Abstract
udvikling zebrafisk muskel højt konserveret med mammale systemer gør dem til en fremragende model til at studere muskelfunktionen og sygdom. Mange myopatier påvirker skeletmuskulatur funktion kan hurtigt og nemt vurderet i zebrafisk i løbet af de første par dage af embryogenese. Ved 24 timer efter befrugtningen (HPF), vildtype zebrafisk spontant kontrakt deres hale muskler og med 48 HPF, zebrafisk udstille kontrolleret svømning adfærd. Reduktion i hyppigheden af eller andre ændringer i, kan disse bevægelser indikere en skeletmuskel dysfunktion. At analysere svømmeadfærd og vurdere muskel præstationer i begyndelsen zebrafisk udvikling, vi udnytter både berøringsfølsomme-fremkaldte flugt respons og bevægelseskomponenter analyser.
Touch-fremkaldte flugt respons assays kan anvendes til at vurdere muskel ydeevne under korte burst bevægelser, der skyldes sammentrækning af hurtige ryk muskelfibre. Som svar på en ydre stimulus, som i dette tilfælde er et tryk påhovedet, vildtype zebrafisk ved 2 dage efter befrugtning (DPF) typisk udviser en kraftig byge svømmetur, ledsaget af skarpe sving. Vores metode kvantificerer skeletmuskel funktion ved at måle den maksimale acceleration ved en burst svømning bevægelse, accelerationen er direkte proportional med den kraft, der frembringes ved muskelkontraktion.
I modsætning hertil er bevægelseskomponenter assays under tidlig zebrafisk larveudviklingen anvendes til at vurdere muskel ydeevne under vedvarende perioder med muskelaktivitet. Brug af et sporingssystem til overvågning svømmeadfærd opnår vi en automatiseret beregning af frekvensen af aktivitet og afstand i 6 dage gamle zebrafisk, afspejler deres skeletmuskel funktion. Målinger af svømning ydeevne er værdifulde for fænotypisk vurdering af sygdomsmodeller og high-throughput screening af mutationer eller kemiske behandlinger påvirker skeletmuskulatur funktion.
Introduction
Gennem det seneste årti zebrafisk er blevet mere og mere brugt til at studere muskel cellebiologi og sygdom. Den hurtige eksterne udvikling af zebrafisk embryo, kombineret med dets optiske klarhed, tillader direkte visualisering af muskel-dannelse, vækst og funktion. Processen med muskeludvikling er stærkt bevaret i zebrafisk, og dette har muliggjort vellykket modellering af en række muskelsygdomme herunder muskeldystrofier og medfødte myopatier 1-8. Detaljeret gennemgang af zebrafisk modeller har ikke kun givet nye indsigt i Patobiologi af disse betingelser, men også en platform for afprøvning af egnede behandlinger 6,9-13.
Analysen af zebrafisk modeller for muskelsygdomme bygger på pålidelige og reproducerbare assays til måling af muskel ydeevne. Tidligere undersøgelser har med succes målt kraften generere kapacitet af zebrafisk stammen musklen i fisk mellem 3 og 7 dpf afelektrisk stimulering kontraktion af et immobiliseret fisk fastgjort til en kraft transduktion systemet 14. Dette kan tilvejebringe detaljerede målinger af kraft, men er ikke velegnet til højere throughput eksperimenter og der er fordele ved at måle muskel ydeevne under svømning. Ved 2 dpf zebrafisk muskel er fuldt funktionel og fiskene kan fremkalde burst svømning bevægelser som reaktion på stimuli. Touch-fremkalde flugtrespons assay anvendes til at måle acceleration ved en burst svømning bevægelse, som kan anvendes som et mål for kontraktil kraft.
En af de mest anvendte foranstaltninger af muskelfunktion i myopati patienter er 6 min gangtest, der registrerer den samlede distance gik på en hård flad overflade 15,16. Vi har anvendt en tilsvarende test til måling af muskel funktion i 6 dpf zebrafisk larver, hvorved vi overvåger den samlede distance svømmet, og det samlede antal flytninger af hver larve over en 10 min periode. Dette udføresanvendelse af et automatiseret sporingssystem, som giver pålidelig og high-throughput målinger af muskelydelse. Begge muskel test er meget reproducerbar og er blevet anvendt til at kvantificere forskelle i musklen præstationer i zebrafisk myopati modeller 8.
Protocol
1. Tryk fremkaldte Assay respons
- Fremstilling af 2 dpf embryoner til Touch-fremkaldt reaktion Assay
- Sørg for, at det tidspunkt på dagen, hvor testen udføres, er i overensstemmelse mellem eksperimenter, fordi aktivitet kan variere voldsomt i løbet af dagen 17,18.
BEMÆRK: bør udføres Forsøget blindet og rækkefølgen af test randomiseret til at minimere eksperimentelle artefakter. - Tildel fisken stammer et nummer, som er ukendt for den enkelte udfører eksperimentet. Efter denne, ved hjælp af frit tilgængelige online værktøjer generere en tilfældig liste, der dikterer rækkefølgen af testning.
- Mindst en time før afprøvning, dechorionate embryoner ved rippe et hul i chorion og forsigtigt at trække chorion hinanden ved hjælp af et par fine pincet. Fjern eventuelle rester fra petriskålen før returnering til det 28 ° C inkubator.
- Sørg for, at det tidspunkt på dagen, hvor testen udføres, er i overensstemmelse mellem eksperimenter, fordi aktivitet kan variere voldsomt i løbet af dagen 17,18.
- Udførelse Touch-fremkaldt reaktion Assay
- Heat stage til 28 ° C i mindst 15 minutter før du starter testen.
BEMÆRK: Denne fase er temperaturstyret og vil forblive på 28 ° C under hele testen. Temperatur vil påvirke aktivitet, og det er derfor vigtigt at opretholde en konstant temperatur. Hvis en opvarmet stadium er ikke tilgængelig hvorefter temperaturen af vandet bør overvåges og bør udføres alle forsøg ved samme temperatur. - Placer en petriskål fyldt med embryo medium (5 mM NaCl, 0,17 mm KCI, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4 i vand) på et oplyst scenen og montere high-speed kamera over petriskål.
- Start videokamera optagelse software (såsom Stream Pix 5, beskrevet her) og under fanen "arbejdsområdet" vælg 1000 ramme pr sek (1000 fps) som capture hastighed for at sikre, at hurtig svømning handling af fisken registreres.
- Arbejde med ét embryon på et tidspunkt, sted fosteret i middle af petriskålen med zebrafisk klart synlige i synsfeltet.
BEMÆRK: Hvis fosteret svømmer væk før påbegyndelsen af forsøget erstatte det med en anden, som genvinde og positionering af fosteret kan resultere i det bliver desensibiliserede på stimulus og gentagne burst reaktioner kan fremme muskel svaghed i nogle sygdomsmodeller. - Begynd optagelsen ved at klikke på "record" knappen, og levere den mechanosensory stimulus til fosteret ved at røre det forsigtigt med en stump nål på toppen af hovedet.
- Stop optagelsen, når fosteret har svømmet ud af synsfeltet eller returneres til hvile.
BEMÆRK: acceleration toppe inden for den første 0,2 sek af burst flugt reaktion efter den mekaniske stimulus. Derfor sikre, at i det mindste under den første 0,2 sek af udgangsvejen respons optagelse fisken er i synsfeltet. Brug af software, der beskrives i trin 1.2.3, vil data automatisk blive gemtsom en .avi videofil. kunne også bruges Alternativ videooptagelse software som gratis Video Capture eller Softonic, som begge er frit tilgængelige for download,. - Retur embryo til en ny petriskål og vælge en anden foster til test. Udfør test på mindst 15 fisk.
- Heat stage til 28 ° C i mindst 15 minutter før du starter testen.
- Kvantificering af Swimming Behavior
- For at kvantificere svømmeadfærd, starte softwaren og vælg "Single Larver Locomotion uden baggrund subtraktion" modul til at åbne den gemte .avi videofilen.
- Brug af "frihånd" eller "polygon" værktøj fra menulinjen Vælg områder af film, der skal anvendes til analysen. Sikre, at regionen omfatter både den oprindelige position af fisken og området, at fisk vil svømme ind. Kontroller, at sonden er udelukket fra det område, der skal analyseres. Softwaren vil automatisk spore bane af fisk inden for det ønskede område.
- For at udføre than analyse, klik på "eksperiment" i menulinjen, og vælg "udføre". Når du bliver bedt gemme rå dataanalyse fil (.phr format) på det ønskede sted. Når den er gemt, skal du klikke på "start" for at begynde analysen. Afslut analysen ved at klikke på "stop" under "eksperiment" drop down menu. Et vindue med resultaterne vil blive vist.
- Rul til højre for at opnå "maksimal acceleration" værdi. Hvis det ønskes, eksportere disse data ved at lukke vinduet resultater og klikke på knappen "eksport øjeblikkelige resultater" under "resultater" drop down menu. Vælg det relevante rå dataanalyse fil, og klik på åben. En tekstfil, der kan åbnes i et regnearksprogram gemmes i destinationsmappen.
- Gentag denne proces for hver enkelt fisk og gennemsnittet for at opnå den gennemsnitlige maksimale acceleration for hver stamme (se Figur 1).
BEMÆRK: Som et alternativ til using den her beskrevne software, kan tilsvarende pakker såsom den frit tilgængelige ImageJ software bruges til at udtrække de relevante bevægelse data. 3D Particle Tracker plugin kan bruges til at spore svømning baner.
2. Locomotion Assay - 10-min Swim Test
- Fremstilling af 6 dpf Embryoner for Swimming Analysis
- Hvis det er nødvendigt, sortere embryoner i det nødvendige genotype, fx ved at undersøge ekspression af en fluorescerende protein eller ved fænotype, og anbringes i en separat petriskål (25-30 embryoer pr skål). Alternativt kan genotypen bestemmes efter gennemførelse af bevægelsesevne assay.
- Ved 3 dpf, atter gennemgå petriskåle og fjern eventuelle uklækkede embryoner og snavs. Retur petriskåle til 28 ° C inkubator indtil 6 dpf.
- Udfør test af alle stammer mellem 09:00 og 12:00, som er det tidspunkt, hvor zebrafisk larver er mest aktive. Tilfældig rækkefølgen af afprøvning og position i psen af vildtype og mutant prøver at minimere virkningerne af døgnrytmen forskelle og andre eksperimentelle bias.
BEMÆRK: Det er vigtigt, at test tid er konsistent mellem forsøgene, fordi aktivitet kan variere voldsomt i løbet af dagen. - Mindst 30 min før prøvning, sted larver i en 48-brønds plade med en larve per brønd. Efter overførsel, fylde fordybningerne, således at vandoverfladen er lige under toppen af brønden, sikrer at der ikke bobler. Retur plader til 28 ° C inkubator.
- Tag plader ud af inkubatoren og akklimatisere i lyset i fem minutter før testning.
- Udførelse Locomotion Assay
- Placer 48-brønds plade i kontrolapparatet kammer, som er udstyret med en infrarød digitalkamera, opfange op til 60 billeder / sek, så kan detekteres, at larver i mørke. Kontroller at alle brøndene er placeret inde i cirkulære gitter på bevægelse software og at alle larver er clearly detekterbar.
- Start softwaren og vælge "sporing" modul. Under "file" klik på "generere ny protokol" og redigere antallet af brønde anvendt til eksperimentet. Set både eksperimentet varighed og integrationsperioden til 10 min ved at klikke på "parametre" drop down menu og vælge "protokolparametre" og efterfølgende på fanen "tid". På den samme "protokolparametre" dialogboks klikke på fanen "indstillinger", og sikre afkrydsningsfeltet "Numeriscope" klikkes hvorefter, de "protokolparametre" dialogboks kan lukkes.
- For at indstille optagelsen områder fremhæve hele nettet og dobbeltklik på en af brøndene. Klik på knappen "tegne områder" og tegne rundt øverst til venstre, øverste højre og nederste venstre brønde og klik på "build", som gør det muligt for software til automatisk at bestemme positionen af hver brønd. Også trække i en skalabar og klik på "gælder for gruppen". Når du er færdig, skal du klikke på "tegne områder" knappen.
- Visuelt bestemme detektionsgrænsen ved at skubbe "detektionsgrænsen" bar til et niveau, hvor kun de fisk bevægelser er fremhævet med ingen baggrund signaler.
BEMÆRK: Detektionsgrænsen vil variere mellem stammer og dermed de tærskler skal bestemmes, når en ny stamme testes. I de repræsentative data præsenteret en påvisning på 25 mm / sek blev anvendt. - Før påbegyndelse af test indtaste tærskler bevægelse til påvisning af inaktivitet, og små og store bevægelser.
BEMÆRK: I de repræsentative data fremlagt en inaktivitet tærskel på 6 mm / sek og en aktivitet burst på 30 mm / sek blev anvendt. Tærskelværdierne bestemme den minimale bevægelse skal betragtes aktiv og det krævede niveau at blive betragtet burst aktivitet og tillade klassificering af aktiviteten i små (aktiv, men under burst aktiviTy tærskler) og store (større end tærskel burst aktivitet) bevægelser. De tærskler kan ændres afhængigt af aktiviteten af de særlige fisk analyserede stammer.
BEMÆRK: Selvom analysen kan udføres i enten lyse eller mørke forhold, har zebrafisk larver vist sig at være mere aktive i mørket 18. - Indstil lysstyrken inde i kammeret til at være på 0% ved at klikke på knappen "light drivende indstillinger" under "parametre" drop down menu. På den resulterende dialogboks, tilføje de nødvendige lys indstillinger.
BEMÆRK: lysintensiteten inden i kammeret kan udløses til at slå til og fra under testen tid til at stimulere larvernes aktivitet - Luk døren af optagelsen kammer og starte videooptagelsen.
- Kvantificering af Swimming Behavior
- Efter eksperimentet er færdig, skal du klikke på "stop" under "eksperiment" drop down menu. En dialog box med alle resultaterne vil blive vist.
- For at få adgang til disse resultater i Excel Klik på "Åbn indeholder mappen" og åbn excel-fil, der vises i den resulterende mappe. De vigtigste parametre er "smlct" (lille bevægelse tæller), "larct" (stor bevægelse tæller), "smldist" (total distance, der er fisk i små bevægelser) og "lardist" (total distance, der er fisk i store bevægelser ).
BEMÆRK: Efter optagelsen, softwaren returnerer også yderligere to output-filer i form af en .avi-fil (indeholdende en video af den 10 min optagelse) og en .png billedfil (indeholdende en visuel repræsentation af den bevægelse i løbet af 10- min forsøg; se figur 2). - Når bevægelseskomponenter værdier beregnes, afspille .avi og .png-filer til anmeldelse om bevægelseskomponenter værdi opgjort præcist skildrer svømning bevægelser af fisk (se figur3).
BEMÆRK: Som et alternativ til at bruge software, der beskrives her, kan pakker såsom den frit tilgængelige ImageJ software bruges til at spore den bevægelsesadfærd.
Representative Results
Touch fremkaldt reaktion-assay kan anvendes til at bestemme hastigheden og accelerationen over svømning bevægelser, der er en proportional måling af muskelkraft. Som svar på en mekanisk stimulus, såsom en lille tap på hovedet 2 dpf vildtype zebrafisk udviser en hurtig svømning handling. Videoer blev taget til fange og analyseret for to forskellige zebrafisk myopati modeller: Tg (ACTA1 D286G -eGFP), en model af nemaline myopati, der har vist sig at have betydelig muskelsvaghed, og en model af Duchennes muskeldystrofi, hvor alvorlige muskel fejl er blevet beskrevet ved 5 dpf 19,20. Billeder fra en video af en typisk præg fremkaldt assay er repræsenteret i figur 1A. Fremskyndelse af zebrafisk blev gennemgået og fundet at toppe inden for de første 0,2 sekunder af burst svømning flugt respons (figur 1B). Denne top maksimum acceleration tilvejebringer et mål, der er proportional med den kraft generating kapacitet skeletmuskel. De maksimale acceleration værdier blev gennemsnit for at opnå en gennemsnitlig maksimal acceleration værdi (± standardafvigelse af middelværdien) for hver stamme: Tg (ACTA1 D286G -eGFP): middelværdi = 276,0 ± 28,8 m / sek 2, n = 3 uafhængige replikere eksperimenter omfattende 15 fisk; vildtype kontrol: middelværdi = 500,8 ± 50,28 m / sek 2, n = 3 uafhængige replikat eksperimenter omfatter 15 fisk; DMD PC2 - / - mutant: middelværdi = 249,9 ± 19,1 m / sek 2, n = 3 uafhængige replikat eksperimenter omfatter 12-19 fisk; DMD PC2 +/- heterozygoter: middelværdi = 235,9 ± 8,7 m / sek 2, n = 3 uafhængige replikere eksperimenter omfatter 16-27 fisk; DMD PC2 + / + vildtype homozygoter: middelværdi = 230,9 ± 8,7 m / sek 2, n = 3 uafhængige replikere eksperimenter omfatter 8-27 fisk (figur 1C). Som forventet, Tg (ACTA1 D286G -eGFP) fisk viste sig at have et betydeligt fald i maksimal acceleration til angivelse af nedsat muskelfunktion, hvilket er i overensstemmelse med musemodeller og patientdata 8,21,22. DMD PC2 - / - mutant fisk imidlertid viste ingen forskel i maksimal acceleration, ved 2 dpf, i overensstemmelse med påvisningen af muskel defekter fra 3 dpf 20 (figur 1 D).
Bevægelseskomponenter assays blev udført ved 6 dpf at bestemme aktiviteten og afstand svømmet af zebrafisk stammer som en indikation af muskelydelse. Efter testen blev en skematisk repræsentation af svømning bevægelser over ti-minutters testperiode genereret, med røde og grønne linjer repræsenterer perioder med langsom og hurtig bevægelse henholdsvis og sorte linjer, der repræsenterer perioder med inaktivitet (figur 2). Individuel vildtype zebrafisk show høj aktivitet med relativt ingen perioder med inaktivitet som opposed til Tg (ACTA1 D286G -eGFP) fisk, som er mindre aktive i løbet af testperioden (figur 2B).
Svømning adfærd blev kvantificeret ved at tage gennemsnittet af de enkelte værdier af antallet af bevægelser og afstanden svømmet af hver fisk (figur 3). Begge, Tg (ACTA1 D286G -eGFP) fisk (figur 3A og 3B) og DMD PC2 - / - mutant fisk (figur 3C og 3D) viste sig at have et signifikant fald i det gennemsnitlige antal bevægelser og afstand svømmet i forhold til deres respektive kontroller: Tg (ACTA1 D286G -eGFP) fisk: gennemsnitligt antal bevægelser = 94,3 ± 13,6, betyder afstand svømmet = 112,9 ± 18,4 mm, n = 3 uafhængige replikat eksperimenter omfatter 45 fisk; vildtype kontrol: gennemsnitligt antal bevægelser = 177,4 ± 14,0, betyder afstand svømmet = 300,2 ± 22,8 mm, n = 3 uafhængige replicate eksperimenter omfatter 45 fisk; DMD PC2 - / - mutant: gennemsnitligt antal bevægelser = 163,3 ± 30,0, betyder afstand svømmet: 298,4 ± 60,37 mm, n = 3 uafhængige replikat eksperimenter omfatter 12-20 fisk; DMD PC2 +/- heterozygoter: gennemsnitlige antal bevægelser = 362,3 ± 38,8, betyder afstand svømmet: 660,3 ± 86.1mm n = 3 uafhængige replikat eksperimenter omfatter 17-27 fisk; DMD PC2 + / + vildtype homozygoter: gennemsnitligt antal bevægelser = 341,9 ± 91,6, betyder afstand svømmet = 574,3 ± 170.9mm n = 3 uafhængige replikat eksperimenter omfatter 8-25 fisk.
Figur 1:. Kvantificering af touch fremkalde respons assay for 2 dpf zebrafisk embryoner (A) Snapshot billeder af en kontrol zebrafisk under touch fremkalde analyser ved 2 dpf. (B) Acceleration profil for den første 0,2 sek af enenkelt Tg (ACTA1 D286G -eGFP) (rød) og enkelt kontrol (blå) zebrafisk efter anvendelse af touch stimulus. Den maksimale acceleration er repræsenteret ved de punkterede linjer. (C, D) Kvantificering af den maksimale acceleration (m / sek 2) optaget fra Touch-fremkaldt reaktion assays af (C) Tg (ACTA1 D286G -eGFP) zebrafisk og (D) DMD PC2 - / - mutant fisk sammenlignet med kontrol zebrafisk ved 2 dpf. Fejl søjler repræsenterer ± SEM for 3 replikat eksperimenter, * p <0,05. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. Repræsentation bevægelseskomponenter assays for zebrafisk embryoner (A) zebrafisk embryoner anbringes i 48-brønds plader og bevægelse registreres ovenfra hjælp af en infrarød digitalkamera. (B) Skematisk af zebrafisk bevægelse under testperioden med røde linjer skildrer hurtige bevægelser, grønne linjer skildrer langsomme bevægelser og sorte linjer skildrer inaktivitet (som bestemt af afsløring tærskler indtastet i softwaren). Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3:. Kvantificering af bevægelseskomponenter analyser til 6 dpf zebrafisk larver Kvantificering af (A) antallet af bevægelser og (B) distance, Tg (ACTA1 D286G -eGFP) zebrafisk forhold til at styre zebrafisk ved 6 dpf.Kvantificering af (C) antallet af bevægelser og (D) distance, DMD PC2 - / - mutant fisk i forhold til at styre zebrafisk ved 6 dpf. Fejl søjler repræsenterer ± SEM for 3 replikat eksperimenter, * p <0,05, ** p <0,01. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Mange forskellige dyremodeller, herunder mus, hunde, zebrafisk, fluer og orme har bidraget til vores forståelse af den genetiske og molekylære grundlag for muskelsygdomme, og bidraget til udviklingen af terapeutiske metoder til at bekæmpe dem. Zebrafisken prale af flere fordele for studiet af muskelsygdom. Zebrafisken tilvejebringer et genetisk manipulerbar system til vurdering kompleks muskel mønsterdannelse i et egnet fysiologisk miljø, hvilket ikke er muligt i in vitro dyrkningssystemer. I modsætning til andre hvirveldyr dyremodeller, det store antal fisk produceret sammen med sin optiske klarhed, muliggør hurtig, høj kapacitet in vivo kemisk og genetisk screening.
Her beskriver vi udviklingen af zebrafisk bevægelse analyser til at give en høj kapacitet og automatiseret metode til at vurdere muskel ydeevne under zebrafisk embryogenese. For begge analyser må det erkendes, at døgnrytmen ogeksterne miljømæssige stimuli i væsentlig grad vil påvirke zebrafisk svømmeadfærd 17,18. Gentagen prøvning af samme zebrafisk vil også føre til tilvænning forårsager et fald i reaktion på den taktile stimulus 23. Derfor for at opnå reproducerbare resultater mellem eksperimenter hver zebrafisk embryo bør kun blive anvendt én gang, tidspunktet på dagen og lysforhold bør standardiseres, og vandtemperaturen skal reguleres stramt.
Ved hjælp af touch evoked analyse ved 2 dpf vi direkte kan måle den maksimale acceleration af en burst svømning handling, som er proportional med muskelkraft. Tidligere teknikker i zebrafisk har undersøgt muskelkraft ved at binde begge ender af embryoner til eksperimentelt udstyr hvorefter muskelsammentrækning stimuleres ved hjælp af et elektrisk felt og kraft-generere kapacitet af musklen 14 måles. Selv om denne metode måler den kraft produktionskapacitet af than larve muskel, betyder det ikke måling af den faktiske kraft, der genereres af larvestadiet musklen under svømning. Vi udviklede derfor en fremgangsmåde til indirekte at vurdere den kraft, der genereres ved normale larve svømning bevægelse for at give et samlet mål for muskel sundhed. Højhastighedstog videosystem, der kan optage individuelle zebrafisk bevægelser på en billedfrekvens på 1.000 billeder / sek kan anvendes til at identificere små men signifikante forskelle i muskelfunktion, som ikke direkte kan skelnes med det blotte øje. Det vil være interessant at se, hvordan tidligere rapporterede ændringer i elektrisk stimuleret kraft generation korrelerer med ændringer i svømning ydeevne.
Desuden touch fremkaldt reaktion assays kan også anvendes til at vurdere svømning kinematik, såsom formen og hastigheden af legemet bølge under svømning bevægelse 24, hvilket gav en kvantitativ måling af den bevægelsesadfærd.
På grund af den spontane bevægelse af zebrafish larver efter 3 dpf, var vi ikke i stand til at udføre touch-fremkalde analyser til at måle muskelfunktion. Omvendt målte vi muskel resultater over en længere periode ved at bestemme afstanden svømmet med zebrafisk larver ved 6 dpf. Denne test, selv om et indirekte mål for muskelfunktion, kan anvendes til at identificere fisk udviser nedsat muskelpræstation 8 eller neurodegeneration 25,26. Denne test giver ikke kun en måling analog med 6 min gangtesten men er også velegnet til automatiseret høj-throughput in vivo drug eller mutagenese-skærme.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 21 G x 1' Blunt Needle | Terumo/Admiral Medical Supplies | TE2125 | |
| 48-well plates | Sigma | M8937 | |
| 90 mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S90001 | |
| High Speed Camera | Baumer | HXC20 | |
| http://www.randomization.com | N/A | Steps 1.1.2, 2.1.3 | |
| Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
| Plastic Pipette | VWR | 16001-188 | |
| StreamPix5 | NorPix | Step 1.2.3 | |
| Temperature Control Unit | Viewpoint | ||
| Tweezers, style 8 | ProSciTech | T04-821 | |
| Zebrabox System | Viewpoint | ||
| Zebralab | Viewpoint | Steps 1.3.1, 2.2.1 |
References
- Bassett, D. I., Bryson-Richardson, R. J., Daggett, D. F., Gautier, P., Keenan, D. G., Currie, P. D. Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo. Development. 130 (23), 5851-5860 (2003).
- Gupta, V. A., Kawahara, G., et al. A splice site mutation in laminin-α2 results in a severe muscular dystrophy and growth abnormalities in zebrafish. PLoS ONE. 7 (8), e43794 (2012).
- Gupta, V., Kawahara, G., et al. The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies. Hum Mol Genet. 20 (9), 1712-1725 (2011).
- Kawahara, G., Karpf, J. A., Myers, J. A., Alexander, M. S., Guyon, J. R., Kunkel, L. M. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci. 108 (13), 5331-5336 (2011).
- Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis Model & Mech. 5 (3), 389-396 (2012).
- Ruparelia, A. A., Oorschot, V., Vaz, R., Ramm, G., Bryson-Richardson, R. J. Zebrafish models of BAG3 myofibrillar myopathy suggest a toxic gain of function leading to BAG3 insufficiency. Acta Neuropathol. 128 (6), 821-833 (2014).
- Sztal, T. E., Sonntag, C., Hall, T. E., Currie, P. D. Epistatic dissection of laminin-receptor interactions in dystrophic zebrafish muscle. Hum Mol Genet. 21 (21), 4718-4731 (2012).
- Sztal, T. E., Zhao, M., et al. Zebrafish models for nemaline myopathy reveal a spectrum of nemaline bodies contributing to reduced muscle function. Acta Neuropathol. 130 (3), 389-406 (2015).
- Pichler, F. B., Laurenson, S., Williams, L. C., Dodd, A., Copp, B. R., Love, D. R. Chemical discovery and global gene expression analysis in zebrafish. Nat Biotechnol. 21 (8), 879-883 (2003).
- Peterson, R. T., Shaw, S. Y., et al. Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation. Nat Biotechnol. 22 (5), 595-599 (2004).
- Kawahara, G., Serafini, P. R., Myers, J. A., Alexander, M. S., Kunkel, L. M. Characterization of zebrafish dysferlin by morpholino knockdown. Biochem Bioph Res Co. 413 (2), 358-363 (2011).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nat Rev Drug Discov. , (2005).
- Smith, L. L., Beggs, A. H., Gupta, V. A. Analysis of skeletal muscle defects in larval zebrafish by birefringence and touch-evoke escape response assays. J Vis Exp. (82), e50925 (2013).
- Sloboda, D. D., Claflin, D. R., Dowling, J. J., Brooks, S. V. Force measurement during contraction to assess muscle function in zebrafish larvae. J Vis Exp. (77), (2013).
- McDonald, C. M., Henricson, E. K., et al. The 6-minute walk test as a new outcome measure in Duchenne muscular dystrophy. Muscle Nerve. 41 (4), 500-510 (2010).
- McDonald, C. M., Henricson, E. K., et al. The 6-minute walk test and other clinical endpoints in duchenne muscular dystrophy: reliability, concurrent validity, and minimal clinically important differences from a multicenter study. Muscle Nerve. 48 (3), 357-368 (2013).
- Hurd, M. W., Debruyne, J., Straume, M., Cahill, G. M. Circadian rhythms of locomotor activity in zebrafish. Physiol Behav. 65 (3), 465-472 (1998).
- MacPhail, R. C., Brooks, J., Hunter, D. L., Padnos, B., Irons, T. D., Padilla, S. Locomotion in larval zebrafish: Influence of time of day, lighting and ethanol. Neurotoxicology. 30 (1), 52-58 (2009).
- Berger, J., Berger, S., Jacoby, A. S., Wilton, S. D., Currie, P. D. Evaluation of exon-skipping strategies for Duchenne muscular dystrophy utilizing dystrophin-deficient zebrafish. J Cell Mol Med. 15 (12), 2643-2651 (2011).
- Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochem Bioph Res Co. 423 (4), 785-788 (2012).
- Ravenscroft, G., Jackaman, C., et al. Mouse models of dominant ACTA1 disease recapitulate human disease and provide insight into therapies. Brain. 134 (4), 1101-1115 (2011).
- Ravenscroft, G., Wilmshurst, J. M., et al. A novel ACTA1 mutation resulting in a severe congenital myopathy with nemaline bodies, intranuclear rods and type I fibre predominance. Neuromuscular Disord. 21 (1), 31-36 (2011).
- Wolman, M. A., Jain, R. A., Liss, L., Granato, M. Chemical modulation of memory formation in larval zebrafish. Proc Natl Acad Sci. 108 (37), 15468-15473 (2011).
- Müller, U. K., van Leeuwen, J. L. Swimming of larval zebrafish: ontogeny of body waves and implications for locomotory development. J Exp Biol. 207 (Pt 5), 853-868 (2004).
- Cheng, W., Tian, J., Burgunder, J. M., Hunziker, W., Eng, H. L. Myotonia congenita-associated mutations in chloride channel-1 affect zebrafish body wave swimming kinematics. PLoS ONE. 9 (8), e103445 (2014).
- Moggio, M., Colombo, I., et al. Mitochondrial disease heterogeneity: a prognostic challenge. Acta Myol. 33 (2), 86-93 (2014).
