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Immunology and Infection

T細胞への抗原提示細胞による抗原の提示を研究するための抗原駆動性大腸炎モデルの開発

doi: 10.3791/54421 Published: September 18, 2016

Introduction

腸は、外部環境にさらされる体の最大の表面です。常駐微生物の広大な配列は、腸内細菌叢(または微生物叢)を形成するために、ヒトの腸にコロニーを形成します。これは、最大100000000000000微生物細胞からなると推定され、生物学1-3で知られている最も人口密度の高い細菌の生息地の1を構成しています。 GITでは細菌は、彼らが生き残ると4を掛け腸のニッチを植民地化。リターンでは、微生物は、そのゲノム1でエンコードされていない追加の機能的特徴を持つホストを付与します。例えば、微生物は、上皮細胞の増殖を刺激し、ホストは自分で作り出すことができないビタミンを生成し、代謝を調節し、病原体4-6から保護します。この有益な関係を考えると、いくつかの著者は、人間が「超生物」または細菌とヒト遺伝子7,8のミックスである「holobionts」であることを示唆しています。 (人間の)ホスト上の微生物叢の有益な影響を考えると、腸管免疫系はルーメンでその存在を可能にするだけでなく、腔側9-11から侵入する病原体を殺すために共生微生物を容認する必要があります。腸管免疫系は無害と潜在的に有害な管腔の微生物を区別するためのメカニズムを開発しました。しかし、これらのメカニズムはまだよく12を理解されていません。腸の整合性を維持することは寛容と免疫の13の間のバランスを保つために厳密に調節免疫恒常性を必要とします。免疫恒常性のアンバランスは、炎症性腸疾患(IBD)3,14などの腸疾患の誘導に寄与する。

クローン病(CD)および潰瘍性大腸炎(UC):IBDの2つの主要なタイプがあります。これらの疾患を有する患者は、通常、直腸出血、重度の下痢や腹痛15,16苦しみます。 IBDの一つの原因はまだです不明ですが、遺伝的要因の組み合わせ、環境の影響および調節不全免疫応答が疾患の発症15のための重要な事象であるかもしれません。

IBDの動物モデルは、50年以上にわたって使用されてきました。過去数十年間、新しいIBDモデル系は、IBD 17,18の病因に関するさまざまな仮説をテストするために開発されてきました。慢性大腸炎の最もよく特徴付けられたモデルは、T細胞ホメオスタシス19,20の破壊を誘導し、T細胞移入モデルです。 16,21このモデルは、( - / -およびSCIDマウスのようなRAGなど)TおよびB細胞を欠いている宿主に免疫したマウスからのナイーブT細胞を転送することを含みます。このモデルにおける疾患の発症は、下痢の存在を評価することによって、3-10週間モニター身体活動の減少、及び体重減少です。これには、消耗症候群16と呼ばれいます。健康なマウスと比較して移植したホストの大腸組織は、シックですR、16短いと重いです。 T細胞移入モデルを使用して、T細胞集団は、IBD 22の病因に寄与することができる方法の異なる理解することが可能です。 T細胞移入モデルでは、抗原特異的様式で疾患プロセスにおけるAPCおよびT細胞の間の相互作用を分析しません。骨髄細胞およびリンパ系細胞間の相互作用は、腸の炎症23の発症の原因であることが示されています。 IBDの多くの側面が明らかにされてきたが、病気の開発につながる初期のイベントは、まだ明確に理解する必要があります。

微生物転写大腸炎の非存在下で24を確立できないことが示されています。最近、いくつかの説は、IBDは、共生細菌25に対する免疫応答の結果であることを示唆しています。著者らは、共生細菌は、遠位腸内の炎症を誘導するのに不可欠であることも提案しています26。生殖無料(GF)動物では腸管免疫系は、一般的に27,28を低下しているが、完全に有能な腸管免疫系29の開発における特定の病原体を含まない細菌の結果の混合物とこれらのマウスの植民地化。したがって、微生物叢は、いずれかの素因または腸の炎症30,31の開発から保護するメカニズムとして、IBDの病因における重要な要素であると思われます。現在の理論は、遺伝的素因の患者32に、IBDは、腸内毒素症と呼ばれる、微生物の不均衡の結果であることを示唆しているが、それは明らかではないが、まだ腸内毒素症は、原因や病気12の結果である場合。 IBDの発症における微生物の役割を考慮すると、 インビトロ実験において CD4 + T細胞は、腸内細菌33,34でパルスしたAPCにより活性化することができることを示しました。

また、より抗原ことが示されています例えば、Eなど、さまざまな共生細菌種、 大腸菌、バクテロイデス、ユーバクテリウムおよびプロテウスは 、CD4 + T細胞35を活性化することができます。これは、T細胞への細菌抗原の提示は、IBDの開発のために重要であることを示しています。疾患過程における微生物叢によって誘導される複数の抗原の複雑さを軽減するために、 大腸菌株は、OVA抗原を産生するように作成されています。転写性大腸炎は、RAGにOVA特異的T細胞を注射することによって誘導した- / - OVAを発現する大腸菌を保菌動物大腸菌

このモデルは、CX 3 CR1 +議員、結腸粘膜固有層(CLP)36の主要な細胞サブセットは、転送37を大腸炎の間にCD4 + T細胞と相互作用していることを示唆している最近の証拠に基づいています。国会議員は、その樹状突起36、38,39を使用して、細菌のような、粒子状抗原のための腸管腔をサンプリング。以前の研究国会議員はまた、腸管腔40,41に導入され、このようなOVAなどの可溶性抗原を、取ることができることを実証しました。 CLPにおけるCX 3 CR1 + MPの存在量を考えると、これらの細胞が管腔細菌をサンプリングし、CD4 T細胞と相互作用することが可能です。 E.が定着OVA特異的CD4 + T細胞を移植したマウスの共焦点イメージングコリ CFP-OVAは、CX 3 CR1 + MPSは抗原駆動型大腸炎の開発中OT-II CD4 + T細胞と接触していることを示しています。このモデルは、腸のAPCおよび唯一の腸管内腔における特定の抗原を発現する細菌に特異的なT細胞間の抗原提示プロセスの研究を可能にします。

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Protocol

マウスは、ウルム大学(ウルム、ドイツ)の動物施設において、特定病原体フリー(SPF)条件下で飼育し、維持しました。全ての動物実験は、地元の動物の使用およびケア委員会と国立動物福祉法のガイドラインに従って行いました。

pCFP-OVAプラスミドの1建設

  1. テンプレートとして42プラスミドPCI-OVA(アンピシリン耐性)を使用して、プライマーOva_SpeI_fw(3'-GACCAACTAGTATGGAATTTTGTTTTGATGTATT-5 ')とOva_ClaI_rev(3'- GACCAGATCGATTAAGGGGAAACACATCTGCC-5')37を使用して、フルサイズのOVA遺伝子を増幅します。特定OVAプラスミドを生成するためにプライマー及びベクターのSpeIとClaI制限部位を使用して、市販のファージミッドベクターにPCR産物( すなわち OVAコード配列)をクローニングします。
  2. プラスミドパッド1を使用して、強力な構成的プロモーターP ハイパーとともにCFPをコードする遺伝子を増幅)43とCFP_SpeI_rev(3'-GATCGAACTAGTACCACCACCACCACCACCTTTGTAGAGTTCATCCATGC-5')37。
  3. プライマーとベクトル37のSpeIおよびSacI制限部位を使用して、特定のOVA-プラスミド(アンピシリン耐性)にCFPをコードする遺伝子をクローニングします。これは、OVA-コード配列からCFP-コーディングの間に6グリシン残基のスペーサーを導入しています。

大腸菌 pCFP-OVAの2建設

  1. 一晩ロータリーシェーカー上で37℃で好気的にルリア・ベルターニ(LB)培地100mlに大腸菌株DH10Bを成長させます。
  2. -80℃でグリセロールストックとストアを作成するために、グリセロール、200μlの細菌培養物の800μLを混ぜます。
  3. LB培地5ml中のグリセロールストックから大腸菌株DH10B50μlのを追加し、ロータリーシェーカーのオベに37℃で好気的にそれらを育てますrnight。
  4. 回転式振盪で37℃でLB培地250 mlのバッフル付き1Lの三角フラスコに培養物を移します。
  5. 600nmでの光学密度に細菌の成長(OD 600)を 0.5の後、30分間氷上で文化を冷やします。 4℃で10分間、5000×gで細菌を遠心。
  6. 氷冷10%グリセロールおよび遠心分離細菌の100mlで4℃で再懸濁菌で10分間、5000×gで氷冷滅菌H 2 Oおよび遠心細菌の100mlで再懸濁菌10分間5000×gで4℃で。二回この最後のステップを繰り返します。
  7. 最後の洗浄工程の後、10%グリセロール700μlの細菌を再懸濁します。 -80℃で液体窒素とストア内の50μlのアリコートを凍結します。
  8. 氷上で50μlのアリコートを解凍し、予め冷却エレクトロポレーションキュベット(2mmの電極間距離)に移します。
  9. 50μlのE.へのプラスミドDNA(100 ngの)の5μLを追加大腸菌 aliquoTS。 25μF、200オーム(Ω)および2.5 kVでの単一パルスでエレクトロポレーションを実行します。
  10. 1ml中に再懸濁細菌予め温めたSOC培地(5 G / Lの酵母抽出物、2つのG / Lトリプトン、10mMの塩化ナトリウム、2.5mMの塩化カリウム、10mM塩化マグネシウム、10mMの硫酸マグネシウム)し、37℃でインキュベート好気的に1時間。
  11. プレートアンピシリンを100μg/ mlのを補充したLB寒天プレート上の細菌(LB寒天の100ミリリットルに100 mg / mlでアンピシリン株式の100μlを添加)、37℃で一晩好気的に培養します。
  12. アンピシリン100μg/ mlのを補充したLB寒天プレートでの単一コロニーと再ストリークそれらを選択してください。 37℃で好気的に一晩インキュベートします。
  13. 単一コロニーを選択し、プラスミド単離のためのアンピシリンを100μg/ mlを補充したLB培地10mlに一晩、それらを成長させます。 「市販のプラスミドミニプレップキットを使用し、30μlののdH 2 O(蒸留水)でプラスミドDNAを溶出メーカーによると; sのプロトコル。制限分析及びDNA配列決定37,42,43によってプラスミドを確認します。
  14. E.の陽性クローンの文化を設定します100mlのLB培地で大腸菌 pCFP-OVAは、アンピシリン100μg/ mlのを補充しました。ロータリーシェーカーで一晩に37℃で好気的に成長します。
  15. -80℃で純粋なグリセロールおよび店舗の200μlで細菌培養物の800μLを混ぜます。
  16. 室温(RT)で10分間5,000×gで一晩培養の残りを遠心分離し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中でペレットを再懸濁します。スライドガラス上に懸濁液10μlを置き、カバースリップでそれをカバーしています。
  17. CFP-OVAの発現蛍光(450 nmでのCFP励起、480nmにおける発光)を確認するために、標準的な蛍光顕微鏡でサンプルを観察します。倍率400倍で始まる細菌を分析します。
  18. 遠心分離機10分間5,000×gで、室温で一晩培養からの細菌の1ミリリットル。 40μlの中にペレットを再懸濁PBSと10分間95℃で沸騰します。
  19. 10分間30,000×gでサンプルを遠心分離し、ウェスタンブロット分析37のために上清を使用します。 400:1に希釈したウサギ起こし抗OVAポリクローナル抗体を使用してください。

OT-IIの3世代/レッドマウス

  1. OT-II /レッドマウス37を生成するために、赤色蛍光タンパク質を発現するメス/オスのマウスでオス/メスOT-IIマウス(両株市販)を渡ります。

4.脾臓細胞の単離

  1. 市販されている(誘導のために5%まで)任意のハロゲン化エーテルの吸入による麻酔後に頚椎脱臼によりOT-II /レッドマウスを安楽死させます。
  2. マウスの左優れた腹部をカットするはさみを使用してください。この腹部の下脾臓(暗赤色の色の楕円形)があります。それを削除するには、ハサミやピンセットを使用してください。
    1. OT-II /レッドマウスの脾臓を抽出し、100を介して渡します単一細胞懸濁液を得るために、1mlシリンジのプランジャーを用いて、50mlチューブに位置決めミクロンの細胞ストレーナー。 PBS 10mlで二回ストレーナーを洗浄し、1%熱不活性化ウシ胎児血清(FBS)を補充しました。
  3. 室温で5分間、390×gで細胞懸濁液を遠心。赤血球を溶解するために予め温めた溶解緩衝液(144 mMのNH 4 Cl 、17 mMトリス、pH値= 7.2)5mlでペレットを再懸濁。 37℃で10分間インキュベートします。
  4. PBS 25mlでサンプルを洗浄し、1%FBSを補充しました。室温で5分間、390×gで遠心分離します。 10mlのPBS、1%FBSを補充した中でペレットを再懸濁します。
  5. ノイバウアー計数チャンバーを用いて細胞数を計測します。 0.4%トリパンブルー溶液10μlを用いて細胞懸濁液10μlを混ぜます。 1-2分間インキュベートします。
    1. 染色した細胞の10μlの血球計数器室を埋めます。 1室とdeterminの2乗4 1×1ミリメートルで、顕微鏡下で細胞を数えます平方あたりの細胞の平均数を電子。生存細胞は白、死細胞が青く表示されます表示されます。細胞の数を決定するために/希釈倍に細胞数を掛けmLです。 2-4象限がカウントされている場合は、象限の数で割ます。

前記CD4 + CD62 L + T細胞濃縮

  1. 負または正の選択の原理を用いた磁気分離キットを介してCD4 + CD62L + T細胞を脾臓細胞を豊か。ここでは、CD4 + T細胞を分離し、さらにCD4 + T細胞プール内のCD62L +集団を濃縮するための正の選択を使用するネガティブ選択を使用しています。
    注:ネガティブ選択手順は、(ここでは全CD4陰性細胞)を単離せずする細胞は、磁気ビーズに結合された特異的抗体で標識されます。カラムの洗浄工程の間、彼らはEASIできるように、CD4 + T細胞は、カラムを通過しますlyが収集しました。正の選択手順細胞では、磁性マイクロビーズに結合された適切な抗体で標識された単離することができました。カラムの洗浄​​工程の間に標識された細胞は、カラムに滞在し、それらは、磁界からカラムを除去し、緩衝液を用いて洗浄することによって回収することができます。
  2. 負の選択手順については、0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)を補充した冷PBS40μlの10 7総脾臓細胞を再懸濁します。 (非CD4 + T細胞を特異的結合する抗体)10磁気分離キットに付属のビオチン標識抗体カクテルのμlを添加して、氷上で15分間インキュベートします。
    1. 冷PBSの30μlを添加し、0.5%BSAおよび抗ビオチンマイクロビーズを20μlを加えたもの。氷上で20分間インキュベート。
    2. 10mlのPBSを5分間390×gで0.5%BSAおよび遠心機を補充したサンプルに追加します。二回、この手順を繰り返します。 0.5%BSを補った冷PBS 1 mlに細胞を再懸濁A.
    3. 磁場中での負の選択手順のための特定の列を配置し、冷PBSの3ミリリットルで洗い流しカラムに0.5%BSAを添加。カラムに細胞懸濁液を添加し、冷PBS 3mlで3回洗浄し、0.5%BSAを補充しました。
    4. 5分間、390×gで流出物の遠心分離細胞。カラムを通過した流出物は、非標識CD4 + T細胞が含まれています。 0.5%BSAを補充した1mlのPBSでペレットを再懸濁し、細胞をカウントします。
    5. ノイバウアー計数チャンバーを用いて細胞数を計測します。 0.4%トリパンブルー溶液10μlを用いて細胞懸濁液10μlを混ぜます。 1-2分間インキュベートします。
      1. 染色した細胞の10μlの血球計数器室を埋めます。 4 1×1ミリメートルで1室の2乗を顕微鏡下で細胞をカウントし、平方あたりの細胞の平均数を決定します。生存細胞は白、死細胞が青く表示されます表示されます。細胞/ mL乗算セルの数を決定するために、希釈倍リットル番号。 2-4象限がカウントされている場合は、象限の数で割ます。
  3. 正の選択手順については、10 7プリ富むCD4 + T細胞画分あたりのCD62Lマイクロビーズの10μlを添加します。氷上で15分間インキュベートします。
    1. 10mlのPBSを5分間390×gで0.5%BSAおよび遠心機を補充したサンプルに追加します。二回、この手順を繰り返します。冷PBS500μlの中に再懸濁し、0.5%のBSAを補充しました。
    2. 磁場中で負の選択手順のための特定の列を置き、カラムに0.5%BSAを補充した冷PBSを500μlですすいでください。カラムに細胞懸濁液を追加し、冷PBSを500μlで3回洗浄、0.5%BSAを添加。
    3. 磁場から列を削除し、適切な収集チューブの上に置きます。カラムに0.5%BSAを補充した1mlのPBSを加え、CD4 + CD62L + T細胞を洗い流しますsがしっかりと列にプランジャーを押すことによってカラムに保持しました。
      注:分離されたCD4 + CD62L + T細胞は、現在、in vivo実験などの下流のアプリケーションのための準備ができています。 CD4 + CD62L + T細胞単離キットの製造業者の指示に従って、マイクロビーズは毒性ではありません。小さいサイズ(50nm程度)のため、彼らは細胞を活性化しないと、彼らは、細胞表面エピトープを飽和しません。したがって、単離された細胞は、大腸炎37,44,45を誘導するために免疫不全マウスに導入することができます。
    4. ノイバウアー計数チャンバーを用いて細胞数を計測します。 0.4%トリパンブルー溶液10μlを用いて細胞懸濁液10μlを混ぜます。 1-2分間インキュベートします。
      1. 染色した細胞の10μlの血球計数器室を埋めます。 4 1×1ミリメートルで1室の2乗を顕微鏡下で細胞をカウントし、平方あたりの細胞の平均数を決定します。生存細胞のappea白、死細胞が青く見えるrを。細胞の数を決定するために/希釈倍に細胞数を掛けmLです。 2場合 - 4象限がカウントされている、象限の数で割ます。

抗原駆動性大腸炎の6誘導

  1. - / -マウスCX 3 CR1 GFP / + X RAGの腹腔内に3×10 5 OT-II /レッドCD4 + CD62L + T細胞を注入します。抗原特異的な大腸炎の誘導のために、Eを投与します大腸菌 pCFP-OVA切歯の背後に強制飼養または経口点滴注入によって動物あたり100μlのPBS中1×10 8コロニー形成単位(CFU)の用量で、一日おきに。
  2. 移植されたマウスとその臨床状態(便中の血液の存在、便の硬さとマウスの活動)の体重を毎週二回監視します。

病理組織学的検査のための7組織サンプル

  1. 目から組織サンプルを取りますマウスの電子大腸、中性緩衝ホルマリン(10%)に修正し、以前に36,46を説明したようにパラフィンに埋め込 ​​むことができます。
  2. セクションミクロトーム上のパラフィンサンプル、スライド上にマウントし、H&E染色47,48を行います。
  3. 以前47,48公開されている大腸の組織像を分類:ノーマル(スコア0);穏やかな大腸炎(スコア1)、中等度の大腸炎(スコア2)および重度の大腸炎(スコア3)。

結腸固有層細胞の8の単離

  1. 市販されている(誘導のために5%まで)任意のハロゲン化エーテルの吸入による麻酔後に頚椎脱臼により移植したマウスを安楽死させます。
  2. 腹を上に向けて動物を下に置きます。尿道口に前方の皮膚をつかむためにピンセットを使用します。胸に脚の付け根から腹側正中線に沿って皮膚をカットするはさみを使用してください。裏側の皮膚を引きます。
  3. 透明腹膜筋肉壁を通してカットし、体腔を開きます。盲腸49に肛門から行くコロンを特定します。 2四肢を切断して、任意の脂肪から組織を解放します。
  4. 解剖ハサミを使用して縦方向にコロンを開きます。 PBSの25ミリリットルを含むペトリ皿に破片や粘液を除去するために、1%FBSを補充した結腸組織を振るためにピンセットを使用してください。 8ミリメートル片 - 5にコロンをカット。
  5. 洗浄緩衝液の20ミリリットルを含む50 mlチューブに大腸セグメントを配置します。洗浄緩衝液は、500ミリリットルのDPBS、10mMのHEPESおよび5mMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)が含まれています。
  6. 最大速度で30秒間チューブをボルテックス。
  7. 200rpmで10分間振とうしながら37℃の水浴中で結腸セグメントを有するチューブをインキュベートします。
  8. インキュベーション後、最大速度で30秒間チューブをボルテックス。
  9. 上清を捨て、洗浄緩衝液の20ミリリットルを含む新しい50ミリリットルチューブに組織サンプルを配置します。繰り返しは6-9 3回ステップ
  10. 秒を破棄upernatantsとPBSの25ミリリットルを含むペトリ皿に組織サンプルを配置します。残留上皮細胞を除去するために、穏やかに数秒間ペトリ皿で​​組織サンプルを振るためにピンセットを使用してください。この手順を3回繰り返します。
  11. 2×2ミリメートル2個に結腸組織をカットし、ロズウェルパーク記念研究所(RPMI)クロストリジウムヒストリチカムからの0.5mg / mlのコラゲナーゼタイプVIIIおよびDNアーゼIの10 U / mlの培地10ml中でインキュベートすることにより、それらを消化。
  12. 最大速度で30秒間チューブをボルテックス。
  13. 200rpmで35分間振盪しながら37℃の水浴中で大腸の断片をインキュベートし、最大速度で30秒ごとに5分間チューブをボルテックス。
  14. インキュベーションの終了時に最大速度で30秒間チューブをボルテックス。
  15. 新しい50ミリリットルチューブ上に配置さ70μmのセルストレーナーに通して消化された断片を収集します。
  16. 5分間400グラムでDPBSと遠心分離機の20ミリリットルを追加することにより、サンプルを洗ってください。その後、再懸濁トンDPBSの1ミリリットルで彼の細胞。
  17. ノイバウアー計数チャンバーを用いて細胞数を計測します。 0.4%トリパンブルー溶液10μlを用いて細胞懸濁液10μlを混ぜます。 1-2分間インキュベートします。
    1. 染色した細胞の10μlの血球計数器室を埋めます。 4 1×1ミリメートルで1室の2乗を顕微鏡下で細胞をカウントし、平方あたりの細胞の平均数を決定します。生存細胞は白、死細胞が青く表示されます表示されます。細胞の数を決定するために/希釈倍に細胞数を掛けmLです。 2-4象限がカウントされている場合は、象限の数で割ます。

FCM分析のための9.外染色

  1. 遠心分離機390×gでCLP細胞を5分。 FACS A 1mlに細胞を再懸濁(PBS、1%BSAおよび0.1%アジ化ナトリウムを補充しました)
    注:アジ化ナトリウムは、非常に有毒です。これは、低血圧、低体温、頭痛の痙攣や死を引き起こす可能性があります。 0(アジ化ナトリウムの希釈溶液1.0%へ0.1)は、通常、ユーザーに特別な危険性を提示していないが、彼らは目や皮膚刺激物です。実験室のコートと使い捨てニトリル手袋の二重のペアを身に着けている間そのため、唯一の化学フードにアジ化ナトリウムを使用します。
  2. FACS Aに希釈のFcγRIII/ II CD16 / CD32に対するモノクローナル抗体(mAb)2.4G2(0.5〜1μgのモノクローナル抗体/ 10 6細胞)を用いて室温で15分間、細胞をインキュベート
  3. 390×gで細胞と遠心5分にFACS Aの200μLを加えます。二回、この手順を繰り返します。 4℃で20分間関連mAbの0.5 ngの/ 10 6細胞で細胞をインキュベートします。 FACS Aに抗体を希釈
  4. 390×gで細胞と遠心5分にFACS Aの200μLを加えます。二回、この手順を繰り返します。 FACS Aの100μlのサンプルを再懸濁し
  5. - / - 37フローサイトメーターでOT-II /レッドCD4 T細胞で再構成したマウスCX 3 CR1 GFP / + X RAGからT細胞を分析します。

10.共焦点顕微鏡分析

  1. OT-II /レッドCD4 + CD62L + T細胞で再構成したりしませCX 3 CR1 GFP / +マウスの結腸を分析し、Eの1×10 8 CFUで一日おきに経口供給大腸菌株DH10B pCFP-OVA。
  2. ハサミやピンセットを用いて、マウスからコロンを削除します。解剖ハサミを使用して縦方向にそれを開きます。
  3. はさみを使用して、結腸サンプル5-8ミリの部分をカットし、ガラススライド上に置き、カバースリップでカバーしています。
  4. 40 / 1.30倍の倍率で共焦点顕微鏡による大腸サンプルを分析します。
  5. 509 nmで488 nmでの励起および発光を有するフィルタセットを使用して、緑色蛍光タンパク質(GFP)で標識したCX 3 CR1 + MPを検出します。
  6. 58で554 nmでの励起および発光を有するフィルタセットを使用して、赤色タンパク質を発現するCD4 + T細胞を検出します6ナノメートル。
  7. 480 nmで450 nmでの励起および発光に設定されたフィルタを使用して大腸菌 pCFP-OVAを検出します。
  8. 関心領域を定義し、以前の共局在の分析を実行するために50に説明したように散布図を生成します。 Mandersとピアソンの係数に応じてオーバーラップ係数:2つの異なる式を使用してください。

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Representative Results

抗原駆動型大腸炎モデルEを確立するために、 大腸菌 CFPの遺伝子は、ニワトリオボアルブミンタンパク質のコード配列に融合され、融合構築物は、強力な構成的プロモーターP ハイパー図1A)の制御下で発現されるプラスミドを含むように構成されています。蛍光顕微鏡は、組換えE.ことを示しています大腸菌 pCFP-OVAではなく、親のE.大腸菌 DH10Bは、CFP( 図1B)を発現しますE.を生産する CFP-OVA- 大腸菌 インビトロで OT-II細胞を活性化し、 大腸菌とは対照的に、IFN-γ産生を誘導することができますCFPを発現している大腸菌株のみ( 図2)。 図3(a)は、Eが供給CX 3 CR1 GFP / +マウスの大腸組織のex vivoでの3D共焦点イメージングを示しています大腸菌 pCFP-OVA。E.大腸菌 pCFP-OVAすることができます近くに腸上皮細胞に位置する結腸陰窩内で検出され、CX 3 CR1 +食細胞との共局在します。 Eの相対的な割合を決定するために、定義されたCX 3 CR1 +食細胞によって内在大腸菌 pCFP-OVAは、青と緑の蛍光強度を散布ブロットによって決定しました。分析は、CX 3 CR1 +細胞が大腸菌の11.9±1.5%をサンプリングしたことを明らかにしました大腸菌 pCFP-OVAは、コロン( 図3B)で検出された。OT-II /レッド動物では、CD4 + T細胞は赤の発現およびフローサイトメトリー( 図4)で示されるVβ5.1発現を特徴としている。 図5(a)は、の一般的な概要を示しています抗原駆動大腸炎モデル。 OT-II /レッド+ CD4 + T CD62L +細胞は養子CX 3 CR1 GFP / + X RAGに移した- / -その後、Eで一日おきに強制経口投与された受信者大腸菌pCFP-OVA。 E.でチャレンジした場合大腸菌 pCFP-OVAは、CX 3を転送CR1 GFP / + X RAG - / -マウスは体重を失い、大腸炎( 図5B)の臨床徴候を開発6番組ex vivoでの 3D結腸組織7、14および21日後の共焦点画像を 。ヘテロ接合CXの再構成3 CR1 GFP / + X RAG - / - OT-II /レッドと受信者+ Eで挑戦した細胞大腸菌 pCFP-OVA。七日細胞移入後わずか数CX 3 CR1 +食細胞はE.サンプリングしています大腸菌 pCFP-OVAおよびOT-II /レッド+細胞は検出されませんでした。細胞移入後の14日、EをサンプリングCX 3 CR1 +食細胞大腸菌 pCFP-OVAは、OT-II /レッド+細胞の近くに位置していました。 E.をサンプリングしているCX 3 CR1 +細胞の21日細胞移入後に高い数大腸菌 pCFP-OVAおよびOT-II / RCX 3 CR1 +食細胞に近接してCLP全体に分散ED +細胞、。

図1
図1:CFP-OVA産生 E.関連する制限部位を有するpCFP-OVAの大腸菌 。(A)地図、OVAと明るい青色蛍光タンパク質CFPをコードする遺伝子。 (B)明視野および野生型Eの蛍光顕微鏡像大腸菌 DH10B、E.大腸菌 DH10B pCFPとE.大腸菌 DH10B pCFP-OVA。スケールバー:10μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
2:OTCFP-OVAで刺激-II細胞は、IFN-γを生成します。脾臓から単離した後、OT-II細胞は、Eの表示された数字で刺激しました大腸菌 DH10B pCFP-OVA。細菌細胞を、5μg/ mlのゲンタマイシンで2時間のインキュベーション後の不活化しました。培養の72時間後、上清を回収し、IFN-γの濃度をELISAによって決定しました。実験は、平均±SEMとして提示三連とデータで行った。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
3:CX 3 CR1 + 食細胞サンプル E.大腸菌 pCFP-OVA。(A)CX 3 CR1のCLP組織GFP / +マウスは、1×10 8 E.で強制飼養します大腸菌 pCFP-OVA 7日間およびex vivo共焦点顕微鏡により分析しました。倍率40X / 1.30。 =30μmのスケールバー。 (B)に内在大腸菌の割合大腸菌 pCFP-OVAを定量化したデータは、平均±SEMとして提示しました。マン・ホイットニー検定pで<0.05を統計学的に有意であると考えられた。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
4:OT-II /レッド+ CD4 + T細胞 の特性 (A)OT-IIトランスジェニック動物OT-IIを得るために、赤色蛍光タンパク質を発現する動物と交配させた/レッド+細胞。 OT-II /レッド+細胞はOT-II /レッドの脾臓から単離しました トランスジェニック動物は、CD4とVß5.1のために染色し、フローサイトメトリーによって分析した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5
図5:OVAドリブン転送大腸炎 (A)抗原駆動大腸炎モデルの模式図 OT-II /レッド+ CD4 + T CD62L +細胞は、養子CX 3 CR1 GFP / + X RAGに移した- / -マウスとホストはEで一日おきに強制経口投与しました。 大腸菌 pCFP-OVA。示されたグループの(B)体重を週2回測定しました。 ±SEM体重減少(%)を意味することは示されています。マンホイットニー検定においてP <0.05を統計学的に有意であると考えられた。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図6
6:CX 3 CR1 + 議員はOVA駆動の転送大腸炎中にOT-II細胞との通信 (A)結腸組織サンプルは、OT-II /レッドの転送後7日目、14と21でex vivoでの 3D共焦点イメージングにより調べました+ CD4 + T CD62L + CX 3 CR1 GFP / + X RAGでの細胞- / -レシピエント。倍率40X / 1.30。 =30μmのスケールバー。

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Discussion

他のすべてのモデルと同様に、上記の抗原駆動型大腸炎モデルは、技術を実行研究者が知っておく必要がありますいくつかの問題を提示することができます。 OT-IIホストで/レッド+ CD4 + T CD62L +細胞を注入すると、研究者は腹腔内に注射針を挿入することは非常に穏やかで注意しなければなりません。これを怠ると、死亡につながる可能性がマウスの腸、または任意の病気を誘発しない細胞の皮下投与が裂ける可能性があります。

一般的に、マウスは、細胞移入後の最初の週の間に体重が増加します。研究者は、各重みの時点で同時にマウスを計量し、手順全体を通して同じ計量バランスを使用する必要があります。時には、実験マウスは、実験の開始時に、その重量は18グラムは、以下の場合は特に、消耗症候群の兆候を発症しません。しかしながら、これらの動物はmightはまだ巨視的評価の下で重要な腸の炎症を開発しています。

遺伝的に改変された細菌で作業する場合、汚染が発生する可能性があります。これらの問題を回避するために、非常に大腸菌は菌が蛍光であり、ロッド状(典型的な大腸菌形状)である場合に分析するために、蛍光顕微鏡を使用してCFP-OVAを発現してチェックすることをお勧めします。

提案された抗原駆動-大腸炎は、定常状態にし、炎症状態36,37の間、CX 3 CR1 +議員サンプル共生管腔の細菌という観察に依存しています。抗原駆動型大腸炎モデルにおけるT細胞応答の誘導は、CX 3 CR1 GFPの結腸からOT-II CD4 + T細胞の高度に活性化された表現型によって実証されている/ + X RAG - / -抗原でチャレンジしたマウス、 CX 3 CR1 GFP / + X RAGから単離されたT細胞と比較し37でチャレンジしなかったマウス。ホストは、OVA発現するE.でチャレンジしたとき、マウス、大腸炎のみを誘発した- / -これは、RAGにおけるOT-II T細胞の養子移入した後、ここで以前の研究と一致しています大腸菌 51。

共焦点イメージングは、彼らがEをサンプリングできるように、CX 3 CR1 +食細胞が腸管上皮の近くに位置していることを示唆しています大腸菌 pCFP-OVA およびOT-II /レッド + CD4 + T細胞と相互作用 。 CX 3 CR1 +食細胞は、Eをサンプリングした後大腸菌 pCFP-OVA管腔抗原は、CX 3 CR1 +食細胞によってCD103 +樹状細胞(DC)に配信されます。 CD103 + DCは、プライムCD4 T細胞37,52に腸間膜リンパ節(MLN)に移行することができます。プライミングされたT細胞は、CX 3 CR1 +食細胞が電子するOVA抗原を示すCLPに組み立てますffector T細胞は、炎症を誘導します。 CX 3 CR1 +食細胞による抗原の送達およびプレゼンテーションは、大腸炎の開発における重要な事象である可能性があります。

特定の抗原を発現して定義された細菌を用いて大腸炎を誘導する能力は、大腸炎24の開発に必要な条件を研究する機会を提供します。 T細胞は、腸内細菌叢の特定の抗原に反応し得ることを示唆し、ホスト- / -このモデルは、抗原性ペプチド( 大腸菌により発現OVA)に特異的な応答は、RAGに腸の炎症を誘発するのに十分であることを示しています。単一の抗原は、動物モデルにおいて腸の炎症を誘発することができるが、単一の抗原が、ヒトIBDの原因であると仮定することはできません。また、転送大腸炎モデルにおける未知の特異性を有し、したがって、複数の反応性であってもよいナイーブCD4 + T細胞から、まだ同定されていない抗原のように、あります微生物。主要な分析および研究が良い粘膜炎症の病因における特定の抗原の役割を明らかにするために必要とされます。

近年では大腸炎の異なる動物モデルの使用は、IBD 53の病因の知識の拡大につながっています。しかし、複雑さと疾患の病因に起因し、決定的な治療法54はありません。説明したモデルを用いて、そのような単球及び樹状細胞との間の(I)の相互作用だけでなく、まだ明らかにされていないIBDのいくつかの側面に対処することが可能である、MLNに腸のDCの(ii)の遊走、(III)抗原提示、 CX 3 CR1 +食細胞によって粘膜固有層における固有層およびエフェクターT細胞の(v)の活性化にMLNからエフェクターT細胞の(iv)のホーミング。しかしながら、さらなる研究は、CX 3 CR1 +食細胞/ CD4 + T細胞の相互作用が重要な役割を果たしているかどうかを確認するために必要とされますIBDの病因。マウスは人間の真の代表にすることはできず、マウスモデルは、ヒトIBD 2研究するために使用されている場合、これは念頭に置いておく必要があります。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth, Miller (Luria-Bertani) Difco 244620
Rotary Shake Reiss Laborbedarf e. K. Model 3020 GFL
2 mm gap couvettes  Peqlab Biotechnologie GmbH 71-2020
Glycerol Sigma-Aldrich G5516-100ML
Gene Pulser Xcell system  BioRad Laboratories GmbH 1652660
LB Agar, Miller (Luria-Bertani) Difco 244510
Ampicillin Sigma-Aldrich A9393-5G
SOC Medium Sigma-Aldrich S1797-100ML
High Pure Plasmid Isolation Kit Roche 11754777001
Agarose Carl Roth GmbH & Co 3810.1
EDTA Sigma-Aldrich E9884-100G
Tris-HCl Sigma-Aldrich T5941
Glacial acetic acid Sigma-Aldrich 537020 
Gel chamber  PEQLAB Biotechnology GmbH 40-0708
Loading Dye Thermo Fisher R0611
GeneRuler 1 kb DNA Ladder  Thermo Fisher SM0312
Ethidium bromide solution Carl Roth GmbH & Co. KG 2218.3
Photo-documentation system  Decon Science Tech GmbH DeVision G 
DNA sequencing  MWG-Biotech GmbH
Phosphate buffered saline (PBS) Biochrom L182-50
Fluorescent microscope  Zeiss HBO 100
Mini-PROTEAN Tetra System Bio-Rad Laboratories GmbH 1658005
PageRuler Prestained Protein Ladder  Fermentas, St. Leon-Rot, Germany
IstanBlue Solution Expedeon, Cambridgeshire, United Kingdom
Nitrocellulose membrane  Macherey-Nagel GmbH & Co. KG 741280
Electro blotter  Biometra GmbH 846-015-600
Bovine Serum Albumins (BSA) Sigma-Aldrich A6003-25G
Anti-Ovalbumin antibody  Abcam ab181688
Anti-rabbit IgG  HRP Sigma-Aldrich A0545 
Pierce ECL Plus Western Blotting Substrate Pierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc 32132
Forene Abbott 2594.00.00
FBS Invitrogen 10500-064
Falcon Cell Strainers Fischer Scientific  08-771-2
Ammonium chloride Sigma-Aldrich 254134-5G
Tris Base Sigma-Aldrich 10708976001
CD4+ CD62 L+ T isolation kit  Miltenyi Biotec 130-093-227 
MACS LS Columns  Miltenyi Biotec 130-042-401
MACS MS Columns  Miltenyi Biotec 130-042-201
MidiMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-302
MiniMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-102
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
Feeding Needle 20G SouthPointe Surgical Supply, Inc FN-7903
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-Aldrich HT501128
Paraffin Sigma-Aldrich 1496904
Hematoxylin Sigma-Aldrich H9627
Eosin Y Sigma-Aldrich 230251 
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D9779 
Collagenase type VIII Sigma-Aldrich C-2139
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium AppliChem A2044, 9050
Sodium azide Sigma-Aldrich 438456
Mouse BD Fc Block BD Pharmingen 553141
FITC-conjugated mAb binding Vß 5.1, 5.2  BD Pharmingen 553189
APC-conjugated mAb binding CD4 GK1.5  eBioscience 17-0041-83
FACS Calibur  BD Biosciences
FCS Express V3 software DeNovo
Meta scanning confocal microscope  Zeiss LSM 710 
Zeiss Workstation Zeiss LSM 7
Zeiss ZEM software  Zeiss v4.2.0.121
Maxisorp immuno plates  NUNC, Roskilde 442404
Streptavidin conjugated alkaline phosphatase Jackson Immuno Research 016-050-084
Alkaline phosphatase substrate 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate Sigma-Aldrich 71768-5G
mAb R4-6A2 BD Biosciences 551216
mAb XMG1.2  BD Biosciences 554410
TECAN microplate-ELISA reader Tecan
EasyWin software Tecan
DNase I recombinant 4536282001

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T細胞への抗原提示細胞による抗原の提示を研究するための抗原駆動性大腸炎モデルの開発
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Rossini, V., Radulovic, K., Riedel, C. U., Niess, J. H. Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells. J. Vis. Exp. (115), e54421, doi:10.3791/54421 (2016).More

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