Summary
Flexor sener i hånden er ofte skadet, noe som fører til nedsatt håndfunksjon. Imidlertid er det arr-vev healing respons ikke godt karakterisert. En murine modell av flexor sene healing er vist her. Denne modellen kan øke forståelsen av helbredelsesprosessen og vurdere terapeutiske tilnærminger for å forbedre helbredelse.
Abstract
Sene forbinder muskel-skjelettlidelser og bein, tilrettelegging bevegelse nesten hele kroppen. I hånden, flexor sener (FTS) mulig fleksjon av fingre og generell håndfunksjon. Skader i FTS er vanlig, og tilfredsstillende healing er ofte svekket på grunn av overflødig arrvev og sammenvoksninger mellom sene og omkringliggende vev. Men lite er kjent om de molekylære og cellulære komponenter i FT reparasjon. For dette formål er en murin modell av FT reparasjon som sammenfatter mange aspekter av helbredelse hos mennesker, inkludert svekket spekter av bevegelser og redusert mekaniske egenskaper, har blitt utviklet og tidligere beskrevet. Her en grundig demonstrasjon av denne kirurgiske prosedyren er gitt, innebærer tran og påfølgende reparasjon av flexor digitorum longus (FDL) sene i murine bakfot. Denne teknikken kan brukes til å gjennomføre avstamning analyse av forskjellige celletyper, vurdere virkningene av genet gevinst eller tap-av-funksjon, og for å teste effcacy av farmakologiske intervensjoner i helbredelsesprosessen. Imidlertid er det to primære begrensninger i denne modellen: i) FDL sene i midtpartiet av det murine bakpote, hvor det transeksjon og reparasjon forekommer, ikke er omgitt av en kappe synovial. Derfor er denne modellen tar ikke hensyn til det potensielle bidrag av kappen til arrdannelse prosessen. ii) For å beskytte integriteten av reparasjonsstedet, er FT utgitt på myotendinous krysset, redusere de mekaniske kreftene i senen, trolig bidra til økt arrdannelse. Isolering av tilstrekkelige celler fra granulasjonsvev av FT under tilhelingsprosessen for flowcytometrisk analyse har vist seg å være vanskelig; cytologi sentrifugering for å konsentrere disse cellene er en alternativ metode som brukes, og gir mulighet for generering av cellepreparater som immunofluorescerende merking kan utføres. Med denne metoden blir kvantifisering av celler eller proteiner av interesse under FT helbredelse mulig.
Introduction
Flexor sener i hånden arbeidet i konsert med flexor musklene i underarmen og digitale hylser for å muliggjøre fleksjon av sifrene og fatte funksjon av hånden. Flexor sener løpe langs håndflate-siden av hånden; denne relativt overfladisk stedet resulterer ofte i skader på flexor sener under traumer til hånden. Sener helbrede gjennom et arrvev respons i stedet for regenerering av normalt senevev en. Selv om dette arrvev gir kontinuitet til sene, er funksjonen dramatisk redusert i forhold til sunn sene. Sene-arrvev kompositter er preget av svekket mekaniske egenskaper 1, gjengi de reparerte sener mer sannsynlig til å sprekke. I tillegg mangler arrvev organiseringen av det native sene kollagen fiberstruktur, noe som resulterer i en økning i størrelse sene og bulk. Gitt de anatomiske begrensninger av den sene-skjede enhet, selv en beskjeden økning i sene størrelse kan drastisk rødUCE den glidende funksjon i sene, og derfor sifret omfanget av bevegelse og håndfunksjon.
Før 1960-tallet skader flexor sener, spesielt de i sone II i hånden, ble ikke rutinemessig reparert på grunn av alvorlige komplikasjoner i healing som oppsto med disse reparasjonene 2. Dette området av hånden ble referert til som "ingenmannsland" 3. Men forbedringer i kirurgiske teknikker, sutur mønstre og fysioterapi rehabilitering protokoller har dramatisk forbedret utfall av flexor sene reparasjoner 2. Til tross for disse fremskrittene, opptil 40% av reparasjoner resultere i tilstrekkelig vedheft formasjon for å hindre håndfunksjon 4. Derfor er en biologisk metode som kreves for å forbedre helbredelsen. Dessverre, svært lite er kjent om den sene helbredelsesprosessen på cellulært og molekylært nivå. Således var målet å utvikle en murin modell som kan brukes for å forbedre den grunnleggende understanding av de cellulære og molekylære komponenter av flexor sene helbredelse og arrdannelse respons, som et middel til å identifisere nye terapeutiske mål å bedre healing.
Større dyremodeller har vært medvirkende i å fremme forståelse av flexor sene helbredelsesprosessen. Canine og kaninstudier har vist både den indre og ytre helbredende evne av flexor sener 5,6, betydningen av tidlig kontrollert passiv bevegelse i å minimere adhesjonsdannelse i forhold til immobilisering 7, så vel som virkningene av forskjellige sutur mønster på helbredelsesprosessen 8 , 9. I tillegg har hundemodell vært nyttig ved testing av translasjonelle vev-tekniske metoder for å forbedre helbredelsen 10. Imidlertid er det flere viktige fordeler i å bruke en murin modell i forhold til et stort dyremodell, inkludert den relative kostnad, tilgjengelighet av murine spesifikke reagenser, og den enkle å generere globalt Knock-outs eller vevsspesifikke sletting / overekspresjon konstruksjoner. Videre de funksjonelle likheter mellom mennesker og mus med hensyn til flexor sener 11 indikerer potensielle nytten i å utvikle en murine modell.
Utvikling av en murine modell av flexor sene tran og reparasjon ligner mange aspekter av klinisk helbredelse, inkludert dannelsen av rikelig arrvev og nedskrevne mekaniske egenskaper. Modellen som er beskrevet her er ikke en ekte gjentagelse av klinisk praksis på grunn av tran av FDL på myotendinous krysset for å beskytte reparasjonsstedet. Videre gjør denne modellen ikke hensyn til bidraget av synovial-celler kappe for den helbredende respons, da det ikke er leddkappe som dekker midtpartiet av den sene hvor reparasjonen foregår. Til tross for disse begrensningene, har denne modellen fordelen av å generere omfanget av bevegelse begrensende voksninger, som ennå ikke er demonstrert i murine modeller at flere closely tilnærmet klinisk scenario. Denne modellen har blitt brukt til å vurdere knock-out musemodeller 12,13, og for å teste ulike farmakologiske tilnærminger for å forbedre helbredelse 14-17. Histologisk analyse av denne modellen, ved hjelp av immunhistokjemi og in situ hybridisering, kan gi viktig innsikt i til lokalisering av viktige gener og proteiner under healing. Imidlertid gir histologi bare et tverrsnitts romlige analyse og ikke tillater kvantifisering gjennom hele vev. Flowcytometri representerer en mer kvantitativ tilnærming, men bare et svært begrenset antall celler kan bli isolert fra den helbredende sene vev i musemodellen, og dette tall er ytterligere redusert i løpet av fikseringen, permeabiliseringen, og vasketrinn. Tar dette på kontoen, flowcytometri blir en unfeasible tilnærming på grunn av antall dyr som ville være nødvendig. En alternativ metode er nødvendig for å bevare de fleste av denne lille cellepopulasjonen i rekkefølgefor ytterligere å karakterisere den helbredende miljø. Metoden som brukes for å oppnå dette, er vist her, involverer konsentrasjon av de isolerte celler via cytologi sentrifugering på en glass-slide, etterfulgt av immunocytokjemi. I den foreliggende undersøkelse EDU (5-etynyl-2'deoxyuridine, en tymidinanalog) inkorporering og påfølgende merking ble anvendt for å bestemme den relative proliferativ tilstand av celler ved helbredelse området. Denne tilnærmingen kan brukes for å teste effektiviteten av farmakologiske behandlinger på celleformering, gene knock-out eller overekspresjon, eller for å identifisere og kvantifisere forskjellige cellepopulasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
The University Committee on Animal Forskning ved University of Rochester godkjent alle dyreforsøk. Ti 12 uker gamle hunn C57BL / 6J mus ble anvendt.
1. Utarbeidelse av dyr for flexor sene Surgery (~ 15 min)
- Autoklaver kirurgiske instrumenter til å sterilisere, slitasje sterile hansker hele, og opprettholde et sterilt operasjonsfelt.
- Bedøve mus via intraperitoneal injeksjon (ip) med et volum av ketamin (80 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg), tilsvarende kroppsvekt. Bekreft dybde av sedasjon via fravær av tå-pinch refleks.
- Administrere forkjøpsrett analgesi (buprenorfin, 0,05-0,1 mg / kg) via subkutan injeksjon. Påfør oftalmisk salve for å hindre at øynene tørker ut.
- Forbered kirurgiske området ved å klippe pelsen på hele bakben. Steril huden ved skrubbing sekvensielt med povidon-jod, etterfulgt av 70% etanol, og igjen med povidon-jod.
- Finn flexor digitorum longus (FDL) sene, sett overfladisk i mediale aspekt av kalv. Ved hjelp av en skalpell, lage en liten 0,5-1 cm snitt i huden med mikro-saks til å eksponere senen.
- Bruk pinsett til å skille FDL sene fra omkringliggende vev og spore det opp til myotendinous krysset. Kutt sene i dette krysset med våren saks for å løsne den, ta vare å unngå posterior tibial arterien.
- Lukk huden med 5-0 nylon suturer.
Merk: FDL tran og reparasjon (trinn 2.4) bør utføres ved hjelp av en stereomikroskop. - Lag en 3 mm snitt over posterolateral aspekt av hind labben ved hjelp av fjær mikro-saks. Forsiktig trekke omkringliggende bløtvev og muskler med pinsett, og pass på å minimere vevskader, og identifisere FDL sene.
- Forsiktig løft FDL sene og helt transekt den ved hjelp av miCro-saks. Suturer endene av FDL sene sammen i en modifisert Kessler mønster med 8-0 suturer, unngå tørking av det sene ved periodisk å fukte det med saltvann.
- Bytt bløtvev og muskler over sene, og lukk snittet med 5-0 nylon suturer.
- Plassere mus på et lysbilde varmere satt til 37 ° C, for å opprettholde kroppstemperaturen inntil utvinnes fra anestesi.
- Monitor mus postoperativt etter tegn på svekkelse eller infeksjon inkludert økt vokalisering og ruffled pels. Injisere buprenorfin (50 ul / mus) som smertestillende hver 12 time før musene ikke lenger viser tegn til smerte eller ubehag.
- Tillat mus til å helbrede for en periode på 10 dager etter operasjonen før du fortsetter til neste trinn.
Merk: Cellene kan høstes når som helst punkt etter operasjonen. Her blir 10 dager valgt for disse representative eksperimenter som er gitt den relativt høye cellularitet av vevet på dette tidspunktet.
3. Labeling Sykling Cells (~ 10 min)
- Forbered EDU (5-etynyl-2'deoxyuridine) oppløsning (10 mg / ml i steril fosfatbuffer-saltvann [PBS] + 1% dimetylsulfoksyd [DMSO] for å øke løseligheten).
- Injisere mus med 100 ul Edu (50 mg / kg) via ip injeksjon 24 timer før avlivning.
4. Harvests Celler for Cytologi sentrifugering (2,5 time, ~ 30 min Hands-on Time)
- Fremstille 3 mg / ml kollagenase I i PBS.
- Avlive mus via karbondioksidasfyksiering ved en strømningshastighet på ikke mer enn 3 l / min, og utføre cervikal dislokasjon som et sekundært mål.
- Finn den reparerte sener å utføre trinn 2.4 ovenfor, og isolere sene vev ved å kutte omtrent 2 mm på hver side av skadestedet med mikro-saks.
- Kjøttdeig vev med skalpell i en petriskål med 1 ml 3 mg / ml kollagenase, deretter passere blandingen gjennom en 18 G nål flere ganger for å bryte opp vev. Samle blandingen inn i en 1,5 ml sentrifugerør. Fordøye sene vev i 1 time ved 37 ° C med risting.
- Spin vev ned (300 xg 5 min), aspiratet kollagenase, deretter resuspender celler / vev med 500 ul 3% bovint serumalbumin (BSA) i PBS ved å pipettere opp og ned flere ganger.
- Filter cellesuspensjon gjennom en 70 mikrometer celle sil for å fjerne rusk og store biter av sene, og satt til side i en 37 ° C inkubator.
- Plasser senevev inn i en annen 1,5 ml sentrifugerør, og oppdatere med ett ml collagenase løsning, pipettere opp og ned for å blande.
- Inkuber vev enda en time ved 37 ° C med risting.
- Spinne ned fordøyd sene vev (300 xg 5 min), deretter suspender i 500 ul 3% BSA i PBS ved å pipettere opp og ned flere ganger.
- Filter cellesuspensjon gjennom en 70 mikrometer celle sil, kombinere med suspensjon isolert i 4.3.3, deretter telle celler med en hemocytometer.
- Vask cellene en gang mer med 3% BSA i PBS, deretter suspender på 3-6x 10 4/100 ul.
- Fest en cytologi trakt til en positivt ladet lysbilde og låse inn lysbildet transportøren. Sett hele anordningen inn i en sentrifuge cytologi og tilsett 100 ul cellesuspensjon til trakten. Sentrifuger ved 300 xg i 5 minutter for å dispergere cellene på lysbildet.
5. Immunocytochemistry å oppdage Edu (2 t, ~ 45 min Hands-on Time)
Merk: Alle ruge trinn skal utføres i mørket for å begrense fotobleking av fluorophores.
- Circle celler med en hydrofob barriere penn for å minimalisere oppløsning som er nødvendig for å følge fremgangsmåten, deretter umiddelbart feste med 150 ul 3% paraformaldehyd i PBS i 15 minutter ved romtemperatur (RT).
- Vask to ganger i 5 min med 150 ul 3% BSA i PBS.
- Permeabilisere cellene med 0,5% Triton-X-100 i PBS i 20 minutter ved RT.
- Gjenta vasketrinn som i 5.1.1.
- Forbered Edu reaksjon cocktail ifølge kit instruksjoner ikke mer enn 30 minutter før bruk.
- Legg 150 mL cocktail til hvert lysbilde, inkuber 30 min ved RT.
- Gjenta vasketrinn som i 5.1.1.
- Inkuber med 150 pl atom counterstain Hoechst33342 fortynnet 1: 2000 i PBS 30 minutter ved romtemperatur.
- Vask to ganger i 5 minutter med 150 pl 1 x PBS.
- Legg 1-2 dråper anti-fade montering medium til celler, deretter sakte lavere dekkglass for å unngå bobler.
- Tillate montering medium for å herde over natten i mørket ved romtemperatur.
- Bruk klar neglelakk for å forsegle dekkglass på lysbildet.
- Bilde lysbilder på 40X forstørrelse ved hjelp av et fluorescerende mikroskop utstyrt med eksitasjon / emisjonsfiltre som kan detektere DAPI (Hoeschst33342), og Texas Red (Alexa Fluor 594).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flexor digitorum longus (FDL) muskel, som ligger i leggen, virker til å bøye sifrene i mus hind labben via bøyesenen (markert i blått i figur 1A, og vist histologisk i figur 2A), som går proksimalt fra myotendinous krysset og ender i de distale falanger. I denne modellen av flexor sene helbredelse, er FDL sene transektert og reparert ved midten av foten, proksimalt til forgreningen i til sifrene i bakpoten (røde piler, figur 1A). For å hindre brudd på reparasjon, noe som ville være til hinder for eksperimentell analyse, er den sene (og tilstøtende muskel) kuttet, eller utgitt, på myotendinous krysset (gul pil i figur 1B, slipper vist i figur 1C). Selv om dette trinnet ikke er representativt for den kliniske situasjon, er det viktig å beskytte reparasjon ved å redusere belastningen på skadestedet. Figur 2Der en histologisk eksempel på en sprukket flexor sene reparasjon, sammenlignet med en vellykket reparasjon vist i figur 2C. I det sistnevnte, er granulasjonsvev viser i stor grad økt celledannelse, sammenlignet med den uskadde sene (figur 2B), og denne cellepopulasjon kan deretter analyseres videre via cytologi sentrifugering på et lysbilde, etterfulgt av immunocytokjemi. Figur 3 beskriver den eksperimentelle fremgangsmåte anvendt for å vurdere den proliferative tilstand av cellene samlet inn fra healing sener 10 dager etter reparasjon via edu innlemmelse i nylig syntetisert DNA. EDU merking viser derfor bare de cellene som aktivt prolifererte i løpet av 24-timers perioden etter EDU puls i levende mus, som vist i figur 4. En kvantitativ vurdering av spredning i granulasjonsvev av helbredelses sene kan deretter bestemmes ved punkt-telling av hele cellepreparat. På denne måten et utgangspunkt på proliferasjon kan etableres på hvert tidspunkt, og eventuelle endringer som følge av genetiske eller farmakologiske tiltak kan vurderes.
Figur 1 :. Murine Hind Paw anatomi og Identifikasjon av Flexor digitorum longus sene. Flexor digitorum longus (FDL) bøyer sifrene i mus hind labben og går langs palmar aspekt av hind labben (FDL skissert i blått) hvor det bifurcates inn sifrene (røde piler) (Figur 1a). Proksimalt, kjører FDL sene gjennom tarsal tunnel (svart pil), til kalven, og endte på myotendinous krysset (gul pil) (figur 1B). Utgivelsen av senen på myotendinous krysset for å hindre brudd er vist i figur 1C. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:. Representative Histologiske Bilder av Un-skadet, Normal Healing og ruptured Flexor Sene Reparasjoner anatomi FDL sene i murine bakpote er vist i figur 2A. Scale bar representerer 1 mm. På figurene 2B-D, blir den sene forstørret ved 8X å sammenligne uskadd sene vev (figur 2B) til en intakt og knuste reparasjon (figurene 2C og 2D, henholdsvis). Hele hind labb prøvene ble fiksert i nøytral bufret formalin, innstøpt i parafin, skåret i 3 mikrometer seksjoner, og farget med Alcian Blå / Hematoxylin / Orange G som tidligere beskrevet 13. Native sene er skissert i blått, blir sene / granulasjonsvev kompositt skissert i grønt og svart piler indikerer sting. Skala barer representerer 200 mikrometer. Please klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Eksperimentell Prosedyre for å utføre Edu Klikk-it kjemi på cellepreparater På dag 10 etter operasjonen healing FDL sener ble dissekert fra mus bakpotene.. Sener ble oppmalt deretter spaltet i to timer i kollagenase jeg å dissosiere cellene. Cellesuspensjonen ble silt for å fjerne rusk, og ~ 6 x 10 4 celler ble spunnet inn i et monolag på positivt ladede glassplater ved hjelp av en sentrifuge cytologi. Cellene ble sirklet med en hydrofob barriere penn og deretter løst umiddelbart med paraformaldehyde. Etter permeabilization med Triton X-100, ble cellene behandlet med en EDU deteksjon cocktail, og et klikk kjemi reaksjon bundet Alexa Fluor 594 til innlemmet Edu. Hoechst 33342 ble brukt som en kjernefysisk flekken, og cellene wer e analysert ved 10-40X med et fluorescerende mikroskop. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4:. Immunocytochemistry Analyse av Cycling Edu-merkede celler Under flexor sene Healing Healing FDL sener ble høstet fra bakpotene av mus 10 dager etter kirurgi og fordøyd med kollagenase for å få en cellesuspensjon. Sentrifugering ble brukt til å dispergere disse cellene inn i et monolag på objektglass, etterfulgt av immunocytokjemi av bildet EDU inkorporering. Figur 4A og 4B er bilder tatt ved 10X og 40X henholdsvis av cellene følgende immunocytokjemisk analyse. Nuclear flekken Hoechst 33342 er blått, og celler som har innarbeidet Edu er strødd med rødt. Skala barer representerer 50 mikrometer.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54433/54433fig4large.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den kirurgiske prosedyre for en murin modell av fullstendig transeksjon og reparasjon av flexor digitorum longus sene er presentert i denne studien. I tillegg er en ny anvendelse for å konsentrere små cellepopulasjoner med cytologi sentrifuge er vist, slik at for kvantitativ immuncytokjemisk analyse av det cellulære miljø i løpet av flexor sene helbredelse. Denne modellen av bøye sene reparasjon viser en reproduserbar helbredende respons, som kan brukes til å vurdere endringer i helbredelsesprosessen ved bruk av knockout-modeller eller sammen med farmakologisk intervensjon. Etter kirurgi, starter en inflammatorisk reaksjon i 24 timer, i løpet av hvilke celler som rekrutteres til skadestedet og en callus av fibrøst vev begynner å dannes. En proliferativ fase slik på om dag fire, med betydelig økt cellularitet og rikelig deponering av uorganisert ekstracellulære matrise på serviceplassen, som fører til vedheft formasjon mellom 14-21 dager. Vevsremodelleringen continues til og med dag 35, og på dette tidspunkt kontinuitet og organisering av flexor sene er gjenopprettet, og cellularitet reduseres 18.
For tiden er det flere murine modeller av flexor sene reparasjon i tillegg til den som presenteres her. Tsubone et al., Har beskrevet en in vitro modell av bøye sene helbredelse 19. Selv om denne modellen kan vurdere endringer i genuttrykk over tid, kan det ikke gjøre rede for rekruttering av ytre celler eller endringer i inflammatoriske / cytokin miljø som oppstår in vivo. In vivo har to modeller av delvis tran blitt utviklet ved hjelp av enten operasjonssåret eller excisional defekter 20,21. Mer nylig, Wong et al., Karakterisert en sone II modell av bøye sene skade i en murin modell 22. Dette er en viktig utvikling, fordi det gir bidrag av synovial kappe-avledede celler til helbredelsesprosessen som skal defineres. Men ingen kvantifiserbare endringer i gliding funksjon er beskrevet ved hjelp av denne modellen. Hver modell har sine egne fordeler og begrensninger som må vurderes, herunder teknisk letthet, klinisk relevans og anatomi. En hoved begrensning av modellen som beskrives her er at healing sene kan sprekke før evalueringen, som gjør det ubrukelig for videre analyse. Høsting tilstrekkelig antall celler er fremstilt ugjørlig under disse omstendigheter, og en hvilken som helst histokjemisk analyse ikke er levedyktig, og et sprukket sene ikke følger standard helbredelsesprosessen som er beskrevet ovenfor. Frigjøring av FDL sene proksimalt for å redusere belastningen på helbredelse sene er derfor et kritisk trinn for å forebygge, til tross for det faktum at det ikke er klinisk relevant. Gjennomføring av operasjonen ensidig også senker frekvensen av brudd. En annen begrensning er manglende evne til å spore bidrag av peri-tendinous skjede celler, som synovial skjede ikke omgir den delen av FDL senen som er skadet i denne modellen.
jove_content "> En viktig funksjon av denne bøye sene reparasjon modell er at den tillater evaluering av cellene ved den helbredende stedet. Immunofluorescens / immunhistokjemi (IHC) er en vanlig biologisk teknikk som kan brukes til å karakterisere disse cellene. Mens IHC er unikt egnet for bestemmelse av romlig informasjon, er det i stor grad en kvalitativ metode. endringer i vev eller celleblanding gjennom hele dybden av vev kan hoppes over, og kvantifisering av populasjoner er vanskelig. Strømnings representerer cytometri en ideell metode for å definere, kvantifisere og eventuelt isolere celle populasjoner under healing. Men, isolasjon og fordøyelse av healing sene vev fra denne modellen gir svært lave celletall for flowcytometrisk analyse (1-2 x 10 5 i snitt fra hver mus), og fiksering / permeabilization skritt for påvisning av intracellulære markører reduserer dette nummer ytterligere. ved hjelp av cytologi sentrifugering for å konsentrere de isolerte celler, etterfulgt av immunocytocheMistry, gir en måte å karakterisere disse små cellepopulasjoner. En betydelig fordel med denne teknikken er at det ikke er noe behov for å bassenget prøvene sammen for å oppnå nok celler; derfor hver mus representerer en enkelt prøve for analyse. En viktig faktor i å generere disse cellepreparater er å opprettholde konsistens i vev høstet for analyse. Omkringliggende muskel og fascia kan forholde seg til granulasjonsvev og må nøye dissekert unna. Etter denne metoden innebærer minimal behandling av cellene før fiksering på objektglass, beholder det et flertall av isolerte celler for videre analyse. På denne måten, kan nesten hele populasjonen av celler som utgjør adhesjonen vev ved reparasjonsstedet kvantitativt vurdert gjennom immunocytokjemi. I den foreliggende undersøkelse, er EDU inkorporering av prolifererende celler brukt for å demonstrere anvendelsen av denne cytologi teknikk, men det kan også benyttes for mer komplekse og inngående karakterisering of de heterogene cellepopulasjoner som er involvert i flexor sene healing. Fremtidige anvendelser av denne teknikken kan føre til mer inngående karakterisering av cellepopulasjoner som er involvert i sene helbredelse, da det gir mulighet for bestemmelse av ko-lokalisering av cellulære markører i cellene forbundet med granulasjonsvev i helbredelse sene.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis støttet av American Society for Surgery av hånd Pilot Award og NIH / NIAMS 1K01AR068386-01 (til AEL) og NIAMS / NIH P30AR061307.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical preparation | |||
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | 000664 | |
| Ketamine | Hospira | NDC# 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Lloyd Inc. | NDC# 61311-482-10 | |
| Buprenorphine | Par Pharmaceutical Inc. | NDC# 42023-179-10 | |
| 0.9% sodium chloride irrigation | Hospira | NDC# 0409-6138-03 | For preparation of ketamine/xylazine and buprenorphine solutions |
| 1 ml syringe | BD | 309659 | |
| 30 G needle | BD | 305106 | |
| Povidone-Iodine solution | Aplicare | 82-226 | |
| 70% ethanol | |||
| Puralube vet opthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | NDC# 17033-211-38 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools | |||
| Portable balance 200 g | Ohaus | SP202 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15124-12 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Needle holders | Fine Science Tools | 91201-13 | |
| Micro spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Micro needle holders | Fine Science Tools | 12061-02 | |
| 5-0 nylon sutures | Ethicon | 668G | |
| 8-0 microsurgery nylon sutures | Ethicon | 2808G | |
| Lab-Line histology slide warmer | Barnstead International | 26025 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytospin method | |||
| Collagenase Type I, lyophilized | Life Technologies | 1700-017 | |
| Bovine Serum Albumin | Cell Signaling Technologies | 9998S | |
| 1x PBS | Thermo Fisher | 10010-023 | |
| Cytology funnels | Fisher HealthCare | 10-354 | |
| HistoBond+ microscope slides | VWR | 16005-110 | |
| Cytospin 2 centrifuge | Shandon | SH-CYTO2 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunocytochemistry | |||
| Slide staining tray with black lid | IHC World | M920-2 | |
| Click-iT Plus EdU Imaging Kit | Life Technologies | C10639 | Includes EdU and Hoeschst 33342 |
| Immedge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| ProLong Diamond mounting medium | Thermo Fisher | P36970 | |
| Glass coverslips 24 x 50 mm #1.5 | |||
| Clear nail polish |
References
- Lin, T. Biomechanics of tendon inury and repair. J Biomech. 37, 865-877 (2004).
- Strickland, J. W. Development of flexor tendon surgery: twenty-five years of progress. J Hand Surg [Am]. 25, 214-235 (2000).
- Bunnell, S. Repair of tendons in the fingers and description of two new instruments. Surg Gynecol Obstet. 26, 103-110 (1918).
- Aydin, A., et al. Single-stage flexor tendoplasty in the treatment of flexor tendon injuries. Acta Orthop Traumatol Turc. 38, 54-59 (2004).
- Gelberman, R. H., Steinberg, D., Amiel, D., Akeson, W. Fibroblast chemotaxis after tendon repair. J Hand Surg Am. 16, 686-693 (1991).
- Lundborg, G., Rank, F. Experimental intrinsic healing of flexor tendons based upon synovial fluid nutrition. J Hand Surg Am. 3, 21-31 (1978).
- Aoki, M., Kubota, H., Pruitt, D. L., Manske, P. R. Biomechanical and histologic characteristics of canine flexor tendon repair using early postoperative mobilization. J Hand Surg Am. 22, 107-114 (1997).
- Kim, H. M., et al. Technical and biological modifications for enhanced flexor tendon repair. J Hand Surg Am. 35, 1031-1037 (2010).
- Aoki, M., Manske, P. R., Pruitt, D. L., Kubota, H., Larson, B. J. Work of flexion after flexor tendon repair according to the placement of sutures. Clin Orthop Relat Res. , 205-210 (1995).
- Zhao, C., et al. Award for Outstanding Orthopaedic Research: Engineering flexor tendon repair with lubricant, cells, and cytokines in a canine model. Clin Orthop Relat Res. 472, 2569-2578 (2014).
- Wong, J., Bennett, W., Ferguson, M. W., McGrouther, D. A. Microscopic and histological examination of the mouse hindpaw digit and flexor tendon arrangement with 3D reconstruction. J Anat. 209, 533-545 (2006).
- Katzel, E. B., et al. Impact of Smad3 loss of function on scarring and adhesion formation during tendon healing. J. Orthop. Res. 29, 684-693 (2011).
- Loiselle, A. E., et al. Bone marrow-derived matrix metalloproteinase-9 is associated with fibrous adhesion formation after murine flexor tendon injury. PloS one. 7, e40602 (2012).
- Lee, D. J., et al. Parathyroid hormone 1-34 enhances extracellular matrix deposition and organization during flexor tendon repair. J Orthop Res. 33, 17-24 (2015).
- Geary, M. B., et al. Systemic EP4 Inhibition Increases Adhesion Formation in a Murine Model of Flexor Tendon Repair. PloS one. 10, e0136351 (2015).
- Loiselle, A. E., et al. Development of antisense oligonucleotide (ASO) technology against Tgf-beta signaling to prevent scarring during flexor tendon repair. J Orthop Res. 33, 859-866 (2015).
- Orner, C. A., Geary, M. B., Hammert, W. C., O'Keefe, R. J., Loiselle, A. E. Low-dose and short-duration Matrix Metalloproteinase 9 Inhibition does not affect adhesion formation during murine flexor tendon healing. Plast Reconstr Surg. , (2016).
- Loiselle, A. E., et al. Remodeling of murine intrasynovial tendon adhesions following injury: MMP and neotendon gene expression. J Orthop Res. 27, 833-840 (2009).
- Tsubone, T., et al. Effect of TGF-beta inducible early gene deficiency on flexor tendon healing. J Orthop Res. 24, 569-575 (2006).
- Beason, D. P., Kuntz, A. F., Hsu, J. E., Miller, K. S., Soslowsky, L. J. Development and evaluation of multiple tendon injury models in the mouse. J Biomech. 45, 1550-1553 (2012).
- David, M. A., et al. Tendon repair is compromised in a high fat diet-induced mouse model of obesity and type 2 diabetes. PloS one. 9, e91234 (2014).
- Wong, J. K., et al. The cellular biology of flexor tendon adhesion formation: an old problem in a new paradigm. Am J Pathol. 175, 1938-1951 (2009).
