagel GmbH & Co. KG | 741280 | |
| Electro blotter | Biometra GmbH | 846-015-600 | |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A6003-25G | |
| Anti-Ovalbumin antibody | Abcam | ab181688 | |
| Anti-rabbit IgG HRP | Sigma-Aldrich | A0545 | |
| Pierce ECL Plus Western Blotting Substrate | Pierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc | 32132 | |
| Forene | Abbott | 2594.00.00 | |
| FBS | Invitrogen | 10500-064 | |
| Falcon Cell Strainers | Fischer Scientific | 08-771-2 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | 254134-5G | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| CD4+ CD62 L+ T isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-093-227 | |
| MACS LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Feeding Needle 20G | SouthPointe Surgical Supply, Inc | FN-7903 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Paraffin | Sigma-Aldrich | 1496904 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | 230251 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| Collagenase type VIII | Sigma-Aldrich | C-2139 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium | AppliChem | A2044, 9050 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 438456 | |
| Mouse BD Fc Block | BD Pharmingen | 553141 | |
| FITC-conjugated mAb binding Vß 5.1, 5.2 | BD Pharmingen | 553189 | |
| APC-conjugated mAb binding CD4 GK1.5 | eBioscience | 17-0041-83 | |
| FACS Calibur | BD Biosciences | ||
| FCS Express V3 software | DeNovo | ||
| Meta scanning confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| Zeiss Workstation | Zeiss | LSM 7 | |
| Zeiss ZEM software | Zeiss | v4.2.0.121 | |
| Maxisorp immuno plates | NUNC, Roskilde | 442404 | |
| Streptavidin conjugated alkaline phosphatase | Jackson Immuno Research | 016-050-084 | |
| Alkaline phosphatase substrate 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma-Aldrich | 71768-5G | |
| mAb R4-6A2 | BD Biosciences | 551216 | |
| mAb XMG1.2 | BD Biosciences | 554410 | |
| TECAN microplate-ELISA reader | Tecan | ||
| EasyWin software | Tecan | ||
| DNase I recombinant | 4536282001 |
References
- Backhed, F., Ley, R. E., Sonnenburg, J. L., Peterson, D. A., Gordon, J. I.
- Cario, E., Podolsky, D. K. Intestinal epithelial TOLLerance versus inTOLLerance of commensals. Mol Immunol. 42, 887-893 (2005).
- Sartor, R. B., Mazmanian, S. K. Intestinal Microbes in Inflammatory Bowel Diseases. Am J Gastroenterol Suppl. 1, 15-21 (2012).
- Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C., Finlay, B. B. Gut microbiota in health and disease. Physiol Rev. 90, 859-904 (2010).
- Metges, C. C. Contribution of microbial amino acids to amino acid homeostasis of the host. J Nutr. 130, 1857S-1864S (2000).
- Rossi, M., Amaretti, A., Raimondi, S. Folate production by probiotic bacteria. Nutrients. 3, 118-134 (2011).
- Ley, R. E., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Ecological and evolutionary forces shaping microbial diversity in the human intestine. Cell. 124, 837-848 (2006).
- Sleator, R. D. The human superorganism - of microbes and men. Med Hypotheses. 74, 214-215 (2010).
- Kumar, H., Kawai, T., Akira, S. Pathogen recognition by the innate immune system. Int Rev Immunol. 30, 16-34 (2011).
- Kumar, H., Kawai, T., Akira, S. Pathogen recognition in the innate immune response. Biochem J. 420, 1-16 (2009).
- Smith, P. M., Garrett, W. S. The gut microbiota and mucosal T cells. Front Microbiol. 2, 111 (2011).
- Fava, F., Danese, S. Intestinal microbiota in inflammatory bowel disease: friend of foe? World J Gastroenterol. 17, 557-566 (2011).
- Mazmanian, S. K., Liu, C. H., Tzianabos, A. O., Kasper, D. L. An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system. Cell. 122, 107-118 (2005).
- Muzes, G., Molnar, B., Tulassay, Z., Sipos, F. Changes of the cytokine profile in inflammatory bowel diseases. World J Gastroenterol. 18, 5848-5861 (2012).
- Koboziev, I., Karlsson, F., Grisham, M. B. Gut-associated lymphoid tissue, T cell trafficking, and chronic intestinal inflammation. Ann N Y Acad Sci. 1207 Suppl. 1207, Suppl 1. E86-E93 (2010).
- Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G135-G146 (2009).
- Elson, C. O., Sartor, R. B., Tennyson, G. S., Riddell, R. H. Experimental models of inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 109, 1344-1367 (1995).
- Boismenu, R., Chen, Y. Insights from mouse models of colitis. J Leukoc Biol. 67, 267-278 (2000).
- Powrie, F., Leach, M. W., Mauze, S., Caddle, L. B., Coffman, R. L. Phenotypically distinct subsets of CD4+ T cells induce or protect from chronic intestinal inflammation in C. B-17 scid mice. Int Immunol. 5, 1461-1471 (1993).
- Rivera-Nieves, J., et al. Emergence of perianal fistulizing disease in the SAMP1/YitFc mouse, a spontaneous model of chronic ileitis. Gastroenterology. 124, 972-982 (2003).
- Ostanin, D. V., et al. T cell-induced inflammation of the small and large intestine in immunodeficient mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 290, G109-G119 (2006).
- Barnett, M., Fraser, A. Animal Models of Colitis: Lessons Learned, and Their Relevance to the Clinic. Ulcerative Colitis - Treatments, Special Populations and the Future. O'Connor, M. , InTech. (2011).
- Reindl, W., Weiss, S., Lehr, H. A., Forster, I. Essential crosstalk between myeloid and lymphoid cells for development of chronic colitis in myeloid-specific signal transducer and activator of transcription 3-deficient mice. Immunology. 120, 19-27 (2007).
- Yoshida, M., et al. CD4 T cells monospecific to ovalbumin produced by Escherichia coli can induce colitis upon transfer to BALB/c and SCID mice. Int Immunol. 13, 1561-1570 (2001).
- Eun, C. S., et al. Induction of bacterial antigen-specific colitis by a simplified human microbiota consortium in gnotobiotic interleukin-10-/- mice. Infect Immun. 82, 2239-2246 (2014).
- Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nat Rev Microbiol. 8, 564-577 (2010).
- Chinen, T., Rudensky, A. Y. The effects of commensal microbiota on immune cell subsets and inflammatory responses. Immunol Rev. 245, 45-55 (2012).
- Dimmitt, R. A., et al. Role of postnatal acquisition of the intestinal microbiome in the early development of immune function. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 51, 262-273 (2010).
- Cebra, J. J., Periwal, S. B., Lee, G., Lee, F., Shroff, K. E. Development and maintenance of the gut-associated lymphoid tissue (GALT): the roles of enteric bacteria and viruses. Dev Immunol. 6, 13-18 (1998).
- Ohkusa, T., Nomura, T., Sato, N. The role of bacterial infection in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Intern Med. 43, 534-539 (2004).
- van Lierop, P. P., Samsom, J. N., Escher, J. C., Nieuwenhuis, E. E. Role of the innate immune system in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 48, 142-151 (2009).
- Kaur, N., Chen, C. C., Luther, J., Kao, J. Y. Intestinal dysbiosis in inflammatory bowel disease. Gut Microbes. 2, 211-216 (2011).
- Trobonjaca, Z., et al. MHC-II-independent CD4+ T cells induce colitis in immunodeficient RAG-/- hosts. J Immunol. 166, 3804-3812 (2001).
- Brimnes, J., Reimann, J., Nissen, M., Claesson, M. Enteric bacterial antigens activate CD4(+) T cells from scid mice with inflammatory bowel disease. Eur J Immunol. 31, 23-31 (2001).
- Cong, Y., et al. CD4+ T cells reactive to enteric bacterial antigens in spontaneously colitic C3H/HeJBir mice: increased T helper cell type 1 response and ability to transfer disease. J Exp Med. 187, 855-864 (1998).
- Niess, J. H., et al. CX3CR1-mediated dendritic cell access to the intestinal lumen and bacterial clearance. Science. 307, 254-258 (2005).
- Rossini, V., et al. CX3CR1(+) cells facilitate the activation of CD4 T cells in the colonic lamina propria during antigen-driven colitis. Mucosal Immunol. 7, 533-548 (2014).
- Vallon-Eberhard, A., Landsman, L., Yogev, N., Verrier, B., Jung, S. Transepithelial pathogen uptake into the small intestinal lamina propria. J Immunol. 176, 2465-2469 (2006).
- Chieppa, M., Rescigno, M., Huang, A. Y., Germain, R. N. Dynamic imaging of dendritic cell extension into the small bowel lumen in response to epithelial cell TLR engagement. J Exp Med. 203, 2841-2852 (2006).
- Farache, J., et al. Luminal Bacteria Recruit CD103(+) Dendritic Cells into the Intestinal Epithelium to Sample Bacterial Antigens for Presentation. Immunity. , (2013).
- Farache, J., Zigmond, E., Shakhar, G., Jung, S. Contributions of dendritic cells and macrophages to intestinal homeostasis and immune defense. Immunol Cell Biol. 91, 232-239 (2013).
- Schirmbeck, R., et al. Translation from cryptic reading frames of DNA vaccines generates an extended repertoire of immunogenic, MHC class I-restricted epitopes. J Immunol. 174, 4647-4656 (2005).
- Balestrino, D., et al. Single-cell techniques using chromosomally tagged fluorescent bacteria to study Listeria monocytogenes infection processes. Appl Environ Microbiol. 76, 3625-3636 (2010).
- Ortega-Gonzalez, M., et al. Validation of bovine glycomacropeptide as an intestinal anti-inflammatory nutraceutical in the lymphocyte-transfer model of colitis. Br J Nutr. 111, 1202-1212 (2014).
- Capitan-Canadas, F., et al. Fructooligosaccharides exert intestinal anti-inflammatory activity in the CD4+ CD62L+ T cell transfer model of colitis in C57BL/6J mice. Eur J Nutr. , (2015).
- Salazar-Gonzalez, R. M., et al. CCR6-mediated dendritic cell activation of pathogen-specific T cells in Peyer's patches. Immunity. 24, 623-632 (2006).
- Niess, J. H., Leithauser, F., Adler, G., Reimann, J. Commensal gut flora drives the expansion of proinflammatory CD4 T cells in the colonic lamina propria under normal and inflammatory conditions. J Immunol. 180, 559-568 (2008).
- Radulovic, K., et al. CD69 regulates type I IFN-induced tolerogenic signals to mucosal CD4 T cells that attenuate their colitogenic potential. J Immunol. 188, 2001-2013 (2012).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nat Rev Immunol. 14, 667-685 (2014).
- Manta, C., et al. CX(3)CR1(+) macrophages support IL-22 production by innate lymphoid cells during infection with Citrobacter rodentium. Mucosal Immunol. 6 (3), 177-188 (2013).
- Feng, T., Wang, L., Schoeb, T. R., Elson, C. O., Cong, Y. Microbiota innate stimulation is a prerequisite for T cell spontaneous proliferation and induction of experimental colitis. J Exp Med. 207, 1321-1332 (2010).
- Mazzini, E., Massimiliano, L., Penna, G., Rescigno, M. Oral tolerance can be established via gap junction transfer of fed antigens from CX3CR1(+) macrophages to CD103(+) dendritic cells. Immunity. 40, 248-261 (2014).
- Fitzpatrick, L. R. Novel Pharmacological Approaches for Inflammatory Bowel Disease: Targeting Key Intracellular Pathways and the IL-23/IL-17 Axis. Int J Inflam. 2012, 389404 (2012).
- Danese, S. New therapies for inflammatory bowel disease: from the bench to the bedside. Gut. 61, 918-932 (2012).
