Summary
tendões flexores na mão são comumente feridos, levando a mão função prejudicada. No entanto, a resposta de cura de tecido cicatricial não está bem caracterizada. Um modelo murino de cura do tendão flexor é demonstrada aqui. Este modelo pode melhorar a compreensão global do processo de cura e avaliar abordagens terapêuticas para melhorar a cicatrização.
Abstract
Tendão conecta o músculo esquelético e o osso, facilitando o movimento de quase todo o corpo. Na mão, tendões flexores (STF) permitem flexão dos dedos e função geral mão. Lesões ao SFT são comuns, e cura satisfatória é muitas vezes prejudicada devido ao tecido cicatricial em excesso e aderências entre o tendão eo tecido circundante. No entanto, pouco se sabe sobre os componentes moleculares e celulares de reparação FT. Para esse fim, num modelo murino de reparação FT que recapitula muitos aspectos de cicatrização em humanos, incluindo a gama de movimento diminuída e diminuição propriedades mecânicas, tem sido desenvolvido e descrito anteriormente. Aqui uma demonstração em profundidade deste procedimento cirúrgico é fornecido, envolvendo o corte transversal e subsequente reparação do tendão flexor longo dos dedos (FDL) na pata posterior murino. Esta técnica pode ser usado para realizar a análise da linhagem de diferentes tipos celulares, avaliar os efeitos do ganho do gene ou a perda de função, e para testar a eficácia de intervenções farmacológicas no processo de cicatrização. No entanto, existem duas limitações principais para este modelo: i) o tendão FDL na porção média da pata posterior de murino, em que a transecção e reparação ocorrer, não é rodeado por uma bainha sinovial. Portanto, este modelo não leva em conta a potencial contribuição da bainha para o processo de formação de cicatriz. ii) A fim de proteger a integridade do local de reparação, o FT é libertado na junção miotendínea, diminuindo as forças mecânicas do tendão, provavelmente contribui para aumentar a formação de cicatriz. Isolamento de células suficientes a partir do tecido de granulação do FT durante o processo de cura para a análise de citometria de fluxo demonstrou ser um desafio; citologia centrifugação a concentrar-se nestas células é um método alternativo utilizado, e permite a geração de preparações de células no qual a rotulagem de imunofluorescência pode ser realizada. Com este método, a quantificação de células ou proteínas de interesse durante FT cura torna-se possível.
Introduction
tendões flexores da mão de obra em conjunto com os músculos flexores do antebraço e bainhas digitais para permitir a flexão dos dígitos e função de agarrar a mão. tendões flexores executar ao longo do aspecto palmar da mão; este local relativamente superficial muitas vezes resulta em lesões nos tendões flexores durante um trauma para a mão. Tendões curar através de uma resposta do tecido da cicatriz em vez de regeneração do tecido do tendão normal de 1. Embora este tecido cicatricial dá continuidade ao tendão, função dramaticamente é diminuída em relação ao tendão saudável. Compósitos tecido do tendão-de cicatriz são caracterizados por propriedades mecânicas com deficiência 1, tornando os tendões reparados mais propensos à ruptura. Além disso, o tecido cicatricial não tem a organização da estrutura de fibra de colagénio de tendão nativa, resultando num aumento do tamanho do tendão e grandes quantidades. Dadas as limitações anatômicas do tendão-bainha, mesmo um modesto aumento no tamanho do tendão pode drasticamente vermelhoUCE a função de deslizamento do tendão, e, portanto, gama dígitos de movimento e função da mão.
Antes de lesões década de 1960 para os tendões flexores, particularmente os da Zona II da mão, não foram rotineiramente reparado devido a complicações graves em cura que surgiram com esses reparos 2. Esta área da mão foi referido como 'terra de ninguém' 3. No entanto, as melhorias nas técnicas cirúrgicas, padrões de sutura e protocolos de reabilitação de fisioterapia têm resultados do tendão flexor reparos 2 melhorou dramaticamente. Apesar destes avanços, até 40% das reparações resultar na formação de aderência suficiente para impedir a função da mão 4. Portanto, uma abordagem biológica é necessário para melhorar a cicatrização. Infelizmente, muito pouco se sabe sobre o processo de cicatrização do tendão no nível celular e molecular. Assim, o objectivo foi desenvolver um modelo murino que poderia ser usado para melhorar a understandin fundamentaisg dos componentes celulares e moleculares da cicatrização do tendão flexor e a resposta de formação de cicatrizes, como um meio para identificar novos alvos terapêuticos para melhorar a cicatrização.
modelos animais maiores têm sido fundamentais para aprofundar a compreensão do processo de cicatrização do tendão flexor. Canino e coelho estudos demonstraram tanto a capacidade de cura intrínseca e extrínseca de tendões flexores 5,6, a importância de movimento passivo precoce controlada para minimizar a formação de aderência em relação à imobilização 7, bem como os efeitos de diferentes padrões de sutura sobre o processo de cura 8 , 9. Além disso, o modelo canino tem sido útil em testes de abordagens de engenharia de tecidos para melhorar a cicatrização de translação 10. No entanto, existem várias vantagens importantes na utilização de um modelo de murino em relação a um modelo animal de grande porte, incluindo o custo relativo, da disponibilidade de reagentes específicos de murino, e a facilidade de gerar KNOC mundialk-outs ou construções de deleção / superexpressão de tecidos específicos. Além disso, as semelhanças funcionais entre humanos e ratinhos com respeito aos tendões flexores 11 indicam a utilidade potencial no desenvolvimento de um modelo de murino.
Desenvolvimento de um modelo murino de transecção do tendão flexor e reparação imita muitos aspectos da cura clínica, incluindo a formação de tecido cicatricial abundante e propriedades mecânicas prejudicada. O modelo descrito aqui não é uma verdadeira recapitulação da prática clínica devido à transecção do FDL na junção miotendínea, a fim de proteger o local de reparação. Além disso, este modelo não leva em conta a contribuição de células da bainha sinovial à resposta de cura, já que não há bainha sinovial que cobre a porção média do tendão onde o reparo ocorre. Apesar destas limitações, este modelo tem a vantagem de intervalo de geração de adesões de limitação de movimento, que ainda tem de ser demonstrada em modelos murinos que mais closEly aproximar o cenário clínico. Este modelo tem sido utilizado para avaliar knock-out modelos de ratinho 12,13, e para testar diferentes abordagens farmacológicas para melhorar a cicatrização 14-17. As análises histológicas deste modelo, usando imuno-histoquímica e hibridação in situ, pode fornecer informações importantes para a localização de genes-chave e proteínas durante a cura. No entanto, histologia fornece apenas uma análise espacial do corte transversal e não permite a quantificação ao longo de todo o tecido. A citometria de fluxo representa uma abordagem mais quantitativa, mas apenas um número muito limitado de células podem ser isoladas a partir do tecido de cicatrização do tendão no modelo de ratinho, e este número é ainda mais reduzida durante os passos de fixação, permeabilização e lavagem. Tendo isto em conta a, citometria de fluxo torna-se uma abordagem inviável devido ao número de animais que seria necessária. Um método alternativo é necessário para preservar a maioria desta população de células pequenas, a fimpara caracterizar ainda mais o meio de cura. O método utilizado para alcançar este objetivo, mostrado aqui, envolve a concentração das células isoladas através de centrifugação citologia numa lâmina de vidro, seguido por imunocitoquímica. No presente estudo EdU (5-etinil-2'desoxiuridina, um análogo da timidina) incorporação e rotulagem subsequente foi usada para determinar o estado proliferativo relativa de células no local de cicatrização. Esta abordagem pode ser aplicada para testar a eficácia dos tratamentos farmacológicos sobre a proliferação celular, o gene de knock-out ou sobre-expressão, ou para identificar e quantificar as populações de células diferentes.
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Protocol
O Comité University em Pesquisa Animal da Universidade de Rochester aprovado todos os experimentos com animais. Dez-12 semanas de idade C57BL fêmea / 6J foram usadas.
1. Preparação de Animais para a cirurgia do tendão flexor (~ 15 min)
- instrumentos cirúrgicos autoclave para esterilizar, usar luvas estéreis por toda parte, e manter um campo de cirurgia estéril.
- Anestesiar o rato através de injecção intraperitoneal (IP) com um volume de cetamina (80 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) correspondente ao peso do corpo. Confirmar profundidade de sedação através de ausência de reflexo toe-pitada.
- Administrar analgesia preventiva (buprenorfina, 0,05-0,1 mg / kg) via injecção subcutânea. Aplicar pomada oftálmica para evitar que os olhos sequem.
- Prepare o local da cirurgia grampeando a pele em toda a pata traseira. Esterilizar a pele por lavagem sequencial com iodo povidona, seguido por 70% de etanol, e novamente com iodo povidona.
- Encontrar o tendão flexor longo dos dedos (FDL), visto superficialmente na face medial da panturrilha. Utilizando um bisturi, fazer uma pequena incisão 0,5-1 cm na pele com micro-tesouras para expor o tendão.
- Use uma pinça para separar o tendão FDL do tecido circundante e segui-lo até a junção miotendínea. Cortar o tendão nesta junção com uma tesoura de mola para liberá-lo, tomando cuidado para evitar a artéria tibial posterior.
- Feche a pele com 5-0 nylon.
Nota: A transecção e reparação (passos 2.4) FDL deve ser efectuada utilizando um estereomicroscópio. - Faça uma incisão 3 milímetros sobre o aspecto póstero da pata traseira com molas micro-tesoura. Gentilmente retirar o tecido mole ao redor e músculo com uma pinça, tomando cuidado para minimizar danos nos tecidos, e identificar o tendão FDL.
- Delicadamente levantar o tendão FDL e transecto-lo completamente usando micro-tesoura. Suturar as extremidades do tendão FDL em conjunto num padrão de Kessler modificada com 8-0 suturas, evitando a secagem do tendão por molhar periodicamente com solução salina.
- Substituir tecidos moles e músculos sobre o tendão, em seguida, fechar a incisão com 5-0 nylon.
- Coloque ratos sobre uma lâmina quente conjunto a 37 ° C, para manter a temperatura corporal até recuperado da anestesia.
- Monitorar ratos pós-operatório para os sinais de deterioração ou infecção, incluindo o aumento da vocalização e de peles de babados. Injectar buprenorfina (50 ul / mouse) como analgésico a cada 12 horas até que os ratos não mostrar sinais de dor ou angústia.
- Permitir que os ratos para curar por um período de 10 dias após a cirurgia, antes de continuar com as próximas etapas.
Nota: As células podem ser colhidas em qualquer ponto de tempo de pós-cirurgia. Aqui, 10 dias são escolhidos para estas experiências representativas, dada a relativamente alta celularidade do tecido, neste momento.
3. Labeling de células em divisão (~ 10 min)
- Prepare EdU (5-etinil-2'desoxiuridina) solução (10 mg / ml em tampão fosfato salino estéril [PBS] + 1% de dimetilsulfóxido [DMSO] para aumentar a solubilidade).
- Injectar murganhos com 100 ul EdU (50 mg / kg) via injecção ip de 24 horas antes do sacrifício.
4. Células colheita para Citologia centrifugação (2,5 horas, ~ 30 min Hands-on Time)
- Prepare a 3 mg / ml de colagenase I em PBS.
- Eutanásia rato através de asfixia com dióxido de carbono a uma taxa de fluxo de não mais de 3 L / min, e efectuar o deslocamento cervical como uma medida secundária.
- Localize o tendão reparado usando o passo 2.4 acima, e isolar tecido do tendão pelo corte de cerca de 2 mm de cada lado do sítio de lesão com micro-tesouras.
- tecido tritura com escalpelo em uma placa de Petri com 1 ml de 3 mg / ml de colagenase, em seguida, passar mistura através de um 18 G agulha várias vezes para quebrar o tecido. Recolhe mistura para um tubo de centrífuga de 1,5 ml. Digerir tecido do tendão durante 1 hora a 37 ° C com agitação.
- Rotação tecido para baixo (300 xg durante 5 min), colagenase aspirado, em seguida, ressuspender as células / tecido com albumina de soro bovino a 500 ul de 3% (BSA) em PBS por pipetagem para cima e para baixo várias vezes.
- suspensão de células do filtro através de um filtro de células 70 mm para remover detritos e pedaços grandes de tendão, e reserve em um 37 ° C incubadora.
- Coloque tecido do tendão em outra 1,5 ml tubo de centrífuga, e refrescar-se com 1 ml de solução de colagenase, pipetando para cima e para baixo para misturar.
- Incubar tecido mais uma hora a 37 ° C com agitação.
- Girar tecido do tendão digerido (300 xg durante 5 min), em seguida ressuspender em 500 ul de 3% BSA em PBS por pipetagem para cima e para baixo várias vezes.
- Filtro de suspensão de células através de um filtro de células 70 mm, combinam com suspensão isolado no 4.3.3, em seguida, contar as células com um hemocitómetro.
- Lave as células uma vez mais com 3% de BSA em PBS, em seguida ressuspender a 6/3x 10 4/100 ul.
- Anexar um funil de citologia para um slide carregado positivamente e bloquear no suporte de slides. Inserir todo o aparelho numa centrífuga citologia e adicionar 100 ul de suspensão de células para o funil. Centrifuga-se a 300 xg durante 5 minutos para dispersar as células para a corrediça.
5. Imunocitoqu�ica para detectar EdU (2 h, ~ 45 min Hands-on Time)
Nota: Todos os passos de incubação deve ser realizada no escuro para limitar a fotodegradação de fluoróforos.
- células de círculo com uma caneta barreira hidrofóbica para minimizar a solução necessária para as seguintes etapas, em seguida, fixar imediatamente com 150 ul de 3% de paraformaldeído em PBS, 15 min à temperatura ambiente (RT).
- Lavar duas vezes durante 5 min com 150 ul de BSA a 3% em PBS.
- permeabilizar as células com 0,5% de Triton X-100 em PBS de 20 minutos à temperatura ambiente.
- Repita o passo de lavagem como em 5.1.1.
- Prepare EdU cockt reaçãoAil de acordo com as instruções do kit de não mais do que 30 minutos antes da utilização.
- Adicionar 150 ul de coquetel para cada lâmina, incubar 30 min a RT.
- Repita o passo de lavagem como em 5.1.1.
- Incubar com 150 ul de contraste nuclear Hoechst33342 diluído 1: 2000 em PBS 30 min à temperatura ambiente.
- Lavar duas vezes durante 5 min com 150 ul de PBS 1x.
- Adicionar 1-2 gotas de médio a células de montagem anti-fade, em seguida, lentamente lamela inferior para evitar bolhas.
- Permitir que o meio de montagem para curar durante a noite no escuro à temperatura ambiente.
- Use unha polonês clara para selar a lamela ao slide.
- imagem desliza em 40X usando um microscópio de fluorescência equipado com filtros de excitação / emissão capazes de detectar DAPI (Hoeschst33342) e Texas Red (Alexa Fluor 594).
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Representative Results
O flexor longo dos dedos (FDL) muscular, localizada na panturrilha, age para flexionar os dígitos da pata de camundongo traseira através do tendão flexor (esboçada em azul na Figura 1A, e mostrado histologicamente na Figura 2A), que funciona proximal do miotendínea junção e termina nas falanges distais. Neste modelo de cicatrização do tendão flexor, o tendão FDL é seccionado e reparado no mid-pé, proximal à bifurcação para os dígitos da pata posterior (setas vermelhas, Figura 1A). Para evitar uma ruptura do reparo, o que impediria a análise experimental, o tendão (e músculo ao lado) é cortado, ou liberado, na junção miotendínea (seta amarela na Figura 1B, liberação mostrado na Figura 1C). Embora este passo não é representativo do quadro clínico, é crítico para proteger o reparo, diminuindo a pressão sobre o local da lesão. A Figura 2Dé um exemplo histológica de uma reparação do tendão flexor ruptura, comparado a um reparo bem sucedido mostrado na Figura 2C. Neste último, o tecido de granulação aumentavam grandemente a celularidade em relação ao tendão não lesionado (Figura 2B), e esta população de células pode, então, ser analisados adicionalmente por meio de centrifugação a citologia numa lâmina seguido por imunocitoquímica. A Figura 3 descreve o método experimental usado para avaliar o estado proliferativo das células coletadas de cura tendões de 10 dias pós-reparo via EdU incorporação no ADN recentemente sintetizado. Por conseguinte, a rotulagem EdU mostra apenas as células que proliferaram de forma activa durante o período de 24 horas após o pulso EdU em ratinhos vivos, como pode ser visto na Figura 4. A avaliação quantitativa de proliferação em tecido de granulação do tendão de cura pode então ser determinada por contagem de pontos a preparação de célula inteira. Deste modo, uma linha de base de proliferação pode ser estabelecida em cada momento, e quaisquer alterações devido a intervenções genéticas ou farmacológicas podem ser avaliadas.
Figura 1 :. Murino Hind Paw Anatomia e Identificação da Flexor longo dos dedos do tendão. O flexor longo dos dedos (FDL) flexiona os dígitos na pata do rato traseira e corre ao longo do aspecto palmar da pata traseira (FDL esboçada em azul), onde bifurca-se em os dígitos (setas vermelhas) (Figura 1A). Proximal, o tendão FDL atravessa o túnel do tarso (seta preta), para o bezerro, terminando na junção miotendínea (seta amarela) (Figura 1B). A liberação do tendão na junção miotendínea para evitar a ruptura é mostrada na Figura 1C. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. Imagens histológicos representativos de Un-ferido, cicatrização normal e Reparos Ruptura do tendão flexor A anatomia do tendão FDL na pata posterior murino é mostrado na Figura 2A. barra de escala representa 1 mm. Nas Figuras 2B-D, o tendão é ampliada na 8X para comparar tecido do tendão não lesionado (Figura 2B) a uma reparação intacta e ruptura (Figuras 2C e 2D, respectivamente). Amostras pata traseira inteiras foram fixadas em formalina tamponada neutra, embebidos em parafina, cortados em secções de 3 um, e corados com azul Alcian / hematoxilina / Orange G como previamente descrito 13. tendão nativo é esboçada em azul, composto tendão / tecido de granulação é esboçado no verde e setas pretas indicam suturas. As barras de escala representam 200 | im. Plocação clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Procedimento Experimental para executar EdU clique nele Química em preparações de células No dia 10 pós-cirurgia cura tendões FDL foram dissecados de rato patas traseiras.. Os tendões digeridos foram picados em seguida, durante duas horas em colagenase I para dissociar as células. A suspensão de células foi esticado para remover detritos, e ~ 6 x 10 4 células foram centrifugadas para uma monocamada em lâminas de vidro carregadas positivamente utilizando uma centrífuga de citologia. As células foram circulou com uma caneta barreira hidrofóbica e depois corrigido imediatamente com paraformaldeído. Depois de permeabilização com Triton X-100, as células foram tratadas com um cocktail de detecção edu, e uma reacção química clique ligado Alexa Fluor 594 para EdU incorporada. Hoechst 33342 foi utilizado como um corante nuclear, e as células wer e analisadas em 10-40X com um microscópio fluorescente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4:. Análise imunocitoquímica de células Ciclismo EDU-rotulados Durante tendões do tendão flexor Cura Cura FDL foram colhidas a partir das patas traseiras de ratos de 10 dias de pós-operatório e digerido com colagenase para se obter uma suspensão de células. A centrifugação foi usado para dispersar estas células para uma monocamada em lâminas, seguido por imunocitoquímica de imagem EdU incorporação. Figura 4A e Figura 4B são fotografias tiradas a 10X e 40X, respectivamente, das células seguintes análise imunocitoquímica. mancha nuclear Hoechst 33342 é azul, e as células que incorporaram EdU são pontilhadas com vermelho. As barras de escala representam 50 mm.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54433/54433fig4large.jpg" target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O procedimento cirúrgico para um modelo murino de transecção completa e reparação do flexor longo dos dedos tendão é apresentado neste estudo. Além disso, uma nova aplicação de concentrar populações de células pequenas com citologia centrífuga é demonstrada, permitindo a análise imunocitoquímica quantitativa do ambiente celular durante a cicatrização do tendão flexor. Este modelo de reparação do tendão flexor demonstra uma resposta de cura reprodutível, que pode ser utilizado para avaliar mudanças no processo de cura utilizando modelos nocaute ou com intervenção farmacológica. No seguimento da cirurgia, uma reacção inflamatória começa dentro de 24 horas, durante o qual as células são recrutadas para o local da lesão e um calo de tecido fibroso começa a formar. A fase proliferativa segue em cerca de quatro dias, envolvendo muito maior celularidade e abundante deposição de matriz extracelular desorganizado no local do reparo, levando à formação de aderências entre 14-21 dias. Tecido remodelação continues até ao dia 35, altura em que a continuidade do tempo e organização do tendão flexor é restaurada, e celularidade é reduzida 18.
Actualmente, existem vários modelos murinos de reparação do tendão flexor em adição ao que aqui se apresenta. Tsubone et al., Descreveram um modelo in vitro de tendão flexor cicatrização 19. Embora este modelo pode avaliar as alterações na expressão do gene ao longo do tempo, ele não pode dar conta do recrutamento de células extrínsecos ou alterações no meio inflamatório / citoquina que ocorre in vivo. In vivo, dois modelos de transecção parcial têm sido desenvolvidos utilizando um incisional ou excisional defeitos 20,21. Mais recentemente, Wong et ai., Caracterizaram um modelo da zona II da lesão do tendão flexor em um modelo murino 22. Este é um importante desenvolvimento, uma vez que permite a contribuição de células derivadas da bainha sinovial para o processo de cura para ser definido. No entanto, não quantificável alterações na função delta têm sido descritos usando este modelo. Cada modelo tem suas próprias vantagens e limitações que devem ser consideradas, incluindo a facilidade técnica, relevância clínica e anatomia. A principal limitação do modelo aqui descrito é que a cura do tendão pode romper-se antes da avaliação, tornando-o inutilizável para análise posterior. A colheita de células suficientes que se inviável sob estas condições, e qualquer análise histoquímica não é viável, como um tendão rompido não seguir o processo de cura padrão descrito acima. Soltar o tendão FDL proximalmente para diminuir a tensão sobre o tendão de cura é, por conseguinte, um passo crítico para a prevenção de, apesar do facto de que não é clinicamente relevante. Realizar a cirurgia unilateralmente também reduz a taxa de ruptura. Outra limitação é a incapacidade de controlar a contribuição de células da bainha peri-tendinosas, como a bainha sinovial não rodear o segmento de FDL tendão que é ferido neste modelo.
jove_content "> Uma função importante deste modelo de reparação de tendão flexor é que ele permite a avaliação das células no local de cicatrização. Imunofluorescência / imuno-histoquímica (IHQ) é uma técnica biológica comum que pode ser utilizado para caracterizar estas células. Embora IHC é exclusivamente adequado para a determinação da informação espacial, que é em grande parte um método qualitativo. Alterações no tecido ou composição de células em toda a profundidade do tecido pode ser dispensada, e quantificação de populações é difícil. a citometria de fluxo representa uma abordagem ideal para definir, quantificar e potencialmente isolar células populações durante a cura. no entanto, o número de células muito baixo de isolamento e digestão de tecido de cicatrização do tendão rendimentos a partir deste modelo para análise por citometria de fluxo (1-2 x 10 5 em média a partir de cada rato), e a fixação / permeabilização passos para a detecção de marcadores intracelulares reduz este número mais. Utilizando citologia centrifugação para concentrar as células isoladas, seguido de immunocytocheMistry, fornece uma maneira de caracterizar estas populações de células pequenas. Uma vantagem significativa desta técnica é que não há necessidade para agrupar as amostras em conjunto para obter células suficientes; Por conseguinte, cada rato representa uma amostra individual para análise. Uma consideração importante na geração de células nestas preparações é manter a consistência no tecido colhidas para análise. músculo circunvizinho e fáscia pode aderir ao tecido de granulação e deve ser cuidadosamente dissecada. Uma vez que este método envolve um processamento mínimo das células antes da fixação em lâminas, ele retém uma maioria de células isoladas para análise posterior. Deste modo, praticamente toda a população de células que constituem o tecido de adesão no local de reparação pode ser quantitativamente avaliado por meio de imunocitoquímica. No presente estudo, EdU incorporação por células em proliferação é usado para demonstrar a aplicação desta técnica a citologia, no entanto, pode também ser usado para mais complexo e em profundidade caracterização óf as populações de células heterogéneas envolvidos na cicatrização do tendão flexor. As aplicações futuras desta técnica pode conduzir a uma maior profundidade na caracterização das populações de células envolvidas na cura do tendão, uma vez que permite determinar a co-localização de marcadores celulares em células associadas com o tecido de granulação no tendão de cura.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Este trabalho foi parcialmente apoiado pela Sociedade Americana de Cirurgia do Prêmio Pilot Mão e NIH / NIAMS 1K01AR068386-01 (a AEL) e NIAMS / NIH P30AR061307.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical preparation | |||
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | 000664 | |
| Ketamine | Hospira | NDC# 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Lloyd Inc. | NDC# 61311-482-10 | |
| Buprenorphine | Par Pharmaceutical Inc. | NDC# 42023-179-10 | |
| 0.9% sodium chloride irrigation | Hospira | NDC# 0409-6138-03 | For preparation of ketamine/xylazine and buprenorphine solutions |
| 1 ml syringe | BD | 309659 | |
| 30 G needle | BD | 305106 | |
| Povidone-Iodine solution | Aplicare | 82-226 | |
| 70% ethanol | |||
| Puralube vet opthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | NDC# 17033-211-38 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools | |||
| Portable balance 200 g | Ohaus | SP202 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15124-12 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Needle holders | Fine Science Tools | 91201-13 | |
| Micro spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Micro needle holders | Fine Science Tools | 12061-02 | |
| 5-0 nylon sutures | Ethicon | 668G | |
| 8-0 microsurgery nylon sutures | Ethicon | 2808G | |
| Lab-Line histology slide warmer | Barnstead International | 26025 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytospin method | |||
| Collagenase Type I, lyophilized | Life Technologies | 1700-017 | |
| Bovine Serum Albumin | Cell Signaling Technologies | 9998S | |
| 1x PBS | Thermo Fisher | 10010-023 | |
| Cytology funnels | Fisher HealthCare | 10-354 | |
| HistoBond+ microscope slides | VWR | 16005-110 | |
| Cytospin 2 centrifuge | Shandon | SH-CYTO2 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunocytochemistry | |||
| Slide staining tray with black lid | IHC World | M920-2 | |
| Click-iT Plus EdU Imaging Kit | Life Technologies | C10639 | Includes EdU and Hoeschst 33342 |
| Immedge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| ProLong Diamond mounting medium | Thermo Fisher | P36970 | |
| Glass coverslips 24 x 50 mm #1.5 | |||
| Clear nail polish |
References
- Lin, T. Biomechanics of tendon inury and repair. J Biomech. 37, 865-877 (2004).
- Strickland, J. W. Development of flexor tendon surgery: twenty-five years of progress. J Hand Surg [Am]. 25, 214-235 (2000).
- Bunnell, S. Repair of tendons in the fingers and description of two new instruments. Surg Gynecol Obstet. 26, 103-110 (1918).
- Aydin, A., et al. Single-stage flexor tendoplasty in the treatment of flexor tendon injuries. Acta Orthop Traumatol Turc. 38, 54-59 (2004).
- Gelberman, R. H., Steinberg, D., Amiel, D., Akeson, W. Fibroblast chemotaxis after tendon repair. J Hand Surg Am. 16, 686-693 (1991).
- Lundborg, G., Rank, F. Experimental intrinsic healing of flexor tendons based upon synovial fluid nutrition. J Hand Surg Am. 3, 21-31 (1978).
- Aoki, M., Kubota, H., Pruitt, D. L., Manske, P. R. Biomechanical and histologic characteristics of canine flexor tendon repair using early postoperative mobilization. J Hand Surg Am. 22, 107-114 (1997).
- Kim, H. M., et al. Technical and biological modifications for enhanced flexor tendon repair. J Hand Surg Am. 35, 1031-1037 (2010).
- Aoki, M., Manske, P. R., Pruitt, D. L., Kubota, H., Larson, B. J. Work of flexion after flexor tendon repair according to the placement of sutures. Clin Orthop Relat Res. , 205-210 (1995).
- Zhao, C., et al. Award for Outstanding Orthopaedic Research: Engineering flexor tendon repair with lubricant, cells, and cytokines in a canine model. Clin Orthop Relat Res. 472, 2569-2578 (2014).
- Wong, J., Bennett, W., Ferguson, M. W., McGrouther, D. A. Microscopic and histological examination of the mouse hindpaw digit and flexor tendon arrangement with 3D reconstruction. J Anat. 209, 533-545 (2006).
- Katzel, E. B., et al. Impact of Smad3 loss of function on scarring and adhesion formation during tendon healing. J. Orthop. Res. 29, 684-693 (2011).
- Loiselle, A. E., et al. Bone marrow-derived matrix metalloproteinase-9 is associated with fibrous adhesion formation after murine flexor tendon injury. PloS one. 7, e40602 (2012).
- Lee, D. J., et al. Parathyroid hormone 1-34 enhances extracellular matrix deposition and organization during flexor tendon repair. J Orthop Res. 33, 17-24 (2015).
- Geary, M. B., et al. Systemic EP4 Inhibition Increases Adhesion Formation in a Murine Model of Flexor Tendon Repair. PloS one. 10, e0136351 (2015).
- Loiselle, A. E., et al. Development of antisense oligonucleotide (ASO) technology against Tgf-beta signaling to prevent scarring during flexor tendon repair. J Orthop Res. 33, 859-866 (2015).
- Orner, C. A., Geary, M. B., Hammert, W. C., O'Keefe, R. J., Loiselle, A. E. Low-dose and short-duration Matrix Metalloproteinase 9 Inhibition does not affect adhesion formation during murine flexor tendon healing. Plast Reconstr Surg. , (2016).
- Loiselle, A. E., et al. Remodeling of murine intrasynovial tendon adhesions following injury: MMP and neotendon gene expression. J Orthop Res. 27, 833-840 (2009).
- Tsubone, T., et al. Effect of TGF-beta inducible early gene deficiency on flexor tendon healing. J Orthop Res. 24, 569-575 (2006).
- Beason, D. P., Kuntz, A. F., Hsu, J. E., Miller, K. S., Soslowsky, L. J. Development and evaluation of multiple tendon injury models in the mouse. J Biomech. 45, 1550-1553 (2012).
- David, M. A., et al. Tendon repair is compromised in a high fat diet-induced mouse model of obesity and type 2 diabetes. PloS one. 9, e91234 (2014).
- Wong, J. K., et al. The cellular biology of flexor tendon adhesion formation: an old problem in a new paradigm. Am J Pathol. 175, 1938-1951 (2009).
