Yakalama ve Kan gelen Canlı Sirkülasyon Tümör Hücrelerinin Yayın
Summary
Protokol, bir poli (N-ISO-propylacrylamide) etkili bir yakalama ve canlı dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CTC) arasında thermoresponsive salınması için (PIPAAm) kaplanmış mikro filtre sunulmaktadır kullanılması. Bu yöntem analizleri ve karakterizasyonu, aşağı off-çip kültürü için hastaların kan ve canlı CTC sonraki sürümünden CTC yakalanmasını sağlar.
Abstract
Bu alt-analiz ve / veya kültür için yonga bu hücrelerin serbest bırakılması ile birlikte, bütün kandan canlı dolaşımdaki tümör hücresi (CTC) boyutu esas yakalanması için bir yöntem ortaya koymaktadır. Strateji CTC ve yakalanan CTC thermoresponsive uygulanabilir serbest bırakılması için bir poli kaplama (N-ISO-propylacrylamide) (PIPAAm) yakalamak için yeni bir Parylene C membran yuvası gözenek mikrofiltre kullanımını kullanır. Canlı hücrelerin yakalama tipik filtrasyon işlemi ile ilgili makaslama stresi azaltmak belirli boyutlara sahip bir yuva gözenek geometrisi tasarımı yararlanarak etkindir. mikrofiltre yüksek yakalama verimliliği sergiler iken, bu hücrelerin serbest bırakma olmayan saçmadır. örneğin ters akım ya da hücre kazıma gibi teknikler kullanıldığında, genellikle, hücrelerin sadece küçük bir yüzdesi serbest bırakılır. Parylene Cı membrana bu epitelyal kanser hücrelerinin güçlü yapışma spesifik olmayan elektrostatik etkileşim atfedilebilir. th önlem olaraketkisi, biz PIPAAm kaplamanın kullanılması istihdam ve filtre hücreleri serbest bırakmak için termal duyarlı arayüz özelliklerinin kullandı. Kan önce oda sıcaklığında süzülür. 32 ° C'nin altında, PIPAAm hidrofiliktir. Bundan sonra, filtre, kültür ortamı ya da hidrofobik getirilmesi ve daha sonra elektro statik olarak bağlanmış hücreleri serbest PIPAAm sonuçlanır 37 ° C'de muhafaza edilen bir tampon ya yerleştirilir.
Introduction
Metastatik hastalık çoğu kanser ölümlerinin sorumludur. metastaz prognostik ve arkadaşı teşhis biyomarker gelişmekte kanser ve tedavisinde çok önemlidir. Dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CTC), tümör yayılması ve metastazında bir rol oynar. Ayrıca, 'sıvı biyopsi' belirteç olarak kolay erişilebilir olması, kanser hastalarının içinde CTC kanser biyomarkır araştırma yuva 'periferik kan bir şekilde artmaktadır.' 3 – CTC iyi meme, prostat ve kolorektal kanser 1 dahil olmak üzere çeşitli kanser ayarları prognostik belirteç olarak onaylanmıştır. Ancak, CTC alanındaki son gelişmeler girişimsel klinik çalışmalarda 4'te gösterildiği gibi bu nadir hücrelerin sadece numaralandırma, klinik yarar sınırlı olduğunu belirtti. Bu nedenle, CTC moleküler ve fonksiyonel karakterizasyon için izin teknolojileri için gelişmekte olan bir ihtiyaç vardır. Şu anda, sadece birkaç teknolojileri fo izin veren mevcutr olmayan antijen önyargılı, canlı yakalama ve CTC serbest bırakılması, sağlam aşağı moleküler ve fonksiyonel analiz 5,6 sağlayarak. Bu mikrofabrike cihaz çoğunluğu mikroakışkan platformlara birleştirilebilir ve bu şekilde 2-4 mi 7 arasında olduğu, işlenebilir kan miktarının, sınırlayıcı bir faktör sahiptir – 10. CTC büyük yakalama ve ilgi bu hücrelerin izole edilmesi olasılığını engeller, bu nedenle daha da işlenebilir kan miktarını azaltarak, kan alımı (7.5 mi) tek bir tüp içinde nadirdir.
Biz büyük tümör hücreleri ve daha küçük normal kan hücrelerinin 11,12 arasında boyut farklılıkları istismar CTC yakalanması için Parylene C membran mikrofiltre cihazları iki tür geliştirdik. Biz daha önce yuvarlak gözenek numaralandırma filtre bildirdi ve mikrofiltre CTC yakalama verimliliği üstün olduğu gösterilmiştir, bir FDA onaylı bir platform ile karşılaştırdık varkanser hastası kan numunelerinin 13,14 için. Ancak, yuvarlak filtre bir sınırlama filtrasyon öncesinde formaldehit esaslı fiksatif kullanmak için bir gerekliliktir. Bu süreç, filtreleme işlemi sırasında kesme stresi ve basınca dayanacak şekilde izin verirken hücre morfolojisi muhafaza eder. Sayım ve moleküler çalışmalar on-chip 13 yapılabilir iken, fiksatif fonksiyonel karakterizasyonu gerçekleştirmek için yeteneğini bozar. Bu sınırlama gidermek için, biz filtrasyon öncesinde hücreler (Şekil 1) düzeltmek için gerekliliğini ortadan bir yarık gözenek filtresi geliştirdi. yuva gözenek geometrisi (6 mikron genişlik x 40 mm uzunluk yuvası gözenekler) sadece kısmen hala diğer kan hücreleri için serbest geçiş izin ve hücre hasarına yol açacak basınç artışı hafifletilmesi böylece gözenek kapatılmasıy ve süre tümör hücrelerinin yakalanmasını sağlar ve nihai patlama 15,16 yuvası gözenek kartuş hangi sandviç 2 akrilik parçadan oluşmaktadırBir conta olarak polidimetilsiloksan (PDMS) oyunculuk ile üst ve alt parça arasında yuva gözenek filtresi bir sızıntı geçirmez conta 14,15 (Şekil 1) temin etmek.
Yuva gözenekli filtre yakalama verimliliği yüksek olsa da, (Tablo 1), çekilen CTC yerine yapışma 15 aracılı hücre dışı matrisin (ECM) güçlü özel olmayan elektrostatik etkileşimlerle Parylene Cı zara bağlıdır. örneğin ters akım veya hücre kazıyıcı kullanımı gibi yöntemler etkili filtreden hücreleri serbest ya da hücre hasarı ve hücre ölümüne neden başarısız. Biz bir salım stratejisi 15 formüle PIPAAm bir sıradışı kullanım araştırdı. PIPAAm 32 ° C'lik bir solüsyon ısısına C17 bir geri düşük kritik çözelti sıcaklığı (LCST'nin) faz geçişine maruz kalan bir polimerdir. Geleneksel olarak, PIPAAm bu özellik yaygın doku mühendisliği uygulamaları için incelenmiştir. Tipik olarak, hücrelerPIPAAm kültüre PIPAAm hidrofobik olduğu zaman, 37 ° C'de yüzeyleri kaplama. Kültür sıcaklığı PIPAAm kaplı yüzey hidratlanmış 17,18 olur 32 ° C'nin altında kaydırılır, hücreler daha sonra bir tabaka olarak ayrılabilir. Bu, oda sıcaklığına (32 ° C) bir filtrasyon işlemi gerçekleştirerek ve daha sonra 37 ° C'de muhafaza kültür ortamı filtre yerleştirilerek hücre serbest sağlayarak bu termal özelliği kullandı. Bu sıcaklıkta, PIPAAm polimer tabakası ve böylece elektro statik olarak bağlanmış hücreleri 15 (Şekil 1), serbest bırakma, hidrofobik hale gelir.
Sıcaklığa duyarlı bir yöntem yanı sıra diğer yöntemler başarılı 19 uygun bir CTC yakalama elde etmek ve serbest bırakmak için uygulanmıştır, ancak – bildirilen bu teknolojilerin tarafından paylaşılan 21, bir anahtar muhtemel bir mahsur da hepsi CTC yakalama için bir antijene bağımlı ilkesi uygulanır olmasıdır. Antijen temelli CTC yakalama, gösterildiği gibi previously, önyargılı CTC analiz 11,14 yol açabilir. Örneğin, çok sayıda afinite bazlı teknolojileri CTC yakalama EpCAM bağlanan antikor kullanır. Bununla birlikte, CTC, bu teknolojilerin EpCAM, düşük ve EpCAM negatif CTC ihmal yol EpCAM çeşitli düzeylerde eksprese gösterilmiştir. non-epitelyal kökenli CTC melanom ve sarkom ayarlarında gibi CTC gibi ilgi göstermektedir Ayrıca, sınırlamalar meydana gelebilir. Böylece, antijen bazlı yakalama tarafından tanıtıldı potansiyel önyargı olmadan yaşayabilir CTC yakalama ve serbest bırakılması için olanak sağlayan bir teknolojidir arzu edilmektedir.
Önemlisi, mikrofiltre yakalama cihazı tamamen dayalı büyüklükte ve bırakma stratejisi belli yüzey belirteçlerinin varlığı agnostik mesafesindedir. Biz PIPAAm kaplı mikro filtre istihdam etkin ve verimli bir yakalama ve alt analizler için CTC serbest bırakmak için yeteneği sağlayarak, metastatik sürecinin anlayışımızı genişletmek için yardımcı olacağına inanıyoruz. güçlü Bu mayısially kolaylıkla izlenebilir ve kanser hastası yönetiminde yardım edilebilir bir biyobelirteç sağlamak gibi yeni hedefli sistemik tedaviler de yönlendirilebilir olabilir için yeni moleküller maruz kalmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
tam kandan canlı CTC yakalamak ve mikro filtre onları bırakmadan süreci oldukça basittir; ancak birkaç kritik noktalar kayda değer bulunmaktadır. Nesnenin steril bir durumda tüm süreç boyunca korunur Tüm hücre kültürü gibi, zorunludur. filtreden hücrelerin serbest tekniği için temel PIPAAm sıcaklık duyarlı arayüz özelliklerinin istismar dayalı olarak PIPAAm filtreyi kaplanması ilk adımı, kritik öneme sahiptir. Filtre etkili kaplanmış temin kaplamadan önce, bir mikroskop altında filtre ü…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank all the patients who have donated blood samples to support this work. We thank Drs. Guiseppe Giaconne, Ritesh Parajuli, and Marc E. Lippman for their assistance in clinical sample acquirement, and Drs. Carmen Gomez, Ralf Landgraf, Stephan Züchner, Toumy Guettouche, Diana Lopez for their insightful discussions. Zheng Ao thanks partial support and assistance from the Sheila and David Fuente Graduate Program in Cancer Biology, Sylvester Comprehensive Cancer Center.
Materials
| Slot Filter | Circulogix Inc. | MSF-01 | Different size filters available based for filtration for CTC from blood or urine (www.circulogixinc.com) |
| poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) | Ploysciences Inc. | 21458 | Non-Hazardous. Store at room temp. |
| 1-Butanol | Sigma Aldrich | B7906 | Use in well ventilated area |
| Plastic Microscope Slides | Cole-Parmer | 48510-30 | Any plastic slides or alternatively any sort of square (Metal, Acrylic etc.) can be used if it will be bale to hold the 8mmx8mm filter square |
| Spin Coater | Specialty Coating Systems | SCS G3 Spin Coater | Instrument |
| Polyimide Tape | Uline | S-7595 | Polyimide is the generic name for Kapton Tape which can be purchased form multiple vendors (Amazon, Kaptontape.com) |
| HBSS- Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14025-092 | |
| 1XPBS | Gibco | 10010-023 | |
| McCoy's | Gibco | 16600-082 | Warm in 37 ⁰C water bath before use. McCoys was used for SKBr3 cells, if you use different cell lines or patient blood, please use media that would be optimal for that particular case |
| Falcon Petri dishes 35×10 mm | VWR | 25373-041 | |
| Microfilter Cassette | Circulogix Inc. | FC-01 | Custom catridges are avilable based on filtration for CTC from blood or urine |
| Syringe 20mL | BD Scientific | 302830 | |
| Syringe Pump | KD scientific | 78-0100V | Any syringe pump capable of holding a 25mL syringe may be used |
| Cellstar 50mL Centrifuge tube | VWR | 82050-322 | |
| Greiner Bio One 6 well plate | VWR | 89131-688 | Any brand can be used, as long as the surface is compatiable for cell adesion and not repellant |
| SKBR3 Cells | ATCC | HTB-30 | |
| Live Dead Assay | Life Technologies | L3224 | Any assay that can provide a reasonable analysis to evaluate live cells will work |
| Cell Culture Incubator | VWR | 98000-368 | Any incubator that can be used for cell culture will suffice |
References
- Cristofanilli, M., Budd, G. T., et al. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N Engl J Med. 351 (8), 781-791 (2004).
- de Bono, J. S., Scher, H. I., et al. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).
- Cohen, S. J., Punt, C. J. a., et al. Prognostic significance of circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer. Ann. Oncol. 20 (7), 1223-1229 (2009).
- Smerage, J. B., Barlow, W. E., et al. Circulating Tumor Cells and Response to Chemotherapy in Metastatic Breast Cancer: SWOG S0500. J. Clin. Oncol. 32 (31), 3483-3490 (2014).
- Mach, A. J., Kim, J. H., Arshi, A., Hur, S. C., Di Carlo, D. Automated cellular sample preparation using a Centrifuge-on-a-Chip. Lab chip. 11 (17), 2827-2834 (2011).
- Ozkumur, E., Shah, A. M., et al. Inertial Focusing for Tumor Antigen-Dependent and -Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells. Sci. Transl. Med. 5 (179), 179 (2013).
- Nagrath, S., Sequist, L. V., et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
- Hosokawa, M., Kenmotsu, H., et al. Size-Based Isolation of Circulating Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Microcavity Array System. PLoS ONE. 8 (6), (2013).
- Bhagat, A. A. S., Hou, H. W., Li, L. D., Lim, C. T., Han, J. Pinched flow coupled shear-modulated inertial microfluidics for high-throughput rare blood cell separation. Lab on a chip. 11 (11), 1870-1878 (2011).
- Tan, S. J., Lakshmi, R. L., Chen, P., Lim, W. -. T., Yobas, L., Lim, C. T. Versatile label free biochip for the detection of circulating tumor cells from peripheral blood in cancer patients. Biosens. Bioelectron. 26 (4), 1701-1705 (2010).
- Vona, G., Sabile, A., et al. Isolation by size of epithelial tumor cells a new method for the immunomorphological and molecular characterization of circulatingtumor cells. Am. J. Pathol. 156 (1), 57-63 (2000).
- Marrinucci, D., Bethel, K., et al. Case study of the morphologic variation of circulating tumor cells. Human pathology. 38 (3), 514-519 (2007).
- Lin, H. K., Zheng, S., et al. Portable filter-based microdevice for detection and characterization of circulating tumor cells. Clin. Cancer Res. 16 (20), 5011-5018 (2010).
- Williams, A., Rawal, S., et al. Clinical translation of a novel microfilter technology Capture, characterization and culture of circulating tumor cells. PHT. , 220-223 (2013).
- Ao, Z., Parasido, E., et al. Thermoresponsive release of viable microfiltrated Circulating Tumor Cells (CTCs) for precision medicine applications. Lab Chip. 15, 4277-4282 (2015).
- Xu, T., Lu, B., Tai, Y. C., Goldkorn, A. A cancer detection platform which measures telomerase activity from live circulating tumor cells captured on a microfilter. Cancer Res. 70 (16), 6420-6426 (2010).
- Okano, T., Bae, Y. H., Jacobs, H., Kim, S. W. Thermally on-off switching polymers for drug permeation and release. J. Control. Release. 11 (1-3), 255-265 (1990).
- Yamada, N., Okano, T., Sakai, H., Karikusa, F., Sawasaki, Y., Sakurai, Y. Thermo-responsive polymeric surfaces; control of attachment and detachment of cultured cells. Die Makromol. Chemie, Rapid Commun. 11 (11), 571-576 (1990).
- Deng, Y., Zhang, Y., et al. An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells. Sci. Rep. 4, 7499 (2014).
- Hou, S., Zhao, H., et al. Capture and stimulated release of circulating tumor cells on polymer-grafted silicon nanostructures. Adv. Mater. 25 (11), 1547-1551 (2013).
- Xiao, Y., Zhou, H., et al. Effective and selective cell retention and recovery from whole blood by electroactive thin films. ACS Appl. Mater. Interfaces. 6 (23), 20804-20811 (2014).
- Wallwiener, M., Hartkopf, A. D., et al. The impact of HER2 phenotype of circulating tumor cells in metastatic breast cancer: a retrospective study in 107 patients. BMC cancer. 15 (1), 403 (2015).
