Summary
tendons fléchisseurs de la main sont souvent blessés, conduisant à la fonction de la main avec facultés affaiblies. Cependant, la réponse de cicatrisation du tissu cicatriciel ne sont pas bien caractérisés. Un modèle murin de tendon fléchisseur de guérison est démontré ici. Ce modèle peut améliorer la compréhension globale du processus de guérison et d'évaluer les approches thérapeutiques pour améliorer la guérison.
Abstract
Tendon relie le muscle squelettique et de l'os, ce qui facilite le mouvement de la quasi-totalité du corps. Dans la main, les tendons fléchisseurs (FTS) permettent la flexion des doigts et de la fonction générale de la main. Les blessures aux FTs sont communs, et la guérison satisfaisante est souvent altérée en raison de tissus et des adhérences entre le tendon et les tissus environnants cicatrice en excès. Cependant, on sait peu sur les composants moléculaires et cellulaires de FT réparation. À cette fin, un modèle murin de FT réparation qui récapitule de nombreux aspects de la guérison chez les humains, y compris les troubles de l'amplitude des mouvements et une diminution des propriétés mécaniques, a été développé et décrit précédemment. Voici une démonstration en profondeur de cette intervention chirurgicale est prévue, impliquant transection et réparation ultérieure du tendon fléchisseur des orteils (FDL) dans la patte arrière murin. Cette technique peut être utilisée pour effectuer une analyse de la lignée des différents types de cellules, d'évaluer les effets du gain ou de la perte du gène de fonction, et de tester l'efficacité des interventions pharmacologiques dans le processus de guérison. Cependant, il y a deux principales limites à ce modèle: i) le tendon FDL dans la partie médiane de la patte arrière murin, où le transection et la réparation se produisent, ne sont pas entouré par une gaine synoviale. Par conséquent, ce modèle ne tient pas compte de la contribution potentielle de la gaine au processus de formation de cicatrice. ii) Afin de protéger l'intégrité du site de réparation, le FT est libéré à la jonction myotendineuse, ce qui diminue les forces mécaniques du tendon, a probablement contribué à l'augmentation de la formation de cicatrices. L'isolement de cellules suffisantes provenant du tissu de granulation du FT pendant le processus de guérison pour une analyse cytométrique en flux a révélé difficile; cytologique centrifugation pour concentrer ces cellules est une autre méthode utilisée et permet de générer des préparations de cellules sur lesquelles marquage immunofluorescent peut être effectuée. Avec cette méthode, la quantification des cellules ou des protéines d'intérêt au cours de la guérison FT devient possible.
Introduction
tendons fléchisseurs dans le travail de la main, de concert avec les muscles fléchisseurs de l'avant-bras et les gaines numériques pour permettre la flexion des doigts et de la fonction de préhension de la main. tendons fléchisseurs courent le long de la face palmaire de la main; cet endroit relativement superficielle entraîne souvent des blessures aux tendons fléchisseurs pendant un traumatisme à la main. Tendons guérissent par une réponse d' un tissu cicatriciel au lieu de la régénération du tissu normal du tendon 1. Bien que ce tissu cicatriciel assure la continuité du tendon, la fonction est considérablement diminué par rapport au tendon sain. Composites de tissus Tendon-cicatrice se caractérisent par des propriétés mécaniques affaiblies 1, ce qui rend les tendons réparés plus susceptibles de se rompre. En outre, le tissu cicatriciel n'a pas l'organisation de la structure des fibres de collagène de tendon natif, ce qui entraîne une augmentation de la taille du tendon et d'encombrement. Compte tenu des contraintes anatomiques de l'unité tendon-gaine, même une légère augmentation de la taille du tendon peut considérablement rougeUCE la fonction de glissement du tendon, et donc plage de chiffres de mouvement et la fonction de la main.
Avant les blessures du 1960 aux tendons fléchisseurs, en particulier dans la zone II de la main, ne sont pas systématiquement réparées en raison des complications graves dans la guérison qui se posent avec ces réparations 2. Cette zone de la main a été appelé «la terre de personne» 3. Cependant, l' amélioration des techniques chirurgicales, des motifs de suture et des protocoles de réhabilitation de physiothérapie ont considérablement amélioré les résultats du tendon fléchisseur réparations 2. Malgré ces progrès, jusqu'à 40% des réparations entraînent la formation d'adhérence suffisante pour empêcher la fonction de la main 4. Par conséquent, une approche biologique est nécessaire pour améliorer la guérison. Malheureusement, on sait très peu sur le processus de guérison du tendon au niveau cellulaire et moléculaire. Ainsi, l'objectif était de développer un modèle murin qui pourrait être utilisé pour améliorer la understandin fondamentaleg des composants cellulaires et moléculaires de fléchisseur guérison du tendon et la réponse de la formation de cicatrices, comme un moyen d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour améliorer la guérison.
modèles animaux plus grands ont contribué à améliorer la compréhension du processus de guérison du tendon fléchisseur. Études de Canine et le lapin ont démontré à la fois la capacité de guérison intrinsèque et extrinsèque des tendons fléchisseurs 5,6, l'importance du mouvement passif tôt contrôlée pour minimiser la formation d'adhérence par rapport à l' immobilisation 7, ainsi que les effets des différents motifs de suture sur le processus de guérison 8 , 9. En outre, le modèle canin a été utile pour tester des approches d'ingénierie tissulaire translationnelle pour améliorer la guérison 10. Cependant, il existe plusieurs avantages importants à l'aide d'un modèle murin par rapport à un grand modèle animal, y compris le coût relatif, la disponibilité des réactifs spécifiques de souris et de la facilité de génération globale KNOCk-out ou constructions délétion / surexpression spécifiques de tissus. En outre, les similitudes fonctionnelles entre les humains et les souris en ce qui concerne les tendons fléchisseurs 11 indiquent l'utilité potentielle dans le développement d' un modèle murin.
Développement d'un modèle murin de tendon fléchisseur transection et de réparation imite de nombreux aspects de la guérison clinique, y compris la formation de tissu cicatriciel abondante et des propriétés mécaniques avec facultés affaiblies. Le modèle décrit ici est pas un vrai récapitulation de la pratique clinique en raison de transection du FDL à la jonction myotendineuse afin de protéger le site de réparation. En outre, ce modèle ne tient pas compte de la contribution des cellules synoviales de la gaine à la réponse de cicatrisation, comme il n'y a pas de gaine synoviale recouvrant la partie médiane du tendon se produit lorsque la réparation. Malgré ces limites, ce modèle a l'avantage de la gamme de production d'adhérences de mouvement de limitation, qui doit encore être démontrée dans des modèles murins que plus de closely rapprochant le scénario clinique. Ce modèle a été utilisé pour évaluer les modèles knock-out souris 12,13, et de tester différentes approches pharmacologiques pour améliorer la guérison 14-17. analyse histologique de ce modèle, par immunohistochimie et hybridation in situ, peut fournir des indications importantes pour la localisation des gènes et des protéines clés au cours de la guérison. Cependant, l'histologie ne donne qu'une analyse spatiale en coupe transversale et ne permet pas de quantification dans l'ensemble du tissu entier. La cytométrie en flux est une approche plus quantitative, mais seulement un nombre très limité de cellules peuvent être isolées à partir du tissu de tendon de guérison dans le modèle de souris, et ce nombre est encore diminué au cours des étapes de fixation, perméabilisation et lavage. Prenant cela en compte, écoulement devient cytométrie une approche irréalisable en raison du nombre d'animaux qui seraient nécessaires. Une autre méthode est nécessaire pour préserver la majorité de cette petite population de cellules dans le butpour caractériser davantage le milieu de guérison. La méthode utilisée pour ce faire, ici, concerne la concentration des cellules isolées par centrifugation cytologique sur une lame de verre, suivie par immunocytochimie. Dans la présente étude EdU (5-éthynyl-2'deoxyuridine, un analogue de la thymidine) l'incorporation et l'étiquetage ultérieur a été utilisé pour déterminer l'état prolifératif relatif de cellules sur le site de guérison. Cette approche peut être appliquée pour tester l'efficacité des traitements pharmacologiques sur la prolifération cellulaire, le gène knock-out ou d'une surexpression ou d'identifier et de quantifier des populations de cellules différentes.
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Protocol
Le Comité de l'Université sur la recherche animale de l'Université de Rochester a approuvé l'ensemble des expérimentations animales. Dix-12 souris C57BL femelle / 6J ont été utilisés.
1. Préparation des animaux pour la chirurgie Flexor Tendon (~ 15 min)
- instruments chirurgicaux autoclaves pour stériliser, porter des gants stériles tout au long, et de maintenir un champ opératoire stérile.
- Anesthésier la souris par injection intrapéritonéale (ip) avec un volume de kétamine (80 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg) correspondant au poids corporel. Confirmer la profondeur de la sédation par absence de toe-pincement réflexe.
- Administrer analgésie préventive (buprénorphine, 0,05-0,1 mg / kg) par injection sous-cutanée. Appliquer une pommade ophtalmique pour éviter les yeux de se dessécher.
- Préparer le site chirurgical par clipsage la fourrure sur l'ensemble du membre postérieur. La stérilisation de la peau par lavage successivement avec de l'iode de povidone, suivie par 70% d'éthanol, et de nouveau avec de la povidone iode.
- Trouver le tendon, vu superficiellement dans la face interne du mollet long fléchisseur des orteils (FDL). L'utilisation d'un scalpel, faire une petite 0,5-1 cm incision dans la peau avec des micro-ciseaux pour exposer le tendon.
- Utilisez une pince pour séparer le tendon FDL du tissu environnant et il trace jusqu'à la jonction myotendineuse. Couper le tendon à cette jonction avec des ciseaux à ressort pour le libérer, en prenant soin d'éviter l'artère tibiale postérieure.
- Fermer la peau avec 5-0 sutures en nylon.
Note: La transection FDL et réparation (étapes 2.4) doivent être effectuées à l'aide d'un stéréomicroscope. - Faire une incision de 3 mm sur l'aspect postérolatérale de la patte arrière en utilisant ressort micro-ciseaux. rétracter délicatement les tissus mous environnants et les muscles avec une pince, en veillant à minimiser les dommages aux tissus, et identifier le tendon FDL.
- Soulevez doucement le tendon FDL et complètement transect en utilisant micro-ciseaux. Suturer les extrémités du tendon FDL ensemble selon un motif Kessler modifié avec des sutures 8-0, évitant ainsi le séchage du tendon en mouillant périodiquement avec une solution saline.
- Remplacer les tissus mous et les muscles sur le tendon, puis fermez l'incision avec 5-0 sutures en nylon.
- Placer des souris sur une lame de chauffe ensemble à 37 ° C, afin de maintenir la température du corps jusqu'à récupéré de l'anesthésie.
- Surveiller les souris post-opératoire pour des signes de déficience ou d'une infection, y compris la vocalisation accrue et fourrure ébouriffée. Injecter buprénorphine (50 pl / souris) comme analgésique toutes les 12 heures jusqu'à ce que les souris ne montrent plus de signes de douleur ou de détresse.
- Permettre aux souris de guérir pendant une période de 10 jours après la chirurgie avant de continuer à les prochaines étapes.
Remarque: Les cellules peuvent être récoltées à tout point de temps après la chirurgie. Ici, 10 jours sont choisis pour ces expériences représentatives étant donné la relativement élevée cellularité du tissu à ce moment.
3. Labeling de cellules Cyclisme (~ 10 min)
- Préparer EdU (5-éthynyl-2'deoxyuridine) solution (10 mg / ml dans une solution saline stérile tamponnée au phosphate [PBS] + 1% de diméthylsulfoxyde [DMSO] pour augmenter la solubilité).
- Injecter souris avec 100 ul EdU (50 mg / kg) par injection ip 24 h avant le sacrifice.
4. Les cellules de récolte pour cytologie Centrifugation (2,5 h, ~ 30 min temps sur les mains)
- Préparer 3 mg / ml de collagénase I dans du PBS.
- Euthanize souris par asphyxie du dioxyde de carbone à un taux de pas plus de 3 L / min Débit et effectuer luxation du rachis cervical en tant que mesure secondaire.
- Localisez le tendon réparé en utilisant l'étape 2.4 ci-dessus, et d'isoler le tissu du tendon en coupant environ 2 mm de chaque côté du site de la lésion avec des micro-ciseaux.
- tissu Hacher avec scalpel dans une boîte de Pétri avec 1 ml de 3 mg / ml de collagénase, puis passer à travers un mélange de 18 aiguilles G à plusieurs reprises pour briser le tissu. Recueillir le mélange dans un tube de 1,5 ml de centrifugeuse. Digest tissu tendineux pendant 1 heure à 37 ° C sous agitation.
- Essorage du tissu vers le bas (300 g pendant 5 min), aspirer la collagénase, puis remettre en suspension les cellules / tissus avec de l'albumine de sérum bovin 500 ul de 3% (BSA) dans du PBS par pipetage de haut en bas plusieurs fois.
- suspension de cellules de filtre à travers un tamis cellulaire de 70 um pour éliminer les débris et de gros morceaux de tendon, et mettre de côté dans un incubateur à 37 °.
- Placez tissu tendineux dans un autre tube de 1,5 ml de centrifugeuse, et rafraîchir avec 1 ml de solution de collagénase, pipetage haut et bas pour mélanger.
- Laisser incuber le tissu encore une heure à 37 ° C sous agitation.
- Isoler tissu tendineux digéré (300 g pendant 5 min), puis remettre en suspension dans 500 pi 3% de BSA dans du PBS par pipetage de haut en bas plusieurs fois.
- Filtre suspension cellulaire à travers un tamis cellulaire de 70 pm, combiner avec suspension isolé en 4.3.3, puis compter les cellules avec un hémocytomètre.
- Laver les cellules une fois avec 3% de BSA dans du PBS, puis remettre en suspension à 3-610 x 4/100 ul.
- Fixer un entonnoir cytologique sur une lame chargée positivement et verrouiller dans le support de diapositives. Insérer l'appareil entier dans une centrifugeuse cytologique et ajouter 100 ul de suspension cellulaire dans l'entonnoir. Centrifuger à 300 g pendant 5 min pour disperser les cellules sur la lame.
5. immunocytochimie pour détecter EdU (2 h, ~ 45 min temps sur les mains)
Remarque: Toutes les étapes d'incubation doivent être effectuées dans l'obscurité pour limiter photoblanchiment des fluorophores.
- les cellules de cercle avec un stylo à barrière hydrophobe pour réduire au minimum une solution nécessaire pour les étapes suivantes, puis fixer immédiatement avec 150 ul de 3% de paraformaldehyde dans du PBS 15 min à température ambiante (TA).
- Laver deux fois pendant 5 min avec 150 ul de BSA à 3% dans du PBS.
- cellules perméabiliser avec 0,5% de Triton-X 100 dans du PBS 20 min à température ambiante.
- étape de lavage répétée comme dans 5.1.1.
- Préparer EdU réaction Cockttous selon les instructions du kit pas plus de 30 minutes avant l'utilisation.
- Ajouter 150 ul cocktail à chaque diapositive, incuber 30 min à température ambiante.
- étape de lavage répétée comme dans 5.1.1.
- Incuber avec 150 ul de contraste nucléaire Hoechst33342 dilué 1: 2000 dans du PBS 30 min à température ambiante.
- Laver deux fois pendant 5 min avec 150 ul de 1 x PBS.
- Ajouter 1-2 gouttes moyen pour les cellules de montage anti-fade, puis lentement lamelle inférieure pour empêcher les bulles.
- Laisser le milieu de montage sécher durant la nuit dans l'obscurité à la température ambiante.
- Utilisez vernis à ongles transparent pour sceller la lamelle à la diapositive.
- Les diapositives d'images au grossissement 40X en utilisant un microscope à fluorescence équipé de filtres d'excitation / émission capables de détecter DAPI (Hoeschst33342) et Texas Red (Alexa Fluor 594).
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Representative Results
Le long fléchisseur des orteils (FDL) musculaire, situé dans le mollet, agit pour fléchir les chiffres de la patte arrière de la souris via le tendon fléchisseur (indiqué en bleu sur la figure 1A, et montré histologiquement à la figure 2A), qui fonctionne de manière proximale de la myotendineuse jonction et se termine par les phalanges distales. Dans ce modèle de tendon fléchisseur guérison, le tendon FDL est sectionnée et réparé à la mi-pied, à proximité de la bifurcation dans les chiffres de la patte arrière (flèches rouges, figure 1A). Pour éviter une rupture de la réparation, qui empêcherait l' analyse expérimentale, le tendon (et le muscle adjacent) est coupé, ou libérés, à la jonction myotendineuse (flèche jaune sur la figure 1B, la libération représenté sur la figure 1C). Bien que cette étape ne soit pas représentatif du scénario clinique, il est essentiel de protéger la réparation en diminuant la pression sur le site de la lésion. Figure 2Dest un exemple histologique d'une rupture de la réparation du tendon fléchisseur, par rapport à une réparation réussie représentée sur la figure 2C. Dans ce dernier, l'affichage du tissu de granulation fortement augmenté cellularité par rapport au tendon intact (figure 2B), et cette population cellulaire peuvent ensuite être analysés plus avant par l' intermédiaire cytologique centrifugation sur une lame suivie par immunocytochimie. La figure 3 illustre le protocole expérimental utilisé pour évaluer l'état prolifératif des cellules recueillies à partir de la guérison des tendons 10 jours post-réparation via EdU incorporation dans l'ADN nouvellement synthétisé. Étiquetage EdU montre donc que les cellules qui ont proliféré activement au cours de la période de 24 heures suivant l'impulsion EdU dans des souris vivantes, comme on le voit sur la figure 4. Une évaluation quantitative de la prolifération dans le tissu de granulation du tendon de guérison peut alors être déterminée par le point de comptage de la préparation cellulaire entière. De cette manière, une base de proliferation peut être établie à chaque point de temps, et toutes les modifications dues aux interventions génétiques ou pharmacologiques peut être évaluée.
Figure 1 :. murin Hind Paw Anatomie et identification du fléchisseur Longus Tendon. Le long fléchisseur des orteils (FDL) fléchit les chiffres dans la patte arrière de la souris et court le long de la face palmaire de la patte arrière (FDL encadrée en bleu) où il bifurque dans les chiffres (flèches rouges) (figure 1A). Proximal, le tendon FDL traverse le tunnel tarsien (flèche noire), dans le mollet, se terminant à la jonction myotendineuse (flèche jaune) (figure 1B). La libération du tendon à la jonction myotendineuse pour empêcher la rupture est représentée sur la figure 1C. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:. Représentant Images histologiques de Un blessé, la guérison normale et Ruptured Flexor Tendon Réparations L'anatomie du tendon FDL dans la patte arrière murin est représentée sur la figure 2A. La barre d'échelle représente 1 mm. Dans les figures 2B-D, le tendon est amplifié à 8X pour comparer tissu tendineux intact (figure 2B) pour une réparation intacte et rupture (figures 2C et 2D, respectivement). Des échantillons de patte arrière entiers ont été fixés dans du formol tamponné neutre, inclus dans la paraffine, coupées en 3 sections um, et colorées avec le Bleu Alcian / hématoxyline / Orange G comme décrit précédemment 13. tendon natif est décrit en bleu, composite tendon / tissu de granulation est décrit en vert, et les flèches noires indiquent des sutures. Les barres d'échelle représentent 200 um. Plocation cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Procédure expérimentale pour Perform EdU Cliquez-il Chimie sur préparations cellulaires Le jour 10 post-chirurgie de guérison des tendons FDL ont été disséqués à partir de pattes arrière de la souris.. Les tendons ont été hachées puis digérés pendant deux heures dans la collagénase I de dissocier les cellules. La suspension cellulaire a été tendu pour éliminer les débris et 6 x 10 ~ 4 cellules ont été centrifugées dans une monocouche sur des lames de verre chargées positivement à l' aide d' une centrifugeuse cytologique. Les cellules ont été entourées avec un stylo barrière hydrophobe et ensuite fixés immédiatement avec du paraformaldéhyde. Après perméabilisation avec du Triton X-100, les cellules ont été traitées avec une détection cocktail EdU, et une réaction click chemistry liés Alexa Fluor 594 à EdU incorporé. Hoechst 33342 a été utilisé comme colorant nucléaire et les cellules wer e analysé à 10-40X avec un microscope à fluorescence. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4:. Immunocytochimie Analyse des cellules à vélo EdU marqués Pendant tendons fléchisseurs Tendon Guérison Guérison FDL ont été récoltées à partir des pattes arrières de souris 10 jours après la chirurgie et digéré avec de la collagénase pour obtenir une suspension cellulaire. La centrifugation a été utilisé pour disperser ces cellules en une monocouche sur des lames, suivie par immunocytochimie à l'image EdU incorporation. La figure 4A et la figure 4B sont des images prises à 10X et 40X respectivement des cellules suivantes analyse immunocytochimique. tache nucléaire Hoechst 33342 est bleu, et les cellules qui ont incorporé EdU sont parsemées de rouge. Les barres d'échelle représentent 50 um.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54433/54433fig4large.jpg" target = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
La procédure chirurgicale pour un modèle murin de transection complète et la réparation du tendon fléchisseur des orteils est présenté dans cette étude. En outre, une nouvelle application de la concentration de petites populations de cellules avec la cytologie centrifugeuse est démontrée, permettant une analyse immunocytochimique quantitative de l'environnement cellulaire pendant la guérison du tendon fléchisseur. Ce modèle de tendon fléchisseur de réparation démontre une réponse de guérison reproductible, qui peut être utilisé pour évaluer les changements dans le processus de guérison en utilisant des modèles knock-out ou d'une intervention pharmacologique. Après l'intervention chirurgicale, une réaction inflammatoire commence dans les 24 heures, au cours de laquelle les cellules sont recrutés au site de la lésion et une cals de tissus fibreux commence à se former. Une phase proliférative suit à environ quatre jours, impliquant beaucoup augmenté cellularité et le dépôt abondant de la matrice extracellulaire désorganisée au niveau du site de réparation, ce qui conduit à la formation d'adhérences entre 14-21 jours. Tissue remodelage contiNues jusqu'au jour 35, au cours de laquelle la continuité et l' organisation du tendon fléchisseur du temps est restauré, et cellularité est réduit 18.
À l'heure actuelle, il existe plusieurs modèles murins de tendon fléchisseur de réparation, en plus de celui présenté ici. Tsubone et al., Ont décrit un modèle in vitro du tendon fléchisseur de guérison 19. Bien que ce modèle peut évaluer les changements dans l' expression des gènes au fil du temps, il ne peut pas expliquer le recrutement de cellules extrinsèques ou des changements de la cytokine milieu inflammatoire / qui se produit in vivo. In vivo, deux modèles de transection partielle ont été développés en utilisant soit incisional ou excisional défauts 20,21. Plus récemment, Wong et al., Caractérisé par un modèle de la zone II de la lésion du tendon fléchisseur dans un modèle murin 22. Ceci est un développement important, car il permet la contribution des cellules de la gaine synoviale dérivé du processus de guérison à définir. Toutefois, aucun quantifiable changements dans la fonction de glissement ont été décrites en utilisant ce modèle. Chaque modèle a ses propres avantages et les limites qui doivent être pris en considération, y compris la facilité technique, la pertinence clinique et l'anatomie. Une limitation principale du modèle décrit ici est que le tendon de cicatrisation peut se rompre avant l'évaluation, le rendant inutilisable pour d'autres analyses. La récolte de cellules suffisantes est fait irréalisable dans ces circonstances, et toute analyse histochimique est pas viable, comme une rupture du tendon ne suit pas le processus de guérison standard décrit ci-dessus. Libérer le tendon FDL proximalement pour diminuer la pression sur le tendon de guérison est donc une étape critique pour la prévention, en dépit du fait qu'il ne soit pas cliniquement pertinente. Déroulement de l'opération unilatérale abaisse également le taux de rupture. Une autre limitation est l'incapacité à suivre la contribution des cellules péri-tendineuses gaine, comme la gaine synoviale n'entoure pas le segment du FDL tendon qui est blessé dans ce modèle.
jove_content "> Une fonction importante de ce modèle tendon de réparation fléchisseur est qu'il permet d'évaluer les cellules sur le site de guérison. immunofluorescence / immunohistochimie (IHC) est une technique biologique commune qui peut être utilisée pour caractériser ces cellules. Bien que IHC est particulièrement bien adapté pour la détermination de l'information spatiale, il est en grande partie une méthode qualitative. les changements dans le tissu ou la composition cellulaire dans toute la profondeur du tissu peut manquer, et la quantification des populations est difficile. cytométrie en flux représente une approche idéale pour définir, quantifier et potentiellement isoler la cellule populations pendant la guérison. Cependant, l' isolement et la digestion du tissu tendineux de guérison de ce modèle des rendements très faible nombre de cellules pour une analyse cytométrique d'écoulement (1-2 x 10 5 en moyenne de chaque souris), et la fixation / perméabilisation étapes pour la détection de marqueurs intracellulaires réduit encore ce nombre. en utilisant la cytologie centrifugation pour concentrer les cellules isolées, suivie par immunocytocheMistry, fournit un moyen de caractériser ces petites populations de cellules. Un avantage important de cette technique est qu'il n'y a pas besoin d'échantillons de piscine ensemble pour obtenir suffisamment de cellules; par conséquent, chaque souris représente un échantillon individuel pour analyse. Une considération importante dans la production de ces préparations de cellules consiste à maintenir la cohérence dans le tissu prélevé pour analyse. muscle environnant et fascia peuvent adhérer au tissu de granulation et doivent être soigneusement disséquée. Étant donné que cette méthode implique un traitement minimal des cellules avant la fixation sur des lames, il conserve une majorité de cellules isolées pour une analyse ultérieure. De cette façon, la quasi-totalité de la population de cellules constituant le tissu d'adhérence au niveau du site de réparation peut être évaluée quantitativement par immunocytochimie. Dans la présente étude, EdU incorporation par les cellules en prolifération est utilisé pour démontrer l'application de cette technique de cytologie, cependant, il peut également être utilisé pour plus complexe et en profondeur la caractérisation of populations cellulaires hétérogènes impliquées dans la cicatrisation du tendon fléchisseur. futures applications de cette technique peut conduire à une caractérisation plus approfondie des populations cellulaires impliqués dans la cicatrisation tendineuse, car elle permet de déterminer la co-localisation de marqueurs cellulaires dans les cellules associées au tissu de granulation dans un tendon de cicatrisation.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Ce travail a été partiellement financé par la Société américaine pour la chirurgie du Prix Pilot Main et NIH / NIAMS 1K01AR068386-01 (à AEL) et NIAMS / NIH P30AR061307.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical preparation | |||
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | 000664 | |
| Ketamine | Hospira | NDC# 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Lloyd Inc. | NDC# 61311-482-10 | |
| Buprenorphine | Par Pharmaceutical Inc. | NDC# 42023-179-10 | |
| 0.9% sodium chloride irrigation | Hospira | NDC# 0409-6138-03 | For preparation of ketamine/xylazine and buprenorphine solutions |
| 1 ml syringe | BD | 309659 | |
| 30 G needle | BD | 305106 | |
| Povidone-Iodine solution | Aplicare | 82-226 | |
| 70% ethanol | |||
| Puralube vet opthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | NDC# 17033-211-38 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools | |||
| Portable balance 200 g | Ohaus | SP202 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15124-12 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Needle holders | Fine Science Tools | 91201-13 | |
| Micro spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Micro needle holders | Fine Science Tools | 12061-02 | |
| 5-0 nylon sutures | Ethicon | 668G | |
| 8-0 microsurgery nylon sutures | Ethicon | 2808G | |
| Lab-Line histology slide warmer | Barnstead International | 26025 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytospin method | |||
| Collagenase Type I, lyophilized | Life Technologies | 1700-017 | |
| Bovine Serum Albumin | Cell Signaling Technologies | 9998S | |
| 1x PBS | Thermo Fisher | 10010-023 | |
| Cytology funnels | Fisher HealthCare | 10-354 | |
| HistoBond+ microscope slides | VWR | 16005-110 | |
| Cytospin 2 centrifuge | Shandon | SH-CYTO2 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunocytochemistry | |||
| Slide staining tray with black lid | IHC World | M920-2 | |
| Click-iT Plus EdU Imaging Kit | Life Technologies | C10639 | Includes EdU and Hoeschst 33342 |
| Immedge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| ProLong Diamond mounting medium | Thermo Fisher | P36970 | |
| Glass coverslips 24 x 50 mm #1.5 | |||
| Clear nail polish |
References
- Lin, T. Biomechanics of tendon inury and repair. J Biomech. 37, 865-877 (2004).
- Strickland, J. W. Development of flexor tendon surgery: twenty-five years of progress. J Hand Surg [Am]. 25, 214-235 (2000).
- Bunnell, S. Repair of tendons in the fingers and description of two new instruments. Surg Gynecol Obstet. 26, 103-110 (1918).
- Aydin, A., et al. Single-stage flexor tendoplasty in the treatment of flexor tendon injuries. Acta Orthop Traumatol Turc. 38, 54-59 (2004).
- Gelberman, R. H., Steinberg, D., Amiel, D., Akeson, W. Fibroblast chemotaxis after tendon repair. J Hand Surg Am. 16, 686-693 (1991).
- Lundborg, G., Rank, F. Experimental intrinsic healing of flexor tendons based upon synovial fluid nutrition. J Hand Surg Am. 3, 21-31 (1978).
- Aoki, M., Kubota, H., Pruitt, D. L., Manske, P. R. Biomechanical and histologic characteristics of canine flexor tendon repair using early postoperative mobilization. J Hand Surg Am. 22, 107-114 (1997).
- Kim, H. M., et al. Technical and biological modifications for enhanced flexor tendon repair. J Hand Surg Am. 35, 1031-1037 (2010).
- Aoki, M., Manske, P. R., Pruitt, D. L., Kubota, H., Larson, B. J. Work of flexion after flexor tendon repair according to the placement of sutures. Clin Orthop Relat Res. , 205-210 (1995).
- Zhao, C., et al. Award for Outstanding Orthopaedic Research: Engineering flexor tendon repair with lubricant, cells, and cytokines in a canine model. Clin Orthop Relat Res. 472, 2569-2578 (2014).
- Wong, J., Bennett, W., Ferguson, M. W., McGrouther, D. A. Microscopic and histological examination of the mouse hindpaw digit and flexor tendon arrangement with 3D reconstruction. J Anat. 209, 533-545 (2006).
- Katzel, E. B., et al. Impact of Smad3 loss of function on scarring and adhesion formation during tendon healing. J. Orthop. Res. 29, 684-693 (2011).
- Loiselle, A. E., et al. Bone marrow-derived matrix metalloproteinase-9 is associated with fibrous adhesion formation after murine flexor tendon injury. PloS one. 7, e40602 (2012).
- Lee, D. J., et al. Parathyroid hormone 1-34 enhances extracellular matrix deposition and organization during flexor tendon repair. J Orthop Res. 33, 17-24 (2015).
- Geary, M. B., et al. Systemic EP4 Inhibition Increases Adhesion Formation in a Murine Model of Flexor Tendon Repair. PloS one. 10, e0136351 (2015).
- Loiselle, A. E., et al. Development of antisense oligonucleotide (ASO) technology against Tgf-beta signaling to prevent scarring during flexor tendon repair. J Orthop Res. 33, 859-866 (2015).
- Orner, C. A., Geary, M. B., Hammert, W. C., O'Keefe, R. J., Loiselle, A. E. Low-dose and short-duration Matrix Metalloproteinase 9 Inhibition does not affect adhesion formation during murine flexor tendon healing. Plast Reconstr Surg. , (2016).
- Loiselle, A. E., et al. Remodeling of murine intrasynovial tendon adhesions following injury: MMP and neotendon gene expression. J Orthop Res. 27, 833-840 (2009).
- Tsubone, T., et al. Effect of TGF-beta inducible early gene deficiency on flexor tendon healing. J Orthop Res. 24, 569-575 (2006).
- Beason, D. P., Kuntz, A. F., Hsu, J. E., Miller, K. S., Soslowsky, L. J. Development and evaluation of multiple tendon injury models in the mouse. J Biomech. 45, 1550-1553 (2012).
- David, M. A., et al. Tendon repair is compromised in a high fat diet-induced mouse model of obesity and type 2 diabetes. PloS one. 9, e91234 (2014).
- Wong, J. K., et al. The cellular biology of flexor tendon adhesion formation: an old problem in a new paradigm. Am J Pathol. 175, 1938-1951 (2009).
