Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Udvikling af et antigen-drevet Colitis Model at studere Præsentation af antigener ved antigen-præsenterende celler for T-celler

Published: September 18, 2016 doi: 10.3791/54421
Automatic Translation
1, 2, 3, 2
1APC Microbiome Institute, University College Cork, 2Division of Gastroenterology and Hepatology, University Hospital Basel, 3Institute of Microbiology and Biotechnology, University of Ulm

Introduction

Tarmen er den største overflade af kroppen, der er udsat for det ydre miljø. Store arrays af residente mikrober kolonisere menneskets tarm til dannelse af den intestinale mikroflora (eller mikroflora). Det skønnes at bestå af op til 100 billioner mikrobielle celler og udgør et af de tættest befolkede bakterielle levesteder kendte inden biologi 1-3. I GIT bakterier koloniserer en tarm niche, hvor de overlever og formerer 4. Til gengæld mikrobiota forlener værten med yderligere funktionelle funktioner, der ikke er kodet på dets genom en. F.eks mikrobiota stimulerer proliferation af epitelceller, producerer vitaminer, der er vært ikke kan producere selv, regulerer stofskiftet og beskytter mod patogener 4-6. På grund af denne fordelagtigt forhold, har nogle forfattere foreslået, at mennesker er "super-organismer" eller "holobionts", som er en blanding af bakterielle og menneskelige gener 7,8. I betragtning af den gavnlige virkning af mikrobiota på (human) vært, tarmens immunsystem skal tolerere kommensale mikrober at aktivere deres eksistens i lumen, men også dræbe patogener, der invaderer fra luminale side 9-11. Den intestinale immunsystem har udviklet mekanismer til at skelne mellem harmløse og potentielt skadelige luminale mikrober; men disse mekanismer er endnu ikke godt forstået 12. Fastholdelse intestinal integritet kræver en tæt reguleret immun homøostase at holde balancen mellem tolerance og immunitet 13. En ubalance i immun homøostase bidrager til induktion af tarmsygdomme, såsom inflammatorisk tarmsygdom (IBD) 3,14.

Der er to hovedtyper af IBD: Crohns sygdom (CD) og ulcerativ colitis (UC). Patienter med disse sygdomme normalt lider rektal blødning, svær diarré og mavesmerter 15,16. Den eneste årsag til IBD er stadigukendt, men en kombination af genetiske faktorer, miljømæssige påvirkninger og dysregulerede immunreaktioner kan være den vigtigste begivenhed for sygdomsudvikling 15.

Dyremodeller for IBD er blevet anvendt i over 50 år. I de seneste årtier er der udviklet nye IBD modelsystemer til at teste forskellige hypoteser om patogenesen af IBD 17,18. Den bedst karakteriseret model for kronisk colitis er T-celle-overførsel model, der inducerer forstyrrelse af T-celle-homeostase 19,20. Denne model indebærer overførsel naive T-celler fra immunkompetente mus i værter, der mangler T og B-celler (såsom RAG - / - og SCID-mus) 16,21. Udviklingen af ​​sygdom i denne model overvåges i 3-10 uger ved at evaluere forekomsten af ​​diarré, nedsat fysisk aktivitet, og tab af legemsvægt. Dette er så kaldes wasting syndrome 16. Sammenlignet med sunde mus den colonvæv af transplanterede værter er Thicker, kortere og tungere 16. Ved hjælp af T-celle transfer model, er det muligt at forstå, hvordan forskellige T-cellepopulationer kan bidrage til patogenesen af IBD 22. T-celle transfer model analyserer ikke samspillet mellem APC'er og T-celler i sygdomsprocessen ved et antigen-specifik måde. Det er blevet vist, at en interaktion mellem myeloide celler og lymfoide celler kunne være ansvarlig for udviklingen af tarmbetændelse 23. Selv om mange aspekter af IBD er blevet præciseret, de indledende begivenheder, der fører til udviklingen sygdommen skal stadig være klart forstået.

Det har vist sig, at i mangel af mikrobiota transfer colitis kan ikke etableres 24. For nylig, flere teorier tyder på, at IBD kunne være et resultat af et immunrespons mod kommensale bakterier 25. Forfattere har også foreslået, at kommensale bakterier er afgørende for at inducere inflammation i den distale tarm26. I kim fri (GF) dyr tarmens immunsystem er generelt svækkede 27,28, men en kolonisering af disse mus med en blanding af specifik-patogenfrie bakterier resulterer i udviklingen af det fuldt kompetente intestinal immunsystem 29. Derfor mikrobiota synes at være et centralt element i patogenesen af IBD, enten som en mekanisme, der disponerer for eller beskytter mod udvikling af tarmbetændelse 30,31. Nuværende teorier antyder, at IBD er et resultat af mikrobiel ubalance, kaldet dysbiosis, i genetisk disponerede patienter 32, men det er endnu ikke klart, om dysbiosis er årsagen eller konsekvensen af sygdommen 12. I betragtning af den rolle af mikroorganismer i udviklingen af IBD, in vitro eksperimenter viste, at CD4 + -T-celler kan aktiveres ved APC'er pulseret med tarmbakterier 33,34.

Endvidere er det blevet vist, at antigener fraforskellige kommensale bakteriearter, såsom E. coli, Bacteroides, Eubacterium og Proteus, kan aktivere CD4 + T-celler 35. Dette indikerer, at præsentation af bakterielle antigener til T-celler er vigtig for udviklingen af ​​IBD. For at reducere kompleksiteten af flere antigener afledt af mikrofloraen i sygdomsforløbet, har en E.coli stamme blevet skabt, der producerer OVA-antigenet. Overførsel colitis blev induceret ved injektion af OVA-specifikke T-celler i RAG - / - dyr koloniseret med OVA-udtrykkende E. coli.

Denne model er baseret på nye oplysninger tyder på, at CX 3 CR1 + parlamentsmedlemmer, en stor celle delmængde i colon lamina propria (CLP) 36, interagerer med CD4 + T-celler under overførsel colitis 37. MP'er prøve tarmlumen for partikler antigen, såsom bakterier, ved hjælp af deres dendritter 36, 38,39. tidligere undersøgelserviste, at MP'er også kan tage op opløselige antigener, såsom OVA, der indføres i den intestinale lumen 40,41. I betragtning af den overflod af CX 3 CR1 + parlamentsmedlemmer i CLP, er det muligt, at disse celler kan prøve luminale bakterier og interagere med CD4 T-celler. Konfokal afbildning af mus transplanteret med OVA-specifikke CD4 + T-celler koloniseret med E. coli CFP-OVA, viser, at CX 3 CR1 + MP'er er i kontakt med OT-II CD4 + T-celle under udviklingen af antigen-drevet colitis. Denne model muliggør studiet af antigenpræsentation proces mellem intestinale APC'er og T-celler specifikke kun for bestemte antigen-udtrykkende bakterier i tarmlumen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Mus blev avlet og holdt under specifikke patogenfrie (SPF) betingelser i dyret facilitet i Ulm Universitet (Ulm, Tyskland). Alle dyreforsøg blev udført i henhold til retningslinjerne i den lokale dyr brug og pleje udvalg og National Animal Welfare Law.

1. Konstruktion af pCFP-OVA plasmid

  1. Amplificere fuld størrelse OVA-genet under anvendelse af primerne Ova_SpeI_fw (3'-GACCAACTAGTATGGAATTTTGTTTTGATGTATT-5 ') og Ova_ClaI_rev (3'GACCAGATCGATTAAGGGGAAACACATCTGCC-5') 37 under anvendelse af plasmid pCl-OVA (ampicillinresistente) 42 som skabelon. Klone PCR-produktet (dvs. OVA-kodende sekvens) i et kommercielt tilgængeligt fag-mid-vektoren under anvendelse Spel og Clal restriktionssteder for primerne og vektor til opnåelse af specifikke OVA-plasmid.
  2. Forstærk den fælles fiskeripolitik-kodning gen sammen med den stærke konstitutive promoter P hyper hjælp plasmid polstringen 1 43 som en skabelon og primere CFP_SacII_fw (3'-GATCGACCGCGGTTCTTGAAGACGAAAGGGCC-5 ') og CFP_SpeI_rev (3'-GATCGAACTAGTACCACCACCACCACCACCTTTGTAGAGTTCATCCATGC-5') 37.
  3. Klone CFP-kodende gen i den specifikke OVA-plasmid (ampicillinresistente) under anvendelse af Spel og Sacl restriktionssteder for primerne og vektor 37. Dette introducerer en spacer på 6 glycinrester mellem den fælles fiskeripolitik-kodning fra OVA-kodende sekvens.

2. Konstruktion af E.coli pCFP-OVA

  1. Grow E.coli-stamme DH10B i 100 ml Luria Bertani (LB) medium aerobt ved 37 ° C på et roterende rysteapparat natten over.
  2. Bland 800 pi bakteriekultur med 200 pi glycerol at skabe glycerolstamme og opbevares ved -80 ° C.
  3. Der tilsættes 50 pi E.coli stamme DH10B fra glycerol stamopløsning i 5 ml LB-medium og dyrke dem aerobt ved 37 ° C på en rotationsryster overnight.
  4. Overfør kulturen i en forvirret 1 L Erlenmeyer-kolbe med 250 ml LB-medium ved 37 ° C i en roterende ryster.
  5. Grow bakterier til en optisk densitet ved 600 nm (OD600) på 0,5 og derefter chill kulturen på is i 30 minutter. Centrifugeres bakterierne ved 5000 xg i 10 min ved 4 ° C.
  6. Resuspender bakterier med 100 ml iskold steril H2O og centrifugeres bakterierne ved 5.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C. Resuspender bakterier med 100 ml iskold 10% glycerol og centrifugeres bakterierne ved 5000 xg i 10 min ved 4 ° C. Gentag dette sidste trin to gange.
  7. Efter den sidste vask trin resuspendere bakterierne i 700 pi 10% glycerol. Frys 50 pi prøver i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C.
  8. Tø en 50 pi alikvot på is og overførsel til en forud kølet elektroporation cuvette (2 mm elektrodeafstand).
  9. Tilsæt 5 pi plasmid-DNA (100 ng) til 50 pi E. coli aliquots. Udfør elektroporering med en enkelt impuls ved 25 uF, 200 ohm (Ω) og 2,5 kV.
  10. Resuspender bakterier i 1 ml forvarmet SOC-medium (5 g / l gærekstrakt, 2 g / l trypton, 10 mM natriumchlorid, 2,5 mM kaliumchlorid, 10 mM magnesiumchlorid, 10 mM magnesiumsulfat) og inkuber ved 37 ° C aerobt i 1 time.
  11. Plate bakterier på LB-agarplader suppleret med ampicillin 100 ug / ml (tilsættes 100 pi af en 100 mg / ml ampicillin lager til 100 ml LB-agar) og inkuberes natten over aerobt ved 37 ° C.
  12. Pick enkelte kolonier og re-streak dem i LB-agar plader suppleret med ampicillin 100 mg / ml. Inkuber natten aerobt ved 37 ° C.
  13. Pick enkeltkolonier og dyrke dem natten over i 10 ml LB medium suppleret med ampicillin 100 ug / ml for plasmid isolation. Bruge kommercielt tilgængeligt plasmid mini prep kit og eluere plasmid-DNA med 30 pi dH2O (destilleret vand) i overensstemmelse med producentens; S protokol. Verificere plasmider ved restriktionsanalyse og DNA-sekventering 37,42,43.
  14. Opsæt en kultur af positive kloner af E. coli pCFP-OVA i 100 ml LB-medium suppleret med ampicillin 100 ug / ml. Grow aerobt ved 37 ° C på et roterende rysteapparat natten over.
  15. Bland 800 pi bakteriekultur med 200 pi ren glycerol og opbevares ved -80 ° C.
  16. Centrifugeres resten af ​​overnatskultur ved 5000 xg i 10 minutter ved stuetemperatur (RT) og pellet resuspenderes i phosphatbufret saltvand (PBS). Placer 10 pi af suspensionen på objektglas og dække det med et dækglas.
  17. Observere prøverne i en standard fluorescensmikroskopi for at bekræfte ekspressionen fluorescens af CFP-OVA (CFP excitation ved 450 nm, emission ved 480 nm). Analyser bakterier starter med forstørrelse 400X.
  18. Centrifuge 1 ml bakterier fra overnatskulturer ved 5.000 xg i 10 minutter, RT. Pellet resuspenderes i 40 piPBS og kog ved 95 ° C i 10 min.
  19. Centrifugeres prøverne ved 30.000 xg i 10 min og bruge supernatanterne til Western blot-analyse 37. Brug kanin-rejst anti-OVA-polyklonalt antistof fortyndet 1: 400.

3. Frembringelse af OT-II / Red Mus

  1. Krydse en han / hun OT-II mus med en kvindelig / mandlig mus udtrykker rødt fluorescerende protein (begge stammer kommercielt tilgængeligt) for at generere OT-II / Red mus 37.

4. Spleen Cell Isolation

  1. Euthanize OT-II / Red mus ved cervikal dislokation efter anæstesi ved inhalation af enhver halogeneret ether (op til 5% for induktion) kommercielt tilgængelige.
  2. Brug saks til at klippe venstre overlegne abdominale del af musen. Under denne abdominale del er der milten (oval form med en mørk-rød farve). Brug saks og pincet til at fjerne det.
    1. Uddrag milten af ​​OT-II / Rød mus og videregive det gennem en 100um cellefilter placeret på et 50 ml rør ved hjælp af stemplet i en 1 ml sprøjte med henblik på at opnå en enkelt-cellesuspension. Vask sien to gange med 10 ml PBS suppleret med 1% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS).
  3. Centrifuger cellesuspensionen ved 390 xg i 5 minutter ved stuetemperatur. Pellet resuspenderes med 5 ml forvarmet lysepuffer (144 mM NH4CI, 17 mM Tris, pH = 7,2) for at lysere de røde blodlegemer. Inkuber 10 min ved 37 ° C.
  4. Vask prøven med 25 ml PBS suppleret med 1% FBS. Centrifuger ved 390 xg i 5 minutter ved stuetemperatur. Pellet resuspenderes i 10 ml PBS suppleret med 1% FBS.
  5. Tæl celler ved hjælp af et Neubauer tællekammer. Bland 10 pi af suspensionen celler med 10 pi af en 0,4% trypanblåt-opløsning. Der inkuberes i 1-2 min.
    1. Fyld hæmocytometeret kammer med 10 pi farvede celler. Tæl celler under mikroskop i fire 1 x 1 mm 2 kvadrater af et kammer og determine det gennemsnitlige antal celler per kvadrat. Levedygtige celler forekommer hvide, døde celler vises blå. For at bestemme antallet af celler / ml formere celleantal ved faktor på fortynding. Hvis 2-4 kvadranter bliver talt, dividere med antallet af kvadranter.

5. CD4 + CD62 L + T Cell Enrichment

  1. Berig miltceller for CD4 + CD62L + T-celler via magnetisk isolering kit ved hjælp af principperne for negativ eller positiv selektion. Her, brug negativ selektion til isolering CD4 + T-celler og anvende positiv selektion til yderligere at berige for CD62L + befolkning i CD4 + T-celle pool.
    BEMÆRK: I den negative udvælgelsesprocedure, de celler, som ikke vil blive isolerede (her: alle CD4 negative celler) er mærket med specifikke antistoffer koblet med magnetiske mikrokugler. Under kolonnen vasketrin CD4 + -T-celler vil passere gennem søjlen, således at de kan være EASIly indsamles. I de positive udvælgelsesprocedure celler, der skal isoleres er mærket med passende antistof kombineret med magnetiske mikrokugler. Under kolonnen vasketrin de mærkede celler vil forblive i kolonnen, og de kan indsamles ved at fjerne søjlen fra magnetfeltet og skylle den med pufferen.
  2. For den negative udvælgelsesprocedure, resuspender 10 7 totale miltceller i 40 pi kold PBS suppleret med 0,5% bovint serumalbumin (BSA). Tilsæt 10 pi biotin mærket antistof cocktail følger med magnetisk isolation kit (specifikke antistoffer, som binder de ikke-CD4 + T-celler) og inkuber 15 minutter på is.
    1. Tilsæt 30 pi kold PBS suppleret med 0,5% BSA og 20 pi anti-biotin mikroperler. Inkuber 20 min på is.
    2. Der tilsættes 10 ml PBS suppleret med 0,5% BSA, og der centrifugeres ved 390 xg i 5 min. Gentag dette trin to gange. Resuspender cellerne i 1 ml kold PBS suppleret med 0,5% BSEN.
    3. Kolonnen anbringes specifik for den negative udvælgelsesmetode i magnetfeltet og skyl med 3 ml kold PBS suppleret med 0,5% BSA på søjlen. Tilføj cellesuspensionen på søjlen og vaskes 3 gange med 3 ml kold PBS suppleret med 0,5% BSA.
    4. Centrifuger cellerne af effluenten ved 390 xg i 5 min. Spildevand passerer gennem søjlen indeholder umærkede CD4 + T-celler. Pellet resuspenderes i 1 ml PBS suppleret med 0,5% BSA og tælle cellerne.
    5. Tæl celler ved hjælp af et Neubauer tællekammer. Bland 10 pi af suspensionen celler med 10 pi af en 0,4% trypanblåt-opløsning. Der inkuberes i 1-2 min.
      1. Fyld hæmocytometeret kammer med 10 pi farvede celler. Tæl celler under mikroskopet i fire 1 x 1 mm 2 kvadrater af et kammer og bestemme det gennemsnitlige antal celler per kvadrat. Levedygtige celler forekommer hvide, døde celler vises blå. For at bestemme antallet af celler / ml formerer cell nummer ved faktor fortynding. Hvis 2-4 kvadranter bliver talt, dividere med antallet af kvadranter.
  3. For den positive udvælgelsesprocedure, tilsættes 10 ul CD62L mikroperler pr 10 7 pre-beriget CD4 + T-celle fraktion. Inkuber 15 minutter på is.
    1. Der tilsættes 10 ml PBS suppleret med 0,5% BSA, og der centrifugeres ved 390 xg i 5 min. Gentag dette trin to gange. Resuspender i 500 pi kold PBS suppleret med 0,5% BSA.
    2. Placer specifikke kolonnen for den negative udvælgelsesmetode i magnetfeltet og skyl med 500 pi kold PBS suppleret med 0,5% BSA på søjlen. Tilføj cellesuspension på søjlen og vaskes 3 gange med 500 pi kold PBS suppleret med 0,5% BSA.
    3. Fjern kolonnen fra magnetfeltet og placere den på en passende samling rør. Der tilsættes 1 ml PBS suppleret med 0,5% BSA på søjlen og skyl CD4 + CD62L + T-celles tilbageholdt i søjlen ved fast at trykke stemplet ind i søjlen.
      BEMÆRK: De isolerede CD4 + CD62L + T-celler er nu klar til downstream applikationer, såsom in vivo-eksperimenter. Ifølge fabrikantens instrukser fra den CD4 + CD62L + T-celler isolation kit, mikroperlerne er ikke giftige. På grund af den lille størrelse (ca. 50 nm), de ikke aktiverer cellerne og de vil ikke mætte celleoverflade-epitoper. Derfor de isolerede celler kan overføres til immundefekte mus for at inducere colitis 37,44,45.
    4. Tæl celler ved hjælp af et Neubauer tællekammer. Bland 10 pi af suspensionen celler med 10 pi af en 0,4% trypanblåt-opløsning. Der inkuberes i 1-2 min.
      1. Fyld hæmocytometeret kammer med 10 pi farvede celler. Tæl celler under mikroskopet i fire 1 x 1 mm 2 kvadrater af et kammer og bestemme det gennemsnitlige antal celler per kvadrat. Levedygtige celler appear hvide, døde celler vises blå. For at bestemme antallet af celler / ml formere celleantal ved faktor på fortynding. Hvis 2 - 4 kvadranter bliver optalt, dividere med antallet af kvadranter.

6. Induktion af antigen-drevet Colitis

  1. Injicere intraperitonealt 3 x 10 5 OT-II / Red CD4 + CD62L + T-celler i CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - mus. Til induktion af antigen-specifik colitis, administrere E. coli pCFP-OVA hver anden dag i en dosis på 1 x 10 8 kolonidannende enhed (CFU) i 100 pi PBS per dyr med sonde eller oral inddrypning bag fortænderne.
  2. Overvåg to gange ugentligt legemsvægten af ​​transplanterede mus og deres kliniske tilstand (tilstedeværelse af blod i afføringen, afføringskonsistens og aktivitet hos mus).

7. vævsprøver til histopatologisk undersøgelse

  1. Tag vævsprøver fra the tyktarmen af mus, fix i neutral-bufferet formalin (10%) og integrere i paraffin som beskrevet tidligere 36,46.
  2. Sektion for paraffin prøver på en mikrotom, montere på dias, og udfører H & E pletten 47,48.
  3. Kategorisere histologi af tyktarmen som tidligere 47,48 offentliggjort: normal (score 0); mild colitis (score 1), moderat colitis (score 2) og svær colitis (score 3).

8. Isolering af Colon lamina propria celler

  1. Euthanize transplanterede mus ved cervikal dislokation efter anæstesi ved inhalation af enhver halogeneret ether (op til 5% for induktion) kommercielt tilgængelige.
  2. Sende dyret ned med maven opad. Brug pincet til at få fat i huden fortil til urinrørets åbning. Bruge en saks til at skære huden langs den ventrale midterlinjen fra lysken til brystet. Trække huden tilbage på siderne.
  3. Skær gennem den transparente peritoneal muskel væg ogåbning af legemshulen. Identificer tyktarmen, der går fra anus til caecum 49. Skær 2 ekstremiteter og befri væv fra enhver fedt.
  4. Åbn colon længderetningen ved hjælp af en dissektion saks. Brug en pincet til at ryste tyktarmen væv i en petriskål indeholdende 25 ml PBS suppleret med 1% FBS for at fjerne snavs og slim. Skær tyktarmen i 5 - 8 mm stykker.
  5. Placer kolon segmenter i et 50 ml rør indeholdende 20 ml af vaskebuffer. Vaskebufferen indeholder 500 ml DPBS, 10 mM Hepes og 5 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA).
  6. Vortex røret i 30 sekunder ved maksimal hastighed.
  7. Inkubér røret med colon-segmenter i et vandbad ved 37 ° C med 200 rpm rystning i 10 min.
  8. Efter inkubationen vortex røret i 30 sekunder ved maksimal hastighed.
  9. Kassér supernatanterne og placere vævsprøver i en ny 50 ml rør indeholdende 20 ml af vaskebuffer. Gentag trin 6-9 tre gange
  10. Kassér de supernatants og placere vævsprøver i en petriskål indeholdende 25 ml PBS. Brug en pincet til at ryste forsigtigt de vævsprøver i petriskål for få sekunder for at fjerne resterende epitelceller. Gentag dette trin tre gange.
  11. Skær colonvæv i 2 x 2 mm2 stykker og fordøje dem ved inkubation i 10 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium med 0,5 mg / ml collagenase typen VIII fra Clostridium histolyticum og 10 U / ml DNasel.
  12. Vortex røret i 30 sekunder ved maksimal hastighed.
  13. Inkubér colon fragmenter i et vandbad ved 37 ° C med 200 rpm rystning i 35 min og vortex røret i 30 sekunder ved maksimal hastighed hver 5 min.
  14. Ved slutningen af ​​inkubationen vortexes røret i 30 sekunder ved maksimal hastighed.
  15. Indsamle de spaltede fragmenter ved at lede dem gennem en 70 um cellefilter placeret på en ny 50 ml rør.
  16. Vask prøven ved tilsætning af 20 ml DPBS og centrifuger ved 400 g i 5 min. Så resuspender than celler i 1 ml DPBS.
  17. Tæl celler ved hjælp af et Neubauer tællekammer. Bland 10 pi af suspensionen celler med 10 pi af en 0,4% trypanblåt-opløsning. Der inkuberes i 1-2 min.
    1. Fyld hæmocytometeret kammer med 10 pi farvede celler. Tæl celler under mikroskopet i fire 1 x 1 mm 2 kvadrater af et kammer og bestemme det gennemsnitlige antal celler per kvadrat. Levedygtige celler forekommer hvide, døde celler vises blå. For at bestemme antallet af celler / ml formere celleantal ved faktor på fortynding. Hvis 2-4 kvadranter bliver talt, dividere med antallet af kvadranter.

9. Ekstracellulær Farvning for FCM Analyse

  1. Centrifuger CLP celler 5 minutter ved 390 x g. Resuspender cellerne i 1 ml FACS A (PBS suppleret med 1% BSA og 0,1% natriumazid)
    BEMÆRK: Natriumazid er meget giftig. Det kan forårsage hypotension, hypotermi, hovedpine kramper eller død. Fortyndede opløsninger af natriumazid (0.1 Til 1,0%) normalt ikke frembyder ekstraordinære farer for brugeren, men de er øjen- og hudirriterende. Brug derfor natriumazid kun i den kemiske hætte, mens iført en kittel og en dobbelt par engangs nitrilhandsker.
  2. Inkubér cellerne i 15 minutter ved stuetemperatur med det monoklonale antistof (mAb) 2.4G2 rettet mod FcyRIII / II CD16 / CD32 (0,5-1 ug mAb / 10 6 celler) fortyndet i FACS A.
  3. Tilsæt 200 pi FACS A til cellerne og centrifugeres i 5 minutter ved 390 x g. Gentag dette trin to gange. Inkubér cellerne med 0,5 ng / 10 6 celler af den relevante mAb i 20 minutter ved 4 ° C. Fortynd antistofferne i FACS A.
  4. Tilsæt 200 pi FACS A til cellerne og centrifugeres i 5 minutter ved 390 x g. Gentag dette trin to gange. Resuspendere prøverne i 100 pi FACS A.
  5. Analyser T-celler fra CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - mus rekonstitueret med OT-II / Red CD4-T-celler ved flowcytometeret 37.

10. Konfokal mikroskopi Analyse

  1. Analyser colon fra CX 3 CR1 GFP / + mus rekonstitueret eller ikke med OT-II / Red CD4 + CD62L + T-celle og fodret oralt hver anden dag med 1 x 10 8 CFU E. coli-stamme DH10B pCFP-OVA.
  2. Fjern colon fra musene med en saks og pincet. Åbn den på langs ved hjælp af en dissektion saks.
  3. Skær en 5-8 mm stykke kolon prøve med en saks, sætte på objektglas og dækkes med dækglas.
  4. Analyser kolon prøver med et konfokalt mikroskop ved en forstørrelse på 40 / 1,30.
  5. Detect CX 3 CR1 + parlamentsmedlemmer, mærket med grønt fluorescein protein (GFP), ved hjælp af et filter sæt med excitation ved 488 nm og emission ved 509 nm.
  6. Detektere CD4 + T-celle der udtrykker rød protein under anvendelse af et filter sæt med excitation ved 554 nm og emission ved 586 nm.
  7. Detect E.coli pCFP-OVA anvendelse af et filter sæt med excitation ved 450 nm og emission ved 480 nm.
  8. Definer et område af interesse og generere scatter diagrammer som tidligere beskrevet 50 at udføre co-lokalisering analyse. Brug 2 forskellige formler: Overlap Koefficient efter Manders og Pearsons Koefficient.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

At etablere et antigen-drevet colitis model et E. coli-stamme er blevet konstrueret, som indeholder et plasmid, hvori genet for FFP er fusioneret til den kodende sekvens for det kyllingeovalbumin proteinet og fusionskonstruktionen udtrykkes under kontrol af den stærke konstitutive promoter P hyper (figur 1A). Fluorescensmikroskopi viser, at den rekombinante E. coli pCFP-OVA, men ikke den parentale E. coli DH10B, udtrykker CFP (figur 1B). CFP-OVA- producerende E. coli er i stand til at aktivere OT-II-celler in vitro og inducerer IFN-γ-produktion i modsætning til en E. coli-stamme, der udtrykker CFP kun (figur 2). Figur 3A viser ex vivo 3D konfokal billeddannelse af colonvæv af CX 3 CR1 GFP / + mus fodret med E. coli pCFP-OVA. E. coli pCFP-OVA kanpåvises inden colon krypter ligger tæt på intestinale epitelceller og co-lokaliserer med CX 3 CR1 + fagocytter. For at bestemme den relative andel af E. coli pCFP-OVA internaliseret af defineret CX 3 CR1 + fagocytter, blev den blå og grøn fluorescens intensitet bestemt af scatter blots. Analysen viste, at CX 3 CR1 + -celler stikprøven 11,9 ± 1,5% af E. coli pCFP-OVA påvises i colon (figur 3B). I OT-II / Red dyr, er CD4 + T-celler kendetegnet ved Red ekspression og Vp 5.1 ekspression vist ved flowcytometri (figur 4). Figur 5A viser en generel oversigt over antigenet drevne colitis model. OT-II / Red + CD4 + T CD62L + -celler blev adoptivt overført til CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - modtagere, som derefter blev tvangsfodret hver anden dag med E.coli pCFP-OVA. Når udfordret med E. coli pCFP-OVA, overført CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - mus mister kropsvægt og udvikle kliniske tegn på colitis (figur 5B) Figur 6 viser ex vivo 3D konfokal billeddannelse af colonvæv 7, 14 og 21 dage efter. rekonstituering af heterozygot CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - modtagere med OT-II / Rød + celler udfordret med E. coli pCFP-OVA. Syv dage efter celle overførsel kun få CX 3 CR1 + fagocytter har stikprøven E. coli pCFP-OVA og OT-II / Rød + celler blev ikke påvist. Fjorten dage efter celle transfer, CX 3 CR1 + fagocytter, der indgik i stikprøven, E. coli pCFP-OVA var placeret tæt på OT-II / Rød + celler. Enogtyve dage efter celle overføre et stort antal CX 3 CR1 + celler, der har stikprøven E. coli pCFP-OVA og OT-II / Red + celler, spredt over hele CLP tæt på CX 3 CR1 + fagocytter.

figur 1
Figur 1: CFP-OVA producerende E. coli. (A) Kort over pCFP-OVA med relevante restriktionssteder, det gen, der koder OVA og den lyse blå fluorescerende protein fælles fiskeripolitik. (B) Bright felt og fluorescerende mikroskopiske billeder af vildtype E. coli DH10B, E. coli DH10B pCFP og E. coli DH10B pCFP-OVA. Målestok:. 10 um Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: OT-II Celler stimuleret med CFP-OVA Produce IFN-γ. Efter isolering fra milt blev OT-II-celler stimuleret med de angivne antal E. coli DH10B pCFP-OVA. Bakterieceller blev inaktiveret efter 2 timers inkubation med 5 ug / ml gentamicin. Efter 72 timers dyrkning blev supernatanter opsamlet og IFN-y-koncentrationer bestemt ved ELISA. Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer og data præsenteres som gennemsnit ± SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: CX 3 CR1 + Fagocytter Sample E. coli pCFP-OVA. (A) CLP væv af CX 3 CR1GFP / + mus tvangsfodret med 1 x 10 8 E. coli pCFP-OVA i 7 dage og analyseret ved ex vivo konfokal mikroskopi. Forstørrelse 40x / 1,30. Scale bar = 30 um. (B) Procentdelen af internaliseret E. coli pCFP-OVA kvantificeret og data præsenteret som gennemsnit ± SEM. I Mann-Whitney test p <0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4:. Karakterisering af OT-II / Rød + CD4 + T-celler (A) OT-II transgene dyr blev krydset med dyr, der udtrykker den røde fluorescerende protein til opnåelse OT-II / Rød +celler. OT-II / Rød + celler blev isoleret fra milte fra OT-II / Rød transgene dyr, farvet for CD4 og Vß5.1 og analyseret ved flowcytometri. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5: OVA-drevet Transfer Colitis (A) Skematisk gengivelse af antigenet drevne colitis model.. OT-II / Red + CD4 + T CD62L + -celler blev adoptivt overført til CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - mus og værter blev tvangsfodret hver anden dag med E. coli pCFP-OVA. (B) Kropsvægt af de angivne grupper blev målt to gange om ugen. Middel ± SEM vægttab (%) præsenteres. I Mann-Whitney-testp <0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6:. CX 3 CR1 + parlamentsmedlemmer Kommuniker med OT-II celler under OVA-drevet Transfer Colitis (A) Colon vævsprøver blev undersøgt af ex vivo 3D konfokal billedbehandling på dag 7, 14 og 21 efter overførsel af OT-II / Rød + CD4 + T CD62L + -celler i CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - modtagere. Forstørrelse 40x / 1,30. Scale bar = 30 um.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Som med enhver anden model, kan det antigen-drevne colitis model beskrevet ovenfor præsentere nogle spørgsmål, som investigator udfører teknikken skal være opmærksom på. Når injektion af OT-II / Rød + CD4 + T CD62L + celler i værter, skal investigator være meget blid og omhyggelig med at indsætte nålen ind i bughulen. I modsat fald kan resultere i rivning af tarmen af ​​musen, der kan føre til døden, eller en subkutan administration af celler, som ikke vil fremkalde nogen sygdom.

Typisk vil mus tage på i vægt i den første uge efter celleoverførsel. Forskeren bør veje musene på samme tid på hver vægt tidspunkt og bruge den samme afvejning balance under hele proceduren. Undertiden de eksperimentelle mus, især når deres vægt ved forsøgets begyndelse er under 18 g, ikke udvikler tegn på wasting syndrome. Men migh disse dyr,t stadig udvikle betydelig tarmbetændelse under makroskopisk vurdering.

Når man arbejder med genetisk modificerede bakterier, kan forureninger forekomme. For at undgå disse problemer er det stærkt anbefales at kontrollere E.coli udtrykker fælles fiskeripolitik-OVA hjælp af fluorescerende mikroskop for at analysere, om bakterierne er fluorescerende og er stavformede (den typiske E.coli form).

Den foreslåede antigen drevne-colitis er afhængig af observation, at CX 3 CR1 + parlamentsmedlemmer prøve kommensale luminale bakterier i steady state og under inflammatoriske tilstande 36,37. Induktionen af T-celler responser i antigen-drevne colitis model er blevet demonstreret ved stærkt aktiverede fænotype af OT-II CD4 + T-celler fra de koloner af CX 3 CR1 GFP / + x RAG - / - mus udfordret med antigenet, sammenlignet med T-celler isoleret fra CX 3 CR1 GFP / + x RAG 37. Dette stemmer overens med tidligere undersøgelser, hvor der, adoptiv overførsel af OT-II T-celler i RAG - / - mus, colitis blev først induceret når værterne blev udfordret med OVA-udtrykkende E. coli 51.

Konfokal imaging foreslår, at CX 3 CR1 + fagocytter er placeret tæt på tarmepitelet, således at de kan prøve E. coli pCFP-OVA og interagere med OT-II / Rød + CD4 + T-celler. Efter CX 3 CR1 + fagocytter har stikprøven E. coli pCFP-OVA den luminale antigen leveres til CD103 + dendritiske celler (DC'er) ved CX 3 CR1 + fagocytter. CD103 + DC'er er i stand til at migrere til den mesenteriske lymfeknude (MLN) til prime CD4 T-celler 37,52. Primede T-celler samles i CLP hvor CX 3 CR1 + fagocytter viser OVA-antigenet til effector T-celler til at inducere inflammation. Leveringen og præsentation af antigenet ved CX 3 CR1 + fagocytter kunne være en vigtig begivenhed i udviklingen af colitis.

Evnen til at fremkalde colitis med en defineret bakterie, der udtrykker et specifikt antigen giver mulighed for at studere de nødvendige betingelser for udviklingen af colitis 24. Denne model viser, at et specifikt svar på et antigent peptid (OVA udtrykt ved E. coli) er tilstrækkelig til at inducere intestinal inflammation i RAG - / - værter, hvilket antyder, at T-celler kan reagere på specifikke antigen fra tarmens mikroflora. En enkelt antigen kan inducere intestinal inflammation i dyremodeller, men det kan ikke antages, at enkelte antigener er årsag til human IBD. Desuden i overførslen colitis model der er naive CD4 + T-celler, der har ukendte specificitet og kan derfor være reaktiv til flere, som i endnu uidentificerede antigener, framikrobiota. Der er behov for større analyser og undersøgelser for bedre at klarlægge betydningen af ​​et specifikt antigen i patogenesen af ​​slimhindeinflammation.

I de senere år brugen af forskellige dyremodel af colitis har ført til en udvidelse i viden om patogenesen af IBD 53. Men på grund af kompleksiteten og til patogenesen af sygdommen, er der ikke en endelig helbredelse 54. Anvendelse af den beskrevne model, er det muligt at behandle flere aspekter af IBD, som ikke er godt afklaret endnu, såsom (i) interaktioner mellem monocytter og dendritiske celler, (ii) migration af intestinale DC'er til MLN, (iii) antigenpræsentation, (iv) målsøgning af effektor T-celler fra MLN til lamina propria og (v) aktivering af effektor T-celler i lamina propria af CX 3 CR1 + fagocytter. Imidlertid behov for yderligere undersøgelser for at bekræfte, om CX 3 CR1 + phagocyt / CD4 + T-celle interaktion spiller en central rolle iIBD patogenese. Mus kan ikke være virkelig repræsentativ for mennesker, og det skal holdes for øje, når musemodeller bruges til at undersøge human IBD 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth, Miller (Luria-Bertani) Difco 244620
Rotary Shake Reiss Laborbedarf e. K. Model 3020 GFL
2 mm gap couvettes  Peqlab Biotechnologie GmbH 71-2020
Glycerol Sigma-Aldrich G5516-100ML
Gene Pulser Xcell system  BioRad Laboratories GmbH 1652660
LB Agar, Miller (Luria-Bertani) Difco 244510
Ampicillin Sigma-Aldrich A9393-5G
SOC Medium Sigma-Aldrich S1797-100ML
High Pure Plasmid Isolation Kit Roche 11754777001
Agarose Carl Roth GmbH & Co 3810.1
EDTA Sigma-Aldrich E9884-100G
Tris-HCl Sigma-Aldrich T5941
Glacial acetic acid Sigma-Aldrich 537020 
Gel chamber  PEQLAB Biotechnology GmbH 40-0708
Loading Dye Thermo Fisher R0611
GeneRuler 1 kb DNA Ladder  Thermo Fisher SM0312
Ethidium bromide solution Carl Roth GmbH & Co. KG 2218.3
Photo-documentation system  Decon Science Tech GmbH DeVision G 
DNA sequencing  MWG-Biotech GmbH
Phosphate buffered saline (PBS) Biochrom L182-50
Fluorescent microscope  Zeiss HBO 100
Mini-PROTEAN Tetra System Bio-Rad Laboratories GmbH 1658005
PageRuler Prestained Protein Ladder  Fermentas, St. Leon-Rot, Germany
IstanBlue Solution Expedeon, Cambridgeshire, United Kingdom
Nitrocellulose membrane  Macherey-Nagel GmbH & Co. KG 741280
Electro blotter  Biometra GmbH 846-015-600
Bovine Serum Albumins (BSA) Sigma-Aldrich A6003-25G
Anti-Ovalbumin antibody  Abcam ab181688
Anti-rabbit IgG  HRP Sigma-Aldrich A0545 
Pierce ECL Plus Western Blotting Substrate Pierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc 32132
Forene Abbott 2594.00.00
FBS Invitrogen 10500-064
Falcon Cell Strainers Fischer Scientific  08-771-2
Ammonium chloride Sigma-Aldrich 254134-5G
Tris Base Sigma-Aldrich 10708976001
CD4+ CD62 L+ T isolation kit  Miltenyi Biotec 130-093-227 
MACS LS Columns  Miltenyi Biotec 130-042-401
MACS MS Columns  Miltenyi Biotec 130-042-201
MidiMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-302
MiniMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-102
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
Feeding Needle 20G SouthPointe Surgical Supply, Inc FN-7903
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-Aldrich HT501128
Paraffin Sigma-Aldrich 1496904
Hematoxylin Sigma-Aldrich H9627
Eosin Y Sigma-Aldrich 230251 
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D9779 
Collagenase type VIII Sigma-Aldrich C-2139
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium AppliChem A2044, 9050
Sodium azide Sigma-Aldrich 438456
Mouse BD Fc Block BD Pharmingen 553141
FITC-conjugated mAb binding Vß 5.1, 5.2  BD Pharmingen 553189
APC-conjugated mAb binding CD4 GK1.5  eBioscience 17-0041-83
FACS Calibur  BD Biosciences
FCS Express V3 software DeNovo
Meta scanning confocal microscope  Zeiss LSM 710 
Zeiss Workstation Zeiss LSM 7
Zeiss ZEM software  Zeiss v4.2.0.121
Maxisorp immuno plates  NUNC, Roskilde 442404
Streptavidin conjugated alkaline phosphatase Jackson Immuno Research 016-050-084
Alkaline phosphatase substrate 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate Sigma-Aldrich 71768-5G
mAb R4-6A2 BD Biosciences 551216
mAb XMG1.2  BD Biosciences 554410
TECAN microplate-ELISA reader Tecan
EasyWin software Tecan
DNase I recombinant 4536282001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Backhed, F., Ley, R. E., Sonnenburg, J. L., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Host-bacterial mutualism in the human intestine. Science. 307, 1915-1920 (2005).
  2. Cario, E., Podolsky, D. K. Intestinal epithelial TOLLerance versus inTOLLerance of commensals. Mol Immunol. 42, 887-893 (2005).
  3. Sartor, R. B., Mazmanian, S. K. Intestinal Microbes in Inflammatory Bowel Diseases. Am J Gastroenterol Suppl. 1, 15-21 (2012).
  4. Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C., Finlay, B. B. Gut microbiota in health and disease. Physiol Rev. 90, 859-904 (2010).
  5. Metges, C. C. Contribution of microbial amino acids to amino acid homeostasis of the host. J Nutr. 130, 1857S-1864S (2000).
  6. Rossi, M., Amaretti, A., Raimondi, S. Folate production by probiotic bacteria. Nutrients. 3, 118-134 (2011).
  7. Ley, R. E., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Ecological and evolutionary forces shaping microbial diversity in the human intestine. Cell. 124, 837-848 (2006).
  8. Sleator, R. D. The human superorganism - of microbes and men. Med Hypotheses. 74, 214-215 (2010).
  9. Kumar, H., Kawai, T., Akira, S. Pathogen recognition by the innate immune system. Int Rev Immunol. 30, 16-34 (2011).
  10. Kumar, H., Kawai, T., Akira, S. Pathogen recognition in the innate immune response. Biochem J. 420, 1-16 (2009).
  11. Smith, P. M., Garrett, W. S. The gut microbiota and mucosal T cells. Front Microbiol. 2, 111 (2011).
  12. Fava, F., Danese, S. Intestinal microbiota in inflammatory bowel disease: friend of foe? World J Gastroenterol. 17, 557-566 (2011).
  13. Mazmanian, S. K., Liu, C. H., Tzianabos, A. O., Kasper, D. L. An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system. Cell. 122, 107-118 (2005).
  14. Muzes, G., Molnar, B., Tulassay, Z., Sipos, F. Changes of the cytokine profile in inflammatory bowel diseases. World J Gastroenterol. 18, 5848-5861 (2012).
  15. Koboziev, I., Karlsson, F., Grisham, M. B. Gut-associated lymphoid tissue, T cell trafficking, and chronic intestinal inflammation. Ann N Y Acad Sci. 1207 Suppl. 1207, Suppl 1. E86-E93 (2010).
  16. Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G135-G146 (2009).
  17. Elson, C. O., Sartor, R. B., Tennyson, G. S., Riddell, R. H. Experimental models of inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 109, 1344-1367 (1995).
  18. Boismenu, R., Chen, Y. Insights from mouse models of colitis. J Leukoc Biol. 67, 267-278 (2000).
  19. Powrie, F., Leach, M. W., Mauze, S., Caddle, L. B., Coffman, R. L. Phenotypically distinct subsets of CD4+ T cells induce or protect from chronic intestinal inflammation in C. B-17 scid mice. Int Immunol. 5, 1461-1471 (1993).
  20. Rivera-Nieves, J., et al. Emergence of perianal fistulizing disease in the SAMP1/YitFc mouse, a spontaneous model of chronic ileitis. Gastroenterology. 124, 972-982 (2003).
  21. Ostanin, D. V., et al. T cell-induced inflammation of the small and large intestine in immunodeficient mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 290, G109-G119 (2006).
  22. Barnett, M., Fraser, A. Animal Models of Colitis: Lessons Learned, and Their Relevance to the Clinic. Ulcerative Colitis - Treatments, Special Populations and the Future. O'Connor, M. , InTech. (2011).
  23. Reindl, W., Weiss, S., Lehr, H. A., Forster, I. Essential crosstalk between myeloid and lymphoid cells for development of chronic colitis in myeloid-specific signal transducer and activator of transcription 3-deficient mice. Immunology. 120, 19-27 (2007).
  24. Yoshida, M., et al. CD4 T cells monospecific to ovalbumin produced by Escherichia coli can induce colitis upon transfer to BALB/c and SCID mice. Int Immunol. 13, 1561-1570 (2001).
  25. Eun, C. S., et al. Induction of bacterial antigen-specific colitis by a simplified human microbiota consortium in gnotobiotic interleukin-10-/- mice. Infect Immun. 82, 2239-2246 (2014).
  26. Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nat Rev Microbiol. 8, 564-577 (2010).
  27. Chinen, T., Rudensky, A. Y. The effects of commensal microbiota on immune cell subsets and inflammatory responses. Immunol Rev. 245, 45-55 (2012).
  28. Dimmitt, R. A., et al. Role of postnatal acquisition of the intestinal microbiome in the early development of immune function. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 51, 262-273 (2010).
  29. Cebra, J. J., Periwal, S. B., Lee, G., Lee, F., Shroff, K. E. Development and maintenance of the gut-associated lymphoid tissue (GALT): the roles of enteric bacteria and viruses. Dev Immunol. 6, 13-18 (1998).
  30. Ohkusa, T., Nomura, T., Sato, N. The role of bacterial infection in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Intern Med. 43, 534-539 (2004).
  31. van Lierop, P. P., Samsom, J. N., Escher, J. C., Nieuwenhuis, E. E. Role of the innate immune system in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 48, 142-151 (2009).
  32. Kaur, N., Chen, C. C., Luther, J., Kao, J. Y. Intestinal dysbiosis in inflammatory bowel disease. Gut Microbes. 2, 211-216 (2011).
  33. Trobonjaca, Z., et al. MHC-II-independent CD4+ T cells induce colitis in immunodeficient RAG-/- hosts. J Immunol. 166, 3804-3812 (2001).
  34. Brimnes, J., Reimann, J., Nissen, M., Claesson, M. Enteric bacterial antigens activate CD4(+) T cells from scid mice with inflammatory bowel disease. Eur J Immunol. 31, 23-31 (2001).
  35. Cong, Y., et al. CD4+ T cells reactive to enteric bacterial antigens in spontaneously colitic C3H/HeJBir mice: increased T helper cell type 1 response and ability to transfer disease. J Exp Med. 187, 855-864 (1998).
  36. Niess, J. H., et al. CX3CR1-mediated dendritic cell access to the intestinal lumen and bacterial clearance. Science. 307, 254-258 (2005).
  37. Rossini, V., et al. CX3CR1(+) cells facilitate the activation of CD4 T cells in the colonic lamina propria during antigen-driven colitis. Mucosal Immunol. 7, 533-548 (2014).
  38. Vallon-Eberhard, A., Landsman, L., Yogev, N., Verrier, B., Jung, S. Transepithelial pathogen uptake into the small intestinal lamina propria. J Immunol. 176, 2465-2469 (2006).
  39. Chieppa, M., Rescigno, M., Huang, A. Y., Germain, R. N. Dynamic imaging of dendritic cell extension into the small bowel lumen in response to epithelial cell TLR engagement. J Exp Med. 203, 2841-2852 (2006).
  40. Farache, J., et al. Luminal Bacteria Recruit CD103(+) Dendritic Cells into the Intestinal Epithelium to Sample Bacterial Antigens for Presentation. Immunity. , (2013).
  41. Farache, J., Zigmond, E., Shakhar, G., Jung, S. Contributions of dendritic cells and macrophages to intestinal homeostasis and immune defense. Immunol Cell Biol. 91, 232-239 (2013).
  42. Schirmbeck, R., et al. Translation from cryptic reading frames of DNA vaccines generates an extended repertoire of immunogenic, MHC class I-restricted epitopes. J Immunol. 174, 4647-4656 (2005).
  43. Balestrino, D., et al. Single-cell techniques using chromosomally tagged fluorescent bacteria to study Listeria monocytogenes infection processes. Appl Environ Microbiol. 76, 3625-3636 (2010).
  44. Ortega-Gonzalez, M., et al. Validation of bovine glycomacropeptide as an intestinal anti-inflammatory nutraceutical in the lymphocyte-transfer model of colitis. Br J Nutr. 111, 1202-1212 (2014).
  45. Capitan-Canadas, F., et al. Fructooligosaccharides exert intestinal anti-inflammatory activity in the CD4+ CD62L+ T cell transfer model of colitis in C57BL/6J mice. Eur J Nutr. , (2015).
  46. Salazar-Gonzalez, R. M., et al. CCR6-mediated dendritic cell activation of pathogen-specific T cells in Peyer's patches. Immunity. 24, 623-632 (2006).
  47. Niess, J. H., Leithauser, F., Adler, G., Reimann, J. Commensal gut flora drives the expansion of proinflammatory CD4 T cells in the colonic lamina propria under normal and inflammatory conditions. J Immunol. 180, 559-568 (2008).
  48. Radulovic, K., et al. CD69 regulates type I IFN-induced tolerogenic signals to mucosal CD4 T cells that attenuate their colitogenic potential. J Immunol. 188, 2001-2013 (2012).
  49. Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nat Rev Immunol. 14, 667-685 (2014).
  50. Manta, C., et al. CX(3)CR1(+) macrophages support IL-22 production by innate lymphoid cells during infection with Citrobacter rodentium. Mucosal Immunol. 6 (3), 177-188 (2013).
  51. Feng, T., Wang, L., Schoeb, T. R., Elson, C. O., Cong, Y. Microbiota innate stimulation is a prerequisite for T cell spontaneous proliferation and induction of experimental colitis. J Exp Med. 207, 1321-1332 (2010).
  52. Mazzini, E., Massimiliano, L., Penna, G., Rescigno, M. Oral tolerance can be established via gap junction transfer of fed antigens from CX3CR1(+) macrophages to CD103(+) dendritic cells. Immunity. 40, 248-261 (2014).
  53. Fitzpatrick, L. R. Novel Pharmacological Approaches for Inflammatory Bowel Disease: Targeting Key Intracellular Pathways and the IL-23/IL-17 Axis. Int J Inflam. 2012, 389404 (2012).
  54. Danese, S. New therapies for inflammatory bowel disease: from the bench to the bedside. Gut. 61, 918-932 (2012).

Tags

Immunologi CX CD4 colitis inflammatorisk tarmsygdom, Konfokal mikroskopi
Udvikling af et antigen-drevet Colitis Model at studere Præsentation af antigener ved antigen-præsenterende celler for T-celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rossini, V., Radulovic, K., Riedel,… More

Rossini, V., Radulovic, K., Riedel, C. U., Niess, J. H. Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells. J. Vis. Exp. (115), e54421, doi:10.3791/54421 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter