Introduction
Tuberculose (tbc) is een van de toonaangevende infectieziekten veroorzaken meer geassocieerd doden dan HIV in de wereld en in combinatie met de stijgende toename van multidrug-resistente stammen maakt TB een alarmerend wereldwijd gezondheidsprobleem 1. Nieuwe diagnostische hulpmiddelen, effectiever en minder giftige medicijnen, en de nieuwe veilige en effectieve tbc-vaccins zijn dringend noodzakelijk, vooral in de ontwikkelingslanden.
Leef verzwakt Bacille Calmette-Guerin (BCG) is momenteel de enige in licentie vaccin tegen tbc, die intradermaal werd toegediend bij de geboorte sinds 1970 wereldwijd. BCG is effectief in het voorkomen van ernstige vormen van de ziekte (meningitis en miliaire TB) bij kinderen beschouwd, maar inconsistente werkzaamheid tegen longtuberculose verantwoordelijk ziekteoverdracht 2 getoond.
Pulmonale vaccinatie, die de natuurlijke route van tuberculose-infectie nabootst, vertegenwoordigt een aantrekkelijke benadering voor het vullen van lokale host immuunresponss. In dit verband hebben verschillende preklinische werken in verschillende relevante TB diermodellen groter vaccineffectiviteit na pulmonaire immunisatie aangetoond in vergelijking met de subcutane of intradermale route 3-6. Toch is de beschermingsmechanismen veroorzaakt door pulmonale vaccinatie zijn niet goed begrepen. In de afgelopen jaren hebben een aantal werken wees naar-IL17 gemedieerde respons als een belangrijke factor van TB-specifieke mucosale immuunrespons, zoals in muismodellen deficiënte voor IL17 mucosale vaccingeïnduceerde beschermende werking in het gedrang 7,8.
Onlangs toonden we voor de eerste keer dat intranasale toediening BCG beschermd DBA / 2 muizen, een muizenstam gekenmerkt door het ontbreken van bescherming na subcutane BCG immunisering 9. Deze resultaten suggereren dat de luchtwegen TB vaccinatie meer effectief in het verminderen tarief van tuberculose in endemische landen, waar de intradermale BCG ineffectief tegen pulmón wordt beschouwd zou kunnen zijnAry TB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle muizen werden onder gecontroleerde omstandigheden gehouden en geobserveerd op tekenen van ziekte. Experimentele werk werd uitgevoerd in overeenstemming met de Europese en nationale richtlijnen voor de bescherming van proefdieren en met goedkeuring van de bevoegde plaatselijke ethische comités.
1. Bereiding van gekwantificeerde glycerol voorraden van BCG Deense en Mycobacterium tuberculosis H37Rv
LET OP: Alle beschreven protocollen werden uitgevoerd onder BSL3 omstandigheden.
- Ontdooi bevroren glycerol voorraden BCG Deens of H37Rv stammen en beënt 100 pl in 10 ml van 7H9 medium 10 aangevuld met Tween-80 0,05% (v / v) en ADC (Albumine, dextrose, katalase) 10% (v / v).
- Incubeer onder statische omstandigheden gedurende één week bij 37 ° C totdat de kweek in log-fase groei.
- Schalen bacteriekweek in door de kweek 10 ml tot 200 ml vers medium. Incubeer gedurende 20 aanvullendedagen onder statische omstandigheden.
- Overbrengen naar 50 ml centrifugebuizen en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 2500 x g.
- Gooi supernatant en resuspendeer bacteriële pellet in het restvolume. Voeg aan elke buis steriele 3 mm diameter glaskralen (10-15 per buis).
- Vortex krachtig gedurende 1 minuut om bacteriële klonten distantiëren. Resuspendeer elk pellet in 10 ml PBS met Tween-80 0,05% (v / v).
- Laat buizen gedurende 10 minuten zodat de grootste bacteriële aggregaten en glazen kralen om te settelen.
- Herstel 9,5 ml supernatant uit elk van de 4 buizen met kleine klontjes en enkele bacteriën en overdracht volumes om een nieuwe 50-ml centrifugebuis (uiteindelijk teruggewonnen volume 38 ml). Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 400 x g.
- Herstel 35 ml supernatant (die hoofdzakelijk één bacteriën) in een verse 50 ml centrifugebuis en voeg 15 ml PBS met glycerol 50% (v / v), het verkrijgen van een uiteindelijke glycerolconcentratie van 15% (v / v).
- meng voorzichtigen distribueren in 1 ml monsters in geschikte buizen voor het invriezen. Bewaren bij -80 ° C (een perceel biedt ongeveer 50 porties glycerol voorraad).
- Glycerol voorraden kwantificeren ontdooien een glycerol de dag na invriezen en uitvoeren zeven tienvoudige seriële verdunningen in afzonderlijke 1,5 ml buisjes met 900 pl PBS.
- Plaat 100 pi van elke verdunning in 7H10 vaste agar medium gesupplementeerd met 10 ADC 10% (v / v) bereid in 55-mm diameter petrischalen.
- Voeg voorzichtig 3 mm diameter glasparels (. ca. 10 per bord) en schud plaat op gelijke volume verdelen over agarplaat. Gooi kralen en verzegelen agar plaat met parafilm.
- Incubeer gedurende 21 dagen bij 37 ° C en bepaal bacteriële concentratie tellen kolonievormende eenheden (CFU) in verdunningen waarin enkelvoudige kolonies nauwkeurig kunnen worden onderscheiden.
2. Mouse Vaccinatie
- Ontdooi een pre-gekwantificeerde BCG glycerol en verdunnen in PBS om preptwee suspensies. Bereken uiteindelijke volume gezien de dosis per dier 100 ul voor subcutane toediening (10 7 CFU per ml voor subcutane vaccinatie) en 40 ul voor intranasale toediening (2,5 x 10 7 CFU voor intranasale vaccinatie).
- Gebruik een gespecialiseerde anesthesiewerkstation Knaagdieren muizen verdoven met een mengsel van zuurstof en isofluraan. Gebruik 5% isofluraan anesthesie en 2% induceert de muizen in de kamer anesthesie te handhaven. (Andere aanvaarde verdovingsprocedure worden gebruikt).
- Voor subcutane toediening van het vaccin Vul een 1 ml spuit met een 26 G naald met 1 ml bacteriesuspensie (10 7 CFU / ml). Verwijder luchtbellen.
- Plaats een verdoofde muis op een vlak oppervlak buikligging in een laminaire stroming kap en beënt subcutaan 100 pl (10 6 CFU / dosis) van het vaccin in een flank van de muis weer. Zet de muis om de kooi en de gaten houden zodat zij properly herstelt van anesthesie.
- Vervang de naald tussen elke toediening muis. Luchtbellen verwijderd zoals hierboven beschreven.
- Voor intranasale toediening, het plaatsen van een verdoofde muis in rugligging in de kap.
- Met een micropipet nemen 20 ul van de suspensie met 2,5 x 10 7 CFU / ml. Plaats de entstof drop-door-drop tussen de twee neusgaten totdat het hele volume is gedeponeerd, waardoor de tijd tussen de druppels om de muis te ademen het volume in. Opmerking: muizen kan tijdens deze procedure last hebben van ademhalingsproblemen, zodat ze moet worden overgelaten aan assimileren elke druppel voor de volgende deze zoveel mogelijk te voorkomen beheren.
- Re-fill de micropipet met nog eens 20 ul en herhaal de handeling. Als de muis begint te ontwaken uit de narcose na de eerste inenting, plaats hem in de anesthesie kamer voorafgaand aan de tweede. Zet de muis naar de kooi en ervoor te zorgen dat deze goed hersteltvan anesthesie.
3. Mouse Intranasale Challenge met H37Rv Strain
- Ontdooi een pre-gekwantificeerde H37Rv glycerol en verdunnen in PBS om een bacteriële suspensie van 2500 CFU per ml te bereiden. Bereken uiteindelijke volume gezien de dosis per dier is 40 pi.
- H37Rv wordt intranasaal geënt, zoals beschreven in 2,5-2,7. Laatste uitdaging dosis per muis 10 2 CFU / 40 pi.
4. Analyse van geïnduceerde immuunrespons in longen
- Lung celsuspensie
OPMERKING: Evaluatie van vaccin geïnduceerde adaptieve immuunrespons in de longen vereist het genereren van enkele celsuspensie. Hiervoor maken we gebruik van een tissue dissociator zoals gentleMACS.- Offer de muis door cervicale dislocatie (of een andere aanvaarde humane methode) en zorgen voor de muis is dood aanraken van de oogbol te bevestigen afwezig van knipperreflex.
- Binnen een laminaire stroming kap, pak het lungs met steriele schaar en pincet en leg ze op een schone ondergrond. Schone longen verwijderen luchtpijp en bindweefsel en de longen te dragen aan een 1,5 ml-buis met PBS (handhaven op ijs tot verwerking).
- Aan een celsuspensie gegenereerd, plaatst longen juiste buis orgel dissociatie (C-dissociator buis) met 5 ml 10 mM HEPES-NaOH pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2 en 1,8 mM CaCl2 buffer.
- Voeg 100 gl Collagenase D 100 mg / ml (2 mg / ml eindconcentratie) en 40 pl DNAse I 20.000 IU / ml (160 IU / ml eindconcentratie.
OPMERKING: Voorraadoplossingen van Collagenase D of DNaseI worden bereid oplossen van gelyofiliseerd enzymen in PBS en glycerol 50% (v / v), 20 mM Tris-HCl pH 7,5 y MgCl2 1 mM, respectievelijk. - Plaats de buis in het weefsel dissociator en gebruik de vooraf gedefinieerde programma m_lung_01 long- fragmentatie. Incubeer de buis bij 37 ° C in een waterbad gedurende 30 min.
- plaats the buis in de dissociator en het gebruik van de vooraf gedefinieerde programma m_lung_02 voor volledige long homogenisering in enkele cellulaire suspensie.
- Voorbij de celsuspensie door een 70 pm nylon celzeef gemonteerd op een 50 ml centrifugebuis. Was de zeef met 10 ml RPMI 1640 medium.
- Centrifugeer cellen gedurende 5 minuten bij 400 x g en verwijder het supernatant.
- Voeg 1 ml erytrocyten lysisbuffer, door vortexen gemengd en incubeer gedurende 1 min bij kamertemperatuur.
- Voeg 10 ml van RPMI 1640 medium en centrifugeer cellen gedurende 5 minuten bij 400 x g.
- Resuspendeer cellen in 0,5 ml compleet RPMI 1640 medium aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd foetaal kalfsserum (FCS), 2 mM L-glutamine, 100 ug / ml streptomycine, 100 IU / ml penicilline en 50 pM 2-mercaptoethanol.
OPMERKING: FCS wordt geïnactiveerd door incubatie bij 56 ° C gedurende 30 minuten. - Tellen cellen en voeg volledig RPMI 1640-medium tot de uiteindelijke cellulaire dichtheid van 10 7 cellen / ml te bereiken.
LET OP: Voor celgetal, maken we gebruik van de geautomatiseerde cel teller. - Verdeel 100 ul van cellulaire suspensie in U-bodem 96-well steriele plaat (10 6 cellen / putje).
- Voeg 50 ul / putje volledig RPMI 1640 medium met 15 ug / ml commercieel H37Rv gezuiverd eiwitderivaat (PPD) (5 ug / ml eindconcentratie).
- Supernatant collectie voor cytokine bepaling door ELISA
- Incubeer plaat uit 4.1.14 gedurende 48 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
- Centrifuge dienblad 5 min bij 400 xg en herstellen 100 pl supernatant.
- Bewaar bij -80 ° C.
- Verdun supernatanten 10/01 en 1/2 in assay buffer voor IFNy en IL17A vastberadenheid, respectievelijk. Bepaal cytokine concentraties met commerciële ELISA-kits, volgens de instructies van de fabrikant (ELISA Development kits).
- Intracellulaire kleuring voor de bepaling van cytokineproducerende CD4 + cellen door flowcytometrie
- Incubeer plaat uit 4.1.14 gedurende 18 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
- Voeg 1,5 gl Brefeldine A 1 mg / ml (stock opgelost in DMSO) aan elk putje (10 ug / ml eindconcentratie) en incubeer gedurende zes extra uren.
- Centrifugeer de plaat uit 4.3.2 gedurende 1 min bij 3200 x g en verwijder het supernatant.
- Resuspendeer cellen in 50 ul anti-muis CD4-FITC verdund in RPMI 1640 met 10% FCS (1/500) en incubeer gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
- Centrifugeer de plaat uit 4.3.4 gedurende 1 min bij 3200 xg, verwijder het supernatant en voeg 100 ul / putje van fixeeroplossing. Incubeer bij 4 ° C gedurende 20 min.
- Was de cellen tweemaal met 150 ul / was van permeabilisatie oplossing.
LET OP: 10x geconcentreerd voorraad wordt verdund in gedeïoniseerd water om 1x werk te bereiden. - Resuspendeer cellen in 50 ul anti-muis IFNy-APC en anti-muis-IL17A APC.Cy7 verdund in permeabilordening oplossing (1/250 beide antilichamen).
- Incubeer gedurende 1 uur bij KT.
- Was de cellen tweemaal met 150 ul / was van permeabilisatie oplossing.
- Resuspendeer cellen in 200 pl PBS voor flowcytometrie verkrijgen.
5. Analyse van immunoglobulinen in bronchoalveolaire lavage (BAL)
- Verkrijgen van BAL monsters
- Offer de muis door cervicale dislocatie (of een andere aanvaarde humane methode) en zorgen voor de muis is dood aanraken van de oogbol te bevestigen afwezig van knipperreflex.
- Expose de luchtpijp met de juiste precisie steriel pincet en een schaar en het uitvoeren van een kleine snede in de luchtpijp, waardoor zeker niet om het volledig te snijden. Zorg ervoor dat u bloeden dat BAL monster kan verontreinigen veroorzaken.
- Breng in de trachea een canule verbonden met een steriele 1 ml spuit met 800 ul ijskoude PBS.
- Inoculeer langzaam de PBS in de longen en dan recover BAL volume terugtrekken van de zuiger van de spuit is heel langzaam om longcollaps vermijden.
OPMERKING: Herstel van 500 tot 600 pi is bevredigend. - Transfer BAL volume in een 1,5 ml buis en bevestig BAL blijft ongekleurde, wat aangeeft dat is niet besmet met bloed (houden op ijs tot verwerking).
- Centrifugeer BAL monsters 5 min bij 400 xg en overdragen supernatant naar een nieuwe buis.
- WINKEL supernatanten bij -80 ° C.
- Bepaling van IgA in BAL supernatanten
LET OP: Alle toegepaste reagentia zijn bij RT.- Coat hoge eiwitbinding polystyreen platte bodem 96-putjesplaten met 100 ui PPD verdund in PBS (10 ug / ml) voor M. tuberculosis-specifieke IgA bepaling, of met 100 ul van BAL supernatant verdund 10 keer in PBS voor de totale IgA bepaling.
- Incubeer overnacht bij 4 ° C.
- Gooi supernatant en tik op de plaat op keukenpapier om dry. Wassen met 200 ul / putje PBS.
- Blok met 200 gl / putje van een runderserumalbumine (BSA) 1% (w / v) in PBS-Tween-80 0,05% (v / v) (Blocking buffer).
- Incubeer 1 uur bij KT.
- Was eenmaal met 200 ui / putje PBS-Tween-80 0,05% (v / v) (wasbuffer).
- Voeg 100 ul onverdund supernatant BAL in het PPD-beklede putjes. Incubeer twee uur bij kamertemperatuur.
Opmerking: Als de totale IgA bepaling gebeurt parallel met de PPD-specifieke IgA, IgA reactie totale putjes met 100 ui wasbuffer Tijdens deze incubatie. - Was driemaal met 200 ul / putje wassen buffer.0170004
- Voeg 100 ul van mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerd anti-muis IgA verdund in blokkerende buffer (1 / 10.000).
- Incubeer 1 uur RT.
- Was vijfmaal met 200 ul / putje wasbuffer.
- Voeg 100 ul / putje van 3,3 ', 5,5' tetramethylbenzidine (TMB). Incubeer 20 min bij kamertemperatuur in thij donker.
- Voeg 100 ul / putje van H 2 SO 4 0,5 N. Lees de plaat in een spectrofotometer bij een golflengte van 450 nm.
6. Bacteriële belasting bepaling in de longen
- Lung homogenisering en plating
- Vier weken na challenge, offeren de muis door cervicale dislocatie (of een andere aanvaarde humane methode) en zorgen voor de muis is dood aanraken van de oogbol te bevestigen afwezig van knipperreflex.
- Plaats de muis in rugligging op een vlakke ondergrond en ontsmet in een laminaire stroming kap vast.
- Maak een incisie en de huid te verwijderen uit de borst regio zichtbaar te vertrekken de thoracale gebied.
- Knip de ribben en de oogst van de longen en het hart met behulp van een steriele schaar en pincet. Plaats organen op een schoon oppervlak.
- Reinig longen door het verwijderen van het hart, trachea en bindweefsel en de longen te dragen aan een 1,5 ml-buis met 1 ml gedeïoniseerd water(Houden op ijs tot verwerking).
- Gebruik steriele tang om de longen van elke muis brengen in een geschikte buis voor homogeniseren orgaan (M - dissociator buis), die 1 ml gedeïoniseerd water.
- Plaats de buis in het weefsel dissociator en gebruik de voorgedefinieerde programma RNA_1 de longen gehomogeniseerd.
- Maak vijf tienvoudige seriële verdunningen in 1,5 ml buizen, beginnend met 100 gl longweefselhomogenaat verdund in 900 ul.
- Plaat verdunningen zoals beschreven in 1,11-1,14.
- Differentiatie tussen BCG en H37Rv door PCR
Opmerking: In de platen van 6.1.6 correspondeert met de groep gevaccineerd met BCG via de intranasale route, analyseerden wij een representatief aantal kolonies door een PCR onderscheiden tussen BCG en H37Rv dat de CFU als beoordeling vaccin toegekend beschermende werking overeen uniek te H37Rv. Dit PCR doelen versterking van RD9, een genomische regio verschillend in BCG en M. tuberculosis, waardoor een fragment van 2618 bp voor H37Rv en 465 bp voor BCG 11.- Bereid een master mix voorraad voor alle monsters met volumes per monster zoals aangegeven, en vervolgens verdelen in PCR-buizen (9 ul / monster).
LET OP: Buffer 5x: 2 pl. Voorwaartse primer 25 uM (GTGTAGGTCAGCCCCATCC): 0,32 ul, Reverse primer 25 pm (GCCCAACAGCTCGACATC): 0,32 pl, Taq-polymerase 5 eenheden / ul: 0,04 ui, Gedeïoniseerd H 2 O: 6.32 pl. - Raak een kolonie met een steriele tandenstoker en dompel de tandenstoker met het monster in een PCR-buis met daarin de master mix.
- Voer het PCR met het volgende programma: 10 min 95 ° C (deze stap is om bacteriële verstoring veroorzaken), 10 min 95 ° C (deze stap is om bacteriële verstoring veroorzaken), 35 cycli (30 seconden bij 95 ° C, 1 min bij 58 ° C en 4 min bij 72 ° C).
- Laad de PCR monsters in een 1% agarosegel met ethidiumbromide en run monsters om de fragmenten te visualiseren.
- Bereid een master mix voorraad voor alle monsters met volumes per monster zoals aangegeven, en vervolgens verdelen in PCR-buizen (9 ul / monster).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit werk beschrijft de vergelijking van de twee routes van toediening van BCG: subcutane en intranasale. Subcutane route vergelijkbaar met de intradermale, de huidige klinische route BCG wereldwijd. Intranasale weg van de vaccinatie heeft als doel om de natuurlijke route van infectie van M. na te bootsen tuberculose, met als doel immuunreactie direct in de longen te induceren, het primaire doelorgaan deze ziekteverwekker.
Figuur 1 beschrijft de workflow gevolgd. Acht tot tien weken oude vrouwelijke DBA / 2 muizen gevaccineerd met 10 6 CFU van BCG Deense langs subcutane of intranasale route van toediening. Acht weken later, wordt een groep muizen gedood long immuunrespons geïnduceerd door vaccinatie geanalyseerd. BAL monsters worden eerst verkregen en dan oogsten we longen. Met het oog op het vaccin verleende beschermende werkzaamheid te bestuderen, te enten we een different groep muizen met een lage dosis intranasale uitdaging van M. tuberculosis H37Rv stam. Een maand later, op te offeren we dieren en de oogst longen. In dat geval wordt voor elk dier gebruiken we de linkerlong bacteriële belasting en de rechter long op vaccin geïnduceerde immuunrespons na prikkeling beoordelen bepalen. Doel is bacteriologische belasting en immuunrespons gegevens longen voor elk dier genereren om potentiële correlaten van bescherming bestuderen.
Zoals getoond in figuur 2, werden longen gedissocieerd om ofwel een orgaan homogenaat of een celsuspensie te verkrijgen. Gehomogeniseerd longen werden uitgezet op vaste agar medium om bacteriële verontreiniging te bepalen vier weken na de challenge. Cellular schorsing tot vaccin geïnduceerde immuunrespons te bestuderen werd verkregen na long enzymatische afbraak met collagenase D en DNaseI.
Onze resultaten geven duidelijk aan dat, in vergelijking to subcutaan, intranasaal vaccinatieroute geeft een veel grotere beschermende werkzaamheid in longen vier weken na challenge (figuur 3A). Daarnaast hebben we bevestigd dat bacteriële belasting in longen van de intranasale BCG-vaccingroep corresponderen met H37Rv en niet BCG vaccin. Hiervoor analyseerden we een representatief aantal kolonies van deze groep specifieke PCR voor het RD9 genoomgebied, die verschillende lengte fragmenten BCG en M. amplificeert tuberculose (Figuur 3B). Duidelijk is aangetoond dat de kolonies geanalyseerd leverde een fragment van 0,4 kbp, die overeenkwam met H37Rv.
Onze gegevens bleek correlatie tussen de beschermende werkzaamheid van intranasale BCG-vaccinatie en vaccin geïnduceerde immuunrespons in de longen voorafgaand aan te vechten verleend. Intranasale BCG duidelijk hogere IL17 geactiveerd en IFNy productie longen, gemeten met ELISA (Figuur4A). Deze gegevens werden bevestigd door intracellulaire kleuring (ICS) en flowcytometrie (gegevens niet getoond). Daarnaast vonden we ook een hogere concentratie van totale en PPD-specifieke IgA concentraties in BAL monsters (figuur 4B), wat aangeeft dat pulmonale BCG vaccinatie induceert productie van IgA en translocatie ademhalingswegen.
Tenslotte onderzochten we BCG-geïnduceerde immuunrespons in de longen na challenge (figuur 5). Onze gegevens bleek verschillen IL17 en IFNy; -IL17A producerende CD4 + cellen werden pas ontdekt in de intranasale BCG-groep, terwijl IFNy-producerende cellen werden gevonden in alle groepen die besmet zijn met H37Rv, ongeacht de vaccinatie. Voorstelling van gegevens van elk dier overeenkomt met IL17-producerende cellen en bacteriële verontreiniging toonden een significante correlatie tussen de aanwezigheid van IL17 en longen bacteriële belasting verlaging, die niet werd waargenomen bij IFNy.
Figuur 1. Workflow in vergelijking intranasale en subcutane toediening van BCG-vaccinatie. Acht weken na de BCG immunisatie, een set van muizen (6 per experimentele groep) wordt gebruikt om de longen te oogsten en het uitvoeren van een BAL, en analyseren van pulmonaire immuunrespons geïnduceerd door vaccinatie. Een andere set van muizen (6 / groep), wordt geënt met een lage dosis intranasale uitdaging van M. tuberculosis H37Rv stam (100 CFU). Een maand later worden de dieren opgeofferd en bacteriële verontreiniging wordt geanalyseerd in de linker long en PPD-specifieke immuunrespons bij de rechter long. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Beschermende werkzaamheid verleend in BCG immunisatie. Groepen 6 DBA / 2 muizen werden gevaccineerd door subcutane (sc BCG), intranasale (BCG) route, of niet-gevaccineerd (Unvacc) met BCG-vaccin 10 Deense 6 CFU. Twee maanden na vaccinatie, werden muizen intranasaal geïnoculeerd met een lage dosis (100CFU) H37Rv uitdaging, en een maand later bacteriële last in de longen werd bepaald. Een representatief experiment van twee onafhankelijke weergegeven. (A) De gegevens van de grafieken worden weergegeven als gemiddelde + SD. One-way-test ANOVA met Bonferroni post-analyse werd uitgevoerd om statistische significantie te berekenen. (B) een representatief aantal afzonderlijke kolonies van de BCG intranasale groep werden geanalyseerd door PCR specifiek voor regio RD9 (anders in BCG en H37Rv genoom) te onderscheiden BCG en H37Rv kolonies. (Eerder verschenen 9). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Vaccin-specifieke Pulmonary immuunrespons geanalyseerd Voorafgaand aan Challenge met H37Rv. Groepen van 6 DBA / 2 muizen werdengevaccineerd door subcutane (BCG sc) of intranasaal (BCG) route, of niet-gevaccineerd (Unvacc) met BCG Deense vaccin 10 6 CFU. (A) in twee maanden na vaccinatie een celsuspensie van geoogste longen werd verkregen. Cellen werden gestimuleerd met PPD zoals beschreven in werkwijzen sectie en IL17A (linker paneel) en IFNy (rechter paneel) productie werden geanalyseerd door ELISA. (B) Totale IgA en M. tuberculosis (MTB) -specifieke IgA werden uit BAL monsters geanalyseerd met ELISA. Samengevoegde gegevens van twee onafhankelijke experimenten worden getoond. Gegevens in de grafieken worden weergegeven als gemiddelde + SD. (Eerder verschenen 9). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Vaccin-specifiekePulmonaire immuunrespons geanalyseerd vóór de prikkeling met H37Rv. Groepen 6 DBA / 2 muizen werden gevaccineerd door subcutane (sc BCG) of intranasaal (BCG) route, of niet-gevaccineerd (NV) met BCG-vaccin 10 Deense 6 CFU. Een controlegroep van niet-gevaccineerde, niet-geïnfecteerde muizen werd ook (NV / NI). Twee maanden na vaccinatie, werden muizen intranasaal geprikkeld met een lage H37Rv dosis (100 CFU) en één maand later werden de dieren gedood. Links en rechts longen van hetzelfde dier werden gebruikt om bacteriële verontreiniging en IL17A- (A) of IFNγ- (B) te bepalen producerende CD4 + cellen. Gegevens in linker panelen overeen met het percentage van cytokine producerende cellen gemeten door middel van flowcytometrie, en worden weergegeven als gemiddelde + SD. Rechts panelen vertegenwoordigen gegevens van bacteriële verontreiniging en cytokine-producerende CD4 + cellen verkregen voor elke muis. Lineaire regressie berekend en in elk geval verkregen p-waarde wordt bij IL17A. samengevoegdgegevens van twee onafhankelijke experimenten zijn getoond in de figuur. (Eerder verschenen 9). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Middlebrook 7H9 broth | BD | 271310 | |
| Middlebrook ADC Enrichment | BD | 211887 | |
| Tween 80 | Scharlau | TW00800250 | |
| 3-mm diameter Glass Beads | Scharlau | 038-138003 | |
| Middlebrook 7H10 Agar | BD | 262710 | |
| 1-ml syringe 26GA 0.45 x 10 mm | BD | 301358 | |
| GentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| M tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | |
| Collagenase D | Roche | 11088882001 | |
| DNaseI | Applichem | A3778,0100 | |
| Falcon 70 µm Cell Strainer | Corning | 352350 | |
| RPMI 1640 | Sigma | R0883 | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer | Sigma | R7757 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | 100x concentrated |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sigma | P4333 | 100x concentrated |
| Fetal Calf Serum | Biological Industries | 04-001-1A | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148-25ML | |
| Scepter 2.0 Handheld Automated Cell Counter | Millipore | PHCC20040 | |
| Scepter Cell Counter Sensors, 40 µm | Millipore | PHCC40050 | |
| Mycobacterium Tuberculosis - Tuberculin PPD | Statens Serum Institut (SSI) | 2390 | |
| Mouse IFN-γ ELISA development kit | Mabtech | 3321-1H | |
| Mouse IL17A ELISA development kit | Mabtech | 3521-1H | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD4 | BD | 553047 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Kit | BD | 555028 | |
| APC-Cy7 Rat Anti-mouse IL-17A | BD | 560821 | |
| APC Mouse Anti-mouse IFNg | BD | 554413 | |
| LACHRYMAL OLIVE LUER LOCK 0.60 x 30 mm. 23G x 1 1/4” | UNIMED | 27.134 | Used as trachea cannula for BAL |
| high-protein binding polystyrene flat-bottom 96-well plates MAXISORP | NUNC | 430341 | |
| Albumin, from bovine serum | Sigma | A4503 | |
| Goat Anti-Mouse IgA (α-chain specific)−Peroxidase antibody | Sigma | A4789 | |
| 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) | Sigma | T0440 | |
| MyTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21107 | The kit Includes Buffer 5x |
References
- Zumla, A., et al. The WHO 2014 global tuberculosis report--further to go. Lancet Glob Health. 3 (1), e10-e12 (2015).
- Mangtani, P., et al. Protection by BCG vaccine against tuberculosis: a systematic review of randomized controlled trials. Clin Infect Dis. 58 (4), 470-480 (2014).
- Aguilo, N., et al. Pulmonary Mycobacterium bovis BCG vaccination confers dose-dependent superior protection compared to that of subcutaneous vaccination. Clin Vaccine Immunol. 21 (4), 594-597 (2014).
- Chen, L., Wang, J., Zganiacz, A., Xing, Z. Single intranasal mucosal Mycobacterium bovis BCG vaccination confers improved protection compared to subcutaneous vaccination against pulmonary tuberculosis. Infect Immun. 72 (1), 238-246 (2004).
- Giri, P. K., Verma, I., Khuller, G. K. Protective efficacy of intranasal vaccination with Mycobacterium bovis BCG against airway Mycobacterium tuberculosis challenge in mice. J Infect. 53 (5), 350-356 (2006).
- Lagranderie, M., et al. BCG-induced protection in guinea pigs vaccinated and challenged via the respiratory route. Tuber Lung Dis. 74 (1), 38-46 (1993).
- Gopal, R., et al. Interleukin-17-dependent CXCL13 mediates mucosal vaccine-induced immunity against tuberculosis. Mucosal Immunol. 6 (5), 972-984 (2013).
- Khader, S. A., et al. IL-23 and IL-17 in the establishment of protective pulmonary CD4+ T cell responses after vaccination and during Mycobacterium tuberculosis challenge. Nat Immunol. 8 (4), 369-377 (2007).
- Aguilo, N., et al. Pulmonary but Not Subcutaneous Delivery of BCG Vaccine Confers Protection to Tuberculosis-Susceptible Mice by an Interleukin 17-Dependent Mechanism. J Infect Dis. , (2015).
- Middlebrook, G., Cohn, M. L. Bacteriology of tuberculosis: laboratory methods. Am J Public Health Nations Health. 48 (7), 844-853 (1958).
- Brosch, R., et al. A new evolutionary scenario for the Mycobacterium tuberculosis complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (6), 3684-3689 (2002).
- Kaushal, D., et al. Mucosal vaccination with attenuated Mycobacterium tuberculosis induces strong central memory responses and protects against tuberculosis. Nat Commun. 6, 8533 (2015).
- Lochhead, J. J., Thorne, R. G. Intranasal delivery of biologics to the central nervous system. Adv Drug Deliv Rev. 64 (7), 614-628 (2012).
- Lochhead, J. J., Wolak, D. J., Pizzo, M. E., Thorne, R. G. Rapid transport within cerebral perivascular spaces underlies widespread tracer distribution in the brain after intranasal administration. J Cereb Blood Flow Metab. 35 (3), 371-381 (2015).
- Griffiths, K. L., et al. Cholera toxin enhances vaccine-induced protection against Mycobacterium tuberculosis challenge in mice. PLoS One. 8 (10), e78312 (2013).
- Hirota, K., et al. Plasticity of Th17 cells in Peyer's patches is responsible for the induction of T cell-dependent IgA responses. Nat Immunol. 14 (4), 372-379 (2013).
- Jaffar, Z., Ferrini, M. E., Herritt, L. A., Roberts, K. Cutting edge: lung mucosal Th17-mediated responses induce polymeric Ig receptor expression by the airway epithelium and elevate secretory IgA levels. J Immunol. 182 (8), 4507-4511 (2009).
