Summary
גידים מכופפים ביד נפצעים נפוץ, מה שמוביל פונקצית יד לקויה. עם זאת, תגובת ריפוי צלקת הרקמות אינה מאופיינת היטב. מודל Murine של ריפוי גיד מכופף מודגם כאן. מודל זה יכול לשפר את ההבנה הכוללת של תהליך הריפוי ולהעריך גישות טיפוליות כדי לשפר את הריפוי.
Abstract
גיד מתחבר שרירים ועצמות השלד, הקלת התנועה של כמעט את כל הגוף. ביד, גידים מכופפים (FTS) לאפשר כיפוף האצבעות ותפקוד יד בכלל. פציעות FTS נפוצות, וריפוי משביע רצון לעתים קרובות נפגע בשל רקמת צלקתית עודפי הידבקויות בין גיד הרקמה שמסביב. עם זאת, מעט מאוד ידוע על הרכיבים המולקולריים התאיים של תיקון FT. לשם כך, מודל Murine של תיקון FT כי משחזר היבטים רבים של ריפוי בבני אדם, כולל מגוון לקוי של תנועה וירידה תכונות מכניות, פותחה שתואר לעיל. הנה הדגמה מעמיקה של הליך כירורגים זה מסופקת, מעורב חיתוך רוחב והתיקון הבא של longus digitorum המכופף (FDL) גיד הכף האחורית בעכברים. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לבצע ניתוח שושלת של תאים מסוגים שונים, להעריך את ההשפעות של רווח גן או פסד של פונקציה, וכדי לבדוק את האפיםcacy של התערבויות תרופתיות בתהליך הריפוי. עם זאת, ישנן שתי מגבלות עיקריות מודל זה: i) גיד FDL באמצע החלק של הכף האחורית בעכברים, שבו חיתוך הרוחב והתיקון להתרחש, אינו מוקף נדן סינוביאלי. לכן מודל זה אינו לוקח בחשבון את התרומה הפוטנציאלית של הנדן לתהליך היווצרות צלקת. ii) כדי להגן על היושרה של אתר התיקון, FT הוא שוחרר בצומת myotendinous, ומקטין את הכוחות המכאניים של הגיד, תורם סביר היווצרות צלקת מוגברת. בידוד של תאים מספיק מן הרקמה פרור של FT במהלך תהליך הריפוי עבור ניתוח תזרים cytometric הוכיח מאתגר; צנטריפוגה ציטולוגיה להתרכז תאים אלה היא שיטה חלופית בשימוש, ומאפשר הדור של ההכנות התא שעליו תיוג immunofluorescent יכול להתבצע. באמצעות שיטה זו, כימות של תאים או חלבונים בעלי עניין במהלך ריפוי FT הופכת אפשרית.
Introduction
גידים מכופפים בעבודת היד בתיאום עם השרירים המכופפים של אמת נדנים דיגיטליים כדי לאפשר כיפוף של הספרות ותפקוד אחיזה של היד. גידים מכופפים לרוץ לאורך היבט Palmar של היד; יחסית שטחית במיקום זה לעתים קרובות תוצאות פציעות בגידים המכופפים במהלך טראומה אל היד. גידים לרפא באמצעות תגובת צלקת רקמות ולא התחדשות של גיד נורמלי רקמות 1. בעוד רקמת צלקת זה מספקת המשכיות לגיד, פונקציה דרמטית פחת יחסית גיד בריא. מרוכבים רקמת גיד-צלקת מאופיינים תכונות מכניות לקוי 1, טיוח הגידים לתיקון סביר יותר להתפקע. בנוסף, רקמת צלקת חסרה את הארגון של מבנה סיבי קולגן גיד הילידים, וכתוצאה מכך לעלייה בגודל גיד וצובר. בהתחשב במגבלות האנטומי של יחידת-נדן הגיד, אפילו עלייה מתונה גודל גיד יכול דרסטי אדוםתחיקת פונקצית הגלישה של הגיד, ולכן טווח ספרה של תנועה ותפקוד יד.
לפני של פציעות 1960 עד הגידים המכופפים, בעיקר אלו המופיעות Zone II של היד, לא תוקנו באופן שיגרתי עקב הסיבוכים החמורים בריפוי שהתעוררו עם תיקונים אלה 2. אזור זה של היד כונה "שטח הפקר" 3. עם זאת, שיפורים בטכניקות הכירורגיות, דפוסי תפר ופרוטוקולים שיקום פיזיותרפיה השתפרו באופן דרמטי התוצאות של תיקונים גיד מכופף 2. למרות ההתפתחויות הללו, עד 40% של תיקונים לגרום להיווצרות הדבקה מספיק כדי לעכב ביד פונקציה 4. לכן, גישה ביולוגית נדרשה לשפר את הריפוי. למרבה הצער, מעט מאוד ידוע על תהליך ריפוי הגיד ברמה התאית ומולקולרית. לכן, המטרה הייתה לפתח מודל בעכברים שיכולים לשמש כדי לשפר את מבין מה היסודגרם של רכיבים התאיים ומולקולריים של ריפוי גיד מכופף ותגובת היווצרות הצלקת, כאמצעי לזיהוי מטרות טיפוליות חדשניות כדי לשפר את הריפוי.
גדולים יותר במודלים של בעלי חיים כבר סייעו לקדם הבנה של תהליך ריפוי הגיד המכופף. מחקרים בכלבי ארנב הוכיחו הוא את יכולת הריפוי הפנימית וחיצונית של גידים מכופפים 5,6, את החשיבות של תנועה פסיבית מבוקרת מוקדם מזעור ביחס היווצרות הידבקות לחוסר מעש 7, כמו גם את ההשפעות של דפוסי תפר שונים על תהליך הריפוי 8 , 9. בנוסף, מודל הכלבים כבר שימושי בבדיקת גישות רקמות הנדסת translational כדי לשפר את הריפוי 10. עם זאת, ישנם מספר יתרונות חשובים באמצעות קרוב משפחה במודל Murine מודל חיה גדולה, כולל בעלות היחסית, זמינות של ריאגנטים ספציפיים בעכברים, ואת הקלות של יצירת knoc העולמיk-outs או בונת מחיקה / ביטוי יתר רקמות ספציפיות. יתר על כן, את הדמיון התפקודי בין אדם ועכברים ביחס גידים מכופפים 11 מצביע על התועלת הפוטנציאלית בפיתוח מודל בעכברים.
פיתוח של מודל Murine של מחקת תיקון חיתוך רוחב ו גיד מכופף היבטים רבים של ריפוי קליני, כוללים ההיווצרות של רקמת צלקתית שופעת תכונות מכאניות לקויות. המודל המתואר כאן אינו ששחזור אמיתי של פרקטיקה קלינית עקב חיתוך רוחב של FDL בצומת myotendinous כדי להגן על האתר לתקן. יתר על כן, מודל זה אינו לוקח בחשבון את התרומה של תאי נדן סינוביאלי לתגובת הריפוי, כפי שאין נדן סינוביאלי כיסוי החלק באמצע של הגיד שבו התיקון מתרחש. למרות מגבלות אלה, מודל זה יש את היתרון של מגוון המניב של הידבקויות הגבלת תנועה, אשר טרם הוכיח במודלי Murine שיותר קלואיליי להיות קרובים ככל האפשר תרחיש הקליני. מודל זה נעשה שימוש כדי להעריך מודלים עכבר נוק-אאוט 12,13, וכדי לבחון גישות פרמקולוגיות שונות כדי לשפר את הריפוי 14-17. היסטולוגית מנתח של מודל זה, באמצעות אימונוהיסטוכימיה ו הכלאה באתרו, יכול לספק תובנות חשובות ל לוקליזציה של גנים מפתח וחלבונים במהלך הריפוי. עם זאת, היסטולוגיה מספק רק ניתוח מרחבי חתך ואינו מאפשר כימות ברחבי הרקמה כולה. Cytometry זרימה מייצגת גישה כמותית יותר, אך רק מספר מצומצם מאוד של תאים יכול להיות מבודד רקמת גיד ריפוי במודל העכבר, ומספר זה ירד עוד יותר במהלך שלבי קיבעון, permeabilization, ואת כביסה. אם תיקח את זה לחשבון, cytometry זרימה הופך גישה ישימה בשל מספר בעלי החיים אשר יידרש. שיטה חלופית יש צורך לשמר את רוב האוכלוסייה תא קטן זה כדיעוד לאפיין את סביבת הריפוי. השיטה המשמשת להשגת יעד זה, המוצג כאן, כרוך ריכוז של תאים בודדים באמצעות צנטריפוגה ציטולוגיה לשקופית זכוכית, ואחריו immunocytochemistry. במחקר הנוכחי EDU (5-ethynyl-2'deoxyuridine, אנלוגי thymidine) התאגדות התיוג הבא שמשה כדי לקבוע את מצב השגשוג היחסי של תאים באתר הריפוי. גישה זו ניתן ליישם על מנת לבחון את היעילות של טיפול תרופתי על התפשטות תאים, גני נוק-אאוט או ביטוי יתר, או לזהות ולכמת אוכלוסיות תאים שונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ועדת אוניברסיטת על בעלי חיים למחקר באוניברסיטת רוצ'סטר אישר את כל הניסויים בבעלי חיים. עשרה-12 בשבוע C57BL נקבה בת / 6J שמש.
1. הכנת בעלי חיים לכירורגיה גיד מכופף (~ 15 דקות)
- מכשירי ניתוח חיטוי לעקר, ללבוש כפפות סטריליות במהלך, ולשמור על שדה הפעלה סטרילי.
- להרדים את העכבר באמצעות זריקה intraperitoneal (IP) עם נפח של קטמין (80 מ"ג / ק"ג) ו xylazine (10 מ"ג / ק"ג) המתאים למשקל הגוף. אשר עומק הרגעה באמצעות העדר רפלקס הבוהן קמצוץ.
- נהל שיכוך כאבים מנע (עצירות, 0.05-0.1 מ"ג / ק"ג) באמצעות זריקה תת עורית. החל משחת עיניים כדי למנוע את העיניים מהתייבשות.
- מכין את האתר כירורגית על ידי גזירה את הפרווה על הגפיים האחוריים כולו. לעקר את העור על ידי שפשוף ברצף עם יוד povidone, ואחריו אתנול 70%, ושוב עם יוד povidone.
ילדה = "jove_title"> 2. Murine מכופף פגיעה גיד וכירורגיה תיקון (~ 10 דקות)
- מצא את longus digitorum המכופף (FDL) הגיד, ראה שטחי בהיבט המדיאלי של העגל. באמצעות אזמל, לעשות חתך 0.5-1 ס"מ קטן בעור עם מספריים מיקרו לחשוף את הגיד.
- שימוש במלקחיים כדי להפריד את גיד FDL מן הרקמה שמסביב ואת עקבות אותו עד לצומת myotendinous. חותך את הגיד בצומת זה במספריים באביב כדי לשחרר אותו, מקפיד להימנע עורק הטיביאלי האחורי.
- סגור את העור עם 5-0 תפרי ניילון.
הערה: חיתוך רוחב ותיקון FDL (שלבים 2.4) צריך להתבצע באמצעות סטראו. - ביצוע חתך 3 מ"מ מעל היבט posterolateral של הכף האחורית באמצעות באביב-מספרי מייקרו. בעדינות לחזור בו רקמות שריר הרכות שמסביב עם מלקחיים, והקפד למזער נזק לרקמות, ולזהות את גיד FDL.
- בעדינות להעלות את גיד FDL והוא לחלוטין transect אותו באמצעות מיילהקרו-מספריים. לתפור את הקצוות של FDL יחד גיד בדפוס קסלר שונה עם 8-0 תפרים, הימנעות ייבוש של גיד באמצעות הרטבתה עם מי מלח מעת לעת.
- חלף רקמות שריר רכים מעל הגיד, ואז לסגור את החתך עם 5-0 תפרי ניילון.
- מניחים עכברים בשקופית סט חם עד 37 מעלות צלזיוס, כדי לשמור על טמפרטורת הגוף עד התאושש מן ההרדמה.
- צג עכברים שלאחר ניתוח עבור סימנים לירידת ערך או זיהום כוללים בדיבור מוגבר ופרווה פרועה. להזריק עצירות (50 μl / עכבר) כמו משכך כאבים כל 12 שעות עד העכברים כבר לא מראים סימנים של כאב או מצוקה.
- אפשר עכברים לרפא לתקופה של 10 ימים שלאחר ניתוח לפני שתמשיך אל השלבים הבאים.
הערה: תאים ניתן לקצור בכל עת נקודות שלאחר ניתוח. הנה, 10 ימים הם נבחרו ניסויי נציגים אלה בהתחשב cellularity הגבוהה יחסית של הרקמה בשלב זה.
3. Labeling של תאי רכיבה על אופניים (~ 10 דקות)
- הכן EDU (5-ethynyl-2'deoxyuridine) פתרון (10 מ"ג / מ"ל ב בופר פוספט סטרילי [PBS] + 1% דימתיל sulfoxide [DMSO] להגדיל מסיסות).
- להזריק עכברים עם 100 μl EDU (50 מ"ג / ק"ג) באמצעות הזרקה IP 24 שעות לפני להקריב.
4. קציר תאים ציטולוגיה צנטריפוגה (2.5 שעות, ~ 30 hands-on דקות זמן)
- הכן 3 מ"ג / מ"ל collagenase אני PBS.
- להרדים העכבר באמצעות מחנק פחמן דו חמצני בקצב זרימה של לא יותר מ -3 ליטר / דקה, ולבצע נקע בצוואר הרחם כאמצעי משני.
- אתר את הגיד לתקן אותה בעזרת צעד 2.4 לעיל, ולבודד רקמת גיד ידי קיצוץ של כ 2 מ"מ משני צדי במקום פציעה עם מספרי מייקרו.
- רקמת בשר טחון עם אזמל בצלחת פטרי עם 1 מ"ל של 3 מ"ג / מ"ל collagenase, ולאחר מכן להעביר התערובת דרך מחט G 18 מספר פעמים כדי לשבור את הרקמה. אסוף התערובת לתוך צינור 1.5 מ"ל צנטריפוגות. תקציר רקמת גיד במשך שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס עם רעד.
- ספין רקמות למטה (300 XG במשך 5 דקות), collagenase לשאוב, ואז התאים resuspend / רקמות עם 500 μl 3% אלבומין בסרום שור (BSA) ב- PBS על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים.
- תא ההשעיה סינון דרך מסננת תא 70 מיקרומטר להסיר פסולת חתיכות גדולות של גיד, ומניחים בצד בתוך 37 ° C חממה.
- מניחים רקמות גיד לתוך צינור צנטריפוגות 1.5 מ"ל אחר, ולרענן עם פתרון collagenase 1 מ"ל, pipetting מעלה ומטה כדי לערבב.
- דגירה רקמת עוד שעה על 37 מעלות צלזיוס עם רעד.
- ספין למטה רקמת גיד מתעכל (300 XG במשך 5 דקות), resuspend אז BSA 500 μl 3% ב PBS על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים.
- סנן השעית תא דרך מסננת תא 70 מיקרומטר, לשלב עם ההשעיה מבודדת 4.3.3, ואז לספור תאים עם hemocytometer.
- שטפו תאים פעם נוספת עם 3% BSA ב PBS, ואז resuspend 3-6x 10 4/100 μl.
- צרף משפך ציטולוגיה לשקופית בעלי מטען חשמלי חיובי וכלא לתוך המוביל שקופית. הכנס את המנגנון כולו לתוך צנטריפוגות ציטולוגיה ולהוסיף 100 השעית תא μl אל המשפך. צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות כדי לפזר את התאים על לשקופית.
5. Immunocytochemistry כדי זיהוי edu (2 hr, ~ 45 hands-on דקות זמן)
הערה: כל שלבי הדגירה צריכות להתבצע בחושך להגביל photobleaching של fluorophores.
- תאים מעגל עם עט מחסום הידרופובי למזער הפתרון הנדרש עבור השלבים הבאים, ולאחר מכן מיד לתקן עם 150 μl paraformaldehyde 3% ב 15 דקות PBS בטמפרטורת החדר (RT).
- שטפו פעמיים במשך 5 דקות עם BSA 150 μl 3% ב PBS.
- תאים Permeabilize עם 0.5% Triton-X 100 ב 20 דקות PBS ב RT.
- שלב לשטוף חזור כמו 5.1.1.
- כן cockt תגובת eduail בהתאם להוראות ערכה לא יותר מ -30 דקות לפני השימוש.
- להוסיף 150 μl קוקטייל כל שקופית, דגירה 30 דקות ב RT.
- שלב לשטוף חזור כמו 5.1.1.
- דגירה עם 150 μl גרעיני counterstain Hoechst33342 בדילול 1: 2,000 ב 30 דקות PBS ב RT.
- שטפו פעמיים במשך 5 דקות עם 150 μl 1x PBS.
- להוסיף 1-2 טיפות לדעוך אנטי הרכבה בינונית לתאים, ואז coverslip התחתון לאט כדי למנוע בועות.
- אפשר הרכבה בינונית לרפא לילה בחושך ב RT.
- השתמש ברור לק כדי לאטום את coverslip לשקופית.
- שקופיות תמונה בהגדלה 40X באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד מסנני עירור / פליטה של מסוגלים גילוי DAPI (Hoeschst33342), וטקסס אדומה (אלקסה פלואוריד 594).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Longus digitorum מכופף השרירים (FDL), הממוקמים העגל, פועל כדי להגמיש את הספרות של הכף האחורית עכבר באמצעות הגיד המכופף (התווה בכחול באיור 1A, והראה היסטולוגית באיור 2 א), אשר פועלת proximally מן myotendinous צומת של דבר הוא מגיע הפלנגות דיסטלי. במודל זה של ריפוי גיד מכופף, גיד FDL הוא transected ותקן על אמצע הרגל, בקרבה ההסתעפות אל הספרות של הכפה האחורית (חצים אדומים, איור 1 א). כדי למנוע קרע של התיקון, אשר ימנע ניתוח הניסיון, הגיד (ושריר סמוך) הוא חתך, או שוחררו, בצומת myotendinous (החץ צהוב באיור 1B, השחרור שמוצג באיור 1C). בעוד צעד זה אינו מייצג את התרחיש הקליני, זה קריטי להגן על התיקון על ידי הפחתת עומס על אתר הפציעה. איור 2 דהיא דוגמה היסטולוגית של תיקון גיד מכופף מקרע, לעומת תיקון מוצלח שמוצג באיור 2C. בחודש האחרון, מציגה רקמת גרנולציה גדל מאוד cellularity לעומת גיד וללא כל פגע (איור 2 ב), והאוכלוסייה תא זה אז יכול להיות מנותח נוספת באמצעות צנטריפוגה ציטולוגיה לשקופית ואחריו immunocytochemistry. איור 3 מתאר את הליך הניסוי נעשה שימוש כדי להעריך מדינת השגשוג של התאים שנאספו גידי ריפוי 10 ימים שלאחר תיקון דרך התאגדות edu לתוך ה- DNA המסונתז חדש. תיוג EDU ולכן מראה רק תאים אלה, המצויים בשפע פעיל בתקופת 24 שעות לאחר הדופק edu בעכברים חיים, כפי שניתן לראות באיור 4. הערכה כמותית של התפשטות בתוך הרקמה פרור של גיד ריפוי ניתן לקבוע מכן על ידי ספירת נקודות של הכנת התא כולו. בדרך זו, בסיס של prolifeמנה ניתן להקים בכל נקודת זמן, וכל שינוי בשל התערבויות גנטיות או תרופתיות ניתן להעריך.
איור 1 :. Murine הינד Paw האנטומיה וזיהוי של גיד המכופף digitorum Longus. Longus digitorum המכופף (FDL) מכופף את ספרות הכף האחורית עכבר ורץ לאורך היבט Palmar הכף האחורית (FDL התווה בכחול) איפה זה מתפצל הספרות (חצים אדומים) (איור 1 א). Proximally, הגיד FDL עובר דרך התעלה הטרסלית (חץ שחור), אל העגל, שהסתיים בצומת myotendinous (חץ צהוב) (איור 1 ב). שחרורו של הגיד בצומת myotendinous כדי למנוע קרע מוצג באיור 1C. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:. תמונות נציג היסטולוגית של Un-פצוע, ריפוי רגיל ותיקוני גיד מכופף מקרע האנטומיה של גיד FDL ב הכף האחורית murine מוצג באיור 2 א. סרגל קנה מידה מייצג 1 מ"מ. איורי 2B-D, הגיד מוגדל ב 8X להשוות רקמת גיד וללא כל פגע (איור 2 ב) אל תיקון שלם מקרע (2C הדמוי & 2D, בהתאמה). דגימות כפה כל האחוריות היו קבועים נייטרלי שנאגרו פורמלין, מוטבע פרפין, לחתוך ל -3 מיקרומטר חלקים, ומוכתם Alcian כחול / Hematoxylin / אורנג 'G כפי שתואר לעיל 13. גיד Native מתואר כחול, גיד / פרור מרוכבים רקמות מתוארים בירוק, חיצים שחורים הצביע תפרים. ברי סולם מייצגים 200 מיקרומטר. Pלחכור לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: נוהל ניסיוני לבצע edu לוחץ-זה כימיה על הכנות תא ביום 10 שלאחר ניתוח ריפוי גידי FDL היו גזור מן כפות עכבר אחורי.. הגידים היו טחונים אז מתעכלים במשך שעות collagenase לי לנתק את התאים. ההשעיה התא היה מתוח כדי להסיר שאריות, ו ~ 6 x 10 4 תאים היו הסתחרר לתוך בשכבה בשקופיות זכוכית בעלי מטען חשמלי חיובי באמצעות צנטריפוגות ציטולוגיה. התאים היו הקיפו עם עט מחסום הידרופובי ואז תוקנו מייד עם paraformaldehyde. לאחר permeabilization עם טריטון X-100, התאים טופלו עם קוקטייל זיהוי edu, ותגובת הכימיה לחץ כבול אלקסה פלואוריד 594 ל Edu משולב. Hoechst 33342 שימש גרעיני כתם, והתאים wer דואר ונותח 10-40X עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4:. Immunocytochemistry ניתוח של הרכיבה על אופני תאי edu שכותרתו במהלך מכופף גיד ריפוי גידי הריפוי FDL נבצר מן הכפותה האחורית של עכברים 10 ימים לאחר הניתוח מתעכל עם collagenase כדי לקבל השעית תא. צנטריפוגה שימש לפיזור תאים אלה לתוך monolayer בשקופיות, ואחריו immunocytochemistry להכללתו תמונה edu. איור 4 א ואיור 4B הם תמונות שצולמו 10X ו 40X בהתאמה של תאים בעקבות ניתוח immunocytochemical. כתם גרעיני Hoechst 33342 הוא כחול, ותאים שילבו edu מנוקדים אדום. ברי סולם מייצגים 50 מיקרומטר.יעד href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54433/54433fig4large.jpg" = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הליך כירורגי עבור מודל Murine של חיתוך רוחב מלא ותיקון של גיד longus digitorum מכופף מוצג במחקר זה. בנוסף יישום רומן לרכז אוכלוסיות תאים קטנות עם צנטריפוגות ציטולוגיה מודגם, המאפשר ניתוח immunocytochemical כמוני של הסביבה הסלולר במהלך ריפוי גיד מכופף. מודל זה של תיקון גיד מכופף מדגים תגובת הריפוי לשחזור, אשר ניתן להשתמש בהם כדי להעריך שינויים בתהליך הריפוי באמצעות מודלים בנוקאאוט או עם התערבות פרמקולוגית. לאחר הניתוח, תגובה דלקתית מתחיל תוך 24 שעות, שבמהלכו התאים מגויסים לאתר הפגיעה יבלת של רקמה סיבית מתחילה להיווצר. שלב שגשוג כדלקמן בסביבות היום ארבעה, מעורב cellularity גדל מאוד בתצהיר שפע של תאי מטריקס לא מאורגנים באתר התיקון, המוביל להיווצרות דבקה בין 14-21 ימים. קונטי שיפוץ רקמותnues דרך היום 35, שבו משכיות זמן וארגון של הגיד המכופף משוחזרות, ו cellularity מצטמצם 18.
נכון לעכשיו, יש מספר דגמים Murine של תיקון גיד מכופף בנוסף לזה המוצג כאן. Tsubone et al., תאר מודל במבחנה של ריפוי גיד מכופף 19. בעוד המודל הזה יכול להעריך שינויים בביטוי גנים לאורך זמן, זה לא יכול להסביר את הגיוס של תאים או שינויים חיצוניים במילייה הדלקתית / ציטוקינים המתרחשת in vivo. בשנת vivo, שני דגמים של חיתוך רוחב חלק פותחו באמצעות אחת incisional או excisional פגמים 20,21. לאחרונה, וונג et al., מאופיין מודל II אזור פציעת גיד מכופף במודל בעכברים 22. זוהי התפתחות חשובה, שכן היא מאפשרת את התרומה של תאים שמקורם נדן סינוביאלי לתהליך הריפוי שתוגדר. עם זאת, לא ניתן לכימות שינויים בתפקוד גלישה תוארו באמצעות מודל זה. לכל דגם יתרונות משלה ומגבלות כי יש לקחת בחשבון, כולל הקלות הטכנית, הרלוונטיות הקלינית ואנטומיה. מגבלה עיקרית של המודל המתואר כאן היא כי גיד הריפוי עלול לגרום לפריצה קודם להערכה, טיוח זה לא שמיש לניתוח נוסף. קציר מספיק תאים נעשה ישים בנסיבות אלה, וכל ניתוח histochemical אינו בת קיימא, כמו גיד קרוע לא פעל את תהליך ריפוי התקן שתואר לעיל. שחרור הגיד FDL proximally כדי להקטין את הלחץ על גיד הריפוי ולכן צעד קריטי למניעה, למרות שזה לא רלוונטי מבחינה קלינית. ניצוח הניתוח באופן חד-צדדי גם מוריד את שיעור הקרע. מגבלה נוספת היא חוסר היכולת לעקוב אחר תרומת תאי נדן פרי-tendinous, כמו נדן הסינוביאלי אינו להקיף בקטע של גיד FDL כי הוא נפגע במודל זה.
jove_content "> תפקיד חשוב של מודל תיקון גיד מכופף זו הוא שהיא מאפשרת הערכה של תאים באתר הריפוי. Immunofluorescence / אימונוהיסטוכימיה (IHC) היא טכניקה ביולוגי משותף שניתן להשתמש בהם כדי לאפיין תאים אלה. בעוד IHC מתאימה באופן ייחודי זיהוי מידע מרחבים, היא שיטה איכותית ברובו. שינויים ברקמה או רכב תא ברחבי עומק הרקמה ניתן לפספס, והכימות של אוכלוסיות קשה. cytometry זרימה מייצגת גישה אידיאלית להגדיר, לכמת ולבודד פוטנציאל תא אוכלוסיות במהלך ריפוי. עם זאת, בידוד ועיכול רקמת גיד ריפוי מתשואות מודל זה מספרים סלולריים נמוכים מאוד עבור ניתוח התזרים cytometric (1-2 x 10 5 בממוצע כל עכבר), קיבעון / צעדים permeabilization לגילוי של סמנים תאיים מפחית מספר זה עוד יותר. באמצעות צנטריפוגה ציטולוגיה לרכז את בתאים מבודדים, ואחריו immunocytocheמיסטרי, מספק דרך לאפיין אוכלוסיות תאים קטנים אלה. יתרון משמעותי של שיטה זו הוא כי אין צורך דגימות ברכה יחד כדי להשיג מספיק תאים; ולכן כל עכבר מייצג מדגם בודד לניתוח. שיקול חשוב ביצירת הכנות תאים אלה הוא שמירה על עקביות בתוך הרקמה שנקטפה לניתוח. שרירי fascia שמסביב עשויים לדבוק רקמת גרנולציה וצריכים גזורים בקפידה משם. מאז שיטה זו כרוכה עיבוד מינימלי של תאים לפני קיבוע בשקופיות, זה יישאר רוב של תאים מבודדים לניתוח נוסף. בדרך זו, כמעט כל אוכלוסיית תאים המרכיבים את רקמת ההידבקות באתר התיקון ניתן להעריך כמותית באמצעות immunocytochemistry. במחקר הנוכחי, שילוב edu ידי תאים מתרבים משמש כדי להדגים את היישום של טכניקת ציטולוגיה זה, עם זאת, זה יכול לשמש גם עבור יותר מורכב o אפיון מעמיקf אוכלוסיות תאי הטרוגנית המעורבים בריפוי גיד מכופף. יישומים עתידיים של טכניקה זו עשויה להוביל יותר באפיון מעמיק של אוכלוסיות תאים המעורבים בריפוי גיד, שכן היא מאפשרת לקביעת שיתוף לוקליזציה של סמנים תאיים בתאים הקשורים רקמת גרנולציה ב גיד ריפוי.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי האגודה האמריקאית לכירורגיה של פרס פיילוט יד ו- NIH / NIAMS 1K01AR068386-01 (כדי AEL) ו NIAMS / NIH P30AR061307.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical preparation | |||
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | 000664 | |
| Ketamine | Hospira | NDC# 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Lloyd Inc. | NDC# 61311-482-10 | |
| Buprenorphine | Par Pharmaceutical Inc. | NDC# 42023-179-10 | |
| 0.9% sodium chloride irrigation | Hospira | NDC# 0409-6138-03 | For preparation of ketamine/xylazine and buprenorphine solutions |
| 1 ml syringe | BD | 309659 | |
| 30 G needle | BD | 305106 | |
| Povidone-Iodine solution | Aplicare | 82-226 | |
| 70% ethanol | |||
| Puralube vet opthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | NDC# 17033-211-38 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools | |||
| Portable balance 200 g | Ohaus | SP202 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15124-12 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Needle holders | Fine Science Tools | 91201-13 | |
| Micro spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Micro needle holders | Fine Science Tools | 12061-02 | |
| 5-0 nylon sutures | Ethicon | 668G | |
| 8-0 microsurgery nylon sutures | Ethicon | 2808G | |
| Lab-Line histology slide warmer | Barnstead International | 26025 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytospin method | |||
| Collagenase Type I, lyophilized | Life Technologies | 1700-017 | |
| Bovine Serum Albumin | Cell Signaling Technologies | 9998S | |
| 1x PBS | Thermo Fisher | 10010-023 | |
| Cytology funnels | Fisher HealthCare | 10-354 | |
| HistoBond+ microscope slides | VWR | 16005-110 | |
| Cytospin 2 centrifuge | Shandon | SH-CYTO2 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunocytochemistry | |||
| Slide staining tray with black lid | IHC World | M920-2 | |
| Click-iT Plus EdU Imaging Kit | Life Technologies | C10639 | Includes EdU and Hoeschst 33342 |
| Immedge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| ProLong Diamond mounting medium | Thermo Fisher | P36970 | |
| Glass coverslips 24 x 50 mm #1.5 | |||
| Clear nail polish |
References
- Lin, T. Biomechanics of tendon inury and repair. J Biomech. 37, 865-877 (2004).
- Strickland, J. W. Development of flexor tendon surgery: twenty-five years of progress. J Hand Surg [Am]. 25, 214-235 (2000).
- Bunnell, S. Repair of tendons in the fingers and description of two new instruments. Surg Gynecol Obstet. 26, 103-110 (1918).
- Aydin, A., et al. Single-stage flexor tendoplasty in the treatment of flexor tendon injuries. Acta Orthop Traumatol Turc. 38, 54-59 (2004).
- Gelberman, R. H., Steinberg, D., Amiel, D., Akeson, W. Fibroblast chemotaxis after tendon repair. J Hand Surg Am. 16, 686-693 (1991).
- Lundborg, G., Rank, F. Experimental intrinsic healing of flexor tendons based upon synovial fluid nutrition. J Hand Surg Am. 3, 21-31 (1978).
- Aoki, M., Kubota, H., Pruitt, D. L., Manske, P. R. Biomechanical and histologic characteristics of canine flexor tendon repair using early postoperative mobilization. J Hand Surg Am. 22, 107-114 (1997).
- Kim, H. M., et al. Technical and biological modifications for enhanced flexor tendon repair. J Hand Surg Am. 35, 1031-1037 (2010).
- Aoki, M., Manske, P. R., Pruitt, D. L., Kubota, H., Larson, B. J. Work of flexion after flexor tendon repair according to the placement of sutures. Clin Orthop Relat Res. , 205-210 (1995).
- Zhao, C., et al. Award for Outstanding Orthopaedic Research: Engineering flexor tendon repair with lubricant, cells, and cytokines in a canine model. Clin Orthop Relat Res. 472, 2569-2578 (2014).
- Wong, J., Bennett, W., Ferguson, M. W., McGrouther, D. A. Microscopic and histological examination of the mouse hindpaw digit and flexor tendon arrangement with 3D reconstruction. J Anat. 209, 533-545 (2006).
- Katzel, E. B., et al. Impact of Smad3 loss of function on scarring and adhesion formation during tendon healing. J. Orthop. Res. 29, 684-693 (2011).
- Loiselle, A. E., et al. Bone marrow-derived matrix metalloproteinase-9 is associated with fibrous adhesion formation after murine flexor tendon injury. PloS one. 7, e40602 (2012).
- Lee, D. J., et al. Parathyroid hormone 1-34 enhances extracellular matrix deposition and organization during flexor tendon repair. J Orthop Res. 33, 17-24 (2015).
- Geary, M. B., et al. Systemic EP4 Inhibition Increases Adhesion Formation in a Murine Model of Flexor Tendon Repair. PloS one. 10, e0136351 (2015).
- Loiselle, A. E., et al. Development of antisense oligonucleotide (ASO) technology against Tgf-beta signaling to prevent scarring during flexor tendon repair. J Orthop Res. 33, 859-866 (2015).
- Orner, C. A., Geary, M. B., Hammert, W. C., O'Keefe, R. J., Loiselle, A. E. Low-dose and short-duration Matrix Metalloproteinase 9 Inhibition does not affect adhesion formation during murine flexor tendon healing. Plast Reconstr Surg. , (2016).
- Loiselle, A. E., et al. Remodeling of murine intrasynovial tendon adhesions following injury: MMP and neotendon gene expression. J Orthop Res. 27, 833-840 (2009).
- Tsubone, T., et al. Effect of TGF-beta inducible early gene deficiency on flexor tendon healing. J Orthop Res. 24, 569-575 (2006).
- Beason, D. P., Kuntz, A. F., Hsu, J. E., Miller, K. S., Soslowsky, L. J. Development and evaluation of multiple tendon injury models in the mouse. J Biomech. 45, 1550-1553 (2012).
- David, M. A., et al. Tendon repair is compromised in a high fat diet-induced mouse model of obesity and type 2 diabetes. PloS one. 9, e91234 (2014).
- Wong, J. K., et al. The cellular biology of flexor tendon adhesion formation: an old problem in a new paradigm. Am J Pathol. 175, 1938-1951 (2009).
