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Immunology and Infection

सुरक्षा प्रभावकारिता और फेफड़े के प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया चूहे में चमड़े के नीचे और Intranasal बीसीजी प्रशासन निम्नलिखित

Published: September 19, 2016 doi: 10.3791/54440
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Microbiology, University of Zaragoza

Introduction

क्षय रोग (टीबी) टीबी एक खतरनाक वैश्विक स्वास्थ्य समस्या 1 बनाता है दुनिया में एचआईवी की तुलना में अधिक जुड़े लोगों की मृत्यु के कारण प्रमुख संक्रामक रोगों में से एक है और बहुऔषध प्रतिरोधी उपभेदों की बढ़ती वृद्धि के साथ संयुक्त है। नई नैदानिक ​​उपकरण, अधिक प्रभावी और कम विषाक्त का सेवन, और नए सुरक्षित और प्रभावी टीके टीबी विशेष रूप से विकासशील देशों में, एक तत्काल आवश्यकता है।

जीते तनु Bacille Calmette-Guerin (बीसीजी) वर्तमान में टीबी, जो दुनिया भर में 1970 के दशक के बाद से जन्म के समय intradermally प्रशासित किया गया है के खिलाफ केवल लाइसेंस प्राप्त टीका है। बीसीजी बच्चों में बीमारी (दिमागी बुखार और ज्वार या बाजरे जैसा टीबी) की गंभीर रूपों को रोकने में कारगर माना जाता है, लेकिन फेफड़े टीबी रोग संचरण 2 के जिम्मेदार के खिलाफ असंगत प्रभावकारिता दिखाया गया है।

फेफड़े के टीकाकरण, जो टीबी के संक्रमण के प्राकृतिक मार्ग mimics, स्थानीय मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया भड़काना के लिए एक आकर्षक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्वएस। इस संबंध में विभिन्न प्रासंगिक टीबी पशु मॉडल में विभिन्न preclinical काम करता है अधिक से अधिक टीका प्रभावकारिता फेफड़े के टीकाकरण के बाद प्रदर्शन किया है चमड़े के नीचे या अंतर्त्वचीय मार्ग 3-6 की तुलना में। फिर भी, सुरक्षात्मक फेफड़े के टीकाकरण से शुरू हो रहा तंत्र अच्छी तरह से समझ नहीं रहे हैं। पिछले वर्षों में, कई काम करता है IL17 श्लैष्मिक टीका प्रेरित सुरक्षात्मक प्रभावकारिता के लिए कमी माउस मॉडल के रूप में टीबी विशिष्ट श्लैष्मिक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का एक महत्वपूर्ण कारक के रूप में IL17 की मध्यस्थता प्रतिक्रिया की ओर इशारा किया है, 7,8 बिगड़ा हुआ है।

हाल ही में हमने पहली बार है कि intranasal बीसीजी प्रशासन संरक्षित डीबीए / 2 चूहे, एक माउस तनाव चमड़े के नीचे बीसीजी टीकाकरण 9 के बाद सुरक्षा की कमी की विशेषता के लिए प्रदर्शन किया। इन परिणामों ने सुझाव दिया कि श्वसन टीबी टीकाकरण स्थानिक देशों में, जहां अंतर्त्वचीय बीसीजी pulmon के खिलाफ अप्रभावी माना जाता है में टीबी की दर को कम करने में ज्यादा प्रभावी हो सकता हैआरे टीबी।

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Protocol

सभी चूहों नियंत्रित परिस्थितियों में रखा है और इस बीमारी के किसी भी हस्ताक्षर के लिए मनाया गया। प्रायोगिक कार्य प्रायोगिक पशुओं के संरक्षण के लिए और सक्षम स्थानीय नैतिकता समितियों से अनुमोदन के साथ यूरोपीय और राष्ट्रीय निर्देशों के साथ समझौते में आयोजित किया गया।

1. बीसीजी डेनिश की मात्रा निर्धारित ग्लिसरॉल शेयरों और माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग H37Rv की तैयारी

नोट: सभी प्रोटोकॉल वर्णित BSL3 शर्तों के तहत किया गया था।

  1. बीसीजी डेनिश या H37Rv स्ट्रेन के पिघलना जमे हुए ग्लिसरॉल शेयरों और बीच-80 0.05% (वी / वी) और एडीसी (albumin, डेक्सट्रोज, Catalase) 10% (वी / वी) के साथ पूरक 7H9 मध्यम 10 से 10 मिलीलीटर में 100 μl टीका लगाना।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सप्ताह के लिए स्थिर शर्तों के तहत सेते हैं जब तक संस्कृति लॉग चरण विकास में है।
  3. ताजा माध्यम के 200 मिलीलीटर के 10 मिलीलीटर संस्कृति के हस्तांतरण से जीवाणु संस्कृति पैमाने। 20 अतिरिक्त के लिए सेतेस्थिर शर्तों के तहत दिनों के लिए।
  4. 2500 में 15 मिनट के लिए 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज के लिए स्थानांतरण x जी।
  5. supernatants त्यागें और अवशिष्ट मात्रा में बैक्टीरिया गोली resuspend। (- 15 ट्यूब प्रति 10) प्रत्येक ट्यूब बाँझ 3 मिमी व्यास कांच के मोती में जोड़े।
  6. भंवर सख्ती क्रम में 1 मिनट के दौरान बैक्टीरियल गुच्छों को अलग कर देना। बीच-80 0.05% के साथ पीबीएस के 10 मिलीलीटर में प्रत्येक गोली Resuspend (वी / वी)।
  7. 10 मिनट के लिए सबसे बड़ा बैक्टीरियल समुच्चय और कांच के मोती बसने के लिए अनुमति देने के लिए ट्यूबों छोड़ दें।
  8. एक भी नए सिरे से 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब (अंतिम बरामद की मात्रा 38 मिलीग्राम) के लिए छोटे गुच्छों और एकल बैक्टीरिया और हस्तांतरण की मात्रा युक्त 4 नलियों में से प्रत्येक से सतह पर तैरनेवाला के 9.5 मिलीलीटर की वसूली। 400 x जी 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
  9. एक एकल ताजा 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में 35 (मुख्य रूप से एकल बैक्टीरिया युक्त) सतह पर तैरनेवाला के मिलीलीटर की वसूली और ग्लिसरॉल के साथ पीबीएस के 15 मिलीलीटर जोड़ने 50% (वी / वी) 15% की एक अंतिम ग्लिसरॉल एकाग्रता प्राप्त (वी / वी)।
  10. धीरे मिक्सऔर ठंड के लिए उपयुक्त ट्यूबों में 1 मिलीलीटर aliquots में वितरित। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर (एक बहुत लगभग 50 aliquots ग्लिसरॉल स्टॉक प्रदान करता है)।
  11. ग्लिसरॉल शेयरों यों, एक ग्लिसरॉल ठंड के बाद दिन पिघलना और अलग 1.5 मिलीलीटर पीबीएस के 900 μl युक्त ट्यूबों में सात से दस गुना धारावाहिक dilutions प्रदर्शन करते हैं।
  12. प्लेट 7H10 ठोस अगर मध्यम 10 में प्रत्येक कमजोर पड़ने के 100 μl के साथ एडीसी 10 से 55 मिमी व्यास पेट्री डिश में तैयार% (वी / वी) पूरक।
  13. ध्यान से 3 मिमी व्यास कांच के मोती (लगभग। प्रति प्लेट 10) जोड़ने और धीरे थाली हिला समान रूप से अगर प्लेट से अधिक मात्रा में वितरित करने के लिए। मोती त्यागें और parafilm के साथ अगर प्लेट सील।
  14. 37 डिग्री सेल्सियस पर 21 दिनों के लिए सेते हैं और dilutions जहां एकल कालोनियों सही प्रतिष्ठित किया जा सकता में कॉलोनी के गठन इकाइयों की गिनती (CFU) द्वारा बैक्टीरियल एकाग्रता का निर्धारण।

2. माउस टीकाकरण

  1. एक पूर्व मात्रा निर्धारित बीसीजी ग्लिसरॉल गला लें और प्रस्तुत करने के लिए पीबीएस में यह पतलादो निलंबन कर रहे हैं। अंतिम मात्रा प्रति पशु खुराक पर विचार की गणना चमड़े के नीचे प्रशासन के लिए 100 μl (चमड़े के नीचे टीकाकरण के लिए मिलीलीटर प्रति 10 7 CFU) और intranasal प्रशासन (intranasal टीकाकरण के लिए 2.5 10 x 7 CFU) के लिए 40 μl है।
  2. isoflurane और ऑक्सीजन का मिश्रण के साथ चूहों anesthetize करने मूषक के लिए एक विशेष कार्य केंद्र संज्ञाहरण का प्रयोग करें। संज्ञाहरण और 2% प्रेरित करने के लिए संज्ञाहरण कक्ष में चूहों बनाए रखने के लिए isoflurane उपयोग 5%। (अन्य स्वीकृत संज्ञाहरण विधि का इस्तेमाल किया जा सकता है)।
  3. चमड़े के नीचे टीका प्रशासन के लिए जीवाणु निलंबन (10 7 CFU / एमएल) के 1 मिलीलीटर के साथ एक 26 जी सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज भरें। हवा के बुलबुले निकालें।
  4. एक लामिना का प्रवाह हुड के अंदर प्रवण स्थिति में एक सपाट सतह पर एक anesthetized माउस प्लेस और वापस subcutaneously टीका लगाना वैक्सीन के 100 μl (10 6 CFU / खुराक) माउस की एक दिशा में। पिंजरे के लिए माउस लौटें और यह निगरानी सुनिश्चित करने के लिए कि यह propeरेलवे संज्ञाहरण से ठीक हो जाए।
  5. प्रत्येक माउस प्रशासन के बीच सिरिंज सुई बदलें। जैसा कि ऊपर वर्णित हवा के बुलबुले निकाला गया।
  6. intranasal प्रशासन के लिए, हुड के अंदर लापरवाह स्थिति में एक anesthetized माउस जगह है।
  7. एक micropipette के साथ 2.5 10 x 7 CFU / एमएल के साथ निलंबन के 20 μl ले। inoculum ड्रॉप द्वारा ड्रॉप दो नाक तक पूरी मात्रा जमा किया गया है के बीच की जगह में माउस मात्रा साँस लेने की अनुमति देने के बूंदों के बीच का समय छोड़ रहा है, नोट:। चूहों इस प्रक्रिया के दौरान श्वसन संकट से ग्रस्त कर सकते हैं तो वे करने के लिए छोड़ दिया जाना चाहिए प्रत्येक बूंद इसे जितना संभव को रोकने के लिए अगले एक प्रबंधन के लिए पहले आत्मसात।
  8. एक और 20 μl के साथ micropipette फिर से भरने और ऑपरेशन दोहराएँ। माउस पहला टीका के बाद संज्ञाहरण से जगाने के लिए शुरू होता है, दूसरा एक से पहले संज्ञाहरण कक्ष में जगह है। पिंजरे के लिए माउस लौटें और सुनिश्चित करें कि यह ठीक से ठीक हो जाएसंज्ञाहरण से।

H37Rv तनाव के साथ 3. माउस intranasal चुनौती

  1. एक पूर्व मात्रा निर्धारित H37Rv ग्लिसरॉल गला लें और पीबीएस में यह पतला मिलीलीटर प्रति 2,500 CFU की एक जीवाणु निलंबन तैयार करने के लिए। अंतिम मात्रा प्रति पशु खुराक पर विचार की गणना 40 μl है।
  2. H37Rv intranasally 2.5 में वर्णित के रूप में टीका है - 2.7। माउस प्रति अंतिम चुनौती खुराक 10 2 CFU / 40 μl है।

4. फेफड़ों में प्रेरित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के विश्लेषण

  1. फेफड़े सेलुलर निलंबन
    नोट: टीका प्रेरित फेफड़ों में अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का आकलन एकल कक्ष निलंबन की पीढ़ी की आवश्यकता है। इस प्रयोजन के लिए, हम इस तरह के GentleMACS के रूप में एक ऊतक dissociator का उपयोग करें।
    1. ग्रीवा अव्यवस्था (या अन्य स्वीकृत मानवीय पद्धति) द्वारा माउस बलिदान और यह सुनिश्चित माउस झपकी पलटा के अनुपस्थित पुष्टि करने के लिए नेत्रगोलक को छू मर चुका है।
    2. एक लामिना का प्रवाह हुड के अंदर, एल निकालनेबाँझ कैंची और संदंश का उपयोग और एक साफ सतह पर उन्हें जगह ungs। स्वच्छ फेफड़ों श्वासनली और संयोजी ऊतक को हटाने, और फेफड़ों (प्रसंस्करण जब तक बर्फ पर बनाए रखने) पीबीएस के साथ एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरण।
    3. एक सेलुलर निलंबन उत्पन्न करने के लिए, अंग हदबंदी (सी-dissociator ट्यूब) 10 मिमी HEPES-NaOH के 5 मिलीलीटर युक्त पीएच 7.4, 150 मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, 1 मिमी 2 MgCl और 1.8 मिमी 2 CaCl के लिए एक उचित ट्यूब में फेफड़ों जगह बफर।
    4. (2 मिलीग्राम / एमएल अंतिम एकाग्रता) कोलेजिनेस डी 100 मिलीग्राम / एमएल के 100 μl, और 160 आइयू / एमएल अंतिम एकाग्रता DNase मैं 20,000 आइयू / एमएल के 40 μl (जोड़े।
      नोट: कोलेजिनेस डी या DNaseI के शेयर समाधान पीबीएस में lyophilized एंजाइम या ग्लिसरॉल 50% भंग तैयार किया जाता है (वी / वी), 20 मिमी Tris एचसीएल पीएच 7.5 y 2 MgCl 1 मिमी, क्रमशः।
    5. ऊतक dissociator में ट्यूब प्लेस और फेफड़ों के विखंडन के लिए पूर्वनिर्धारित कार्यक्रम m_lung_01 का उपयोग करें। 30 मिनट के लिए एक पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब सेते हैं।
    6. प्लेस वेंdissociator में ई ट्यूब और एकल सेलुलर निलंबन में पूरा फेफड़ों के homogenization के लिए पूर्वनिर्धारित कार्यक्रम m_lung_02 का उपयोग करें।
    7. एक 70 माइक्रोन नायलॉन सेल एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए फिट झरनी के माध्यम से सेलुलर निलंबन गुजरती हैं। RPMI 1640 के माध्यम के 10 मिलीलीटर के साथ झरनी धो लें।
    8. 400 XG पर 5 मिनट के लिए और सतह पर तैरनेवाला त्यागें अपकेंद्रित्र कोशिकाओं।
    9. बफर lysing एरिथ्रोसाइट्स के 1 मिलीलीटर जोड़ें vortexing द्वारा मिश्रण और कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए सेते हैं।
    10. 400 x जी 5 मिनट के लिए 1640 RPMI मध्यम और सेंट्रीफ्यूज कोशिकाओं के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
    11. पूरा RPMI 1640 मध्यम के 0.5 मिलीलीटर में Resuspend कोशिकाओं, 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस), 2 मिमी एल Glutamin, 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक 100 आइयू / एमएल पेनिसिलिन और 50 माइक्रोन के 2-मर्केप्टोइथेनाल।
      नोट: एफसीएस 30 मिनट के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन से निष्क्रिय है।
    12. कोशिकाओं की गणना और पूरा RPMI 1640 मध्यम जोड़ने 10 7 कोशिकाओं / एमएल के अंतिम सेलुलर घनत्व तक पहुँचने के लिए।
      नोट: सेल गिनती के लिए, हम स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करें।
    13. यू-नीचे 96 अच्छी तरह से थाली में बाँझ सेलुलर निलंबन के 100 μl बांटो (10 6 कोशिकाओं / अच्छी तरह से)।
    14. 15 माइक्रोग्राम / वाणिज्यिक H37Rv शुद्ध प्रोटीन व्युत्पन्न (5 माइक्रोग्राम / एमएल अंतिम एकाग्रता) मिलीलीटर (पीपीडी) के साथ पूरा RPMI 1640 माध्यम की अच्छी तरह से 50 μl / जोड़ें।
  2. एलिसा द्वारा साइटोकाइन निर्धारण के लिए सतह पर तैरनेवाला संग्रह
    1. 4.1.14 से 37 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटा और 5% सीओ 2 के लिए थाली सेते हैं।
    2. 400 XG पर 5 मिनट और सतह पर तैरनेवाला के 100 μl की वसूली के लिए अपकेंद्रित्र थाली।
    3. -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
    4. क्रमशः supernatants पतला 1/10 और 1/2 IFNγ के लिए परख बफर और IL17A निर्धारण में। वाणिज्यिक एलिसा किट के साथ साइटोकाइन सांद्रता का निर्धारण करते हैं, निर्माता निर्देश (एलिसा विकास किट) के अनुसार।
  3. साइटोकाइन के निर्धारण के लिए intracellular धुंधलाप्रवाह cytometry द्वारा CD4 + कोशिकाओं उत्पादक
    1. 4.1.14 से 37 डिग्री सेल्सियस पर 18 घंटा और 5% सीओ 2 के लिए थाली सेते हैं।
    2. प्रत्येक अच्छी तरह से (10 माइक्रोग्राम / एमएल अंतिम एकाग्रता) को Brefeldin एक 1 मिलीग्राम / एमएल (DMSO में भंग शेयर) के 1.5 μl जोड़ें और छह अतिरिक्त घंटे के लिए सेते हैं।
    3. 3200 XG पर 1 मिनट के लिए 4.3.2 से थाली अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    4. विरोधी माउस सीडी 4-FITC के 50 μl 10% एफसीएस (1/500) के साथ RPMI 1640 में पतला और Resuspend कोशिकाओं 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
    5. 3200 XG पर 1 मिनट के लिए 4.3.4 से थाली अपकेंद्रित्र, तैरनेवाला त्यागें और 100 μl / अच्छी तरह के निर्धारण समाधान जोड़ें। 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    6. कोशिकाओं permeabilization समाधान के 150 μl / धोने के साथ दो बार धोएं।
      नोट: 10x केंद्रित शेयर 1x काम समाधान तैयार करने के लिए विआयनीकृत पानी में पतला है।
    7. विरोधी माउस IFNγ एपीसी और विरोधी माउस IL17A-APC.Cy7 के 50 μl में Resuspend कोशिकाओं permeabil में पतलाization समाधान (1/250 दोनों एंटीबॉडी)।
    8. आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
    9. कोशिकाओं permeabilization समाधान के 150 μl / धोने के साथ दो बार धोएं।
    10. फ्लो का अधिग्रहण के लिए पीबीएस के 200 μl में Resuspend कोशिकाओं।

5. ब्रोन्कोएल्वियोलर Lavage में इम्युनोग्लोबुलिन का विश्लेषण (बाल)

  1. बाल के नमूनों का ग्रहण
    1. ग्रीवा अव्यवस्था (या अन्य स्वीकृत मानवीय पद्धति) द्वारा माउस बलिदान और यह सुनिश्चित माउस झपकी पलटा के अनुपस्थित पुष्टि करने के लिए नेत्रगोलक को छू मर चुका है।
    2. श्वासनली उचित परिशुद्धता बाँझ संदंश और कैंची का उपयोग बेनकाब और श्वासनली में एक छोटा सा कट प्रदर्शन, यकीन है कि यह पूरी तरह से उत्पाद शुल्क के लिए नहीं कर रही है। खून बह रहा है कि बाल नमूना दूषित सकता पैदा करने के लिए नहीं ख्याल रखना।
    3. श्वासनली में एक प्रवेशनी ठंडा पीबीएस के 800 μl के साथ एक बाँझ 1 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़े परिचय।
    4. फेफड़ों और फिर धीरे-धीरे आर में टीका लगाना पीबीएसeCover बाल मात्रा क्रम में फेफड़ों के पतन से बचने के लिए सिरिंज के पिस्टन वापस खींच बहुत धीरे धीरे।
      नोट: 500 से 600 μl की वसूली संतोषजनक है।
    5. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में बाल मात्रा स्थानांतरण और पुष्टि बाल uncoloured रहता है, यह दर्शाता है कि रक्त (प्रसंस्करण जब तक बर्फ पर बनाए रखने) के साथ दूषित नहीं है।
    6. एक नया ट्यूब 400 XG पर 5 मिनट, और हस्तांतरण सतह पर तैरनेवाला के लिए अपकेंद्रित्र बाल के नमूने।
    7. -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर supernatants।
  2. बाल supernatants में आईजी ऐ का निर्धारण
    नोट: इस्तेमाल सभी अभिकर्मकों आरटी पर कर रहे हैं।
    1. कोट उच्च प्रोटीन बाध्यकारी polystyrene फ्लैट नीचे पीपीडी के 100 μl (10 माइक्रोग्राम / एमएल) पीबीएस में पतला एम के लिए के साथ 96 अच्छी तरह प्लेटें तपेदिक विशिष्ट IgA दृढ़ संकल्प, या कुल IgA निर्धारण के लिए पीबीएस में 10 गुना पतला बाल सतह पर तैरनेवाला के 100 μl के साथ।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं।
    3. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और विकास के लिए कागज तौलिया पर थाली नलry। 200 μl / पीबीएस के साथ अच्छी तरह से धो लें।
    4. 200 μl / अच्छी तरह से एक गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) 1% (w / v) पीबीएस बीच 80 0.05% में (वी / वी) (अवरुद्ध बफर) के साथ ब्लॉक।
    5. आरटी पर 1 घंटे सेते हैं।
    6. 200 μl / पीबीएस बीच 80 0.05% (वी / वी) (वॉशिंग बफर) के साथ अच्छी तरह से एक बार धो लें।
    7. पीपीडी लेपित कुओं में undiluted बाल सतह पर तैरनेवाला के 100 μl जोड़ें। कमरे के तापमान पर दो घंटे सेते हैं।
      नोट: कुल IgA दृढ़ संकल्प पीपीडी विशेष आईजी ऐ के साथ समानांतर में किया जाता है, तो इस ऊष्मायन के दौरान 100 μl धोने बफर के साथ कुल IgA कुओं छोड़ दें।
    8. कपड़े धोने buffer.0170004 के 200 μl / अच्छी तरह से साथ तीन बार धोएं
    9. हॉर्सरैडिश peroxidase (एचआरपी) के 100 μl जोड़े बफर (1 / 10,000) अवरुद्ध में पतला संयुग्मित विरोधी माउस आईजी ऐ।
    10. 1 घंटा आरटी सेते हैं।
    11. कपड़े धोने बफर के 200 μl / अच्छी तरह से साथ पांच बार धोएं।
    12. 3,3 के 100 μl / अच्छी तरह से जोड़ें ', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB)। टी में कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए सेतेवह अंधेरा।
    13. 100 μl / अच्छी तरह से एच 2 अतः 4 0.5N जोड़ें। 450 एनएम के तरंग दैर्ध्य में एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में थाली पढ़ें।

फेफड़ों में 6. बैक्टीरियल लोड दृढ़ संकल्प

  1. फेफड़े homogenization और चढ़ाना
    1. चार सप्ताह चुनौती के बाद, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था (या अन्य स्वीकृत मानवीय पद्धति) द्वारा माउस का त्याग करें और सुनिश्चित करें माउस झपकी पलटा के अनुपस्थित पुष्टि करने के लिए नेत्रगोलक को छू मर चुका है।
    2. एक लामिना का प्रवाह हुड के अंदर एक फ्लैट और कीटाणुरहित सतह पर तय लापरवाह स्थिति में माउस रखें।
    3. एक चीरा और दृश्य वक्ष क्षेत्र छोड़ने के लिए छाती क्षेत्र से त्वचा को हटा दें।
    4. पसलियों बाहर कट और फेफड़े और दिल बाँझ कैंची और संदंश का उपयोग फसल। एक स्वच्छ सतह पर अंगों रखें।
    5. फेफड़ों को साफ दिल, श्वासनली और संयोजी ऊतक को हटाने के द्वारा और विआयनीकृत पानी की 1 मिलीलीटर के साथ एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब को फेफड़ों का स्थानांतरण(बर्फ पर बनाए रखने के लिए जब तक प्रोसेसिंग)।
    6. (- Dissociator ट्यूब एम), विआयनीकृत पानी की 1 मिलीलीटर युक्त अंग homogenization के लिए एक उचित ट्यूब में प्रत्येक माउस के फेफड़ों हस्तांतरण करने के लिए बाँझ संदंश का प्रयोग करें।
    7. ऊतक dissociator में ट्यूब प्लेस और फेफड़ों homogenise को पूर्वनिर्धारित कार्यक्रम RNA_1 का उपयोग करें।
    8. 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में पांच से दस गुना धारावाहिक dilutions बनाओ, 900 μl में पतला फेफड़ों homogenate के 100 μl के साथ शुरू।
    9. 1.11-1.14 में वर्णित के रूप में प्लेट dilutions।
  2. पीसीआर द्वारा बीसीजी और H37Rv के बीच भेदभाव
    नोट: समूह intranasal मार्ग द्वारा बीसीजी के साथ टीका लगाया को इसी 6.1.6 से प्लेट में, हम कालोनियों के एक प्रतिनिधि नंबर बीसीजी और H37Rv के बीच एक समझदार पीसीआर से सुनिश्चित करने के लिए कि CFU आकलन करने के लिए टीका-प्रदत्त सुरक्षा प्रभावकारिता corresponded माना विश्लेषण किया अनोखे H37Rv करने के लिए। RD9 की यह पीसीआर प्रवर्धन लक्ष्यों, एक जीनोमिक क्षेत्र बीसीजी और एम टू में अलग-अलगberculosis, H37Rv के लिए 2618 बीपी, और बीसीजी 11 के लिए 465 बीपी का एक टुकड़ा दे रही है।
    1. संकेत के रूप में नमूना प्रति संस्करणों के साथ सभी नमूनों के लिए एक मास्टर मिश्रण स्टॉक तैयार है, और फिर पीसीआर नलियों में वितरित (9 μl / नमूना)।
      नोट: बफर 5x: 2 μl। आगे प्राइमर 25 सुक्ष्ममापी (GTGTAGGTCAGCCCCATCC): 0.32 μl, प्राइमर रिवर्स 25 सुक्ष्ममापी (GCCCAACAGCTCGACATC): 0.32 μl, Taq पोलीमरेज़ 5 इकाइयों / μl: 0.04 μl, विआयनीकृत एच 2 ओ: 6.32 μl।
    2. एक बाँझ दंर्तखोदनी के साथ एक कॉलोनी टच और मास्टर मिश्रण युक्त एक पीसीआर ट्यूब में नमूने के साथ दंर्तखोदनी विसर्जित कर दिया।
    3. निम्नलिखित कार्यक्रम के साथ पीसीआर चलाएँ: 10 मिनट 95 डिग्री सेल्सियस (इस कदम बैक्टीरियल व्यवधान को गति प्रदान करने के लिए है), 10 मिनट 95 डिग्री सेल्सियस, 95 डिग्री सेल्सियस पर 35 चक्र (30 सेकंड, 1 मिनट (इस कदम बैक्टीरियल व्यवधान को गति प्रदान करने के लिए है) 58 डिग्री सेल्सियस और 72 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट) पर।
    4. ethidium ब्रोमाइड और चलाने के नमूनों के साथ एक 1% agarose जेल में पीसीआर नमूने लोड टुकड़े कल्पना करने के लिए।

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Representative Results

चमड़े के नीचे और intranasal: यह काम बीसीजी के प्रशासन के दो मार्गों की तुलना वर्णन करता है। चमड़े के नीचे मार्ग अंतर्त्वचीय, जो दुनिया भर में बीसीजी के लिए वर्तमान नैदानिक ​​मार्ग है के बराबर है। टीकाकरण के Intranasal मार्ग एम के संक्रमण के प्राकृतिक मार्ग की नकल करना है तपेदिक, उद्देश्य के साथ, फेफड़ों में सीधे प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रेरित करने के लिए इस रोगज़नक़ का प्राथमिक लक्ष्य अंग।

चित्रा 1 कार्यप्रवाह का पालन वर्णन करता है। दस सप्ताह पुरानी महिला डीबीए के लिए आठ / 2 चूहों प्रशासन के चमड़े के नीचे या intranasal मार्ग द्वारा 10 6 बीसीजी का CFU डेनिश साथ टीके लगाए जाते हैं। आठ हफ्ते बाद, चूहों के एक समूह फेफड़ों प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया टीकाकरण से प्रेरित विश्लेषण करने के लिए बलिदान किया है। बाल के नमूने पहले प्राप्त कर रहे हैं और फिर हम फेफड़ों फसल। टीका-प्रदत्त सुरक्षा प्रभावकारिता अध्ययन करने के लिए आदेश में, हम एक विभिन्न टीका लगानाएम की एक कम खुराक intranasal चुनौती के साथ चूहों के समूह NT तपेदिक H37Rv तनाव। एक महीने बाद, हम जानवरों और फसल फेफड़ों बलिदान। इस मामले में, प्रत्येक जानवर के लिए हम बैक्टीरियल लोड और सही फेफड़ों टीका प्रेरित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के बाद चुनौती का आकलन करने के लिए निर्धारित करने के लिए बाएं फेफड़े का उपयोग करें। उद्देश्य सुरक्षा के संभावित संबद्ध अध्ययन करने के क्रम में प्रत्येक जानवर के लिए फेफड़ों में बैक्टीरिया लोड और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया डेटा उत्पन्न करने के लिए है।

चित्रा 2 में दिखाया गया है, फेफड़ों या तो एक अंग homogenate या एक सेलुलर निलंबन प्राप्त करने के लिए अलग कर दिया गया। Homogenized फेफड़ों ठोस अगर मध्यम पर चढ़ाया गया जीवाणु लोड निर्धारित करने के लिए चार सप्ताह के बाद चुनौती। टीका प्रेरित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए सेलुलर निलंबन कोलैजिनेज़ डी और DNaseI के साथ फेफड़ों enzymatic पाचन के बाद प्राप्त हुई थी।

हमारे परिणाम स्पष्ट रूप से संकेत मिलता है कि, जब तुलना टीओ चमड़े के नीचे मार्ग, टीकाकरण की intranasal मार्ग चुनौती (चित्रा 3) के बाद फेफड़ों चार सप्ताह में एक बहुत बड़ा सुरक्षात्मक प्रभावकारिता प्रदान करता है। इसके अलावा, हम पुष्टि की है कि intranasal बीसीजी टीका-समूह से फेफड़ों में बैक्टीरिया लोड H37Rv करने और बीसीजी के टीके के लिए नहीं अनुरूप हैं। यह अंत करने के लिए, हम RD9 जीनोम क्षेत्र के लिए विशिष्ट पीसीआर द्वारा इस समूह है, जो बीसीजी और एम में अलग लंबाई के टुकड़े amplifies से कालोनियों के एक प्रतिनिधि संख्या का विश्लेषण तपेदिक (चित्रा 3 बी)। चित्रा स्पष्ट रूप से पता चला है कि सभी कालोनियों 0.4 KBP का एक टुकड़ा है, जो H37Rv के लिए corresponded प्रदान की विश्लेषण किया।

हमारे डेटा intranasal बीसीजी टीकाकरण और वैक्सीन प्रेरित चुनौती देने से पहले फेफड़ों में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया द्वारा प्रदत्त सुरक्षा प्रभावकारिता के बीच संबंध का पता चला। Intranasal बीसीजी स्पष्ट रूप से उच्च IL17 और फेफड़ों में IFNγ उत्पादन, एलिसा द्वारा मापा ट्रिगर (चित्रा4 क)। इन आंकड़ों intracellular धुंधला (आईसीएस) द्वारा की पुष्टि की और प्रवाह cytometry गया (डेटा) नहीं दिखाया। इसके अलावा, हम भी बाल के नमूने (चित्रा 4 बी) में दोनों कुल और पीपीडी विशेष आईजी ऐ एकाग्रता के एक उच्च एकाग्रता पाया यह दर्शाता है कि फेफड़े के बीसीजी टीकाकरण श्वसन वायुमार्ग को आईजी ऐ के उत्पादन और स्थानान्तरण लाती है।

अंत में, हम बीसीजी प्रेरित प्रतिरक्षा (चित्रा 5) चुनौती के बाद फेफड़ों में प्रतिक्रिया का अध्ययन किया। हमारे डेटा IL17 और IFNγ के बीच मतभेद का पता चला; IL17A उत्पादक CD4 + कोशिकाओं केवल intranasal बीसीजी समूह में पता चला है, जबकि IFNγ उत्पादक कोशिकाओं टीकाकरण की परवाह किए बिना H37Rv से संक्रमित सभी समूहों में पाए गए थे। प्रत्येक जानवर IL17 उत्पादक कोशिकाओं और बैक्टीरियल लोड करने के लिए इसी के डेटा का प्रतिनिधित्व IL17 की उपस्थिति और फेफड़ों बैक्टीरियल लोड कमी के बीच एक महत्वपूर्ण संबंध है, जो IFNγ के मामले में नहीं मनाया गया पता चला।

आकृति 1
तुलना चित्रा 1. कार्यप्रवाह करने के लिए बीसीजी टीकाकरण की Intranasal और चमड़े के नीचे मार्ग। आठ सप्ताह के बाद बीसीजी टीकाकरण, (प्रायोगिक समूह प्रति 6) चूहों का एक सेट फेफड़ों फसल और एक बाल करते हैं, और फेफड़े के प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया टीकाकरण से प्रेरित विश्लेषण करने के लिए प्रयोग किया जाता है। (6 / समूह) चूहों का एक और सेट, एम की एक कम खुराक intranasal चुनौती के साथ टीका है तपेदिक H37Rv तनाव (100 CFU)। एक महीने बाद, जानवरों की बलि दी जाती है और बैक्टीरियल लोड बाएं फेफड़े और सही फेफड़ों में पीपीडी विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में विश्लेषण किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
फेफड़े नमूने के प्रसंस्करण। एक ऊतक dissociator फेफड़ों संसाधित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। में प्रयोगों जीवाणु लोड निर्धारित करने के लिए, फेफड़ों उन्हें ठोस अगर मध्यम में थाली से पहले homogenised थे। प्रयोगों है कि एक फेफड़ों सेलुलर निलंबन की आवश्यकता होती है, इस कोलैजिनेज़ डी और DNaseI साथ enzymatic पाचन के बाद तैयार की गई थी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. सुरक्षा प्रभावकारिता बीसीजी टीकाकरण द्वारा सम्मानित किया गया। 6 डीबीए के समूह / 2 चूहों चमड़े के नीचे (बीसीजी अनुसूचित जाति), intranasal में (बीसीजी) मार्ग, या गैर टीका लगाया (Unvacc) बीसीजी वैक्सीन डेनिश 10 6 CFU के साथ टीका लगाया गया। दो महीने के बाद टीकाकरण, चूहों के एक कम खुराक के साथ intranasally inoculated थे (100CFU) H37Rv चुनौती है, और फेफड़ों में एक महीने बाद बैक्टीरियल बोझ निर्धारित किया गया था। दो स्वतंत्र का एक प्रतिनिधि प्रयोग दिखाया गया है। (ए) डाटा रेखांकन में मतलब + एसडी के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। Bonferroni पद विश्लेषण के साथ एक तरह से एनोवा परीक्षण सांख्यिकीय महत्व की गणना करने के लिए किया गया था। (बी) बीसीजी intranasal समूह से एकल कालोनियों RD9 क्षेत्र के लिए पीसीआर विशिष्ट (बीसीजी और H37Rv जीनोम में अलग) द्वारा विश्लेषण किया गया का एक प्रतिनिधि नंबर बीसीजी विचार करने के लिए और H37Rv कालोनियों। (पहले प्रकाशित 9)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. वैक्सीन विशेष पल्मोनरी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया H37Rv के साथ चुनौती से पहले का विश्लेषण किया। 6 डी बी / 2 चूहों के समूह थेदो महीने के बाद टीकाकरण पर चमड़े के नीचे (बीसीजी अनुसूचित जाति) या intranasal में (बीसीजी) मार्ग, या गैर टीका लगाया बीसीजी वैक्सीन डेनिश 10 6 CFU साथ (Unvacc)। (ए) द्वारा टीका लगाया, काटा फेफड़ों से एक सेलुलर निलंबन प्राप्त हुई थी। प्रकोष्ठों के तरीकों अनुभाग और IL17A (बाएं पैनल) और IFNγ (सही पैनल) उत्पादन एलिसा द्वारा विश्लेषण किया गया के रूप में वर्णित पीपीडी साथ प्रेरित किया गया। (बी) के कुल आईजी ऐ, और एम क्षय रोग (एमटीबी) विशिष्ट IgA एलिसा द्वारा बाल के नमूने से विश्लेषण किया गया। दो स्वतंत्र प्रयोगों से जमा डेटा दिखाए जाते हैं। रेखांकन में डेटा मतलब + एसडी के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। (पहले प्रकाशित 9)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. वैक्सीन विशेषफेफड़े के प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया H37Rv के साथ चुनौती से पहले का विश्लेषण किया। 6 डीबीए के समूह / 2 चूहों चमड़े के नीचे (बीसीजी अनुसूचित जाति) या intranasal में (बीसीजी) मार्ग, या गैर टीका लगाया (NV) में बीसीजी वैक्सीन डेनिश 10 6 CFU के साथ टीका लगाया गया। गैर-टीका लगाया, गैर संक्रमित चूहों के एक समूह के नियंत्रण भी (NV / एनआई) शामिल किया गया था। दो महीने के बाद टीकाकरण, चूहों के एक कम H37Rv खुराक (100 CFU) के साथ intranasally चुनौती दी थी, और एक महीने बाद जानवरों euthanized थे। वाम और एक ही पशु से सही फेफड़ों बैक्टीरियल लोड और IL17A- (ए) या ​​IFNγ- (बी) निर्धारित करने के लिए सीडी 4 + कोशिकाओं क्रमश: उत्पादन में इस्तेमाल किया गया। बाएं पैनल में डेटा प्रवाह cytometry द्वारा मापा साइटोकाइन उत्पादक कोशिकाओं का प्रतिशत के अनुरूप है, और मतलब + एसडी के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। सही पैनल बैक्टीरियल लोड से और प्रत्येक माउस के लिए प्राप्त सीडी 4 + कोशिकाओं के उत्पादन cytokine- डेटा प्रतिनिधित्व करते हैं। रेखीय प्रतिगमन गणना की गई और पी मूल्य प्रत्येक मामले में प्राप्त IL17A के मामले में दिखाया गया है। जमादो स्वतंत्र प्रयोगों से डेटा के आंकड़े में दिखाया गया है। (पहले प्रकाशित 9)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Middlebrook 7H9 broth BD 271310
Middlebrook ADC Enrichment BD 211887
Tween 80 Scharlau TW00800250
3-mm diameter Glass Beads Scharlau 038-138003
Middlebrook 7H10 Agar BD 262710
1-ml syringe 26GA 0.45 x 10 mm BD 301358
GentleMACS dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235
C tubes Miltenyi Biotec 130-093-237
M tubes Miltenyi Biotec 130-093-236
Collagenase D Roche 11088882001
DNaseI Applichem A3778,0100
Falcon 70 µm Cell Strainer Corning 352350
RPMI 1640 Sigma R0883
Red Blood Cell Lysing Buffer Sigma R7757
GlutaMAX Supplement Gibco 35050-061 100x concentrated
Penicillin-Streptomycin Solution Sigma P4333 100x concentrated
Fetal Calf Serum Biological Industries 04-001-1A
2-Mercaptoethanol Sigma M3148-25ML
Scepter 2.0 Handheld Automated Cell Counter Millipore PHCC20040
Scepter Cell Counter Sensors, 40 µm Millipore PHCC40050
Mycobacterium Tuberculosis - Tuberculin PPD Statens Serum Institut (SSI) 2390
Mouse IFN-γ ELISA development kit  Mabtech 3321-1H
Mouse IL17A ELISA development kit  Mabtech 3521-1H
Brefeldin A Sigma B7651
FITC Rat Anti-Mouse CD4 BD 553047
BD Cytofix/Cytoperm Kit BD 555028
APC-Cy7 Rat Anti-mouse IL-17A BD 560821
APC Mouse Anti-mouse IFNg BD 554413
LACHRYMAL OLIVE LUER LOCK 0.60 x 30 mm. 23G x 1 1/4” UNIMED 27.134 Used as trachea cannula for BAL
high-protein binding polystyrene flat-bottom 96-well plates MAXISORP NUNC 430341
Albumin, from bovine serum Sigma A4503
Goat Anti-Mouse IgA (α-chain specific)−Peroxidase antibody Sigma A4789
3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB)  Sigma T0440
MyTaq DNA Polymerase Bioline BIO-21107 The kit Includes Buffer 5x

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References

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संक्रमण अंक 115 बीसीजी श्लैष्मिक टीका IL17 माउस मॉडल तपेदिक intranasal इम्यूनोलॉजी
सुरक्षा प्रभावकारिता और फेफड़े के प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया चूहे में चमड़े के नीचे और Intranasal बीसीजी प्रशासन निम्नलिखित
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Uranga, S., Marinova, D., Martin, C., Aguilo, N. Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice. J. Vis. Exp. (115), e54440, doi:10.3791/54440 (2016).

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