Introduction
La tubercolosi (TB) è una delle principali malattie infettive che causano più morti associate di HIV nel mondo e combinato con l'aumento della crescita di ceppi resistenti multiresistenti rende TB un allarmante problema di salute globale 1. I nuovi strumenti diagnostici, farmaci più efficaci e meno tossici, e nuovi vaccini TB sicuri ed efficaci sono una necessità urgente, soprattutto nel mondo in via di sviluppo.
Vivo attenuato Bacille Calmette-Guerin (BCG) è attualmente l'unico vaccino autorizzato contro la tubercolosi, che è stato somministrato per via intradermica alla nascita dal 1970 in tutto il mondo. BCG è considerata efficace nel prevenire le forme gravi della malattia (meningite e la tubercolosi miliare) nei bambini, ma ha dimostrato efficacia in contrasto contro la tubercolosi polmonare responsabile della trasmissione della malattia 2.
la vaccinazione polmonare, che imita percorso naturale di infezione da TBC, rappresenta un approccio interessante per l'innesco della risposta immunitaria host localeS. A questo proposito, varie opere preclinici in modelli animali TB pertinenti hanno dimostrato una maggiore efficacia del vaccino a seguito di immunizzazione polmonare rispetto alla via sottocutanea o intradermica 3-6. Tuttavia, i meccanismi di protezione innescati dalla vaccinazione polmonare non sono ben compresi. Negli ultimi anni, diversi lavori hanno puntato verso di risposta IL17-mediata come un importante fattore di mucosa risposta immunitaria specifica-TB, come nei modelli murini carenti per IL17 mucosa efficacia protettiva del vaccino-indotta è compromessa 7,8.
Recentemente abbiamo dimostrato per la prima volta che intranasale amministrazione BCG protetto / 2 topi DBA, un ceppo di topi caratterizzata dalla mancanza di protezione dopo BCG sottocutaneo vaccinazione 9. Questi risultati suggeriscono che la vaccinazione respiratorio TB potrebbe essere più efficace nel ridurre il tasso di tubercolosi nei paesi endemici, in cui intradermica di BCG è considerato inefficace contro pulmonTB ary.
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Protocol
Tutti i topi sono stati tenuti in condizioni controllate e osservati per qualsiasi segno di malattia. Il lavoro sperimentale è stato condotto in accordo con le direttive europee e nazionali per la protezione degli animali da esperimento e con l'approvazione del competenti comitati etici locali.
1. Preparazione di quantificata glicerolo scorte di BCG danese e Mycobacterium tuberculosis H37Rv
Nota: Tutti i protocolli descritti sono stati eseguiti in BSL3.
- Scongelare scorte glicerolo congelati di BCG danese ceppi H37Rv e inoculare 100 ml in 10 ml di 7H9 media 10 integrato con Tween-80 allo 0,05% (v / v) e ADC (albumina, destrosio, catalasi) 10% (v / v).
- Incubare in condizioni statiche per una settimana a 37 ° C fino a quando la coltura è in fase di crescita logaritmica.
- Scalare fino coltura batterica trasferendo la cultura da 10 ml a 200 ml di terreno fresco. Incubare per 20 aggiuntivogiorni in condizioni statiche.
- Trasferimento a provette da centrifuga da 50 ml e centrifugare per 15 min a 2500 x g.
- Eliminare sovranatante e risospendere pellet batterico nel volume residuo. Aggiungere ad ogni provetta perle di vetro sterili a 3 mm di diametro (10 - 15 per provetta).
- Vortex vigorosamente per 1 minuto al fine di dissociare grumi batteriche. Risospendere ogni pellet in 10 ml di PBS con Tween-80 allo 0,05% (v / v).
- Lasciare i tubi per 10 min permettendo i più grandi aggregati batterici e perle di vetro di stabilirsi.
- Recupero 9,5 ml di surnatante da ciascuna delle 4 provette contenenti piccoli grumi e batteri singoli e volumi di trasferimento ad un singolo tubo da centrifuga da 50 ml fresca (volume finale recuperato 38 ml). Centrifugare per 10 min a 400 x g.
- Recupero 35 ml di surnatante (contenenti batteri principalmente singoli) in una singola provetta da centrifuga da 50 ml fresca e aggiungere 15 ml di PBS con glicerolo 50% (v / v), ottenendo una concentrazione di glicerolo finale del 15% (v / v).
- mescolare delicatamentee distribuire in aliquote da 1 ml in tubi appropriati per il congelamento. Conservare a -80 ° C (un lotto fornisce circa il 50 aliquote stock di glicerolo).
- Per quantificare le scorte glicerolo, scongelare un glicerolo il giorno dopo il congelamento e di eseguire sette diluizioni seriali di dieci volte separati tubi da 1,5 ml contenente 900 ml di PBS.
- Piatto 100 microlitri di ogni diluizione in 7H10 mezzo solido-agar addizionato con 10 ADC 10% (v / v) preparata in diametro piatti 55 mm Petri.
- Aggiungere con cautela 3 mm di diametro perle di vetro (circa. 10 per piastra) e scuotere delicatamente piastra per distribuire equamente il volume su piastra di agar. Eliminare perline e sigillare piastra di agar con parafilm.
- Incubare per 21 giorni a 37 ° C e determinare la concentrazione batterica contando unità formanti colonia (CFU) nelle diluizioni in cui singole colonie possono essere accuratamente distinti.
2. mouse Vaccinazione
- Scongelare un glicerolo pre-quantificato BCG e diluirlo in PBS a prepsono due sospensioni. Calcolare il volume finale considerando la dose per animale è di 100 ml per somministrazione sottocutanea (10 7 CFU per ml per la vaccinazione per via sottocutanea) e 40 ml per somministrazione intranasale (2,5 x 10 7 CFU per la vaccinazione intranasale).
- Utilizzare una stazione di anestesia specializzato per roditori per anestetizzare topi con una miscela di isoflurano e ossigeno. Utilizzare isoflurano 5% per indurre anestesia e 2% per mantenere i topi nella camera di anestesia. (Altro metodo di anestesia accettato può essere utilizzato).
- Per la somministrazione del vaccino sottocutanea riempire una siringa da 1 ml con un ago 26 G con 1 ml di sospensione batterica (10 7 CFU / ml). Rimuovere le bolle d'aria.
- Inserire un mouse anestetizzato su una superficie piana in posizione prona all'interno di una cappa a flusso laminare e inoculare sottocutanea 100 microlitri (10 6 CFU / dose) di vaccino in un fianco della parte posteriore del mouse. Ritorna il mouse per la gabbia e monitorarlo per assicurare che properly recupera da anestesia.
- Cambiare l'ago della siringa tra ogni amministrazione mouse. Rimosso bolle d'aria come descritto sopra.
- Per la somministrazione intranasale, posizionare un mouse anestetizzato in posizione supina all'interno della cappa.
- Con una micropipetta prendere 20 ml di sospensione con 2,5 x 10 7 CFU / ml. Posizionare l'inoculo goccia a goccia tra le due narici fino a quando l'intero volume è stato depositato, lasciando tempo tra gocce per consentire il mouse respirare il volume. Nota: i topi possono soffrire di distress respiratorio durante questa procedura in modo che dovrebbe essere lasciato a assimilare ogni goccia prima amministrare quello successivo per evitare il più possibile.
- Ri-riempire la micropipetta con un altro 20 ml e ripetere l'operazione. Se il mouse comincia a svegliare dall'anestesia dopo il primo inoculo, posizionarlo nella camera di anestesia prima alla seconda. Ritorna il mouse per la gabbia e garantire che recupera correttamentedall'anestesia.
3. mouse intranasale sfida con H37Rv Strain
- Scongelare un glicerolo pre-quantificato H37Rv e diluire in PBS per preparare una sospensione batterica di 2.500 CFU per ml. Calcolare il volume finale considerando la dose per animale è di 40 ml.
- H37Rv viene inoculato per via intranasale, come descritto nella 2,5-2,7. Dose sfida finale per il mouse è di 10 CFU 2/40 ml.
4. Analisi dei indotta risposta immunitaria nei polmoni
- Sospensione cellulare Lung
NOTA: Valutazione della risposta immunitaria adattativa indotta dal vaccino nei polmoni richiede la generazione di sospensione cellulare singolo. A questo scopo, usiamo un dissociatore tessuto come gentleMACS.- Sacrificare il mouse per dislocazione cervicale (o altra metodologia umana accettato) e garantire il mouse è morto di toccare il bulbo oculare per confermare assenza di riflesso corneale.
- All'interno di una cappa a flusso laminare, estrarre lungs usando forbici e pinze sterili e collocarli su una superficie pulita. polmoni puliti rimozione della trachea e del tessuto connettivo, e trasferire i polmoni in una provetta da 1,5 ml con PBS (mantenere in ghiaccio fino al trattamento).
- Per generare una sospensione cellulare, posizionare polmoni in un tubo adeguato per la dissociazione organo (tubo C-dissociatore) contenente 5 ml di 10 mM HEPES-NaOH pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2 e 1.8 mM CaCl 2 buffer.
- Aggiungere 100 ml di collagenasi D 100 mg / ml (2 mg / ml concentrazione finale) e 40 ml di DNAsi I 20.000 UI / ml (160 UI / ml concentrazione finale.
NOTA: Soluzioni madre della collagenasi D o DNasiI sono preparati dissolvendo enzimi liofilizzati in PBS o glicerolo 50% (v / v), 20 mM Tris-HCl pH 7.5 y MgCl 2 1 mM, rispettivamente. - Posizionare il tubo nella dissociatore tessuti e utilizzare il programma di m_lung_01 predefinito per la frammentazione del polmone. Incubare la provetta a 37 ° C a bagnomaria per 30 minuti.
- ° postoe tubo nella dissociatore e utilizzare il m_lung_02 programma predefinito per l'omogeneizzazione del polmone completo in un'unica sospensione cellulare.
- Passare la sospensione cellulare attraverso un colino cella nylon 70 micron montato su un tubo da centrifuga da 50 ml. Lavare il filtro con 10 ml di RPMI 1640 medium.
- celle di centrifugazione per 5 minuti a 400 xg ed eliminare il surnatante.
- Aggiungere 1 ml di eritrociti lisi tampone, mescolare nel vortex e incubare per 1 minuto a temperatura ambiente.
- Aggiungere 10 ml di RPMI 1640 cellule medie e centrifugare per 5 minuti a 400 x g.
- Risospendere le cellule in 0,5 ml di RPMI completo 1640 supplementato con 10% inattivato al calore fetale Calf Serum (FCS), 2 mM L-Glutamin, 100 ug / ml streptomicina, 100 IU / ml penicillina e 50 mM 2-mercaptoetanolo.
NOTA: FCS è inattivata tramite incubazione a 56 ° C per 30 minuti. - Contare le cellule e aggiungere completo RPMI 1640 medium per raggiungere densità finale cellulare di 10 7 cellule / ml.
NOTA: Per il conteggio delle cellule, usiamo il contatore delle cellule automatizzato. - Distribuire 100 ml di sospensione cellulare in U-bottom piastra a 96 pozzetti sterili (10 6 cellule / pozzetto).
- Aggiungere 50 ml / pozzetto di completo RPMI 1640 medium con 15 ug / ml di H37Rv commerciale purificata proteine derivati (PPD) (5 mg / ml concentrazione finale).
- Raccolta surnatante per la determinazione di citochine da parte ELISA
- Incubare la piastra da 4.1.14 per 48 ore a 37 ° C e 5% CO 2.
- Piastra centrifugare per 5 minuti a 400 xg e recuperare 100 ml di surnatante.
- Conservare a -80 ° C.
- Diluire surnatanti 1/10 e 1/2 nel tampone per IFNγ e determinazione IL17A, rispettivamente. Determinare le concentrazioni di citochine con kit commerciali ELISA, secondo le istruzioni del produttore (kit ELISA Sviluppo).
- Colorazione intracellulare per la determinazione delle citochine-produzione di cellule CD4 + mediante citometria di flusso
- Incubare la piastra da 4.1.14 per 18 ore a 37 ° C e 5% CO 2.
- Aggiungere 1,5 ml di brefeldina a 1 mg / ml (archivio disciolto in DMSO) a ciascuna (concentrazione finale 10 ug / ml) e incubare per sei ore aggiuntive.
- Centrifugare la piastra da 4.3.2 per 1 min a 3200 xg e scartare il surnatante.
- Risospendere le cellule in 50 ml di anti-topo CD4-FITC diluito in RPMI 1640 con 10% FCS (1/500) e incubare per 10 minuti a 4 ° C.
- Centrifugare la piastra da 4.3.4 per 1 min a 3.200 xg, scartare il surnatante e aggiungere 100 ml / pozzetto di soluzione di fissaggio. Incubare a 4 ° C per 20 min.
- Lavare le cellule due volte con 150 ml / lavaggio di soluzione di permeabilizzazione.
NOTA: 10x magazzino concentrato viene diluito in acqua deionizzata per preparare la soluzione di lavoro 1x. - Risospendere le cellule in 50 ml di anti- topo IFNγ-APC e anti-topo-IL17A APC.Cy7 diluiti in permeabilsoluzione zione (1/250 entrambi gli anticorpi).
- Incubare per 1 ora a RT.
- Lavare le cellule due volte con 150 ml / lavaggio di soluzione di permeabilizzazione.
- Risospendere le cellule in 200 ml di PBS per l'acquisizione di citometria a flusso.
5. Analisi delle immunoglobuline nel lavaggio broncoalveolare (BAL)
- Ottenimento di campioni BAL
- Sacrificare il mouse per dislocazione cervicale (o altra metodologia umana accettato) e garantire il mouse è morto di toccare il bulbo oculare per confermare assenza di riflesso corneale.
- Esporre la trachea utilizzando adeguata precisione pinza sterile e forbici ed eseguire un piccolo taglio nella trachea, facendo attenzione a non asportare completamente. Fare attenzione a non causare sanguinamento che potrebbe contaminare campione BAL.
- Introdurre nella trachea una cannula collegata ad una siringa sterile da 1 ml con 800 ml di PBS ghiacciato.
- Seminare il PBS lentamente nei polmoni e poi recover volume di BAL tirando indietro il pistone della siringa molto lentamente per evitare il collasso del polmone.
NOTA: Il recupero di 500 a 600 microlitri è soddisfacente. - Trasferire il volume BAL in un tubo da 1,5 ml e confermare BAL rimane incolore, che indica che non è contaminato con il sangue (mantenere in ghiaccio fino al trattamento).
- centrifugare i campioni BAL per 5 minuti a 400 xg, e il trasferimento surnatante in una nuova provetta.
- surnatanti conservare a -80 ° C.
- Determinazione delle IgA nel BAL surnatanti
NOTA: Tutti i reagenti utilizzati sono a temperatura ambiente.- Coat-alto contenuto di proteine di polistirolo legame a fondo piatto piastre a 96 pozzetti con 100 ml di PPD diluito in PBS (10 mg / ml) per M. tubercolosi determinazione IgA SPECIFICI, o con 100 ml di BAL surnatante diluiti 10 volte in PBS per la determinazione totale di IgA.
- Incubare per una notte a 4 ° C.
- Gettare il surnatante e toccare la piastra su carta assorbente per dry. Lavare con 200 pl / pozzetto di PBS.
- Blocco con 200 pl / pozzetto di una albumina sierica bovina (BSA) 1% (w / v) in PBS-Tween-80 allo 0,05% (v / v) (tampone di bloccaggio).
- Incubare 1 ora a temperatura ambiente.
- Risciacquare una volta con 200 ml / pozzetto di PBS-Tween-80 0,05% (v / v) (tampone di lavaggio).
- Aggiungere 100 ml di diluito surnatante BAL nei pozzetti PPD-rivestiti. Incubare due ore a temperatura ambiente.
NOTA: Se la determinazione totale IgA viene fatto in parallelo con il PPD-specifica IgA, lasciare pozzi totale di IgA con tampone di lavaggio 100 microlitri Durante questa incubazione. - Lavare tre volte con 200 pl / pozzetto di lavaggio buffer.0170004
- Aggiungere 100 ml di perossidasi di rafano (HRP) coniugata anti-topo IgA diluito in tampone di bloccaggio (1 / 10.000).
- Incubare 1 ora RT.
- Lavare cinque volte con 200 pl / pozzetto di tampone di lavaggio.
- Aggiungere 100 ml / pozzetto di 3,3 ', 5,5'-Tetrametilbenzidina (TMB). Incubare 20 minuti a temperatura ambiente in tegli scuro.
- Aggiungere 100 pl / pozzetto di H 2 SO 4 0.5N. Leggere la piastra in uno spettrofotometro ad una lunghezza d'onda di 450 nm.
6. determinazione carica batterica nei polmoni
- Omogeneizzazione del polmone e placcatura
- Quattro settimane dopo la sfida, sacrificare il mouse per dislocazione cervicale (o altra metodologia umana accettato) e garantire il mouse è morto di toccare il bulbo oculare per confermare assenza di riflesso corneale.
- Posizionare il mouse in posizione supina fissa su una superficie piana e disinfettati all'interno di una cappa a flusso laminare.
- Fare un'incisione e rimuovere la pelle da regione toracica lasciare visibile la zona toracica.
- Tagliare le costole e raccogliere i polmoni e il cuore con le forbici e pinze sterili. Mettere organi su una superficie pulita.
- Pulire polmoni rimuovendo cuore, trachea e tessuto connettivo e trasferire i polmoni in una provetta da 1,5 ml con 1 ml di acqua deionizzata(Mantenere in ghiaccio fino lavorazione).
- Utilizzare pinze sterili per trasferire i polmoni di ciascun topo in una provetta adeguata per omogeneizzazione organo (M - tubo dissociatore), contenente 1 ml di acqua deionizzata.
- Posizionare il tubo nella dissociatore tessuti e utilizzare il programma RNA_1 predefinito per omogeneizzare i polmoni.
- Fare cinque diluizioni seriali dieci volte in tubi da 1,5 ml, a partire da 100 ml di omogenato polmone diluito in 900 ml.
- diluizioni piastra come descritto in 1,11-1,14.
- La differenziazione tra BCG e H37Rv mediante PCR
NOTA: In piastre dalla 6.1.6 corrispondenti al gruppo vaccinato con BCG per via intranasale, abbiamo analizzato un numero rappresentativo di colonie da una PCR discernere tra BCG e H37Rv per garantire che il CFU considerato per valutare l'efficacia protettiva del vaccino-conferito corrispondeva unica per H37Rv. Questo target di amplificazione PCR di RD9, una regione genomica diversa in BCG e M. tutuberculosis, dando un frammento di 2618 bp per H37Rv, e 465 bp per BCG 11.- Preparare uno stock master mix per tutti i campioni con volumi per campione come indicato, e quindi distribuire in provette da PCR (9 ml / campione).
NOTA: Buffer 5x: 2 ml. Avanti di primer 25 micron (GTGTAGGTCAGCCCCATCC): 0,32 ml, Reverse Primer 25 micron (GCCCAACAGCTCGACATC): 0,32 microlitri, Taq polimerasi 5 unità / mL: 0,04 ml, deionizzata H 2 O: 6.32 ml. - Toccare una colonia con uno stuzzicadenti sterile e immergere lo stuzzicadenti con il campione in un tubo di PCR contenente la master mix.
- Eseguire il PCR con il seguente programma: 10 min 95 ° C (questo passaggio è per innescare interruzione batterica), 10 min a 95 ° C (questo passaggio è per innescare interruzione batterica), 35 cicli (30 secondi a 95 ° C, 1 min a 58 ° C e 4 minuti a 72 ° C).
- Caricare i campioni di PCR in un 1% gel con i campioni di etidio bromuro e correre a visualizzare i frammenti.
- Preparare uno stock master mix per tutti i campioni con volumi per campione come indicato, e quindi distribuire in provette da PCR (9 ml / campione).
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Representative Results
Questo lavoro descrive il confronto delle due vie di somministrazione di BCG: sottocutaneo e intranasale. Via di somministrazione sottocutanea è paragonabile al intradermica, che è il percorso clinica corrente BCG mondo. Via intranasale della vaccinazione si propone di imitare la via naturale di infezione di M. tuberculosis, con l'obiettivo di indurre risposta immunitaria direttamente nei polmoni, l'organo bersaglio primario di questo patogeno.
Figura 1 descrive il workflow seguito. Otto a dieci settimane di età DBA femmina / 2 topi vaccinati con 10 6 CFU di BCG danese per via sottocutanea o intranasale di somministrazione. Otto settimane dopo, un gruppo di topi è sacrificato per analizzare polmonare risposta immunitaria indotta dalla vaccinazione. campioni BAL vengono prima ottenuti e quindi abbiamo raccolto i polmoni. Al fine di studiare l'efficacia protettiva del vaccino-conferita, abbiamo inoculare un differegruppo nt di topi con una intranasale sfida a basso dosaggio di M. ceppo di tubercolosi H37Rv. Un mese dopo, sacrifichiamo animali e polmoni raccolto. In questo caso, per ogni animale usiamo il polmone sinistro per determinare carica batterica e il polmone destro per valutare la risposta immunitaria post-sfida vaccino-indotta. L'obiettivo è quello di generare carica batterica e dati di risposta immunitaria nei polmoni per ogni animale per studiare potenziali correlati di protezione.
Come mostrato in figura 2, polmoni erano dissociate avere sia un omogenato organo o una sospensione cellulare. polmoni omogeneizzati sono stati placcati in solido agar per determinare carica batterica quattro settimane post-sfida. sospensione cellulare per studiare la risposta immunitaria indotta dal vaccino è stato ottenuto a seguito del polmone digestione enzimatica con collagenasi D e DNasiI.
I nostri risultati indicano chiaramente che, rispetto to la via sottocutanea, la via intranasale di vaccinazione conferisce una maggiore efficacia protettiva nei polmoni quattro settimane dopo la sfida (Figura 3A). Inoltre, abbiamo confermato che la carica batterica nei polmoni del intranasale gruppo BCG-vaccino corrisponde a H37Rv e non al vaccino BCG. A questo scopo, abbiamo analizzato un numero rappresentativo di colonie da questo gruppo con PCR specifica per la regione del genoma RD9, che amplifica diversi frammenti di lunghezza in BCG e M. la tubercolosi (Figura 3B). Figura chiaramente dimostrato che tutte le colonie analizzati fornito un frammento di 0,4 kb, che corrispondeva a H37Rv.
I nostri dati hanno rivelato correlazione tra efficacia protettiva conferito dal intranasale vaccinazione BCG e la risposta immunitaria indotta dal vaccino nei polmoni prima di sfidare. Intranasale BCG innescato nettamente superiore IL17 e la produzione di IFNγ nei polmoni, misurato con metodo ELISA (Figura4A). Questi dati sono stati confermati da intracellulare colorazione (ICS) e citometria a flusso (dati non riportati). Inoltre, abbiamo anche trovato una maggiore concentrazione sia di concentrazione totale e PPD specifico IgA nei campioni BAL (Figura 4B), che indica che la vaccinazione BCG polmonare induce la produzione di IgA e traslocazione vie respiratorie.
Infine, abbiamo studiato la risposta immunitaria BCG-indotta nei polmoni dopo il challenge (Figura 5). I nostri dati hanno rivelato differenze tra IL17 e IFNγ; cellule IL17A produttrici di CD4 + sono stati rilevati solo nel gruppo BCG intranasale, mentre le cellule che producono IFNγ-sono stati trovati in tutti i gruppi infettati con H37Rv indipendentemente dalla vaccinazione. Rappresentazione dei dati di ciascun animale corrispondenti alle celle IL17 produttrici e carica batterica ha mostrato una significativa correlazione tra presenza di IL17 e riduzione del carico batterico polmonare, che non è stato osservato nel caso di IFNγ.
Figura 1. Flusso di lavoro confrontare intranasale e sottocutanea Via di vaccinazione BCG. Otto settimane dopo l'immunizzazione con BCG, una serie di topi (6 per gruppo sperimentale) viene utilizzato per raccogliere i polmoni ed eseguire un BAL, e analizzare la risposta immunitaria polmonare indotta dalla vaccinazione. Un altro gruppo di topi (6 / gruppo), viene inoculato con una intranasale sfida a basso dosaggio di M. la tubercolosi H37Rv ceppo (100 CFU). Un mese dopo, gli animali vengono sacrificati e carica batterica viene analizzata nel polmone sinistro e risposta immunitaria PPD-specifico nel polmone destro. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. protezione Efficacia conferiti dal BCG immunizzazione. Gruppi di 6 DBA / 2 topi sono stati vaccinati dal sottocutanea (BCG SC), intranasale (BCG a) percorso, o non vaccinati (Unvacc) con il vaccino BCG danese 10 6 CFU. A due mesi dopo la vaccinazione, i topi sono stati inoculati per via intranasale con una dose bassa (100CFU) sfida H37Rv, e un mese più tardi onere batterica nei polmoni è stato determinato. Viene mostrato un esperimento rappresentativo di due indipendenti. (A) I dati nel grafico sono rappresentati come media + SD. One-way ANOVA con l'analisi post Bonferroni è stata effettuata per calcolare la significatività statistica. (B) Un numero rappresentativo di singole colonie del gruppo intranasale BCG sono stati analizzati mediante PCR specifico per regione RD9 (diversa in BCG e H37Rv genomi) a discernere BCG e colonie H37Rv. (Precedentemente pubblicato 9). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. vaccino-specifica risposta immunitaria polmonare analizzati prima di sfidare con H37Rv. Gruppi di topi 2/6 DBA eranovaccinati dal sottocutanea (BCG sc) o intranasale (BCG a) percorso, o non vaccinati (Unvacc) con il vaccino BCG danese 10 6 CFU. (A) A due mesi dopo la vaccinazione, una sospensione cellulare dai polmoni raccolte è stato ottenuto. Le cellule sono state stimolate con PPD come descritto nella sezione Metodi e IL17A (pannello di sinistra) e IFNγ (pannello di destra) di produzione sono stati analizzati mediante test ELISA. (B) Totale IgA, e M. tuberculosis (MTB) SPECIFICI IgA sono stati analizzati da campioni BAL mediante ELISA. vengono mostrati dati raccolti da due esperimenti indipendenti. I dati nei grafici sono rappresentati come media + SD. (Precedentemente pubblicato 9). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. specifica Vaccino-Risposta immunitaria polmonare analizzati prima di sfidare con H37Rv. Gruppi di 6 DBA / 2 topi sono stati vaccinati dal sottocutanea (BCG sc) o intranasale (BCG a) percorso, o non vaccinati (NV) con il vaccino BCG danese 10 6 CFU. Un gruppo di controllo di topi non vaccinati, non infetto è stato anche incluso (NV / NI). A due mesi dopo la vaccinazione, i topi sono stati sfidati intranasale con una dose bassa H37Rv (100 CFU), e un mese dopo gli animali sono stati sottoposti ad eutanasia. Sinistra e polmoni destro dello stesso animale sono stati usati per determinare carica batterica e IL17A- (A) o IFNγ- (B) che produce cellule CD4 +, rispettivamente. Dati in pannelli di sinistra corrispondono alla percentuale di cellule producenti citochine misurate mediante citometria di flusso, e sono rappresentati come media + SD. pannelli di destra rappresentano i dati di carica batterica e citochine produzione di cellule CD4 + ottenuti per ogni mouse. La regressione lineare è stato calcolato e il p-valore ottenuto in ciascun caso è mostrato nel caso di IL17A. pooldati di due esperimenti indipendenti sono mostrati in figura. (Precedentemente pubblicato 9). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Middlebrook 7H9 broth | BD | 271310 | |
| Middlebrook ADC Enrichment | BD | 211887 | |
| Tween 80 | Scharlau | TW00800250 | |
| 3-mm diameter Glass Beads | Scharlau | 038-138003 | |
| Middlebrook 7H10 Agar | BD | 262710 | |
| 1-ml syringe 26GA 0.45 x 10 mm | BD | 301358 | |
| GentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| M tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | |
| Collagenase D | Roche | 11088882001 | |
| DNaseI | Applichem | A3778,0100 | |
| Falcon 70 µm Cell Strainer | Corning | 352350 | |
| RPMI 1640 | Sigma | R0883 | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer | Sigma | R7757 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | 100x concentrated |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sigma | P4333 | 100x concentrated |
| Fetal Calf Serum | Biological Industries | 04-001-1A | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148-25ML | |
| Scepter 2.0 Handheld Automated Cell Counter | Millipore | PHCC20040 | |
| Scepter Cell Counter Sensors, 40 µm | Millipore | PHCC40050 | |
| Mycobacterium Tuberculosis - Tuberculin PPD | Statens Serum Institut (SSI) | 2390 | |
| Mouse IFN-γ ELISA development kit | Mabtech | 3321-1H | |
| Mouse IL17A ELISA development kit | Mabtech | 3521-1H | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD4 | BD | 553047 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Kit | BD | 555028 | |
| APC-Cy7 Rat Anti-mouse IL-17A | BD | 560821 | |
| APC Mouse Anti-mouse IFNg | BD | 554413 | |
| LACHRYMAL OLIVE LUER LOCK 0.60 x 30 mm. 23G x 1 1/4” | UNIMED | 27.134 | Used as trachea cannula for BAL |
| high-protein binding polystyrene flat-bottom 96-well plates MAXISORP | NUNC | 430341 | |
| Albumin, from bovine serum | Sigma | A4503 | |
| Goat Anti-Mouse IgA (α-chain specific)−Peroxidase antibody | Sigma | A4789 | |
| 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) | Sigma | T0440 | |
| MyTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21107 | The kit Includes Buffer 5x |
References
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