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Immunology and Infection

एक प्रतिजन संचालित कोलाइटिस मॉडल के विकास के एंटीजन टी कोशिकाओं को प्रकोष्ठों पेश करके प्रतिजनों की प्रस्तुति का अध्ययन करने के लिए

doi: 10.3791/54421 Published: September 18, 2016

Introduction

आंत कि बाहरी वातावरण के संपर्क में है शरीर का सबसे बड़ा सतह है। निवासी रोगाणुओं के विशाल arrays मानव आंत उपनिवेश आंतों माइक्रोबायोटा (या microflora) के रूप में। यह अप करने के लिए 100 खरब माइक्रोबियल कोशिकाओं से मिलकर का अनुमान है और जीव विज्ञान में 1-3 से जाना जाता है सबसे घनी आबादी वाले जीवाणु आवासों में से एक का गठन किया है। GIT में बैक्टीरिया एक आंत्र आला जहां वे जीवित और 4 गुणा उपनिवेश। बदले में, माइक्रोबायोटा अपने जीनोम 1 पर इनकोडिंग नहीं अतिरिक्त कार्यात्मक सुविधाओं के साथ मेजबान endows। उदाहरण के लिए माइक्रोबायोटा उपकला कोशिकाओं के प्रसार को उत्तेजित करता है, स्वयं द्वारा विटामिन है कि मेजबान का उत्पादन नहीं कर सकते हैं पैदा करता है, चयापचय को नियंत्रित करता है और रोगाणुओं को 4-6 से बचाता है। इस लाभप्रद संबंध को देखते हुए कुछ लेखकों ने सुझाव दिया है कि मनुष्य के "सुपर जीवों" या "holobionts" है कि बैक्टीरियल और मानव जीन 7.8 का एक मिश्रण कर रहे हैं। (मानव) मेजबान पर माइक्रोबायोटा के लाभदायक प्रभाव को देखते हुए आंतों प्रतिरक्षा प्रणाली लुमेन में अपने अस्तित्व को सक्षम करने के लिए, लेकिन यह भी रोगज़नक़ों कि ल्यूमिनल पक्ष 9-11 से आक्रमण मारने खानेवाला रोगाणुओं को सहन करने की जरूरत है। आंतों की प्रतिरक्षा प्रणाली को नुकसान न पहुंचाने और हानिकारक ल्यूमिनल रोगाणुओं के बीच भेद करने के लिए तंत्र विकसित किया गया है; हालांकि इन तंत्र अभी तक अच्छी तरह से 12 से समझ नहीं रहे हैं। आंतों की अखंडता को बनाए रखने सहिष्णुता और प्रतिरक्षा 13 के बीच संतुलन रखने के लिए एक कसकर विनियमित प्रतिरक्षा homeostasis की आवश्यकता है। प्रतिरक्षा homeostasis में एक असंतुलन ऐसे भड़काऊ आंत्र रोग (IBD) 3,14 के रूप में आंतों की बीमारियों के शामिल होने के लिए योगदान देता है।

Crohn रोग (सीडी) और अल्सरेटिव कोलाइटिस (यूसी): वहाँ आईबीडी के दो प्रमुख प्रकार हैं। इन बीमारियों के साथ मरीजों को आमतौर पर गुदा से खून बह रहा है, गंभीर दस्त और पेट दर्द 15,16 से पीड़ित हैं। आईबीडी का एक कारण अब भी हैअज्ञात है, लेकिन एक आनुवांशिक कारक, पर्यावरणीय प्रभावों और dysregulated प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के संयोजन रोग के विकास के लिए 15 महत्वपूर्ण घटना हो सकती है।

आईबीडी के लिए पशु मॉडल 50 से अधिक वर्षों के लिए इस्तेमाल किया गया है। पिछले कुछ दशकों में नए आईबीडी मॉडल प्रणाली आईबीडी 17,18 के रोगजनन के विषय में विभिन्न परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए विकसित किया गया है। पुरानी कोलाइटिस की सबसे विशेषता मॉडल टी सेल हस्तांतरण मॉडल है कि टी-सेल homeostasis 19,20 के विघटन को प्रेरित करता है। 16,21 यह मॉडल मेजबान है कि कमी है टी और बी कोशिकाओं (- - / और SCID चूहों ऐसे चीर के रूप में) में असुरक्षित चूहों से अनुभवहीन टी कोशिकाओं के हस्तांतरण शामिल है। इस मॉडल में रोग के विकास दस्त की उपस्थिति, कम शारीरिक गतिविधि, और शरीर के वजन के नुकसान का मूल्यांकन द्वारा 3-10 हफ्तों के लिए नजर रखी है। यह तो बर्बाद सिंड्रोम 16 कहा जाता है। स्वस्थ चूहों की तुलना में प्रत्यारोपित सेनाओं के colonic ऊतक Thicke हैआर, छोटे और भारी 16। टी सेल हस्तांतरण मॉडल का उपयोग करना है, यह समझने के लिए कि किस तरह अलग टी सेल आबादी आईबीडी 22 के रोगजनन में योगदान कर सकते संभव है। टी सेल हस्तांतरण मॉडल एक विशिष्ट प्रतिजन ढंग से APCs और रोग की प्रक्रिया में टी कोशिकाओं के बीच बातचीत का विश्लेषण नहीं करता। यह दिखाया गया है कि माइलॉयड कोशिकाओं और लसीकावत् कोशिकाओं के बीच एक संवाद आंतों में सूजन 23 के विकास के लिए जिम्मेदार हो सकता है। हालांकि आईबीडी के कई पहलुओं को स्पष्ट किया गया है, प्रारंभिक घटनाओं है कि रोग के विकास के लिए नेतृत्व अभी भी स्पष्ट रूप से समझने की जरूरत है।

यह दिखाया गया है कि माइक्रोबायोटा हस्तांतरण कोलाइटिस के अभाव में 24 स्थापित नहीं किया जा सकता है। हाल ही में, कई सिद्धांतों का सुझाव आईबीडी खानेवाला बैक्टीरिया 25 के खिलाफ एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का परिणाम हो सकता है। लेखक भी प्रस्ताव रखा है कि खानेवाला बैक्टीरिया बाहर का आंत में सूजन प्रेरित करने के लिए आवश्यक हैं26। रोगाणु मुक्त (GF) पशु आंतों प्रतिरक्षा प्रणाली को आम तौर पर 27,28 बिगड़ा हुआ है, लेकिन पूरी तरह से सक्षम आंतों प्रतिरक्षा प्रणाली 29 के विकास में विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त बैक्टीरिया परिणामों का एक मिश्रण के साथ इन चूहों के एक उपनिवेश की स्थापना। इसलिए, माइक्रोबायोटा या तो एक तंत्र है कि करने के लिए predisposes या आंतों में सूजन 30,31 के विकास के खिलाफ की रक्षा के रूप में, आईबीडी के रोगजनन में एक महत्वपूर्ण तत्व हो रहा है। मौजूदा सिद्धांतों का सुझाव है कि आईबीडी माइक्रोबियल असंतुलन, आनुवंशिक रूप से संवेदनशील रोगियों में 32 dysbiosis कहा जाता है, का एक परिणाम है, लेकिन यह स्पष्ट नहीं है फिर भी अगर dysbiosis कारण या रोग 12 का परिणाम है। आईबीडी के विकास में सूक्ष्म जीवाणुओं की भूमिका को देखते हुए, इन विट्रो प्रयोगों में पता चला कि सीडी 4+ टी कोशिकाओं पेट के बैक्टीरिया 33,34 के साथ स्पंदित APCs से सक्रिय किया जा सकता है।

इसके अलावा, यह दिखाया गया है से प्रतिजनों किऐसे के रूप में विभिन्न प्रजातियों के जीवाणु खानेवाला, कोलाई, Bacteroides, Eubacterium और बदलनेवाला, सीडी 4+ टी कोशिकाओं 35 सक्रिय करने में सक्षम हैं। यह इंगित करता है कि बैक्टीरियल एंटीजन टी कोशिकाओं को की प्रस्तुति आईबीडी के विकास के लिए महत्वपूर्ण है। रोग की प्रक्रिया में microflora द्वारा निकाली गई कई एंटीजन की जटिलता को कम करने के लिए, एक कोलाई तनाव बना दिया गया है कि ओवीए प्रतिजन का उत्पादन किया है। स्थानांतरण कोलाइटिस चीर में ओवीए विशेष टी कोशिकाओं को इंजेक्शन द्वारा प्रेरित किया गया था - / - जानवरों के साथ ओवीए व्यक्त उपनिवेश कोलाई।

यह मॉडल हाल ही में सबूत सुझाव है कि CX 3 CR1 + सांसदों, colonic लामिना propria (सीएलपी), 36 में एक प्रमुख सेल सबसेट, स्थानांतरण के दौरान सीडी 4+ टी कोशिकाओं के साथ बातचीत कर रहे हैं पर आधारित है 37 कोलाइटिस। सांसदों बैक्टीरिया जैसे कण प्रतिजन के लिए आंतों लुमेन, नमूना, उनकी डेन्ड्राइट 36, 38,39 के प्रयोग से। पिछला अध्ययनदिखा दिया है कि सांसदों को भी इस तरह ओवीए के रूप में घुलनशील एंटीजन, 40,41 लुमेन आंतों में पेश लग सकता है। कांग्रेस विधायक दल में CX 3 CR1 + सांसदों की बहुतायत को देखते हुए यह संभव है कि इन कोशिकाओं ल्यूमिनल बैक्टीरिया नमूना और सीडी 4 टी कोशिकाओं के साथ बातचीत कर सकते हैं। चूहों के Confocal इमेजिंग ओवीए विशिष्ट सीडी 4+ टी के साथ उपनिवेश कोशिकाओं के साथ प्रतिरोपित कोलाई CFP-ओवीए, बताते हैं कि CX 3 CR1 + सांसदों प्रतिजन संचालित कोलाइटिस के विकास के दौरान OT-द्वितीय सीडी 4+ टी सेल के साथ संपर्क में हैं। यह मॉडल आंतों APCs और टी कोशिकाओं केवल आंत लुमेन में विशेष प्रतिजन व्यक्त बैक्टीरिया के लिए विशिष्ट प्रतिजन के बीच प्रस्तुति प्रक्रिया के अध्ययन के लिए सक्षम बनाता है।

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Protocol

चूहे नस्ल और विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त (एसपीएफ) उल्म विश्वविद्यालय (उल्म, जर्मनी) के जानवरों की सुविधा में शर्तों के अधीन रखा गया था। सभी पशु प्रयोगों स्थानीय पशु उपयोग और देखभाल समिति और राष्ट्रीय पशु कल्याण कानून के दिशा निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया।

1. pCFP-ओवीए प्लाज्मिड के निर्माण

  1. पूर्ण आकार ओवीए प्राइमरों Ova_SpeI_fw (3'-GACCAACTAGTATGGAATTTTGTTTTGATGTATT -5 ') और Ova_ClaI_rev (3'- GACCAGATCGATTAAGGGGAAACACATCTGCC-5'), 37 का उपयोग कर प्लाज्मिड पीसीआई-ओवीए (एम्पीसिलीन प्रतिरोधी) 42 एक टेम्पलेट के रूप में उपयोग करते हुए जीन बढ़ाना। पीसीआर उत्पाद (यानी ओवीए अनुक्रम कोडन) एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फेज मध्य वेक्टर प्राइमरों और वेक्टर के SpeI और Clai प्रतिबंध साइटों का उपयोग कर विशिष्ट ओवीए प्लाज्मिड उपज में क्लोन।
  2. मजबूत विधान प्रमोटर पी हाइपर प्लाज्मिड पैड 1 का उपयोग के साथ मिलकर सीएफपी-कोडिंग जीन बढ़ाना 43 एक टेम्पलेट और प्राइमरों CFP_SacII_fw (3'-GATCGACCGCGGTTCTTGAAGACGAAAGGGCC-5 ') के रूप में और CFP_SpeI_rev (3'-GATCGAACTAGTACCACCACCACCACCACCTTTGTAGAGTTCATCCATGC-5'), 37।
  3. विशिष्ट ओवीए प्लाज्मिड (एम्पीसिलीन प्रतिरोधी) प्राइमरों और वेक्टर 37 की SpeI और SACI प्रतिबंध साइटों का उपयोग करने में सीएफपी-कोडिंग जीन क्लोन। इस ओवीए कोडिंग अनुक्रम से CFP-कोडिंग के बीच 6 ग्लाइसिन अवशेषों की एक स्पेसर का परिचय।

2. कोलाई pCFP-ओवीए का निर्माण

  1. कोलाई तनाव DH10B रात भर एक रोटरी प्रकार के बरतन पर 37 डिग्री सेल्सियस पर Luria Bertani (पौंड) मध्यम aerobically की 100 मिलीलीटर में आगे बढ़ें।
  2. -80 डिग्री सेल्सियस पर ग्लिसरॉल शेयर और दुकान बनाने के लिए ग्लिसरॉल के 200 μl के साथ जीवाणु संस्कृति के 800 μl मिक्स।
  3. लेग माध्यम के 5 मिलीलीटर में ग्लिसरॉल स्टॉक से कोलाई तनाव DH10B के 50 μl जोड़ें और उन्हें एक रोटरी प्रकार के बरतन ove पर aerobically बढ़ने 37 डिग्री सेल्सियस परrnight।
  4. एक रोटरी हिला में 37 डिग्री सेल्सियस पर लेग माध्यम के 250 मिलीलीटर के साथ एक चकित 1 एल Erlenmeyer फ्लास्क में संस्कृति स्थानांतरण।
  5. 600 एनएम पर एक ऑप्टिकल घनत्व के बैक्टीरिया बढ़ने (600 आयुध डिपो) 0.5 की और फिर 30 मिनट के लिए बर्फ पर संस्कृति ठंडा। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 5000 XG पर बैक्टीरिया अपकेंद्रित्र।
  6. ठंडा 10% ग्लिसरॉल और सेंट्रीफ्यूज बैक्टीरिया के 100 मिलीलीटर के साथ 4 डिग्री सेल्सियस Resuspend बैक्टीरिया पर 10 मिनट के लिए 5000 XG पर ठंडा बाँझ एच 2 ओ और सेंट्रीफ्यूज बैक्टीरिया के 100 मिलीलीटर के साथ Resuspend बैक्टीरिया 10 मिनट के लिए 5000 XG पर 4 डिग्री सेल्सियस पर। इस अंतिम चरण के लिए दो बार दोहराएँ।
  7. अंतिम धोने के कदम के बाद, 10% ग्लिसरॉल के 700 μl में बैक्टीरिया resuspend। -80 डिग्री सेल्सियस पर तरल नाइट्रोजन और दुकान में 50 μl aliquots रुक।
  8. एक पूर्व ठंडा electroporation क्युवेट (2 मिमी इलेक्ट्रोड दूरी) में बर्फ और हस्तांतरण पर एक 50 μl विभाज्य पिघलना।
  9. 50 μl करने के लिए प्लास्मिड डीएनए (100 एनजी) के 5 μl जोड़े कोलाई aliquoटीएस। 25 μF, 200 ओम (Ω) और 2.5 केवी पर एक नाड़ी के साथ electroporation प्रदर्शन करना।
  10. 1 मिलीलीटर पूर्व गर्म समाज मध्यम (5 ग्राम / एल खमीर निकालने, 2 जी / एल tryptone, 10 मिमी सोडियम क्लोराइड, 2.5 मिमी पोटेशियम क्लोराइड, 10 मिमी मैग्नीशियम क्लोराइड, 10 मिमी मैग्नीशियम सल्फेट) में Resuspend बैक्टीरिया और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते aerobically 1 घंटे के लिए।
  11. लेग अगर प्लेटों पर प्लेट बैक्टीरिया एम्पीसिलीन 100 माइक्रोग्राम / एमएल (लेग अगर की 100 मिलीलीटर के लिए एक 100 मिलीग्राम / एमएल एम्पीसिलीन शेयर के 100 μl जोड़) और रात भर aerobically 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते के साथ पूरक।
  12. एकल कालोनियों और एम्पीसिलीन 100 माइक्रोग्राम / एमएल के साथ पूरक लेग अगर प्लेट में फिर से लकीर उन्हें उठाओ। रात भर aerobically 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  13. एकल कालोनियों उठाओ और उन्हें रात भर बढ़ने प्लाज्मिड अलगाव के लिए एम्पीसिलीन 100 माइक्रोग्राम / एमएल के साथ पूरक लेग मीडिया के 10 मिलीलीटर में। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्लाज्मिड मिनी प्रस्तुत करने का किट का प्रयोग करें और 30 μl DH 2 हे (आसुत जल) निर्माता के अनुसार 'के साथ प्लास्मिड डीएनए eluteकी प्रोटोकॉल। प्रतिबंध के विश्लेषण और डीएनए अनुक्रमण 37,42,43 द्वारा plasmids की जाँच करें।
  14. की सकारात्मक क्लोन की एक संस्कृति को सेट करें लेग माध्यम की 100 मिलीलीटर में कोली pCFP-ओवीए एम्पीसिलीन 100 माइक्रोग्राम / एमएल के साथ पूरक। एक रोटरी प्रकार के बरतन रातोंरात पर 37 डिग्री सेल्सियस पर aerobically आगे बढ़ें।
  15. -80 डिग्री सेल्सियस पर शुद्ध ग्लिसरॉल और दुकान के 200 μl के साथ जीवाणु संस्कृति के 800 μl मिक्स।
  16. कमरे के तापमान (आरटी) पर 10 मिनट के लिए 5000 XG पर रातोंरात संस्कृति के बाकी अपकेंद्रित्र और फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में गोली resuspend। गिलास स्लाइड पर निलंबन के 10 μl प्लेस और एक coverslip के साथ कवर।
  17. एक मानक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी में नमूनों का निरीक्षण करें CFP-ओवीए की अभिव्यक्ति प्रतिदीप्ति (450 एनएम पर सीएफपी उत्तेजना, 480 एनएम पर उत्सर्जन) की पुष्टि करें। बैक्टीरिया बढ़ाई 400X के साथ शुरू विश्लेषण।
  18. अपकेंद्रित्र 10 मिनट, आरटी के लिए 5000 XG पर रात भर संस्कृतियों से बैक्टीरिया के 1 मिलीलीटर। के 40 μl में गोली Resuspendपीबीएस और 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर फोड़ा।
  19. 10 मिनट के लिए 30,000 XG पर नमूने अपकेंद्रित्र और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए 37 supernatants का उपयोग करें। 400: खरगोश उठाया विरोधी ओवीए पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी 1 पतला प्रयोग करें।

3. OT-द्वितीय की पीढ़ी / लाल चूहे

  1. आदेश OT-द्वितीय / लाल चूहों 37 उत्पन्न करने के लिए एक महिला / पुरुष माउस लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त के साथ एक पुरुष / महिला OT-द्वितीय माउस (दोनों उपभेदों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध) पार।

4. प्लीहा सेल अलगाव

  1. किसी भी halogenated आकाश की साँस लेना द्वारा संज्ञाहरण के बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से OT-द्वितीय / लाल चूहों euthanize व्यावसायिक रूप से उपलब्ध (अप शामिल करने के लिए 5% करने के लिए)।
  2. माउस के बाएं बेहतर उदर भाग में कटौती करने के लिए कैंची का प्रयोग करें। इस उदर भाग के अधीन तिल्ली (एक अंधेरे लाल रंग के साथ अंडाकार आकार) है। कैंची और चिमटी का प्रयोग इसे हटाने के लिए।
    1. OT-द्वितीय / लाल चूहों की तिल्ली निकालें और एक 100 के माध्यम से इसे पारितमाइक्रोन सेल झरनी के क्रम में एक एकल कोशिका निलंबन प्राप्त करने के लिए एक 1 मिलीलीटर सिरिंज के सवार का उपयोग कर एक 50 मिलीलीटर ट्यूब पर तैनात हैं। झरनी पीबीएस के साथ दो बार 10 मिलीलीटर 1% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक धो लें।
  3. आरटी पर 5 मिनट के लिए 390 XG पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र। पूर्व गर्म lysis बफर (144 मिमी एनएच 4 सीएल, 17 मिमी Tris, पीएच = 7.2) के 5 मिलीलीटर के साथ गोली Resuspend लाल रक्त कोशिकाओं lyse करने के लिए। 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट सेते हैं।
  4. नमूना धो पीबीएस के 25 एमएल के साथ 1% FBS के साथ पूरक। आरटी पर 5 मिनट के लिए 390 XG पर अपकेंद्रित्र। गोली Resuspend में पीबीएस के 10 मिलीलीटर 1% FBS के साथ पूरक।
  5. एक Neubauer गिनती कक्ष का उपयोग कोशिकाओं की गणना। एक 0.4% Trypan ब्लू समाधान के 10 μl के साथ कोशिकाओं को निलंबन के 10 μl मिक्स। 1-2 मिनट के लिए सेते हैं।
    1. दाग कोशिकाओं के 10 μl के साथ hemocytometer चैम्बर भरें। चार 1 x 1 मिमी में खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं की गणना एक कक्ष और determin के 2 चौकोंप्रति वर्ग कोशिकाओं की औसत संख्या ई। व्यवहार्य कोशिकाओं सफेद, मृत कोशिकाओं नीला दिखाई दिखाई देते हैं। कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए / कमजोर पड़ने के पहलू से सेल नंबर गुणा मिलीलीटर। 2-4 quadrants में गिना जा रहा है, quadrants की संख्या से विभाजित।

5. सीडी 4 + CD62 एल + टी सेल संवर्धन

  1. नकारात्मक या सकारात्मक चयन के सिद्धांतों का उपयोग चुंबकीय अलगाव किट के माध्यम से सीडी 4 + CD62L + टी कोशिकाओं के लिए तिल्ली कोशिकाओं को समृद्ध। इधर, सीडी 4+ टी कोशिकाओं को अलग और सकारात्मक चयन का उपयोग आगे CD62L + आबादी सीडी 4+ टी सेल पूल के भीतर के लिए समृद्ध करने के लिए नकारात्मक चयन का उपयोग करें।
    नोट: नकारात्मक चयन प्रक्रिया में, कोशिकाओं है, जो अलग-थलग नहीं किया जाएगा (यहाँ: सभी सीडी 4 नकारात्मक कोशिकाओं) चुंबकीय microbeads के साथ मिलकर विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ लेबल रहे हैं। ताकि वे EASI हो सकता है के दौरान स्तंभ धोने कदम सीडी 4+ टी कोशिकाओं स्तंभ से गुजरना होगाLy एकत्र। सकारात्मक चयन प्रक्रिया कोशिकाओं में चुंबकीय microbeads के साथ मिलकर उचित एंटीबॉडी के साथ चिह्नित कर रहे हैं अलग किया जा सके। के दौरान स्तंभ धोने कदम लेबल की कोशिकाओं स्तंभ में रहना होगा और वे चुंबकीय क्षेत्र से स्तंभ को हटाने और बफर के साथ यह rinsing द्वारा एकत्र किया जा सकता है।
  2. नकारात्मक चयन प्रक्रिया के लिए, 0.5% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) के साथ पूरक ठंड पीबीएस के 40 μl में 10 7 कुल तिल्ली कोशिकाओं resuspend। (गैर सीडी 4+ टी कोशिकाओं बाध्यकारी विशिष्ट एंटीबॉडी) बायोटिन लेबल एंटीबॉडी कॉकटेल चुंबकीय अलगाव किट की आपूर्ति के 10 μl जोड़ें और बर्फ पर 15 मिनट सेते हैं।
    1. ठंड पीबीएस के 30 μl 0.5% बीएसए और विरोधी बायोटिन microbeads के 20 μl के साथ पूरक जोड़ें। बर्फ पर 20 मिनट सेते हैं।
    2. नमूना पीबीएस के 10 मिलीलीटर 5 मिनट के लिए 390 XG पर 0.5% बीएसए और सेंट्रीफ्यूज के साथ पूरक करने के लिए जोड़ें। इस कदम दो बार दोहराएँ। ठंड पीबीएस के 1 मिलीलीटर 0.5% बी एस के साथ पूरक में कोशिकाओं Resuspendए।
    3. स्तंभ चुंबकीय क्षेत्र में नकारात्मक चयन प्रक्रिया के लिए विशिष्ट स्थान है और ठंड पीबीएस के 3 मिलीलीटर के साथ कुल्ला स्तंभ पर 0.5% बीएसए के साथ पूरक। ठंड पीबीएस के 3 मिलीलीटर के साथ स्तंभ पर सेल निलंबन जोड़ें और 3 बार धोने 0.5% बीएसए के साथ पूरक।
    4. 5 मिनट के लिए 390 XG पर प्रवाह की कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। स्तंभ के माध्यम से प्रवाह गुजर लेबल हटाया गया सीडी 4+ टी कोशिकाओं में शामिल है। पीबीएस के 1 मिलीलीटर 0.5% BSA के साथ पूरक में गोली Resuspend और कोशिकाओं की गिनती।
    5. एक Neubauer गिनती कक्ष का उपयोग कोशिकाओं की गणना। एक 0.4% Trypan ब्लू समाधान के 10 μl के साथ कोशिकाओं को निलंबन के 10 μl मिक्स। 1-2 मिनट के लिए सेते हैं।
      1. दाग कोशिकाओं के 10 μl के साथ hemocytometer चैम्बर भरें। चार 1 x 1 मिमी में खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं की गणना एक कक्ष के 2 चौकों और वर्ग प्रति कोशिकाओं की औसत संख्या का निर्धारण। व्यवहार्य कोशिकाओं सफेद, मृत कोशिकाओं नीला दिखाई दिखाई देते हैं। कोशिकाओं / एमएल गुणा सेल की संख्या निर्धारित करने के लिएकमजोर पड़ने के पहलू से एल नंबर। 2-4 quadrants में गिना जा रहा है, quadrants की संख्या से विभाजित।
  3. सकारात्मक चयन प्रक्रिया के लिए, प्रति 10 7 पूर्व समृद्ध सीडी 4+ टी सेल अंश CD62L microbeads के 10 μl जोड़ें। बर्फ पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
    1. नमूना पीबीएस के 10 मिलीलीटर 5 मिनट के लिए 390 XG पर 0.5% बीएसए और सेंट्रीफ्यूज के साथ पूरक करने के लिए जोड़ें। इस कदम दो बार दोहराएँ। ठंड पीबीएस के 500 μl में Resuspend 0.5% बीएसए के साथ पूरक।
    2. नकारात्मक चयन प्रक्रिया के लिए विशिष्ट स्तंभ चुंबकीय क्षेत्र में जगह और ठंड पीबीएस के 500 μl स्तंभ पर 0.5% BSA के साथ पूरक से कुल्ला। ठंड पीबीएस के 500 μl के साथ स्तंभ पर सेल निलंबन जोड़ें और 3 बार धोने 0.5% बीएसए के साथ पूरक।
    3. चुंबकीय क्षेत्र से स्तंभ निकालें और एक उपयुक्त संग्रह ट्यूब पर जगह है। स्तंभ पर पीबीएस के 1 मिलीलीटर 0.5% BSA के साथ पूरक जोड़ें और सीडी 4 + CD62L + टी सेल को बाहर निकलवानेमजबूती स्तंभ में सवार धक्का द्वारा स्तंभ में बनाए रखा रहा।
      नोट: पृथक सीडी 4 + CD62L + टी कोशिकाओं अब ऐसे में इन विवो प्रयोगों के रूप में नीचे की ओर अनुप्रयोगों के लिए तैयार हैं। सीडी 4 + CD62L + टी कोशिकाओं अलगाव किट से निर्माता अनुदेश के अनुसार, microbeads विषाक्त नहीं कर रहे हैं। छोटे आकार (लगभग 50 एनएम) के कारण, वे कोशिकाओं को सक्रिय नहीं है और वे कोशिका की सतह epitopes तर नहीं होगा। इसलिए अलग कक्षों कोलाइटिस 37,44,45 प्रेरित करने के लिए immunodeficient चूहों में स्थानांतरित किया जा सकता है।
    4. एक Neubauer गिनती कक्ष का उपयोग कोशिकाओं की गणना। एक 0.4% Trypan ब्लू समाधान के 10 μl के साथ कोशिकाओं को निलंबन के 10 μl मिक्स। 1-2 मिनट के लिए सेते हैं।
      1. दाग कोशिकाओं के 10 μl के साथ hemocytometer चैम्बर भरें। चार 1 x 1 मिमी में खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं की गणना एक कक्ष के 2 चौकों और वर्ग प्रति कोशिकाओं की औसत संख्या का निर्धारण। व्यवहार्य कोशिकाओं appeaसफेद, नीले रंग की मृत कोशिकाओं को दिखाई आर। कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए / कमजोर पड़ने के पहलू से सेल नंबर गुणा मिलीलीटर। 2 - अगर 4 quadrants में गिना जा रहा है, quadrants की संख्या से विभाजित।

6. एंटीजन संचालित कोलाइटिस की प्रेरण

  1. / - - चूहों CX 3 CR1 GFP / + x चीर में intraperitoneally 3 एक्स 10 5 OT-द्वितीय / लाल सीडी 4 + CD62L + टी कोशिकाओं इंजेक्षन। विशिष्ट प्रतिजन कोलाइटिस के शामिल होने के लिए, प्रशासन कोलाई pCFP-ओवीए gavage या कृन्तक पीछे मौखिक टपकाना द्वारा पशु प्रति पीबीएस के 100 μl में 1 एक्स 10 8 कॉलोनी के गठन इकाई (CFU) की एक खुराक पर हर दूसरे दिन।
  2. दो बार साप्ताहिक प्रत्यारोपित चूहों के शरीर के वजन और उनके नैदानिक ​​हालत (मल, मल स्थिरता और चूहों की गतिविधि में रक्त की उपस्थिति) की निगरानी।

7. Histopathological परीक्षा के लिए ऊतक के नमूने

  1. वें से ऊतक के नमूने लेनेचूहों के ई बड़ी आंत, आयल में तटस्थ बफर formalin (10%) और ट्वीट में ठीक कर के रूप में पहले से 36,46 का वर्णन किया।
  2. खंड एक microtome पर आयल के नमूने, स्लाइड्स पर माउंट, और एच एंड ई दाग 47,48 प्रदर्शन करते हैं।
  3. बड़ी आंत के ऊतक विज्ञान वर्गीकृत के रूप में पहले 47,48 प्रकाशित: सामान्य (स्कोर 0); हल्के कोलाइटिस (स्कोर 1), मध्यम कोलाइटिस (स्कोर 2) और गंभीर कोलाइटिस (स्कोर 3)।

8. Colonic लामिना propria कोशिकाओं के अलगाव

  1. ग्रीवा अव्यवस्था किसी भी halogenated आकाश की साँस लेना द्वारा संज्ञाहरण के बाद (प्रेरण के लिए साइन अप करने के लिए 5%) व्यावसायिक रूप से उपलब्ध द्वारा प्रत्यारोपित चूहों euthanize।
  2. पशु नीचे पेट का सामना करना पड़ के साथ रखें। मूत्रमार्ग खोलने के लिए पूर्व से त्वचा को हड़पने के लिए संदंश का प्रयोग करें। छाती को कमर से उदर midline के साथ त्वचा में कटौती करने के लिए कैंची का प्रयोग करें। किनारों पर त्वचा वापस खींचो।
  3. पारदर्शी पेरिटोनियल पेशी दीवार के माध्यम से कट औरशरीर गुहा को खोलने। बृहदान्त्र कि गुदा से काएकुम 49 को जाता है पहचानें। 2 पांव कट और किसी भी वसा ऊतक से मुक्त।
  4. पेट के longitudinally एक विच्छेदन कैंची का उपयोग खोलें। पीबीएस के 25 मिलीग्राम से युक्त एक पेट्री डिश में पेट के ऊतक मिलाने के लिए 1% FBS के साथ पूरक मलबे और श्लेष्मा को हटाने के लिए एक चिमटी का प्रयोग करें। 8 मिमी टुकड़े - 5 में पेट के कट।
  5. धो बफर के 20 मिलीग्राम से युक्त एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में पेट के खंडों रखें। धो बफर 500 मिलीलीटर DPBS, 10mm Hepes और 5 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) शामिल हैं।
  6. अधिकतम गति पर 30 सेकंड के लिए ट्यूब भंवर।
  7. 200 आरपीएम 10 मिनट के लिए झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में पेट के क्षेत्रों के साथ ट्यूब सेते हैं।
  8. ऊष्मायन के बाद, अधिकतम गति पर 30 सेकंड के लिए ट्यूब भंवर।
  9. supernatants त्यागें और एक नया 50 मिलीलीटर धो बफर के 20 मिलीलीटर युक्त ट्यूब में ऊतकों के नमूनों जगह है। दोहराएँ 6-9 तीन बार दोहराएँ
  10. त्यागें रोंupernatants और पीबीएस के 25 मिलीग्राम से युक्त एक पेट्री डिश में ऊतकों के नमूनों जगह है। पेट्री डिश में धीरे ऊतकों के नमूनों में मिलाने के लिए एक चिमटी का प्रयोग कुछ सेकंड के अवशिष्ट उपकला कोशिकाओं को दूर करने के लिए। इस कदम के तीन बार दोहराएँ।
  11. 2 एक्स 2 मिमी 2 टुकड़ों में colonic ऊतकों कट और रोसवेल पार्क मेमोरियल संस्थान (RPMI) क्लोस्ट्रीडियम histolyticum से 0.5 मिलीग्राम / एमएल collagenase प्रकार आठवीं और 10 यू / DNaseI की मिलीलीटर के साथ के माध्यम के 10 मिलीलीटर में ऊष्मायन द्वारा उन्हें पचा।
  12. अधिकतम गति पर 30 सेकंड के लिए ट्यूब भंवर।
  13. 200 rpm पर 35 मिनट के लिए झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में पेट के टुकड़े सेते हैं और अधिक से अधिक गति पर 30 सेकंड के लिए हर 5 मिनट के लिए ट्यूब भंवर।
  14. ऊष्मायन के अंत में अधिक से अधिक गति पर 30 सेकंड के लिए ट्यूब भंवर।
  15. एक 70 माइक्रोन सेल एक नया 50 मिलीलीटर ट्यूब पर तैनात झरनी के माध्यम से उन्हें गुजर द्वारा पचा टुकड़े ले लीजिए।
  16. 5 मिनट के लिए 400 ग्राम पर DPBS के 20 मिलीलीटर और सेंट्रीफ्यूज जोड़कर नमूना धो लें। तब resuspend टीवह DPBS के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं।
  17. एक Neubauer गिनती कक्ष का उपयोग कोशिकाओं की गणना। एक 0.4% Trypan ब्लू समाधान के 10 μl के साथ कोशिकाओं को निलंबन के 10 μl मिक्स। 1-2 मिनट के लिए सेते हैं।
    1. दाग कोशिकाओं के 10 μl के साथ hemocytometer चैम्बर भरें। चार 1 x 1 मिमी में खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं की गणना एक कक्ष के 2 चौकों और वर्ग प्रति कोशिकाओं की औसत संख्या का निर्धारण। व्यवहार्य कोशिकाओं सफेद, मृत कोशिकाओं नीला दिखाई दिखाई देते हैं। कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए / कमजोर पड़ने के पहलू से सेल नंबर गुणा मिलीलीटर। 2-4 quadrants में गिना जा रहा है, quadrants की संख्या से विभाजित।

9. FCM विश्लेषण के लिए बाह्य धुंधला

  1. अपकेंद्रित्र CLP कोशिकाओं 5 पर 390 x जी मिनट। FACS ए के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं Resuspend (पीबीएस 1% बीएसए और 0.1% सोडियम azide के साथ पूरक)
    नोट: सोडियम azide बेहद जहरीला है। यह हाइपरटेंशन, हाइपोथर्मिया, सिरदर्द आक्षेप या मौत का कारण बन सकता है। सोडियम azide के समाधान पतला (0.1 1.0% करने के लिए) आमतौर पर उपयोगकर्ता के लिए असाधारण खतरों मौजूद नहीं है, लेकिन वे आंख और त्वचा में परेशानी है। इसलिए, केवल रासायनिक हुड में सोडियम azide का उपयोग करते हुए एक प्रयोगशाला कोट और डिस्पोजेबल nitrile दस्ताने के एक डबल जोड़ी पहने हुए।
  2. मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) 2.4G2 FcγRIII / द्वितीय CD16 / CD32 के खिलाफ निर्देशित (0.5-1 माइक्रोग्राम एमएबी / 10 6 कोशिकाओं) FACS ए में पतला साथ आरटी पर 15 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते
  3. कोशिकाओं और 390 x जी सेंट्रीफ्यूज 5 मिनट के लिए FACS ए के 200 μl जोड़ें। इस कदम दो बार दोहराएँ। 0.5 से 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए एनजी प्रासंगिक एमएबी की / 10 6 कोशिकाओं के साथ कोशिकाओं को सेते हैं। FACS ए में एंटीबॉडी पतला
  4. कोशिकाओं और 390 x जी सेंट्रीफ्यूज 5 मिनट के लिए FACS ए के 200 μl जोड़ें। इस कदम दो बार दोहराएँ। FACS ए के 100 μl में नमूने Resuspend
  5. CX 3 से टी कोशिकाओं का विश्लेषण CR1 GFP / + x चीर - / - OT-द्वितीय / 37 प्रवाह में लाल सीडी 4 टी कोशिकाओं के साथ पुनर्गठन चूहों।

10 Confocal माइक्रोस्कोपी विश्लेषण

  1. CX 3 CR1 GFP / + पुनर्गठन या OT-द्वितीय / लाल सीडी 4 + CD62L + टी सेल के साथ नहीं चूहों के पेट के विश्लेषण और 1 एक्स 10 8 की CFU के साथ हर दूसरे दिन मौखिक रूप से तंग आ गया कोलाई तनाव DH10B pCFP-ओवीए।
  2. कैंची और चिमटी का उपयोग कर चूहों से पेट के निकालें। यह longitudinally एक विच्छेदन कैंची का उपयोग खोलें।
  3. कैंची का उपयोग पेट के नमूने के एक 5-8 मिमी टुकड़ा काट, कांच स्लाइड पर डाल दिया है और coverslips के साथ कवर किया।
  4. 40 / 1.30 की एक बढ़ाई पर एक confocal खुर्दबीन के साथ पेट के नमूनों का विश्लेषण।
  5. CX 3 CR1 + सांसदों, हरे fluorescein प्रोटीन (GFP) के साथ लेबल का पता लगाने, एक फिल्टर 509 एनएम पर 488 एनएम पर उत्तेजना और उत्सर्जन के साथ सेट का उपयोग कर।
  6. सीडी 4+ टी सेल लाल प्रोटीन एक फिल्टर 58 पर 554 एनएम पर उत्तेजना और उत्सर्जन के साथ सेट का उपयोग कर व्यक्त करने का पता लगाने6 एनएम।
  7. एक फिल्टर 480 एनएम पर 450 एनएम पर उत्तेजना और उत्सर्जन के साथ सेट का उपयोग कर कोलाई pCFP-ओवीए का पता लगाने।
  8. ब्याज की एक क्षेत्र को परिभाषित करें और तितर बितर आरेख उत्पन्न के रूप में पहले 50 में वर्णित सह स्थानीयकरण विश्लेषण से बाहर ले जाने के लिए। ओवरलैप गुणांक Manders और पियर्सन के गुणांक के अनुसार: 2 अलग फार्मूले का प्रयोग करें।

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Representative Results

एक प्रतिजन संचालित कोलाइटिस मॉडल एक स्थापित करने के लिए कोलाई तनाव निर्माण किया गया एक प्लाज्मिड जिसमें सीएफपी के लिए जीन चिकन ovalbumin प्रोटीन और फ्यूजन निर्माण के लिए कोडिंग अनुक्रम से जुड़े हुए है मजबूत विधान प्रमोटर पी हाइपर (चित्रा 1 ए) के नियंत्रण में व्यक्त किया जाता है जिसमें गई है। फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी से पता चलता है कि पुनः संयोजक ई कोलाई pCFP-ओवीए, लेकिन नहीं माता पिता का ई कोलाई DH10B, सीएफपी (चित्रा 1 बी) को व्यक्त करता है। CFP-OVA- उत्पादन कोलाई इन विट्रो में OT-द्वितीय कोशिकाओं को सक्रिय करने और एक के विपरीत IFN-γ उत्पादन को प्रेरित करने में सक्षम है कोलाई तनाव सीएफपी व्यक्त केवल (चित्रा 2)। चित्रा 3 ए से पता चलता CX 3 CR1 GFP / + चूहों के colonic ऊतक के साथ खिलाया के पूर्व vivo 3D confocal इमेजिंग कोलाई pCFP-ओवीए ई। कोलाई pCFP-ओवीए कर सकते हैंcolonic करीब स्थित उपकला कोशिकाओं और आंतों को तहखाने के भीतर पता लगाया जा CX 3 CR1 + फ़ैगोसाइट के साथ सह-localizes। के अनुपात को निर्धारित करने के लिए कोलाई pCFP-ओवीए परिभाषित CX 3 CR1 + फ़ैगोसाइट, नीले और हरे रंग पुष्पन तीव्रता बिखराव blots द्वारा निर्धारित किया गया है से भली भाँति। विश्लेषण है कि CX 3 CR1 + कोशिकाओं जांचा के 11.9 ± 1.5% का पता चला कोलाई pCFP-ओवीए पेट के (चित्रा 3 बी)। OT-द्वितीय में / लाल पशुओं में पता चला, सीडी 4+ टी कोशिकाओं लाल अभिव्यक्ति और Vβ की विशेषता है 5.1 से फ्लो (चित्रा 4) के द्वारा दिखाया अभिव्यक्ति। चित्रा 5 ए के एक सामान्य अवलोकन से पता चलता है प्रतिजन प्रेरित कोलाइटिस मॉडल। OT-द्वितीय / लाल + सीडी 4+ टी CD62L + कोशिकाओं adoptively CX 3 में स्थानांतरित कर दिया गया CR1 GFP / + x चीर - / - प्राप्तकर्ताओं कि तब के साथ हर दूसरे दिन gavaged थेकोलाई pCFP-ओवीए। जब के साथ चुनौती दी कोलाई pCFP-ओवीए, CX 3 का तबादला CR1 GFP / + x चीर - / - चूहों के शरीर के वजन कम है और कोलाइटिस (चित्रा 5 ब) के नैदानिक ​​लक्षण विकसित 6 से पता चलता पूर्व vivo 3 डी colonic ऊतक 7, 14 और 21 दिनों के बाद के confocal इमेजिंग चित्रा। विषमयुग्मजी CX के पुनर्गठन 3 CR1 GFP / + x चीर - / - OT-द्वितीय के साथ प्राप्तकर्ताओं / लाल + कोशिकाओं के साथ चुनौती दी कोलाई pCFP-ओवीए। सात दिनों सेल हस्तांतरण के बाद ही कुछ CX 3 CR1 + फ़ैगोसाइट नमूना है कोलाई pCFP-ओवीए और OT-द्वितीय / लाल + कोशिकाओं पता नहीं थे। सेल हस्तांतरण के बाद चौदह दिन, CX 3 CR1 + फ़ैगोसाइट कि जांचा कोलाई pCFP-ओवीए OT-द्वितीय के करीब / लाल + कोशिकाओं स्थित थे। इक्कीस दिनों के बाद सेल CX के एक उच्च संख्या हस्तांतरण 3 CR1 + कोशिकाओं कि नमूना है कोलाई pCFP-ओवीए और OT-द्वितीय / आरएड + कोशिकाओं, करीब निकटता में CLP भर में बिखरे 3 CR1 + फ़ैगोसाइट CX करने के लिए।

आकृति 1
चित्रा 1: CFP-ओवीए उत्पादन कोलाई। (ए) प्रासंगिक प्रतिबंध साइटों के साथ-pCFP ओवीए का मानचित्र, जीन ओवीए और चमकदार नीली फ्लोरोसेंट प्रोटीन सीएफपी एन्कोडिंग। (बी) के उज्ज्वल क्षेत्र और जंगली प्रकार के फ्लोरोसेंट सूक्ष्म छवियों कोलाई DH10B, ई कोलाई DH10B pCFP और ई कोलाई DH10B pCFP-ओवीए। स्केल पट्टी:। 10 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: ओ.टी.द्वितीय CFP-ओवीए के साथ प्रेरित कोशिकाओं का उत्पादन IFN-γ। तिल्ली से अलगाव के बाद, OT-द्वितीय कोशिकाओं का संकेत संख्या के साथ प्रेरित थे कोलाई DH10B pCFP-ओवीए। बैक्टीरियल कोशिकाओं के बाद 5 माइक्रोग्राम / एमएल जेंटामाइसिन के साथ 2 घंटा ऊष्मायन निष्क्रिय कर दिया गया। संस्कृति के 72 घंटे के बाद, supernatants एकत्र किए गए थे और IFN-γ सांद्रता एलिसा द्वारा निर्धारित की। प्रयोगों triplicates और डेटा ± SEM के मतलब के रूप में प्रस्तुत करने में किया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: CX 3 CR1 + phagocytes नमूना ई कोलाई pCFP-ओवीए। (ए) CX 3 CR1 की CLP ऊतकGFP / + चूहों 1 एक्स 10 8 के साथ gavaged कोलाई pCFP-ओवीए 7 दिनों के लिए और पूर्व vivo confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण किया। बढ़ाई 40X / 1.30। स्केल बार = 30 माइक्रोन। (बी) भाँति का प्रतिशत कोलाई pCFP-ओवीए quantitated और डेटा ± SEM के मतलब के रूप में प्रस्तुत किया। मान व्हिटनी परीक्षण पी में 0.05 <सांख्यिकीय महत्वपूर्ण माना जाता था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। OT-द्वितीय / लाल + सीडी 4 + टी कोशिकाओं की विशेषता (ए) OT-द्वितीय ट्रांसजेनिक जानवरों OT-द्वितीय प्राप्त करने के लिए लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त जानवरों के साथ पार कर रहे थे / लाल +कोशिकाओं। OT-द्वितीय / लाल + कोशिकाओं OT-द्वितीय / लाल की spleens से अलग थे ट्रांसजेनिक जानवरों, सीडी 4 और Vß5.1 के लिए दाग और प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: ओवीए संचालित स्थानांतरण कोलाइटिस (ए) प्रतिजन प्रेरित कोलाइटिस मॉडल की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व।। के साथ हर दूसरे दिन चूहों और मेजबान gavaged थे - / - OT-द्वितीय / लाल + सीडी 4+ टी CD62L + कोशिकाओं adoptively 3 CR1 GFP / + x चीर CX में स्थानांतरित कर दिया गया कोलाई pCFP-ओवीए। संकेत दिया समूहों में से (बी) के शरीर का वजन एक सप्ताह में दो बार मापा गया था। मतलब ± SEM शरीर के वजन घटाने (%) प्रस्तुत किया है। मान व्हिटनी परीक्षण मेंपी <0.05 सांख्यिकीय महत्वपूर्ण माना जाता था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6:। CX 3 CR1 + सांसदों ओवीए संचालित स्थानांतरण कोलाइटिस के दौरान OT-द्वितीय कोशिकाओं के साथ संवाद (ए) Colonic ऊतकों के नमूनों OT-द्वितीय / लाल के हस्तांतरण के बाद दिन 7, 14 और 21 में पूर्व vivo 3D confocal इमेजिंग द्वारा जांच की गई / - - प्राप्तकर्ताओं + सीडी 4+ टी CD62L + CX 3 CR1 GFP / + x चीर में कोशिकाओं। बढ़ाई 40X / 1.30। स्केल बार = 30 माइक्रोन।

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Discussion

हर दूसरे मॉडल के साथ के रूप में, प्रतिजन संचालित कोलाइटिस मॉडल ऊपर वर्णित कुछ मुद्दों है कि अन्वेषक तकनीक के प्रदर्शन के बारे में पता होना चाहिए उपस्थित हो सकता है। जब OT-द्वितीय मेजबानों में / लाल + सीडी 4+ टी CD62L + कोशिकाओं को इंजेक्शन, अन्वेषक पेरिटोनियल गुहा में सुई डालने के लिए बहुत ही सौम्य और सावधान रहना चाहिए। ऐसा करने में विफलता माउस जो मौत का कारण हो सकता है, या कोशिकाओं जो किसी भी रोग को उत्पन्न नहीं होगा की एक चमड़े के नीचे प्रशासन की आंत के फाड़ में हो सकता है।

आमतौर पर, चूहों सेल हस्तांतरण के बाद पहले सप्ताह के दौरान वजन मिलेगा। अन्वेषक प्रत्येक वजन समय बिंदु पर एक ही समय में चूहों का वजन और पूरी प्रक्रिया के दौरान एक ही वजन के संतुलन का उपयोग करना चाहिए। कभी कभी प्रयोगात्मक चूहों, खासकर जब प्रयोग की शुरुआत में अपने वजन के नीचे 18 ग्राम है, बर्बाद सिंड्रोम के कोई लक्षण विकसित नहीं है। हालांकि, इन जानवरों mighटी अभी भी स्थूल मूल्यांकन के अंतर्गत महत्वपूर्ण आंतों में सूजन का विकास।

जब आनुवंशिक रूप से संशोधित बैक्टीरिया के साथ काम कर रहा है, संदूषण हो सकता है। इन मुद्दों में यह अत्यधिक कोलाई फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग का विश्लेषण करने के लिए अगर बैक्टीरिया फ्लोरोसेंट कर रहे हैं और छड़ के आकार का (ठेठ कोलाई आकार) CFP-ओवीए व्यक्त की जांच की सिफारिश की है से बचने के लिए।

प्रस्तावित प्रतिजन संचालित-कोलाइटिस अवलोकन पर निर्भर करता है कि स्थिर अवस्था में और भड़काऊ शर्तों 36,37 दौरान CX 3 CR1 + सांसदों नमूना खानेवाला ल्यूमिनल बैक्टीरिया। प्रतिजन संचालित कोलाइटिस मॉडल में टी कोशिकाओं प्रतिक्रियाओं की प्रेरण CX 3 CR1 GFP के कॉलन से OT-द्वितीय सीडी 4+ टी कोशिकाओं की अत्यधिक सक्रिय phenotype के द्वारा प्रदर्शन किया गया है / + x चीर - / - प्रतिजन के साथ चुनौती दी चूहों, CX 3 CR1 GFP / + x चीर से अलग टी कोशिकाओं की तुलना में 37 के साथ चुनौती नहीं थे। / - - चूहों, कोलाइटिस केवल प्रेरित किया गया था जब मेजबान के साथ ओवीए व्यक्त चुनौती दी थी यह पिछले अध्ययनों में है, जो चीर में OT-द्वितीय टी कोशिकाओं के दत्तक हस्तांतरण के बाद के अनुरूप है कोलाई 51।

Confocal इमेजिंग पता चलता है कि CX 3 CR1 + फ़ैगोसाइट आंतों उपकला के करीब स्थित हैं, ताकि वे कर सकते हैं नमूना कोलाई pCFP-ओवीए और OT-द्वितीय / लाल + सीडी 4+ टी कोशिकाओं के साथ बातचीत। बाद CX 3 CR1 + फ़ैगोसाइट नमूना है कोलाई pCFP-ओवीए ल्यूमिनल प्रतिजन CX 3 CR1 + फ़ैगोसाइट द्वारा CD103 + वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी) को दिया है। CD103 + डीसी mesenteric लिम्फ नोड (मिलियन) प्रधानमंत्री सीडी 4 टी कोशिकाओं 37,52 करने की ओर पलायन कर रहे हैं। Primed टी कोशिकाओं CLP जहां CX 3 CR1 + फ़ैगोसाइट ओवीए प्रतिजन दिखाने ई में इकट्ठाffector टी कोशिकाओं में सूजन प्रेरित करने के लिए। CX से वितरण और प्रतिजन की प्रस्तुति 3 CR1 + फ़ैगोसाइट कोलाइटिस के विकास में एक महत्वपूर्ण घटना हो सकती है।

एक परिभाषित जीवाणु एक विशिष्ट प्रतिजन व्यक्त के साथ कोलाइटिस प्रेरित करने की क्षमता कोलाइटिस 24 के विकास के लिए आवश्यक शर्तों का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करता है। यह मॉडल से पता चलता है कि एक प्रतिजनी पेप्टाइड (ओवीए ई कोलाई द्वारा व्यक्त की) करने के लिए एक विशेष प्रतिक्रिया चीर में आंतों में सूजन के लिए प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है - / - होस्ट करता है, सुझाव है कि टी कोशिकाओं आंतों microflora से विशिष्ट प्रतिजन के लिए प्रतिक्रिया हो सकती है। एक एकल प्रतिजन पशु मॉडल में आंतों में सूजन पैदा कर सकते हैं, लेकिन यह नहीं माना जा सकता है कि एकल एंटीजन मानव आईबीडी का कारण रहे हैं। इसके अलावा, स्थानांतरण कोलाइटिस मॉडल में वहाँ अनुभवहीन सीडी 4+ टी कोशिकाओं अज्ञात विशिष्टता है और इसलिए, कई के लिए प्रतिक्रियाशील हो सकता है अभी तक अज्ञात एंटीजन के रूप में है कि, से कर रहे हैंमाइक्रोबायोटा। मेजर विश्लेषण और अध्ययन बेहतर श्लैष्मिक सूजन के रोगजनन में एक विशिष्ट प्रतिजन की भूमिका को स्पष्ट करने की जरूरत है।

हाल के वर्षों में कोलाइटिस के विभिन्न पशु मॉडल का उपयोग आईबीडी 53 के रोगजनन के ज्ञान का विस्तार करने के लिए प्रेरित किया है। हालांकि, जटिलता और रोग के रोगजनन के कारण, वहाँ एक निश्चित इलाज 54 है। वर्णित मॉडल का उपयोग करना, यह इस तरह के (i) monocytes और वृक्ष के समान कोशिकाओं के बीच बातचीत के रूप में अच्छी तरह से है कि अभी तक स्पष्ट नहीं कर रहे हैं आईबीडी के कई पहलुओं को संबोधित करने के लिए संभव है, (ii) मिलियन करने के लिए आंतों डीसी के प्रवास, (iii) प्रतिजन प्रस्तुति, (iv) CX 3 CR1 + फ़ैगोसाइट द्वारा लामिना propria और लामिना propria में (v) प्रेरक टी कोशिकाओं की सक्रियता को MLN से प्रेरक टी कोशिकाओं के घर वापस आना। हालांकि, आगे की पढ़ाई यदि CX 3 CR1 + भक्षककोशिकीय / सीडी 4+ टी सेल बातचीत में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है इस बात की पुष्टि करने की जरूरत हैआईबीडी रोगजनन। चूहे मनुष्य की सही मायने में प्रतिनिधि नहीं हो सकता है और यह ध्यान में रखा जाना चाहिए जब माउस मॉडल मानव आईबीडी 2 अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth, Miller (Luria-Bertani) Difco 244620
Rotary Shake Reiss Laborbedarf e. K. Model 3020 GFL
2 mm gap couvettes  Peqlab Biotechnologie GmbH 71-2020
Glycerol Sigma-Aldrich G5516-100ML
Gene Pulser Xcell system  BioRad Laboratories GmbH 1652660
LB Agar, Miller (Luria-Bertani) Difco 244510
Ampicillin Sigma-Aldrich A9393-5G
SOC Medium Sigma-Aldrich S1797-100ML
High Pure Plasmid Isolation Kit Roche 11754777001
Agarose Carl Roth GmbH & Co 3810.1
EDTA Sigma-Aldrich E9884-100G
Tris-HCl Sigma-Aldrich T5941
Glacial acetic acid Sigma-Aldrich 537020 
Gel chamber  PEQLAB Biotechnology GmbH 40-0708
Loading Dye Thermo Fisher R0611
GeneRuler 1 kb DNA Ladder  Thermo Fisher SM0312
Ethidium bromide solution Carl Roth GmbH & Co. KG 2218.3
Photo-documentation system  Decon Science Tech GmbH DeVision G 
DNA sequencing  MWG-Biotech GmbH
Phosphate buffered saline (PBS) Biochrom L182-50
Fluorescent microscope  Zeiss HBO 100
Mini-PROTEAN Tetra System Bio-Rad Laboratories GmbH 1658005
PageRuler Prestained Protein Ladder  Fermentas, St. Leon-Rot, Germany
IstanBlue Solution Expedeon, Cambridgeshire, United Kingdom
Nitrocellulose membrane  Macherey-Nagel GmbH & Co. KG 741280
Electro blotter  Biometra GmbH 846-015-600
Bovine Serum Albumins (BSA) Sigma-Aldrich A6003-25G
Anti-Ovalbumin antibody  Abcam ab181688
Anti-rabbit IgG  HRP Sigma-Aldrich A0545 
Pierce ECL Plus Western Blotting Substrate Pierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc 32132
Forene Abbott 2594.00.00
FBS Invitrogen 10500-064
Falcon Cell Strainers Fischer Scientific  08-771-2
Ammonium chloride Sigma-Aldrich 254134-5G
Tris Base Sigma-Aldrich 10708976001
CD4+ CD62 L+ T isolation kit  Miltenyi Biotec 130-093-227 
MACS LS Columns  Miltenyi Biotec 130-042-401
MACS MS Columns  Miltenyi Biotec 130-042-201
MidiMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-302
MiniMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-102
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
Feeding Needle 20G SouthPointe Surgical Supply, Inc FN-7903
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-Aldrich HT501128
Paraffin Sigma-Aldrich 1496904
Hematoxylin Sigma-Aldrich H9627
Eosin Y Sigma-Aldrich 230251 
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D9779 
Collagenase type VIII Sigma-Aldrich C-2139
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium AppliChem A2044, 9050
Sodium azide Sigma-Aldrich 438456
Mouse BD Fc Block BD Pharmingen 553141
FITC-conjugated mAb binding Vß 5.1, 5.2  BD Pharmingen 553189
APC-conjugated mAb binding CD4 GK1.5  eBioscience 17-0041-83
FACS Calibur  BD Biosciences
FCS Express V3 software DeNovo
Meta scanning confocal microscope  Zeiss LSM 710 
Zeiss Workstation Zeiss LSM 7
Zeiss ZEM software  Zeiss v4.2.0.121
Maxisorp immuno plates  NUNC, Roskilde 442404
Streptavidin conjugated alkaline phosphatase Jackson Immuno Research 016-050-084
Alkaline phosphatase substrate 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate Sigma-Aldrich 71768-5G
mAb R4-6A2 BD Biosciences 551216
mAb XMG1.2  BD Biosciences 554410
TECAN microplate-ELISA reader Tecan
EasyWin software Tecan
DNase I recombinant 4536282001

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References

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एक प्रतिजन संचालित कोलाइटिस मॉडल के विकास के एंटीजन टी कोशिकाओं को प्रकोष्ठों पेश करके प्रतिजनों की प्रस्तुति का अध्ययन करने के लिए
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Rossini, V., Radulovic, K., Riedel, C. U., Niess, J. H. Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells. J. Vis. Exp. (115), e54421, doi:10.3791/54421 (2016).More

Rossini, V., Radulovic, K., Riedel, C. U., Niess, J. H. Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells. J. Vis. Exp. (115), e54421, doi:10.3791/54421 (2016).

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