Introduction
结核病（TB）是全球领先的传染性疾病导致性比HIV相关的死亡在世界之一，耐多药菌株的增加上升相结合，使得TB惊人的全球性健康问题1。新的诊断工具，更有效和毒性较小的药物，以及新的安全和有效的结核病疫苗的迫切需要，特别是在发展中世界。
减毒活卡介苗（BCG）是目前预防结核病，已在皮内诞生以来全球20世纪70年代给予唯一的持牌疫苗。卡介苗被认为是有效地防止儿童疾病（脑膜炎和粟粒TB）的严重形式，但已经显示出对负责疾病变速 器2的肺结核功效不一致。
肺接种疫苗，它模仿结核感染的自然路线，代表了当地引发宿主的免疫反应有吸引力的方法秒。在这点上，相比于皮下或皮内途径3-6在不同的有关结核的动物模型的各种临床前工作已经证明以下肺免疫更大疫苗效力。尽管如此，通过肺接种引发的保护机制尚不十分清楚。在过去的几年中，一些作品指着具体TB-粘膜免疫应答的重要因子IL17介导的反应，如在缺陷的IL17粘膜疫苗诱导的保护效力小鼠模型受损7,8。
最近，我们展示的第一次鼻内BCG管理保护的DBA / 2鼠标，鼠标应变特点是皮下BCG免疫后9缺乏保护的。这些结果表明，呼吸道结核疫苗可以减少在流行国家，皮内BCG被认为是对pulmon无效结核病率更有效元TB。
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Protocol
所有小鼠保持在受控条件下和对疾病的任何迹象观察。试点工作是在与欧洲和国家指令实验动物保护，并与主管地方伦理委员会批准同意进行。
1. BCG丹麦的量化甘油股票和结核 分枝杆菌的制备
注：所有所述的协议进行BSL3条件下进行。
- BCG丹麦或分枝杆菌H37Rv菌株的解冻冷冻甘油股票和在10ml 7H9介质10补充有吐温80 0.05％（体积/体积）和ADC（白蛋白，葡萄糖，过氧化氢 酶）的10％（V / V）接种100微升。
- 静态条件下孵育一周，在37℃，直到培养是在对数生长期。
- 由10毫升的文化转移到200毫升的新鲜培养基扩大细菌培养。孵育另外20静态条件下天。
- 转移至50毫升离心管中并离心15分钟，在2500×克
- 丢弃上清液，剩余体积重悬细菌沉淀。添加到每个管无菌3-毫米直径的玻璃珠（10 - 15每管）。
- 涡大力以1分钟内要分离的细菌团块。重悬在10毫升PBS中的各粒料用Tween-80 0.05％（体积/体积）。
- 离开管10分钟允许的最大细菌聚集和玻璃珠定居下来。
- 从每片含小团块和单细菌和转让卷一个新鲜的50毫升离心管（最终恢复卷38ml）中的4管的恢复9.5毫升上清液。离心机在400×g下10分钟。
- 在一个单一的新鲜的50毫升离心管中回收35毫升上清液（主要含有单一细菌），并添加15毫升的PBS与甘油50％（体积/体积），得到15％的最终甘油浓度（体积/体积）。
- 轻轻混匀并在1毫升的等分试样散布在适当的管中冷冻。存储在-80°C（一阄提供大约50等分甘油）。
- 量化甘油股票，解冻甘油天冷冻后，在含有900微升的PBS单独1.5毫升管执行七点十分倍连续稀释。
- 板在7H10固体琼脂培养基10 100微升每种稀释液的补充有55毫米直径的皮氏培养皿中制备的ADC 10％（体积/体积）。
- 小心加入3毫米直径的玻璃珠（约10每盘）并轻轻摇动板均等地分布体积随琼脂平板上。丢弃珠和密封琼脂平板用封口膜。
- 孵育21天，在37℃，并通过在稀释那里单个菌落可以准确分辨计数菌落形成单位（CFU）测定细菌的浓度。
2.鼠标疫苗接种
- 解冻预先定量卡介苗甘油并在PBS中稀释至准备两个悬浮液。计算最终体积考虑每只动物的剂量是用于皮下施用100微升（每毫升10 7 CFU用于皮下接种）和40微升用于鼻内给药（2.5×10 7 CFU鼻内疫苗）。
- 使用专门麻醉工作站啮齿动物用异氟烷和氧气的混合物麻醉小鼠。使用异氟醚的5％以诱导麻醉和2％，以保持麻醉室中的小鼠。 （其他公认的麻醉方法都可以使用）。
- 用于皮下施用疫苗填充1毫升注射器用＆G针用1ml细菌悬浮液（10 7 CFU /毫升）。去除气泡。
- 放置在层流罩内俯卧的平坦表面麻醉小鼠并接种皮下100μl的疫苗（10 6 CFU /剂量）在小鼠的一侧面背面。返回鼠标笼并监视它，以确保它propeRLY从麻醉中恢复。
- 改变各小鼠施用之间的注射器针头。如上所述除去气泡。
- 用于鼻内给药，将麻醉小鼠在引擎盖内仰卧位。
- 用微量取20微升悬浮的2.5×10 7 CFU /毫升。将接种下降逐滴两鼻孔直到整个卷已沉积之间，留下滴之间的时间来让鼠标呼吸音量注：鼠标可以在此过程中因呼吸窘迫这么辛苦，他们应该留给同化管理下一个，以防止它尽可能事先每下降。
- 重新填写与另一个20微升微量并重复该操作。如果鼠标开始从第一接种后麻醉醒来，将其放置在麻醉室中的第二个前。返回鼠标笼子，并确保其恢复正常从麻醉。
3.鼠标鼻内挑战与应变分枝杆菌
- 解冻预先定量分枝杆菌甘油和稀释在PBS准备每毫升2500 CFU的菌悬液。计算最终体积考虑每只动物的剂量是40微升。
- 在2.5中所述分枝杆菌是鼻内接种 - 2.7。每只小鼠最后的挑战剂量为10 2 CFU / 40微升。
4.肺引起的免疫响应分析
- 肺细胞悬浮液
注：在肺中疫苗诱导的免疫应答的评估需要单细胞悬浮液的生成。为了这个目的，我们使用的组织离解，如GentleMACS。- 牺牲颈椎脱位（或其他公认的人性化的方法）鼠标和鼠标确保是死触摸眼球，以确认没有瞬目反射。
- 内部层流罩，提取第lungs用无菌剪刀和镊子，将其放在一个干净的表面。干净的肺移除气管和结缔组织，以及肺用PBS转移到1.5毫升试管（保持在冰上，直到处理）。
- 以产生细胞悬浮液，将肺在含有5ml的10mM HEPES-NaOH中pH为7.4，150 mM氯化钠，5mM的氯化钾，1mM的MgCl 2的1.8毫米氯化钙2器官离解（C-离解器管）的适当管缓冲。
- 添加的胶原酶D 100毫克/毫升100微升（2毫克/毫升终浓度），和DNA酶I 20000 IU / ml的40微升（160单位/毫升的最终浓度。
注：胶原酶D或DNA酶I的储备溶液制备分别溶解在PBS中冻干酶或甘油50％（V / V），20毫摩尔Tris -盐酸pH为7.5ý的MgCl 2为1mM，。 - 将管在组织离解和使用肺碎片预定义的程序m_lung_01。孵育在37℃下在管的水浴中30分钟。
- 第广场在离解ë管，并使用完全同质化的肺成单细胞悬浮液预定义的程序m_lung_02。
- 通过装配到一个50毫升的离心管70微米尼龙细胞过滤器通过细胞悬浮液。用10ml的RPMI 1640培养基中洗涤过滤器。
- 离心细胞在400 XG 5分钟，弃上清。
- 加入1ml红细胞裂解缓冲液中，涡旋混合并孵育在室温下1分钟。
- 加入10 mL的RPMI 1640培养基中，离心细胞在400×g下5分钟。
- 在0.5的完全RPMI 1640培养基中重悬细胞在补充有10％热灭活胎牛血清（FCS），2mM的L-谷氨酰胺，100微克/毫升链霉素，100国际单位/毫升青霉素和50μM2-巯基乙醇。
注：FCS的温育在56℃灭活30分钟。 - 计数细胞并添加完全RPMI 1640培养基中，达到10 7个细胞/ ml的终细胞密度。
注：对于细胞计数，我们使用自动细胞计数器。 - 分发100微升细胞悬浮液在U型底96孔无菌板（10 6个细胞/孔）。
- 添加50μl/孔的完全RPMI 1640培养基中的15微克/毫升的商业H37Rv的纯蛋白衍生物（PPD）（5微克/毫升的最终浓度）。
- 上清液收集通过ELISA的细胞因子测定
- 孵育板从4.1.14为在37℃下48小时和5％ 的 CO 2。
- 离心机板在400 xg离心5分钟，回收100μl的上清液。
- 存储在-80℃。
- 分别上清液稀释1/10和1/2在分析缓冲液的IFNγ和IL17A的决心。确定与商业ELISA试剂盒细胞因子浓度，根据制造商的说明（ELISA开发工具包）。
- 细胞内染色测定细胞因子-producing CD4 +细胞通过流式细胞仪
- 孵育板从4.1.14为在37℃下18小时和5％ 的 CO 2。
- 添加1.5微升的布雷菲德菌素A 1毫克/毫升（股票溶于DMSO）至每孔（10微克/毫升终浓度）孵育额外六个小时。
- 从离心4.3.2板1分钟在3200 XG弃上清。
- 在抗小鼠CD4-FITC的50微升的RPMI 1640稀释，用10％的FCS（1/500）和悬浮细胞孵育在4℃下10分钟。
- 离心从4.3.4板1分钟3,200 xg离心，弃去上清液，加入100μl/孔的固定溶液。孵育在4℃下20分钟。
- 用通透的解决方案150微升/洗洗细胞两次。
注：10倍浓缩储液稀释于去离子水中以制备1×工作溶液。 - 在50μl抗小鼠IFNγ-APC和抗小鼠IL17A-APC.Cy7的悬浮细胞稀释在permeabil化溶液（1/250两种抗体）。
- 在室温下孵育1小时。
- 用通透的解决方案150微升/洗洗细胞两次。
- 悬浮细胞在200μl的PBS中进行流式细胞采集。
5.免疫球蛋白支气管肺泡灌洗液分析（BAL）
- BAL样品的获得
- 牺牲颈椎脱位（或其他公认的人性化的方法）鼠标和鼠标确保是死触摸眼球，以确认没有瞬目反射。
- 揭露使用适当的精度无菌镊子和剪刀气管并执行气管一小截，确保不完全切除它。小心不要引起出血可能污染BAL样本。
- 引入进气管连接到一个无菌的1-ml注射器用800微升冰冷的PBS的套管。
- 慢慢地接种PBS进入肺部，则RECOVER BAL体积，以避免肺塌陷拉回注射器的活塞速度非常缓慢。
注：在500到600微升的恢复是令人满意的。 - 转移BAL卷成1.5毫升管中并确认BAL保持无色，表明没有被血液污染的（保持在冰上，直到处理）。
- 离心机BAL样品在400 xg离心5分钟，并转移上清液至新管。
- 商店在上清-80℃。
- 的IgA在BAL上清测定
注意：使用的所有试剂是在室温下。- 用100μl的PPD在PBS（10微克/毫升）稀释分枝涂层高蛋白结合聚苯乙烯平底96孔板结核病特异性IgA检测，或用100微升BAL上清液稀释10倍的PBS总IgA决心。
- 在4℃孵育过夜。
- 弃上清并点击纸巾到D盘RY。用200微升/ PBS的好洗。
- 用200μl/孔的牛血清白蛋白（BSA）的1％（重量/体积）在PBS吐温80 0.05％（体积/体积）（封闭缓冲液）阻断。
- 孵育在RT 1小时。
- 用200μl/ PBS吐温80 0.05％（体积/体积）（洗涤缓冲液）的孔洗一次。
- 加入100μl未稀释的BAL上清液中的PPD-包被的孔。在室温下孵育两小时。
注意：如果总IgA判定与PPD特异性的IgA并行完成，离开总IgA孔用100μl洗涤缓冲液这个温育过程。 - 用洗涤buffer.0170004的200μl/孔洗涤三次
- 添加100μl的辣根过氧化物酶（HRP）的缀合抗小鼠IgA稀释在封闭缓冲液（1 / 10,000）。
- 孵育1小时RT。
- 用洗涤缓冲液200μl/孔洗涤五次。
- 添加的3,3100μl/孔'，5,5'-四甲基联苯胺（TMB）。孵育20分钟，在T室温他暗。
- 添加100μl/孔的H 2 SO 4 0.5N。读在分光光度计板在450nm的波长。
6.细菌量测定肺
- 龙同质化和电镀
- 在攻击后四个星期，牺牲通过颈脱位（或其它公认的人道方法）的小鼠，并确保小鼠死触摸眼球确认不存在眨眼反射的。
- 鼠标放置在固定在层流罩内平坦并消毒表面仰卧位。
- 做一个切口，并从胸部区域去除皮肤留下明显的胸区域。
- 剪下的肋骨和收获用无菌剪刀和镊子的肺和心脏。将机关在清洁的表面。
- 通过移除心脏，气管和结缔组织清理肺部和肺部用1毫升去离子水转移到1.5毫升管（冰上保持，直至处理）。
- 使用无菌镊子对各小鼠的肺转移到用于器官均质的适当管（M - 离解器管），含有1毫升去离子水。
- 放置管在组织离解器和使用预定义的程序RNA_1至均质化肺部。
- 使万分之五倍连续稀释在1.5毫升管，开始用100μl肺匀浆在900微升稀释。
- 板稀释为1.11-1.14描述。
- BCG和分枝杆菌之间的差异，通过PCR
注：在从6.1.6对应于鼻内途径接种BCG组的板块，我们分析殖民地的代表人数由BCG和分枝杆菌之间的挑剔的PCR，以确保CFU认为，评估疫苗赋予的保护效果相当以独特的分枝杆菌。 RD9的这种PCR扩增目标，基因组区域中BCG和M.涂不同berculosis，得到2618碱基对杆菌H37Rv，和465碱基对的BCG 11的片段。- 制备主混合物的库存为每个样品体积所指示所有的样品，然后在PCR管分配（9微升/样品）。
注：缓冲区5X：2微升。正向引物25μM（GTGTAGGTCAGCCCCATCC）：0.32微升，反向引物25μM（GCCCAACAGCTCGACATC）：0.32微升，Taq DNA聚合酶5单位/微升：0.04微升，去离子水2 O：6.32微升。 - 触摸菌落用无菌牙签在含有预混PCR管样品浸泡牙签。
- 用下面的程序运行的PCR：10分钟95℃（此步骤是触发细菌破坏），10分钟95℃（此步骤是触发细菌破坏），35个循环（在95℃下30秒，1分钟在58℃，并在72℃4分钟）。
- 加载的PCR样品用溴化乙锭和运行的样品在1％琼脂糖凝胶，以可视化的片段。
- 制备主混合物的库存为每个样品体积所指示所有的样品，然后在PCR管分配（9微升/样品）。
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Representative Results
这部作品描述了BCG给药两种途径的比较：皮下和鼻内。皮下途径是可比的皮内，这是全世界的卡介苗目前临床路径。疫苗接种的鼻内途径旨在模仿M的感染的天然途径肺结核 ，目标是直接诱导免疫反应在肺，这种病原体的主要靶器官。
图1描述了工作流程遵循。八到十周龄的雌性DBA / 2小鼠用10 6卡介苗CFU丹麦通过施用皮下或鼻内途径接种。 8周后，一组老鼠被牺牲分析由疫苗接种引起的肺免疫反应。 BAL样本首先获得，然后我们收获的肺。为了研究疫苗赋予的保护效果，我们接种各色核苷酸组小鼠与M的低剂量鼻内攻击结核分枝杆菌H37Rv株。一个月后，我们牺牲动物和收获肺。在这种情况下，对于每个动物，我们使用左肺确定细菌负荷和右肺来评估疫苗诱导的免疫应答攻击后。的目标是产生为了研究保护的潜在相关因素在肺部每只动物的细菌负荷和免疫反应的数据。
如图2中所示，肺离解，以获得任一器官匀浆或细胞悬浮液。均质肺铺板固体琼脂培养基上，以确定细菌负荷4周攻击后。以下肺酶消化胶原酶D和DNA酶I获得细胞悬浮液，研究疫苗诱导的免疫反应。
我们的结果清楚地表明，相当tÓ皮下途径，疫苗接种的鼻内途径赋予挑战（图3A）后更大的保护效力在肺部四个星期。此外，我们证实，在从鼻内BCG疫苗组的肺部细菌负载对应杆菌H37Rv和不卡介苗。为此，我们分析菌落有代表性的若干从该基通过特异性PCR为RD9基因组区域，其放大在BCG和M.不同长度的片段结核病 （图3B）。图清楚地表明，所有的菌落分析了提供0.4千碱基对的片段，其对应于分枝杆菌H37Rv。
我们的数据显示滴鼻接种卡介苗，并在攻击前肺部疫苗诱导的免疫反应所赋予的保护效果之间的相关性。鼻内BCG显然引发更高的IL17和IFNγ生产的肺，用ELISA法测定（图图4A）。 （数据未显示），这些数据是通过细胞内染色（ICS）的确认和流式细胞术。此外，我们还发现BAL样品（图4B）在总的和PPD特异性的IgA浓度的高浓度，这表明肺BCG接种诱导产生的IgA和易位到呼吸道，。
最后，我们研究了在肺部卡介苗诱导的免疫应答攻击后（图5）。我们的数据显示IL17和IFNγ之间的差异;只鼻内BCG组检测IL17A生产CD4 +细胞，而IFNγ产生细胞在感染分枝杆菌疫苗接种无关各组中。对应于IL17产生细胞和细菌负荷每只动物的数据的表示法表明IL17的存在和肺部细菌负载降低之间的显著相关性，这不是在IFNγ的情况下观察到。
图1 的工作流程比较BCG接种的鼻内和皮下途径。八周后接种BCG，一组小鼠（6每个实验组）被用来收获肺和执行BAL，和分析由疫苗诱导的肺的免疫反应。另一组小鼠（6 /组）中，接种M的低剂量鼻内攻击结核分枝杆菌H37Rv株（100 CFU）。一个月后，处死动物和细菌负荷左肺和右肺PPD特异性免疫反应进行了分析。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3. 保护效果卡介苗免疫赋予的。6的DBA的组/ 2小鼠通过皮下（卡介苗SC），鼻内（卡介苗）的路线，或者未接种疫苗的（Unvacc）用BCG丹麦疫苗10 6 CFU接种。两个个月接种后，小鼠用低剂量的鼻内接种（100CFU）H37Rv的挑战，并在肺中一个月后细菌负荷进行了测定。的两个独立的有代表性的实验中示出（A）中的数据的图表表示为平均值±SD。进行与邦费罗尼事后分析单向ANOVA检验来计算统计学意义。（二）从BCG滴鼻组单菌落通过PCR特异性RD9地区（不同的卡介苗和分枝杆菌基因组）进行了分析有代表性的若干辨别BCG和分枝杆菌菌落。 （此前公布的9）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4. 疫苗特异性肺免疫反应分析与前向分枝杆菌挑战。6 DBA / 2组小鼠通过皮下（卡介苗sc）或鼻内（卡介苗）的路线，或者未接种疫苗的（Unvacc）用BCG丹麦疫苗10 6 CFU（A）疫苗接种术后两月接种后，得到从收获的肺细胞悬浮液。如在方法部分和IL17A（左图）和IFNγ（右面板）产量通过ELISA分析所述细胞用PPD刺激。（B）中的总IgA和M.肺结核 （MTB）特异性的IgA用ELISA法从BAL样本进行分析。从两个独立实验汇总数据被示出。在图的数据被表示为平均值±SD。 （此前公布的9）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5. 疫苗特异性与分枝杆菌H37Rv攻击前肺的免疫应答分析6的DBA的组/ 2小鼠通过皮下（卡介苗sc）或鼻内（卡介苗）的路线，或者未接种疫苗的（NV）用BCG丹麦疫苗10 6 CFU接种。未接种，未感染的小鼠对照组也被列入（NV / NI）。两个个月接种后，小鼠用低杆菌H37Rv剂量（100 CFU）鼻内攻击，及1个月后动物安乐死。左和从相同动物右肺用于测定细菌负荷和IL17A-（A）或IFNγ-（B）中的CD4 +细胞，分别。在左面板数据对应于通过流式细胞术测定的细胞因子产生细胞的百分比，并且表示为平均值±SD。右图表示从细菌载荷和细胞因子产生用于每个小鼠获得的CD4 +细胞的数据。线性回归计算，并在各情况下所得到的p值在IL17A的情况下示出。汇集从两个独立实验的数据显示在该图中。 （此前公布的9）。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Middlebrook 7H9 broth | BD | 271310 | |
| Middlebrook ADC Enrichment | BD | 211887 | |
| Tween 80 | Scharlau | TW00800250 | |
| 3-mm diameter Glass Beads | Scharlau | 038-138003 | |
| Middlebrook 7H10 Agar | BD | 262710 | |
| 1-ml syringe 26GA 0.45 x 10 mm | BD | 301358 | |
| GentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| M tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | |
| Collagenase D | Roche | 11088882001 | |
| DNaseI | Applichem | A3778,0100 | |
| Falcon 70 µm Cell Strainer | Corning | 352350 | |
| RPMI 1640 | Sigma | R0883 | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer | Sigma | R7757 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | 100x concentrated |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sigma | P4333 | 100x concentrated |
| Fetal Calf Serum | Biological Industries | 04-001-1A | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148-25ML | |
| Scepter 2.0 Handheld Automated Cell Counter | Millipore | PHCC20040 | |
| Scepter Cell Counter Sensors, 40 µm | Millipore | PHCC40050 | |
| Mycobacterium Tuberculosis - Tuberculin PPD | Statens Serum Institut (SSI) | 2390 | |
| Mouse IFN-γ ELISA development kit | Mabtech | 3321-1H | |
| Mouse IL17A ELISA development kit | Mabtech | 3521-1H | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD4 | BD | 553047 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Kit | BD | 555028 | |
| APC-Cy7 Rat Anti-mouse IL-17A | BD | 560821 | |
| APC Mouse Anti-mouse IFNg | BD | 554413 | |
| LACHRYMAL OLIVE LUER LOCK 0.60 x 30 mm. 23G x 1 1/4” | UNIMED | 27.134 | Used as trachea cannula for BAL |
| high-protein binding polystyrene flat-bottom 96-well plates MAXISORP | NUNC | 430341 | |
| Albumin, from bovine serum | Sigma | A4503 | |
| Goat Anti-Mouse IgA (α-chain specific)−Peroxidase antibody | Sigma | A4789 | |
| 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) | Sigma | T0440 | |
| MyTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21107 | The kit Includes Buffer 5x |
References
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