Abstract
Zebrafish मांसपेशियों के विकास अत्यधिक स्तनधारी उन्हें पेशी समारोह और बीमारी अध्ययन करने के लिए एक शानदार मॉडल बनाने प्रणालियों के साथ संरक्षित है। कई कंकाल की मांसपेशी समारोह को प्रभावित myopathies जल्दी और आसानी से embryogenesis के पहले कुछ दिनों में zebrafish में मूल्यांकन किया जा सकता है। द्वारा 24 घंटे बाद निषेचन (HPF), wildtype zebrafish अनायास उनके पूंछ मांसपेशियों अनुबंध और 48 HPF, zebrafish प्रदर्शनी नियंत्रित तैराकी व्यवहार के द्वारा। की आवृत्ति में कमी, या अन्य में परिवर्तन, इन आंदोलनों एक कंकाल की मांसपेशी में शिथिलता का संकेत हो सकता। तैराकी व्यवहार का विश्लेषण और जल्दी zebrafish विकास में पेशी प्रदर्शन का आकलन करने के लिए, हम दोनों स्पर्श पैदा भागने प्रतिक्रिया और हरकत assays का उपयोग।
टच पैदा भागने प्रतिक्रिया assays तेजी से चिकोटी मांसपेशी फाइबर के संकुचन से उत्पन्न छोटी फट आंदोलनों के दौरान मांसपेशियों में प्रदर्शन का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक बाह्य प्रेरणा है, जो इस मामले में पर एक नल है के जवाब मेंसिर, 2 दिन बाद निषेचन (DPF) पर wildtype zebrafish आम तौर पर एक शक्तिशाली फट तैरना, तेजी से बदल जाता के साथ दिखा रहे हैं। हमारे विधि एक फट तैराकी प्रस्ताव के दौरान अधिकतम त्वरण मापने, त्वरण सीधे बल मांसपेशियों के संकुचन द्वारा उत्पादित करने के लिए आनुपातिक द्वारा किया जा रहा कंकाल की मांसपेशी समारोह quantifies।
इसके विपरीत, जल्दी zebrafish लार्वा विकास के दौरान हरकत assays मांसपेशियों की गतिविधि की निरंतर अवधि के दौरान मांसपेशियों में प्रदर्शन का आकलन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। तैराकी व्यवहार पर नजर रखने के लिए एक ट्रैकिंग प्रणाली का उपयोग करते हुए, हम 6 दिन पुरानी zebrafish में गतिविधि और दूरी की आवृत्ति की एक स्वचालित गणना, उनके कंकाल की मांसपेशी समारोह को प्रतिबिंबित करता प्राप्त करते हैं। तैराकी प्रदर्शन की माप रोग मॉडल और म्यूटेशन या रासायनिक उपचार कंकाल की मांसपेशी समारोह को प्रभावित करने के उच्च throughput स्क्रीनिंग के प्ररूपी मूल्यांकन के लिए मूल्यवान हैं।
Introduction
पिछले एक दशक में तेजी से zebrafish मांसपेशी कोशिका जीव विज्ञान और बीमारी अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। zebrafish भ्रूण, अपनी ऑप्टिकल स्पष्टता के साथ मिलकर तेजी से बाहरी विकास, मांसपेशियों गठन, विकास, और समारोह के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए अनुमति देता है। मांसपेशियों के विकास की प्रक्रिया अत्यधिक zebrafish में संरक्षित है और इस पेशी अपविकास और जन्मजात myopathies 1-8 सहित मांसपेशियों की बीमारियों की एक श्रृंखला के सफल मॉडलिंग अनुमति दी गई है। Zebrafish मॉडल की विस्तृत जांच के लिए न केवल इन शर्तों के pathobiology में उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान की गई है, लेकिन यह भी उपयुक्त उपचारों 6,9-13 के परीक्षण के लिए एक मंच प्रदान किया।
मांसपेशियों की बीमारियों के zebrafish मॉडल का विश्लेषण विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य assays पर निर्भर करता है मांसपेशियों के प्रदर्शन को मापने के लिए। पिछले अध्ययनों सफलतापूर्वक 3 और 7 के बीच मछली में zebrafish ट्रंक मांसपेशियों द्वारा DPF के बल पैदा करने की क्षमता मापा हैविद्युत एक स्थिर एक शक्ति के पारगमन प्रणाली 14 से जुड़ी मछली के संकुचन उत्तेजक। इस बल की विस्तृत माप प्रदान कर सकते हैं लेकिन आदर्श उच्च throughput प्रयोगों के लिए अनुकूल नहीं हैं और वहाँ तैराकी के दौरान मांसपेशियों प्रदर्शन को मापने के लिए लाभ कर रहे हैं। 2 zebrafish पेशी DPF पर पूरी तरह कार्यात्मक है और मछली उत्तेजनाओं के जवाब में फट तैराकी आंदोलनों बटोर सकते हैं। स्पर्श आह्वान भागने प्रतिक्रिया परख एक फट तैराकी गति है, जो सिकुड़ा बल के एक उपाय के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता दौरान त्वरण को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है।
मायोपथी रोगियों में पेशी समारोह का सबसे अधिक इस्तेमाल उपायों में से एक 6 मिनट की पैदल दूरी परीक्षण है, जो रिकॉर्ड कुल दूरी एक कठिन फ्लैट सतह 15,16 पर चला गया है। हम zebrafish लार्वा DPF 6 में पेशी समारोह को मापने के लिए एक तुलनीय परीक्षा आवेदन किया है, जिससे हम कुल दूरी swum की निगरानी, और एक 10 मिनट की अवधि में प्रत्येक लार्वा द्वारा किए गए आंदोलनों की कुल संख्या। यह किया जाता हैएक स्वचालित ट्रैकिंग प्रणाली है, जो मांसपेशियों के प्रदर्शन के विश्वसनीय और उच्च throughput मापन प्रदान करता है का उपयोग कर। दोनों की मांसपेशी परीक्षण अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं और zebrafish मायोपथी मॉडल 8 में पेशी प्रदर्शन में अंतर यों इस्तेमाल किया गया है।
Protocol
1. टच पैदा की प्रतिक्रिया परख
- टच पैदा की प्रतिक्रिया परख के लिए भ्रूण DPF 2 की तैयारी
- सुनिश्चित करें कि जिस पर परीक्षा आयोजित की जाती है दिन के समय प्रयोगों के बीच संगत है क्योंकि गतिविधि दिन 17,18 भर में नाटकीय रूप से भिन्न हो सकते हैं।
नोट: प्रयोग अंधा प्रदर्शन किया जाना चाहिए और परीक्षण के आदेश प्रयोगात्मक कलाकृतियों को कम करने के लिए बेतरतीब। - मछली निरुपित एक संख्या है, जो प्रयोग से बाहर ले जाने व्यक्ति के लिए अज्ञात है तनाव। इस के बाद, का उपयोग कर स्वतंत्र रूप से उपलब्ध ऑनलाइन उपकरण एक यादृच्छिक सूची है कि परीक्षण के आदेश पैदा करती है उत्पन्न करते हैं।
- कम से कम एक घंटे के परीक्षण से पहले, जरायु में एक छेद तेजस्वी और धीरे जरायु अलग खींच ठीक चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग करके dechorionate भ्रूण। 28 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में लौटने से पहले पेट्री डिश से किसी भी मलबे को हटा दें।
- सुनिश्चित करें कि जिस पर परीक्षा आयोजित की जाती है दिन के समय प्रयोगों के बीच संगत है क्योंकि गतिविधि दिन 17,18 भर में नाटकीय रूप से भिन्न हो सकते हैं।
- प्रदर्शन टच पैदा की प्रतिक्रिया परख
- हीट स्टेशनजीई 28 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 15 मिनट के लिए परीक्षण शुरू करने से पहले।
नोट: इस चरण में तापमान नियंत्रित किया जाता है और 28 पर बने रहेंगे परीक्षण की अवधि के लिए सें। तापमान गतिविधि को प्रभावित करेगा और यह एक निरंतर तापमान बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। एक गर्म मंच उपलब्ध नहीं है तो पानी के तापमान पर नजर रखी जानी चाहिए और सभी प्रयोगों में ही तापमान में आयोजित किया जाना चाहिए। - एक पेट्री भ्रूण मध्यम (5 मिमी NaCl, 0.17 मिमी KCl, 0.33 मिमी 2 CaCl, पानी में 0.33 मिमी MgSO 4) एक प्रबुद्ध मंच पर साथ भरा पकवान प्लेस और पेट्री डिश पर उच्च गति कैमरा माउंट।
- (जैसे स्ट्रीम Pix 5, यहाँ वर्णित के रूप में) और "कार्यस्थान" टैब के तहत प्रति सेकंड (1,000 एफपीएस) पर कब्जा गति के रूप में 1,000 फ्रेम का चयन मछली की है कि तेजी से तैराकी कार्रवाई दर्ज की गई है सुनिश्चित करने के लिए वीडियो कैमरा रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर लॉन्च।
- एक समय में एक भ्रूण के साथ काम करते हुए, midd में भ्रूण जगहzebrafish देखने के क्षेत्र में स्पष्ट रूप से दिखाई साथ पेट्री डिश के ले।
नोट: भ्रूण दूर से पहले तैरती है तो प्रयोग के प्रारंभ दूसरे के साथ की जगह है, वापसी की और भ्रूण की स्थिति में यह प्रोत्साहन और दोहराया फट प्रतिक्रियाओं को desensitized बनने कुछ रोग मॉडल में मांसपेशियों में कमजोरी को बढ़ावा देने के कर सकते हैं परिणाम हो सकता है के रूप में करने के लिए। - "रिकॉर्ड" बटन पर क्लिक करके रिकॉर्डिंग शुरू और, यह धीरे छू सिर के शीर्ष पर एक कुंद सुई के साथ द्वारा भ्रूण को mechanosensory प्रोत्साहन देने के लिए।
- रिकॉर्डिंग रोक के बाद भ्रूण को देखने के क्षेत्र से बाहर तैरा या आराम करने के लिए वापस आ गया है।
नोट: यांत्रिक उत्तेजना के बाद फट भागने की प्रतिक्रिया के पहले 0.2 सेकंड के भीतर त्वरण चोटियों। इसलिए, यह सुनिश्चित करें कि कम से कम भागने प्रतिक्रिया रिकॉर्डिंग मछली देखने के क्षेत्र में है के पहले 0.2 सेकंड के दौरान। सॉफ्टवेयर कदम 1.2.3 में वर्णित का उपयोग करना, डेटा स्वचालित रूप से सहेजा जाएगाएक .avi वीडियो फ़ाइल के रूप में। जैसे फ्री वीडियो कैद या Softonic, जो दोनों के डाउनलोड के लिए आसानी से उपलब्ध हैं, वैकल्पिक वीडियो पर कब्जा सॉफ्टवेयर भी इस्तेमाल किया जा सकता है। - एक नया पेट्री डिश के लिए भ्रूण लौटें और परीक्षण के लिए एक और भ्रूण का चयन करें। 15 मछली की एक न्यूनतम पर परीक्षण प्रदर्शन।
- हीट स्टेशनजीई 28 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 15 मिनट के लिए परीक्षण शुरू करने से पहले।
- तैराकी व्यवहार की मात्रा
- तैराकी व्यवहार यों, सॉफ्टवेयर लांच और बचाया .avi वीडियो फ़ाइल को खोलने के लिए मॉड्यूल "पृष्ठभूमि घटाव के बिना एकल लार्वा हरकत" का चयन करें।
- "मुक्तहस्त" या फिल्म के मेनू पट्टी चुनिंदा क्षेत्रों से "बहुभुज" उपकरण का उपयोग विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। सुनिश्चित करें कि क्षेत्र शामिल हैं और मछली के दोनों मूल स्थिति क्षेत्र है कि मछली में तैर जाएगा। सुनिश्चित करें कि जांच के क्षेत्र विश्लेषण किया जा से बाहर रखा गया है सुनिश्चित करें। सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से वांछित क्षेत्र के भीतर मछली की गति को ट्रैक करेगा।
- टी प्रदर्शन करने के लिएवह विश्लेषण, मेनू पट्टी से "प्रयोग" पर क्लिक करें और "अमल" का चयन करें। कहा जाए, जब इच्छित स्थान में कच्चे डेटा विश्लेषण फ़ाइल (.phr प्रारूप) बचाने के लिए। एक बार बचाया, विश्लेषण शुरू करने के लिए "शुरू" पर क्लिक करें। "प्रयोग" के तहत "बंद करो" पर क्लिक करके विश्लेषण समाप्त ड्रॉप डाउन मेनू। परिणामों से युक्त एक विंडो प्रदर्शित किया जाएगा।
- "अधिकतम त्वरण" मूल्य प्राप्त करने के लिए सही करने के लिए स्क्रॉल करें। अगर वांछित, परिणाम विंडो बंद करने और "परिणाम" के तहत "निर्यात तात्कालिक परिणाम" बटन पर क्लिक करके इस डेटा निर्यात ड्रॉप डाउन मेनू। उचित कच्चे डेटा विश्लेषण फ़ाइल का चयन करें और खुले पर क्लिक करें। एक पाठ फ़ाइल एक स्प्रेडशीट कार्यक्रम में खोला जा सकता है कि गंतव्य फ़ोल्डर में सहेजा जाएगा।
- प्रत्येक व्यक्ति मछली और प्रत्येक तनाव के लिए औसत अधिकतम त्वरण प्राप्त करने के लिए औसत के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं (चित्रा 1 देखें)।
नोट: एक विकल्प के रूप usin कोजी सॉफ्टवेयर यहाँ वर्णित है, इस तरह के स्वतंत्र रूप से उपलब्ध ImageJ सॉफ्टवेयर के रूप में समान संकुल प्रासंगिक आंदोलन डेटा निकालने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। 3 डी कण ट्रैकर प्लगइन तैराकी प्रक्षेप पथ पर नज़र रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
2. हरकत परख - 10 मिनट तैरना परीक्षण
- तैराकी विश्लेषण के लिए भ्रूण DPF 6 की तैयारी
- यदि आवश्यक हो, प्रकार भ्रूण आवश्यक जीनोटाइप के लिए, एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन की या phenotype द्वारा अभिव्यक्ति की जांच, और एक अलग पेट्री डिश (पकवान प्रति 25-30 भ्रूण) में जगह द्वारा उदाहरण के लिए। वैकल्पिक रूप से, जीनोटाइप हरकत परख के पूरा होने के बाद निर्धारित किया जा सकता है।
- 3 DPF पर, पेट्री डिश फिर से जांच करने और किसी भी unhatched भ्रूण और मलबे को हटा दें। 6 DPF तक 28 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर पेट्री डिश लौटें।
- 9 बजे से 12 बजे जो समय है, जिस पर zebrafish लार्वा सबसे अधिक सक्रिय हैं के बीच सभी नस्लों के परीक्षण प्रदर्शन। पी में परीक्षण और स्थिति के आदेश अनियमित करेंwildtype और उत्परिवर्ती नमूनों की देर circadian मतभेद और अन्य प्रयोगात्मक पूर्वाग्रह के प्रभाव को कम करने के लिए।
नोट: यह है कि परीक्षण के समय प्रयोगों के बीच संगत है क्योंकि गतिविधि दिन भर में नाटकीय रूप से भिन्न हो सकते हैं महत्वपूर्ण है। - कम से कम 30 मिनट के परीक्षण, अच्छी तरह से प्रति एक लार्वा के साथ एक 48 अच्छी तरह से थाली में जगह लार्वा से पहले। हस्तांतरण के बाद, कुओं इतना भर है कि पानी की सतह सिर्फ अच्छी तरह के ऊपर से नीचे है, यह सुनिश्चित करने के लिए कोई बुलबुले हैं। 28 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर प्लेटें लौटें।
- इनक्यूबेटर से बाहर प्लेटें ले लो और परीक्षण करने से पहले पांच मिनट के लिए प्रकाश में जलवायु के अनुकूल बनाना।
- हरकत परख प्रदर्शन
- 48 अच्छी तरह से थाली रिकार्डिंग कक्ष है, जो एक अवरक्त डिजिटल कैमरे से लैस है, 60 फ्रेम / सेकंड तक कब्जा इतना है कि लार्वा अंधेरे में पता लगाया जा सकता है में रखें। जाँच करें कि कुओं के सभी हरकत सॉफ्टवेयर पर परिपत्र ग्रिड के अंदर रखा जाता है और सभी लार्वा CLE हैं किआर्ली detectable।
- सॉफ्टवेयर शुरू करने और "ट्रैकिंग" मॉड्यूल का चयन करें। "फाइल" के तहत "नए प्रोटोकॉल उत्पन्न" पर क्लिक करें और प्रयोग के लिए इस्तेमाल कुओं की संख्या को संपादित करें। दोनों प्रयोग की अवधि और "पैरामीटर" पर क्लिक करके 10 मिनट के लिए एकीकरण की अवधि निर्धारित मेनू नीचे गिरा और "प्रोटोकॉल पैरामीटर" और बाद में "समय" टैब का चयन। एक ही "प्रोटोकॉल पैरामीटर" संवाद बॉक्स पर "विकल्प" टैब पर क्लिक करें और सुनिश्चित करें "Numeriscope" चेकबॉक्स जिसके बाद, "प्रोटोकॉल पैरामीटर" संवाद बॉक्स बंद किया जा सकता क्लिक किया जाता है।
- सेट करने के लिए रिकॉर्डिंग क्षेत्रों कुओं में से एक पर पूरे ग्रिड और डबल क्लिक पर प्रकाश डाला। "आकर्षित क्षेत्रों" बटन पर क्लिक करें और ऊपरी बाएं, ऊपर सही, और नीचे बाईं कुओं के आसपास आकर्षित और क्लिक करें "बिल्ड", जो सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से अच्छी तरह से प्रत्येक की स्थिति निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा पैमाने में आकर्षितबार और "समूह के लिए लागू करें" पर क्लिक करें। एक बार जब पूरा, "क्षेत्रों आकर्षित" बटन पर क्लिक करें।
- नेत्रहीन एक किस स्तर पर केवल मछली आंदोलनों कोई पृष्ठभूमि संकेतों के साथ डाला जाता है के लिए "का पता लगाने दहलीज" बार फिसलने से पता लगाने की दहलीज निर्धारण करते हैं।
ध्यान दें: पता लगाने की दहलीज तनाव और इस प्रकार थ्रेसहोल्ड जब भी एक नई नस्ल का परीक्षण किया जाता है निर्धारित किया है के बीच अलग अलग होंगे। में प्रतिनिधि डेटा 25 मिमी की एक सीमा का पता लगाने प्रस्तुत / सेकंड इस्तेमाल किया गया था। - परीक्षण शुरू करने से पहले निष्क्रियता का पता लगाने के लिए, और छोटे और बड़े आंदोलनों के लिए आंदोलन थ्रेसहोल्ड दर्ज करें।
नोट: में प्रतिनिधि डेटा 6 मिमी / सेकंड की एक सीमा निष्क्रियता और 30 मिमी की एक गतिविधि सीमा फट प्रस्तुत / सेकंड इस्तेमाल किया गया था। थ्रेसहोल्ड निर्धारित न्यूनतम आंदोलन सक्रिय विचार किया जा करने के लिए और स्तर की आवश्यकता फट गतिविधि माना जाता है और छोटे (सक्रिय में लेकिन फट गतिविधियों नीचे गतिविधि के वर्गीकरण के लिए अनुमति देने के लिए किया जाTy थ्रेसहोल्ड) और बड़े (फट गतिविधि सीमा से अधिक) आंदोलनों। थ्रेसहोल्ड का विश्लेषण विशेष मछली उपभेदों की गतिविधि के आधार पर बदला जा सकता है।
नोट: परख सकते हैं या तो प्रकाश या अंधेरे की स्थिति में किया जा सकता है, zebrafish लार्वा अंधेरा 18 में और अधिक सक्रिय होने के लिए दिखाया गया है। - कक्ष के अंदर प्रकाश की तीव्रता सेट "पैरामीटर" के तहत "प्रकाश ड्राइविंग सेटिंग्स" बटन पर क्लिक करके 0% पर होना करने के लिए ड्रॉप डाउन मेनू। जिसके परिणामस्वरूप संवाद बॉक्स पर, आवश्यक प्रकाश सेटिंग्स जोड़ें।
नोट: कक्ष के अंदर प्रकाश की तीव्रता लार्वा गतिविधियों को प्रोत्साहित करने के लिए परीक्षण के समय के दौरान पर और बंद करने के लिए शुरू किया जा सकता - रिकार्डिंग कक्ष के दरवाजे बंद करो और वीडियो रिकॉर्डिंग शुरू करते हैं।
- तैराकी व्यवहार की मात्रा
- प्रयोग के बाद पूरा हो गया, "प्रयोग" के तहत "बंद करो" पर क्लिक करें ड्रॉप डाउन मेनू। एक संवाद बोसभी परिणामों के साथ एक्स प्रदर्शित किया जाएगा।
- पर "युक्त खुले फ़ोल्डर" एक्सेल क्लिक में इन परिणामों एक्सेस और एक्सेल फ़ाइल है कि जिसके परिणामस्वरूप फ़ोल्डर में प्रकट होता खोलने के लिए। महत्वपूर्ण पैरामीटर "smlct" (छोटे आंदोलन गिनती), "larct" (बड़े आंदोलन की गिनती), "smldist" (कुल दूरी छोटे आंदोलनों में मछली द्वारा कवर) और "lardist" (कुल दूरी बड़े आंदोलनों में मछली द्वारा कवर कर रहे हैं )।
नोट: रिकॉर्डिंग के बाद, सॉफ्टवेयर भी एक AVI फ़ाइल के रूप में दो अतिरिक्त आउटपुट फाइल रिटर्न 10 के दौरान और एक PNG छवि फ़ाइल (हरकत के एक दृश्य प्रतिनिधित्व युक्त (10 मिनट रिकॉर्डिंग का एक वीडियो से युक्त) मिनट प्रयोग, चित्रा 2 देखें)। - एक बार हरकत मूल्यों गणना कर रहे हैं, की समीक्षा करने के .avi और .png फ़ाइलों से खेलना है कि क्या सही गणना की हरकत मूल्यों मछली की तैराकी आंदोलनों को दर्शाती (आंकड़ा देखें3)।
नोट: सॉफ्टवेयर यहाँ वर्णित का उपयोग करने के लिए एक विकल्प के रूप में, इस तरह के स्वतंत्र रूप से उपलब्ध ImageJ सॉफ्टवेयर के रूप में संकुल locomotory व्यवहार पर नज़र रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Representative Results
टच पैदा की प्रतिक्रिया परख की गति और तैराकी आंदोलनों के त्वरण जो मांसपेशियों की शक्ति का एक आनुपातिक उपाय है निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक यांत्रिक उत्तेजना, के जवाब में इस तरह के सिर 2 जंगली प्रकार zebrafish प्रदर्शनी एक तेज तैराकी कार्रवाई DPF पर एक छोटे से नल के रूप में। वीडियो कब्जा कर लिया गया है और दो अलग अलग zebrafish मायोपथी मॉडल के लिए विश्लेषण: टीजी (ACTA1 D286G -eGFP), nemaline मायोपथी का एक मॉडल है कि महत्वपूर्ण मांसपेशियों में कमजोरी है दिखाया गया है, और Duchenne पेशी dystrophy के एक मॉडल, जिसमें गंभीर मांसपेशियों में दोष वर्णित किया गया है 5 19,20 DPF पर। एक विशिष्ट स्पर्श के एक वीडियो से छवियों को परख चित्रा 1 ए में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं पैदा की। Zebrafish के त्वरण की जांच की और फट तैराकी भागने प्रतिक्रिया (चित्रा 1 बी) के पहले 0.2 सेकंड के भीतर पीक करने के लिए मिला था। इस शिखर अधिकतम त्वरण एक उपाय है कि बल जी के लिए आनुपातिक है प्रदान करता हैकंकाल की मांसपेशी की क्षमता enerating। टीजी (ACTA1 D286G -eGFP):: मतलब = 276.0 ± 28.8 मीटर / सेकंड 2, एन = 3 स्वतंत्र दोहराने के प्रयोगों जिसमें अधिकतम त्वरण मूल्यों एक मतलब अधिकतम त्वरण मूल्य (मतलब की ± मानक त्रुटि) प्रत्येक तनाव के लिए प्राप्त करने के लिए औसतन थे 15 अलग-अलग मछली; wildtype नियंत्रण: मतलब = 500.8 ± 50.28 मीटर / सेकंड 2, एन = 3 स्वतंत्र दोहराने 15 व्यक्ति मछली शामिल प्रयोगों; डीएमडी PC2 - / - उत्परिवर्ती: मतलब = 249.9 ± 19.1 मीटर / सेकंड 2, एन = 3 स्वतंत्र दोहराने 12-19 व्यक्ति मछली शामिल प्रयोगों; डीएमडी PC2 +/- heterozygotes: मतलब = 235.9 ± 8.7 मीटर / सेकंड 2, एन = 3 स्वतंत्र दोहराने 16-27 व्यक्ति मछली शामिल प्रयोगों; डीएमडी PC2 + + / wildtype समयुग्मज: मतलब = 230.9 ± 8.7 मीटर / सेकंड 2, एन = 3 स्वतंत्र दोहराने 27/08 व्यक्ति मछली (चित्रा 1 सी) शामिल प्रयोगों। जैसी कि उम्मीद थी, टीजी (ACTA1 D286जी -eGFP) मछली अधिकतम त्वरण कम मांसपेशी समारोह है, जो माउस मॉडल और रोगी डेटा 8,21,22 के साथ संगत है यह दर्शाता है में एक महत्वपूर्ण कमी है पाए गए। डीएमडी PC2 - / - उत्परिवर्ती मछली हालांकि, अधिकतम त्वरण में कोई अंतर नहीं दिखाया 2 DPF पर, 3 से पेशी दोष का पता लगाने के DPF 20 (चित्रा -1) के साथ संगत।
हरकत assays 6 DPF पर प्रदर्शन किया गया पेशी प्रदर्शन का एक संकेत के रूप में zebrafish उपभेदों द्वारा गतिविधि और दूरी swum निर्धारित करने के लिए। परीक्षण के बाद, दस मिनट की परीक्षण अवधि में तैराकी आंदोलनों की एक ढांचे के रूप में प्रतिनिधित्व उत्पन्न किया गया था, लाल और हरे रंग की लाइनों में क्रमश: धीमी और तेज आंदोलन के समय का प्रतिनिधित्व करने और काले लाइनों (चित्रा 2) निष्क्रियता की अवधि का प्रतिनिधित्व करने के साथ। व्यक्तिगत wildtype zebrafish शो oppos के रूप में निष्क्रियता के अपेक्षाकृत कोई समय के साथ उच्च गतिविधिएड टीजी (ACTA1 D286G -eGFP) मछली है, जो परीक्षण अवधि (चित्रा 2 बी) पर कम सक्रिय हैं।
तैराकी व्यवहार प्रत्येक मछली (चित्रा 3) द्वारा आंदोलनों की संख्या और दूरी swum व्यक्तिगत मूल्यों के औसत से मात्रा निर्धारित किया गया था। दोनों, टीजी (ACTA1 D286G -eGFP) मछली (चित्रा 3 ए और 3 बी) और डीएमडी PC2 - / - उत्परिवर्ती मछली (चित्रा -3 सी और 3 डी) उनके संबंधित की तुलना में तैरा आंदोलनों और दूरी का मतलब संख्या में एक महत्वपूर्ण कमी है पाए गए नियंत्रण: टीजी (ACTA1 D286G -eGFP) मछली: आंदोलनों का मतलब संख्या = 94.3 ± 13.6, इसका मतलब यह दूरी swum = 112.9 ± 18.4 मिमी, एन = 3 स्वतंत्र दोहराने 45 मछली शामिल प्रयोगों; जंगली प्रकार नियंत्रण:, मतलब आंदोलनों की संख्या = 177.4 ± 14.0 मतलब दूरी swum = 300.2 ± 22.8 मिमी, एन = 3 स्वतंत्र अनुसंधानeplicate 45 मछली शामिल प्रयोगों; डीएमडी PC2 - / - उत्परिवर्ती: इसका मतलब आंदोलनों की संख्या = 163.3 ± 30.0, इसका मतलब यह दूरी swum: 298.4 ± 60.37 मिमी, एन = 3 स्वतंत्र दोहराने 12-20 मछली शामिल प्रयोगों; डीएमडी PC2 +/- heterozygotes: आंदोलनों का मतलब संख्या = 362.3 ± 38.8, इसका मतलब यह दूरी swum: 660.3 ± 86.1mm एन = 3 स्वतंत्र दोहराने 17-27 मछली शामिल प्रयोगों; डीएमडी PC2 + + / wildtype समयुग्मज: आंदोलनों की संख्या = 341.9 ± 91.6 मतलब है, इसका मतलब यह दूरी swum = 574.3 ± 170.9mm एन = 3 स्वतंत्र दोहराने 8-25 मछली शामिल प्रयोगों।
चित्रा 1:। की मात्रा प्रतिक्रिया परख 2 के लिए zebrafish भ्रूण DPF एक नियंत्रण zebrafish की (ए) स्नैपशॉट छवियों के दौरान स्पर्श आह्वान 2 DPF पर स्पर्श आह्वान assays। (बी) के एक के पहले 0.2 सेकंड के लिए त्वरण प्रोफ़ाइलएकल टीजी (ACTA1 D286G -eGFP) (लाल) और एकल नियंत्रण (नीला) zebrafish स्पर्श प्रोत्साहन के आवेदन के बाद। अधिकतम त्वरण बिंदीदार रेखा का प्रतिनिधित्व करती है। (सी, डी) अधिकतम त्वरण (M / सेकंड 2) (सी) टीजी (ACTA1 D286G -eGFP) zebrafish के स्पर्श पैदा प्रतिक्रिया assays से दर्ज की मात्रा और (डी) डीएमडी PC2 - / - उत्परिवर्ती मछली 2 DPF पर zebrafish नियंत्रित करने के लिए की तुलना में। त्रुटि सलाखों, 3 को दोहराने के प्रयोगों के लिए ± SEM प्रतिनिधित्व * पी <0.05। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2:। Zebrafish भ्रूण के लिए हरकत assays के प्रतिनिधित्व (ए) zebrafish भ्रूण 48 अच्छी तरह से प्लेट में रखा जाता है और हरकत एक अवरक्त डिजिटल कैमरे का उपयोग ऊपर से दर्ज की गई है। (बी) लाल लाइनों तेजी से आंदोलनों, हरे रंग की लाइनों धीमी आंदोलनों और काले लाइनों निष्क्रियता (के रूप में सॉफ्टवेयर में दर्ज किया गया पता लगाने थ्रेसहोल्ड द्वारा निर्धारित) चित्रण चित्रण चित्रण के साथ परीक्षण अवधि के दौरान zebrafish आंदोलन के योजनाबद्ध। का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा।
चित्रा 3:। Zebrafish लार्वा DPF 6 के लिए हरकत assays की मात्रा आंदोलनों की (ए) नंबर की मात्रा और (बी) टीजी से कूच (ACTA1 D286G -eGFP) zebrafish 6 DPF पर zebrafish पर नियंत्रण की तुलना में दूरी।/ - - उत्परिवर्ती मछली 6 DPF पर zebrafish पर नियंत्रण की तुलना में आंदोलनों की (सी) संख्या और (डी) की मात्रा डीएमडी PC2 से कूच दूरी। त्रुटि सलाखों, 3 को दोहराने के प्रयोगों के लिए ± SEM प्रतिनिधित्व * पी <0.05, ** पी <0.01। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
चूहों, कुत्तों, zebrafish, मक्खियों और कीड़े सहित कई अलग अलग पशु मॉडल मांसपेशियों की बीमारियों के आनुवंशिक और आणविक आधार के बारे में हमारी समझ की दिशा में योगदान दिया, और चिकित्सकीय दृष्टिकोण उन्हें मुकाबला करने के विकास में सहायता प्रदान की है। zebrafish मांसपेशियों की बीमारी के अध्ययन के लिए कई फायदे भी हैं। Zebrafish एक उपयुक्त मनोवैज्ञानिक वातावरण है, जो इन विट्रो संस्कृति प्रणालियों में संभव नहीं है में जटिल पेशी patterning आकलन करने के लिए एक आनुवंशिक रूप से manipulable प्रणाली प्रदान करता है। अन्य कशेरुकी पशु मॉडल के विपरीत, उत्पादित मछली की एक बड़ी संख्या है, एक साथ अपनी ऑप्टिकल स्पष्टता के साथ, की सुविधा विवो रासायनिक और जेनेटिक स्क्रीनिंग में तेजी, उच्च throughput।
यहाँ हम zebrafish आंदोलन assays के विकास का वर्णन एक उच्च throughput और स्वचालित विधि zebrafish embryogenesis दौरान मांसपेशियों में प्रदर्शन का आकलन करने के लिए प्रदान करते हैं। दोनों assays के लिए यह स्वीकार किया जाना चाहिए कि circadian लय औरबाहरी पर्यावरण उत्तेजनाओं काफी zebrafish तैराकी व्यवहार 17,18 को प्रभावित करेगा। एक ही zebrafish की दोहराया परीक्षण भी स्पर्श के जवाब में कमी के कारण उत्तेजना 23 आदी होना करने के लिए नेतृत्व करेंगे। इसलिए, क्रम में प्रयोगों के बीच प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्रत्येक zebrafish भ्रूण प्राप्त करने के लिए केवल एक बार परीक्षण किया जाना चाहिए, दिन और प्रकाश व्यवस्था की स्थिति के समय मानकीकृत किया जाना चाहिए, और पानी का तापमान कसकर विनियमित किया जाना चाहिए।
टच का उपयोग कर 2 में विश्लेषण पैदा DPF हम सीधे एक फट तैराकी कार्रवाई, जो मांसपेशियों की शक्ति के लिए आनुपातिक है की अधिकतम त्वरण उपाय कर सकते हैं। Zebrafish में पिछले तकनीकों प्रायोगिक उपकरण निम्नलिखित भ्रूण जो मांसपेशियों के संकुचन एक बिजली के क्षेत्र और मांसपेशियों 14 के बल पैदा क्षमता का उपयोग प्रेरित है मापा जाता है के दोनों सिरों बांधने से मांसपेशियों की शक्ति की जांच की है। नदीम इस विधि बल टी की क्षमता पैदा करने के उपायवह लार्वा मांसपेशियों, यह तैराकी के दौरान वास्तविक लार्वा पेशी द्वारा उत्पन्न बल उपाय नहीं है। इसलिए हम एक विधि परोक्ष रूप से बल सामान्य लार्वा तैराकी प्रस्ताव के दौरान उत्पन्न पेशी स्वास्थ्य का एक समग्र उपाय प्रदान करने के लिए आकलन करने के लिए विकसित की है। उच्च गति वीडियो प्रणाली, 1000 तख्ते की एक फ्रेम दर पर व्यक्तिगत zebrafish आंदोलनों रिकॉर्डिंग में सक्षम / सेक जो सीधे आंखों से अलग पहचाना नहीं हैं मांसपेशी समारोह में छोटी लेकिन महत्वपूर्ण मतभेद की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह देखने के लिए कि कैसे पहले से विद्युत प्रेरित बल पीढ़ी में परिवर्तन तैराकी प्रदर्शन में परिवर्तन के साथ संबंध स्थापित सूचना दी ब्याज की हो जाएगा।
इसके अलावा टच पैदा की प्रतिक्रिया assays भी इस तरह के आकार और तैराकी गति 24 के दौरान शरीर लहर की गति के रूप में तैराकी कीनेमेटीक्स, का आकलन करने के लिए, locomotory व्यवहार का एक मात्रात्मक माप देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
zebraf की सहज आंदोलन के कारणish लार्वा 3 DPF के बाद, हम मांसपेशी समारोह को मापने के लिए स्पर्श आह्वान assays प्रदर्शन करने में सक्षम नहीं थे। इसके विपरीत, हम 6 DPF पर zebrafish लार्वा से दूरी swum के निर्धारण से एक लंबी अवधि में पेशी प्रदर्शन मापा। इस परीक्षा में, हालांकि मांसपेशी समारोह के एक अप्रत्यक्ष उपाय, मछली बिगड़ा पेशी प्रदर्शन 8 या neurodegeneration 25,26 प्रदर्शित की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस परीक्षा में न केवल एक माप 6 मिनट की पैदल दूरी परीक्षण के अनुरूप प्रदान करता है, लेकिन यह भी विवो दवा या म्युटाजेनेसिस स्क्रीन में स्वचालित उच्च throughput के लिए उपयुक्त है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 21 G x 1' Blunt Needle | Terumo/Admiral Medical Supplies | TE2125 | |
| 48-well plates | Sigma | M8937 | |
| 90 mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S90001 | |
| High Speed Camera | Baumer | HXC20 | |
| http://www.randomization.com | N/A | Steps 1.1.2, 2.1.3 | |
| Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
| Plastic Pipette | VWR | 16001-188 | |
| StreamPix5 | NorPix | Step 1.2.3 | |
| Temperature Control Unit | Viewpoint | ||
| Tweezers, style 8 | ProSciTech | T04-821 | |
| Zebrabox System | Viewpoint | ||
| Zebralab | Viewpoint | Steps 1.3.1, 2.2.1 |
References
- Bassett, D. I., Bryson-Richardson, R. J., Daggett, D. F., Gautier, P., Keenan, D. G., Currie, P. D. Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo. Development. 130 (23), 5851-5860 (2003).
- Gupta, V. A., Kawahara, G., et al. A splice site mutation in laminin-α2 results in a severe muscular dystrophy and growth abnormalities in zebrafish. PLoS ONE. 7 (8), e43794 (2012).
- Gupta, V., Kawahara, G., et al. The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies. Hum Mol Genet. 20 (9), 1712-1725 (2011).
- Kawahara, G., Karpf, J. A., Myers, J. A., Alexander, M. S., Guyon, J. R., Kunkel, L. M. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci. 108 (13), 5331-5336 (2011).
- Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis Model & Mech. 5 (3), 389-396 (2012).
- Ruparelia, A. A., Oorschot, V., Vaz, R., Ramm, G., Bryson-Richardson, R. J. Zebrafish models of BAG3 myofibrillar myopathy suggest a toxic gain of function leading to BAG3 insufficiency. Acta Neuropathol. 128 (6), 821-833 (2014).
- Sztal, T. E., Sonntag, C., Hall, T. E., Currie, P. D. Epistatic dissection of laminin-receptor interactions in dystrophic zebrafish muscle. Hum Mol Genet. 21 (21), 4718-4731 (2012).
- Sztal, T. E., Zhao, M., et al. Zebrafish models for nemaline myopathy reveal a spectrum of nemaline bodies contributing to reduced muscle function. Acta Neuropathol. 130 (3), 389-406 (2015).
- Pichler, F. B., Laurenson, S., Williams, L. C., Dodd, A., Copp, B. R., Love, D. R. Chemical discovery and global gene expression analysis in zebrafish. Nat Biotechnol. 21 (8), 879-883 (2003).
- Peterson, R. T., Shaw, S. Y., et al. Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation. Nat Biotechnol. 22 (5), 595-599 (2004).
- Kawahara, G., Serafini, P. R., Myers, J. A., Alexander, M. S., Kunkel, L. M. Characterization of zebrafish dysferlin by morpholino knockdown. Biochem Bioph Res Co. 413 (2), 358-363 (2011).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nat Rev Drug Discov. , (2005).
- Smith, L. L., Beggs, A. H., Gupta, V. A. Analysis of skeletal muscle defects in larval zebrafish by birefringence and touch-evoke escape response assays. J Vis Exp. (82), e50925 (2013).
- Sloboda, D. D., Claflin, D. R., Dowling, J. J., Brooks, S. V. Force measurement during contraction to assess muscle function in zebrafish larvae. J Vis Exp. (77), (2013).
- McDonald, C. M., Henricson, E. K., et al. The 6-minute walk test as a new outcome measure in Duchenne muscular dystrophy. Muscle Nerve. 41 (4), 500-510 (2010).
- McDonald, C. M., Henricson, E. K., et al. The 6-minute walk test and other clinical endpoints in duchenne muscular dystrophy: reliability, concurrent validity, and minimal clinically important differences from a multicenter study. Muscle Nerve. 48 (3), 357-368 (2013).
- Hurd, M. W., Debruyne, J., Straume, M., Cahill, G. M. Circadian rhythms of locomotor activity in zebrafish. Physiol Behav. 65 (3), 465-472 (1998).
- MacPhail, R. C., Brooks, J., Hunter, D. L., Padnos, B., Irons, T. D., Padilla, S. Locomotion in larval zebrafish: Influence of time of day, lighting and ethanol. Neurotoxicology. 30 (1), 52-58 (2009).
- Berger, J., Berger, S., Jacoby, A. S., Wilton, S. D., Currie, P. D. Evaluation of exon-skipping strategies for Duchenne muscular dystrophy utilizing dystrophin-deficient zebrafish. J Cell Mol Med. 15 (12), 2643-2651 (2011).
- Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochem Bioph Res Co. 423 (4), 785-788 (2012).
- Ravenscroft, G., Jackaman, C., et al. Mouse models of dominant ACTA1 disease recapitulate human disease and provide insight into therapies. Brain. 134 (4), 1101-1115 (2011).
- Ravenscroft, G., Wilmshurst, J. M., et al. A novel ACTA1 mutation resulting in a severe congenital myopathy with nemaline bodies, intranuclear rods and type I fibre predominance. Neuromuscular Disord. 21 (1), 31-36 (2011).
- Wolman, M. A., Jain, R. A., Liss, L., Granato, M. Chemical modulation of memory formation in larval zebrafish. Proc Natl Acad Sci. 108 (37), 15468-15473 (2011).
- Müller, U. K., van Leeuwen, J. L. Swimming of larval zebrafish: ontogeny of body waves and implications for locomotory development. J Exp Biol. 207 (Pt 5), 853-868 (2004).
- Cheng, W., Tian, J., Burgunder, J. M., Hunziker, W., Eng, H. L. Myotonia congenita-associated mutations in chloride channel-1 affect zebrafish body wave swimming kinematics. PLoS ONE. 9 (8), e103445 (2014).
- Moggio, M., Colombo, I., et al. Mitochondrial disease heterogeneity: a prognostic challenge. Acta Myol. 33 (2), 86-93 (2014).
