Introduction
A tuberculose (TB) é uma das doenças infecciosas, causador de mortes associadas mais do que o HIV no mundo e combinada com o aumento do crescimento de estirpes resistentes a múltiplos fármacos torna a TB um problema de saúde mundial alarmante 1. Novas ferramentas de diagnóstico, drogas mais eficazes e menos tóxicos, e novas vacinas contra a tuberculose seguros e eficazes são uma necessidade urgente, especialmente nos países em desenvolvimento.
Vivo atenuado Bacilo de Calmette-Guerin (BCG) é atualmente a única vacina licenciada contra a tuberculose, que foi administrado por via intradérmica no nascimento desde 1970 em todo o mundo. BCG é considerada eficaz na prevenção de formas graves da doença (meningite e TB miliar) em crianças, mas tem demonstrado eficácia inconsistente contra a TB pulmonar responsável da transmissão da doença 2.
vacinação pulmonar, que imita via natural de infecção por tuberculose, representa uma abordagem atraente para o priming resposta imune host locals. A este respeito, vários trabalhos pré-clínicos em diferentes modelos animais relevantes de TB demonstram maior eficácia da vacina após imunização pulmonar, em comparação com a via subcutânea ou intradérmica rota 3-6. No entanto, os mecanismos de protecção activadas por vacinação pulmonar não são bem compreendidos. Nos últimos anos, vários trabalhos têm apontado para resposta mediada por IL17 como um fator importante da resposta imune da mucosa específicos de TB, como em modelos de ratos deficientes em IL17 eficácia protetora induzida pela vacina da mucosa é prejudicada 7,8.
Recentemente, demonstrou pela primeira vez que intranasal administração BCG protegido ratinhos DBA / 2, uma cepa de rato caracteriza-se pela falta de proteção após a BCG subcutânea imunização 9. Estes resultados sugerem que a vacinação TB respiratória poderia ser mais eficaz na redução da taxa de TB em países endêmicos, onde BCG intradérmica é considerado ineficaz contra pulmonTB ary.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os ratinhos foram mantidos sob condições controladas e observados quanto a quaisquer sinais de doença. O trabalho experimental foi realizado de acordo com as directivas europeias e nacionais para a protecção dos animais experimentais e com a aprovação dos comités de ética locais competentes.
1. Preparação de Stocks quantificada glicerol de BCG dinamarquesa e H37Rv Mycobacterium tuberculosis
Nota: Todos os protocolos descritos foram realizadas em condições BSL3.
- Estoques de glicerol congelado descongelar BCG Danish ou estirpes H37Rv e inocular 100 ul em 10 ml de meio 7H9 10 suplementado com Tween-80 0,05% (v / v) e ADC (albumina, dextrose, catalase) 10% (v / v).
- Incubar sob condições estáticas durante uma semana a 37 ° C até a cultura está em crescimento de fase log.
- Dimensionar-se a cultura bacteriana por transferência da cultura de 10 ml a 200 ml de meio fresco. Incubar por 20 adicionaldias, em condições estáticas.
- Transferir para tubos de centrífuga de 50 ml e centrifugar durante 15 min a 2500 x g.
- Rejeitar sobrenadante e ressuspender sedimento bacteriano no volume residual. Adicionar a cada tubo de esferas de vidro de 3 mm de diâmetro estéreis (10 - 15) por tubo.
- Vortex vigorosamente durante 1 min, a fim de dissociar aglomerados de bactérias. Ressuspender cada pellet em 10 ml de PBS com Tween-80 a 0,05% (v / v).
- Deixar os tubos durante 10 minutos permitindo que os maiores agregados bacterianos e contas de vidro para se estabelecer.
- Recuperar 9,5 ml de sobrenadante a partir de cada um dos 4 tubos contendo pequenos aglomerados e bactérias individuais e volumes de transferência para um único tubo de centrífuga de 50 ml fresco (volume recuperado final de 38 ml). Centrifugar durante 10 minutos a 400 x g.
- Recuperar 35 ml de sobrenadante (contendo as bactérias, principalmente simples) num tubo de centrífuga de 50 mL fresco e adicionar 15 ml de PBS com glicerol a 50% (v / v), obtendo-se uma concentração de glicerol final de 15% (v / v).
- misture delicadamentee distribuir-se em alíquotas de 1 ml em tubos apropriados para congelação. Armazenar a -80 ° C (um lote fornece cerca de 50 alíquotas de stock de glicerol).
- Para quantificar os estoques de glicerol, glicerol a descongelar um dia após a congelação e executar sete diluições em série de dez vezes em tubos de 1,5 ml contendo 900 ul separadas de PBS.
- Placa de 100 ul de cada diluição em meio sólido 7H10 agar-10 suplementado com ADC a 10% (v / v) preparados em placas de Petri de diâmetro de 55 mm.
- Adicionar cuidadosamente 3 mm de diâmetro contas de vidro (aprox. 10 por placa) e agitar suavemente placa para distribuir igualmente o volume sobre a placa de ágar. Descarte pérolas e selar placa de ágar com parafilme.
- Incubar durante 21 dias a 37 ° C e determinar a concentração bacteriana por contagem de unidades formadoras de colónias (CFU) nas diluições onde as colónias individuais podem ser distinguidos com precisão.
2. Rato Vacinação
- Descongelar um glicerol pré-quantificadas BCG e diluir em PBS para prepsão duas suspensões. Calcular o volume final, considerando a dose por animal é de 100 ul para a administração subcutânea (10 7 CFU por ml para vacinação por via subcutânea) e de 40 ul para a administração intranasal (2,5 x 10 7 UFC de vacinação intranasal).
- Use uma estação de trabalho de anestesia especializada para roedores para anestesiar os ratos com uma mistura de isoflurano e oxigênio. Use isoflurano a 5% para induzir a anestesia e 2% para manter os ratos na câmara de anestesia. (Outro método de anestesia aceite pode ser usado).
- Para a administração subcutânea de vacina encher uma seringa de 1 ml com uma agulha de 26 G com 1 ml de suspensão bacteriana (10 7 CFU / ml). Remover bolhas de ar.
- Coloque um rato anestesiado numa superfície plana na posição de bruços no interior de uma câmara de fluxo laminar e inocular subcutaneamente 100 ul (10 6 CFU / dose) de vacina num flanco do rato para trás. Devolver o mouse para a gaiola e monitorá-lo para garantir que ele PROPErly recupera da anestesia.
- Mudar a agulha da seringa entre cada administração mouse. Removido bolhas de ar, como descrito acima.
- Para administração intranasal, coloque um rato anestesiado em decúbito dorsal no interior do exaustor.
- Com uma micropipeta ter 20 ul da suspensão com 2,5 x 10 7 CFU / mL. Coloque a gota-a-gota de inóculo entre as duas narinas até que todo o volume foi depositado, deixando tempo entre gotas para permitir que o mouse respirar o volume. Nota: os ratos podem sofrer de desconforto respiratório durante este procedimento para que eles devem ser deixadas para assimilar cada gota antes de administrar a próxima para evitar tanto quanto possível.
- Voltar a encher a micropipeta com uma outra 20 ul e repetir a operação. Se o rato começa a acordar da anestesia após a primeira inoculação, colocá-lo na câmara de anestesia antes da segunda. Devolver o mouse para a gaiola e garantir que ele corretamente recuperada anestesia.
3. Rato intranasal Desafio com H37Rv Strain
- Descongelar uma pré-glicerol quantificada H37Rv e dilua em PBS para preparar uma suspensão de bactérias de 2500 CFU por ml. Calcule volume final considerando a dose por animal é de 40 mL.
- H37Rv é inoculado por via intranasal, tal como descrito em 2,5-2,7. Dose de desafio final por ratinho é de 10 2 UFC / 40 mL.
4. Análise do induzida resposta imune nos pulmões
- Lung suspensão celular
NOTA: Avaliação da resposta imune adaptativa induzida pela vacina em pulmões requer a geração de suspensão de células individuais. Para este fim, usamos um Dissociator tecido tais como gentleMACS.- Sacrificar o mouse por deslocamento cervical (ou outra metodologia humana aceita) e garantir o rato está morto tocar o globo ocular para confirmar ausência de reflexo de piscar.
- Dentro de uma capela de fluxo laminar, extrair o lUNGS usando tesouras e pinças esterilizadas e coloque-os em uma superfície limpa. pulmões limpas retirando da traqueia e do tecido conjuntivo, e transferir os pulmões para um tubo de 1,5 ml com PBS (manter em gelo até que o processamento).
- Para gerar uma suspensão celular, colocar os pulmões em um tubo adequado para a dissociação do órgão (tubo de C-Dissociator) contendo 5 ml de HEPES-NaOH 10 mM pH 7,4, 150 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1 mM de MgCl2 e 1,8 mM de CaCl2 amortecedor.
- Adicionar 100 ul de colagenase D 100 mg / ml (2 mg / ml de concentração final), e 40 ul de ADNase I 20000 IU / ml (160 UI / ml de concentração final.
NOTA: As soluções-mãe de colagenase D ou ADNasel são preparados dissolvendo enzimas liofilizadas em PBS ou glicerol 50% (v / v), Tris-HCl 20 mM pH 7,5 y MgCl2 1 mM, respectivamente. - Colocar o tubo em a Dissociator tecido e usar o m_lung_01 programa predefinido para a fragmentação do pulmão. Incubar o tubo a 37 ° C num banho de água durante 30 min.
- º lugare tubo no Dissociator e usar o m_lung_02 programa predefinido para homogeneização completa do pulmão em suspensão celular única.
- Passar a suspensão celular através de um coador de células de nylon de 70 ^ M equipado com um tubo de centrífuga de 50 ml. Lavar o filtro com 10 ml de meio RPMI 1640.
- centrifugar células durante 5 minutos a 400 xg e elimine o sobrenadante.
- Adicionar 1 ml de tampão de lise de eritrócitos, misturar em vortex e incubar durante 1 minuto à temperatura ambiente.
- Adicionam-se 10 ml de meio RPMI 1640 células médias e centrifugar durante 5 minutos a 400 x g.
- Ressuspender as células em 0,5 ml de meio completo de RPMI 1640 suplementado com-inactivado pelo calor 10% de Soro Fetal Bovino (FCS), 2 mM de L-glutamina, 100 ug / ml de estreptomicina, 100 IU / ml de penicilina e 50 ^ M de 2-mercaptoetanol.
NOTA: FCS é inactivada por incubação a 56 ° C durante 30 minutos. - Contar as células e adicionar RPMI completo 1640 para alcançar a densidade celular final de 10 7 células / ml.
NOTA: Para contagem de células, usamos o contador de células automatizado. - Distribuir 100 ul de suspensão celular em placas de 96 poços de fundo em U estéril (10 6 células / poço).
- Adicionar 50 ul / poço de meio completo de RPMI 1640 com 15 ug / ml de H37Rv comercial derivado de proteína purificada (PPD) (5 ug / ml de concentração final).
- Recolha de sobrenadante para a determinação da citoquina por ELISA
- Incubar a placa a partir de 4.1.14 durante 48 horas a 37 ° C e 5% de CO 2.
- placa Centrifugar durante 5 minutos a 400 xg e recuperar 100 ul de sobrenadante.
- Armazenar a -80 ° C.
- Dilui-se sobrenadantes de 1/10 e 1/2 no tampão de ensaio para determinação de IFN-y e IL17A, respectivamente. Determinar a concentração de citocinas com kits comerciais de ELISA, de acordo com as instruções do fabricante (kits de desenvolvimento de ELISA).
- Coloração intracelular para a determinação da citoquina-producing células CD4 + através de citometria de fluxo
- Incubar a placa a partir de 4.1.14, durante 18 h a 37 ° C e 5% de CO 2.
- Adicionar 1,5 uL de Brefeldina A 1 mg / ml (estoque dissolvido em DMSO) a cada (concentração final 10 ug / mL) bem e incubar durante seis horas adicionais.
- Centrifugar a placa a partir de 4.3.2, durante 1 min a 3200 xg e descartar o sobrenadante.
- Ressuspender as células em 50 ul de anti-rato CD4-FITC diluído em meio RPMI 1640 com FCS a 10% (1/500) e incubar durante 10 min a 4 ° C.
- Centrifugar a placa a partir de 4.3.4, durante 1 min a 3200 xg, descartar o sobrenadante e adicionar / poço de solução de fixação 100 ul. Incubar a 4 ° C durante 20 min.
- Lave as células duas vezes com 150 mL / lavagem de solução de permeabilização.
NOTA: 10x Estoque concentrado é diluído em água desionizada para preparar a solução de trabalho 1x. - Ressuspender as células em 50 ul de anti-ratinho de IFN-y-APC e anti-rato IL17A-APC.Cy7 diluído em permeabilsolução ização (1/250 ambos os anticorpos).
- Incubar durante 1 h à TA.
- Lave as células duas vezes com 150 mL / lavagem de solução de permeabilização.
- Ressuspender as células em 200 ul de PBS para aquisição de citometria de fluxo.
5. Análise das imunoglobulinas em Lavagem Broncoalveolar (BAL)
- Obtenção de amostras de LBA
- Sacrificar o mouse por deslocamento cervical (ou outra metodologia humana aceita) e garantir o rato está morto tocar o globo ocular para confirmar ausência de reflexo de piscar.
- Expor a traquéia usando adequada precisão pinça e tesouras estéreis e realizar um pequeno corte na traqueia, certificando-se de não extirpar completamente. Tome cuidado para não causar sangramento que poderia contaminar amostras BAL.
- Introduzir na traqueia uma cânula ligada a uma seringa esterilizada de 1 ml com 800 ul de PBS gelado.
- Inocular lentamente o PBS nos pulmões e, em seguida, recover volume de BAL puxando para trás do êmbolo da seringa muito lentamente, a fim de evitar o colapso do pulmão.
NOTA: Recuperação de 500 a 600 ul é satisfatória. - Transferir o volume BAL em um tubo de 1,5 ml e confirmar BAL permanece incolor, indicando que não está contaminada com sangue (manter em gelo até que o processamento).
- Centrifugar as amostras BAL durante 5 minutos a 400 xg, e transferência de sobrenadante para um novo tubo.
- sobrenadantes armazenar a -80 ° C.
- Determinação dos níveis de IgA em LBA sobrenadantes
NOTA: Todos os reagentes utilizados são à temperatura ambiente.- Revestimento de poliestireno de ligação elevada de proteínas de fundo plano de placas de 96 poços com 100 ul de PPD diluído em PBS (10 ug / ml) para M. tuberculose determinação IgA -específica, ou com 100 uL de sobrenadante BAL diluídas 10 vezes em PBS para determinação de IgA total.
- Incubar durante a noite a 4 ° C.
- Elimine o sobrenadante e toque a placa em papel toalha para dry. Lava-se com 200 ul / poço de PBS.
- Bloquear com 200 ul / poço de albumina de soro bovino (BSA) a 1% (w / v) em PBS-Tween-80 0,05% (v / v) (tampão de bloqueio).
- Incubar 1 hora à TA.
- Lavar uma vez com 200 ul / poço de PBS-Tween-80 0,05% (v / v) (tampão de lavagem).
- Adiciona-se 100 ul de sobrenadante BAL não diluído nos poços de PPD-revestidos. Incubar duas horas à temperatura ambiente.
NOTA: Se a determinação de IgA total é feita em paralelo com o PPD-específico IgA, IgA totais deixar poços com tampão de lavagem de 100 ul durante esta incubação. - Lavar três vezes com 200 ul / poço de lavagem buffer.0170004
- Adicionar 100 ul de peroxidase de rábano (HRP) -conjugated IgA anti-rato diluído em tampão (1 / 10.000) de bloqueio.
- Incubar 1 hora temperatura ambiente.
- Lavar cinco vezes com 200 ul / poço de tampão de lavagem.
- Adicionam-se 100 ul / poço de 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB). Incubar 20 minutos à temperatura ambiente em tele escuro.
- Adicionam-se 100 ul / cavidade de H 2 SO 4 0,5 N. Ler a placa num espectrofotómetro a um comprimento de onda de 450 nm.
6. determinação da carga bacteriana nos pulmões
- Lung homogeneização e chapeamento
- Quatro semanas após o desafio, sacrificar o mouse por deslocamento cervical (ou outra metodologia humana aceita) e garantir o rato está morto tocar o globo ocular para confirmar ausência de reflexo de piscar.
- Colocar o rato na posição supina fixo sobre uma superfície plana e desinfectados, dentro de uma câmara de fluxo laminar.
- Faça uma incisão e remover a pele da região torácica para deixar visível a área torácica.
- Cortar as costelas e colher os pulmões eo coração, usando tesouras e pinças esterilizadas. Coloque órgãos sobre uma superfície limpa.
- Limpar os pulmões através da remoção do coração, da traqueia e do tecido conjuntivo e transferir os pulmões para um tubo de 1,5 ml com 1 ml de água desionizada(Manter em gelo até o processamento).
- Utilize uma pinça estéril para transferir os pulmões de cada rato para um tubo de órgão adequada para homogeneização (H - Dissociator tubo), contendo 1 ml de água desionizada.
- Colocar o tubo em a Dissociator tecido e usar o RNA_1 programa pré-definido de forma a homogeneizar os pulmões.
- Adicione cinco diluições em série de dez vezes em tubos de 1,5 ml, começando com 100 ul de homogenato de pulmão diluído em 900 ul.
- diluições em placa conforme descrito no 1,11-1,14.
- A diferenciação entre BCG e H37Rv por PCR
Nota: Nas placas de 6.1.6 correspondentes para o grupo vacinado com a vacina BCG por via intranasal, analisou-se um número representativo de colónias por um PCR discernir entre BCG e H37Rv para assegurar que o CFU considerado para avaliar a eficácia de protecção conferido pela vacina correspondeu exclusivamente para H37Rv. Esta amplificação por PCR de alvos RD9, uma região genómica diferente em BCG e M. TUberculosis, dando um fragmento de 2618 pb para H37Rv e 465 pb para BCG 11.- Prepare um estoque mestre mix para todas as amostras com volumes por amostra como indicado, e depois distribuir em tubos de PCR (9 l / amostra).
NOTA: Tampão de 5x: 2 ul. Iniciador directo 25 mM (GTGTAGGTCAGCCCCATCC): 0,32 mL, o iniciador inverso 25 mM (GCCCAACAGCTCGACATC): 0,32 ml, Taq polimerase 5 unidades / ul: 0,04 mL, desionizada H2O: 6,32 mL. - Toque em uma colônia com um palito estéril e mergulhe o palito com a amostra num tubo de PCR contendo a mistura principal.
- Executar a PCR com o seguinte programa: 10 min 95 ° C (este passo é o de provocar perturbações bacteriana), 10 min 95 ° C (este passo é o de provocar perturbações bacteriana), 35 ciclos (30 segundos a 95 ° C, 1 min a 58 ° C e 4 min a 72 ° C).
- Coloque as amostras de PCR num gel de agarose a 1% com amostras de brometo de etídio e correr para visualizar os fragmentos.
- Prepare um estoque mestre mix para todas as amostras com volumes por amostra como indicado, e depois distribuir em tubos de PCR (9 l / amostra).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Este trabalho descreve a comparação de duas vias de administração de BCG: subcutânea e intranasal. via subcutânea é comparável à intradérmica, que é a via clínica corrente de BCG em todo o mundo. Via intranasal de vacinação destina-se a imitar a via natural de infecção de M. tuberculose, com o objetivo de induzir resposta imune diretamente nos pulmões, o principal órgão alvo deste patógeno.
A Figura 1 descreve o fluxo de trabalho seguido. Oito a fêmea DBA 10 semanas de idade / 2 ratos são vacinados com 10 6 CFU de BCG Danish por via subcutânea ou de administração intranasal. Oito semanas mais tarde, um grupo de ratinhos foi sacrificado para analisar pulmão resposta imunitária induzida por vacinação. amostras de LBA são primeiro obtidas e, em seguida, colhemos pulmões. A fim de estudar a eficácia protetora conferida pela vacina, nós inocular um differeNT grupo de ratinhos com um desafio intranasal de uma dose baixa de M. tuberculosis H37Rv. Um mês mais tarde, nós sacrificar animais e pulmões colheita. Neste caso, para cada animal que use o pulmão esquerdo para determinar a carga bacteriana e o pulmão direito de avaliar induzida pela vacina resposta imune pós-desafio. O objectivo é o de gerar a carga bacteriana e dados de respostas imunes em pulmões de cada animal, a fim de estudar potenciais indicadores de protecção.
Como mostrado na Figura 2, os pulmões foram dissociadas para obter tanto um homogenato de órgão ou de uma suspensão celular. pulmões homogeneizados foram plaqueadas em meio de agar sólido para determinar a carga bacteriana quatro semanas pós-desafio. suspensão celular para estudar a resposta imune induzida pela vacina foi obtido após pulmão digestão enzimática com colagenase D e DNaseI.
Os nossos resultados indicam claramente que, quando comparado tO a via subcutânea, a via intranasal de uma vacina confere protecção muito maior eficácia em pulmões de quatro semanas após a provocação (Figura 3A). Além disso, constatou-se que a carga bacteriana nos pulmões do grupo BCG-vacina intranasal correspondem à H37Rv e não a vacina BCG. Para este fim, analisamos um número representativo de colônias deste grupo por PCR específica para a região do genoma do RD9, que amplifica diferentes fragmentos de comprimento em BCG e M. tuberculose (Figura 3B). Figura mostrou claramente que todas as colónias analisadas proporcionado um fragmento de 0,4 kpb, o que correspondeu a H37Rv.
Nossos dados revelaram uma correlação entre a eficácia protectora conferida por intranasal vacina BCG e da resposta imune induzida pela vacina nos pulmões antes do desafio. Intranasal BCG desencadeada claramente superior IL17 e produção de IFNy nos pulmões, medida através de ELISA (Figura4A). Estes dados foram confirmados por coloração intracelular (ICS) e citometria de fluxo (dados não apresentados). Além disso, encontramos também uma maior concentração de ambos concentração total e específica do PPD IgA em amostras de LBA (Figura 4B), indicando que a vacinação BCG pulmonar induz a produção de IgA e translocação para vias respiratórias.
Finalmente, estudou-se a resposta imune induzida por BCG nos pulmões após desafio (Figura 5). Nossos dados revelaram diferenças entre IL17 e IFN-y; As células CD4 + produtoras de IL17A foram detectadas apenas no grupo BCG intranasal, enquanto que as células produtoras de IFNy foram encontrados em todos os grupos infectados com H37Rv, independentemente da vacinação. Representação de dados de cada animal que corresponde a células produtoras de IL17 e carga bacteriana mostrou uma correlação significativa entre a presença de IL17 e redução da carga bacteriana do pulmão, o que não foi observado no caso de IFN-y.
Figura 1. Fluxo de trabalho para comparação intranasal e subcutânea Via de Vacina BCG. Oito semanas após a vacina BCG, um conjunto de ratos (6 por grupo experimental) é usado para colher os pulmões e realizar uma BAL, e analisar a resposta imune pulmonar induzida pela vacinação. Outro conjunto de ratinhos (6 / grupo), é inoculado com um desafio intranasal de uma dose baixa de M. tuberculosis estirpe H37Rv (100 CFU). Um mês mais tarde, os animais são sacrificados e carga bacteriana é analisada no pulmão esquerdo e resposta imune específica PPD-no pulmão direito. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Protecção eficácia conferida pelo BCG Imunização. Grupos de 6 ratinhos DBA / 2 foram vacinados pela via subcutânea (BCG sc), intranasal (BCG in) rota, ou não-vacinados (Unvacc) com a vacina BCG dinamarquesa 10 6 UFC. Ao fim de dois meses após a vacinação, os ratinhos foram inoculados intranasalmente com uma dose baixa (100foi determinada CFU) desafio H37Rv, e um mês mais tarde carga bacteriana nos pulmões. A experiência representativa de dois independentes é mostrada. (A) de dados nos gráficos são representados como média + SD. Foi realizada One-way ANOVA com análise post Bonferroni para calcular a significância estatística. (B) Um número representativo de colónias individuais do grupo intranasal BCG foram analisados por PCR específica para a região RD9 (diferente em BCG e H37Rv genomas) para discernir BCG e colónias H37Rv. (Anteriormente publicado 9). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Vacina-específica Pulmonar resposta imune analisados antes de desafio com H37Rv. Grupos de seis ratinhos DBA / 2 foramvacinadas pela via subcutânea (BCG sc) ou intranasal (BCG in) rota, ou não-vacinados (Unvacc) com a vacina BCG dinamarquesa 10 6 UFC. (A) Em dois meses após a vacinação, foi obtida uma suspensão celular a partir de pulmões colhidas. As células foram estimuladas com PPD, como descrito na secção de métodos e IL17A (painel da esquerda) e IFN-y (painel da direita) de produção foram analisados por ELISA. (B) de IgA total, e M. tuberculosis (MTB) IgA espec�ico foram analisados a partir de amostras de LBA por ELISA. Os dados recolhidos de dois experimentos independentes são mostrados. Os dados nos gráficos são representados como média + SD. (Anteriormente publicado 9). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Vacina-específicaResposta Imunológica pulmonar analisados antes do desafio com H37Rv. Grupos de 6 ratinhos DBA / 2 foram vacinados pela via subcutânea (BCG sc) ou intranasal (BCG in) rota, ou não-vacinados (NV) com a vacina BCG dinamarquesa 10 6 UFC. Um grupo de ratinhos não vacinados, de controlo não infectado foi também incluído (NV / NI). Ao fim de dois meses após a vacinação, os ratinhos foram desafiados intranasalmente com uma dose baixa de H37Rv (100 CFU), e um mês mais tarde os animais foram sacrificados. À esquerda e pulmões direito do mesmo animal foram usadas para determinar a carga bacteriana e IL17A- (A) ou IFNγ- (B) produzir células CD4 +, respectivamente. Dados em painéis da esquerda correspondem a percentagem de células produtoras de citocinas medida por citometria de fluxo, e são representados como média + SD. painéis da direita representam os dados de carga bacteriana e citoquinas produzir células CD4 + obtidos para cada ratinho. A regressão linear foi calculada e o valor p obtido em cada caso é mostrada, no caso de IL17A. agrupadadados de duas experiências independentes são apresentados na figura. (Anteriormente publicado 9). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Middlebrook 7H9 broth | BD | 271310 | |
| Middlebrook ADC Enrichment | BD | 211887 | |
| Tween 80 | Scharlau | TW00800250 | |
| 3-mm diameter Glass Beads | Scharlau | 038-138003 | |
| Middlebrook 7H10 Agar | BD | 262710 | |
| 1-ml syringe 26GA 0.45 x 10 mm | BD | 301358 | |
| GentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| M tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | |
| Collagenase D | Roche | 11088882001 | |
| DNaseI | Applichem | A3778,0100 | |
| Falcon 70 µm Cell Strainer | Corning | 352350 | |
| RPMI 1640 | Sigma | R0883 | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer | Sigma | R7757 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | 100x concentrated |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sigma | P4333 | 100x concentrated |
| Fetal Calf Serum | Biological Industries | 04-001-1A | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148-25ML | |
| Scepter 2.0 Handheld Automated Cell Counter | Millipore | PHCC20040 | |
| Scepter Cell Counter Sensors, 40 µm | Millipore | PHCC40050 | |
| Mycobacterium Tuberculosis - Tuberculin PPD | Statens Serum Institut (SSI) | 2390 | |
| Mouse IFN-γ ELISA development kit | Mabtech | 3321-1H | |
| Mouse IL17A ELISA development kit | Mabtech | 3521-1H | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD4 | BD | 553047 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Kit | BD | 555028 | |
| APC-Cy7 Rat Anti-mouse IL-17A | BD | 560821 | |
| APC Mouse Anti-mouse IFNg | BD | 554413 | |
| LACHRYMAL OLIVE LUER LOCK 0.60 x 30 mm. 23G x 1 1/4” | UNIMED | 27.134 | Used as trachea cannula for BAL |
| high-protein binding polystyrene flat-bottom 96-well plates MAXISORP | NUNC | 430341 | |
| Albumin, from bovine serum | Sigma | A4503 | |
| Goat Anti-Mouse IgA (α-chain specific)−Peroxidase antibody | Sigma | A4789 | |
| 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) | Sigma | T0440 | |
| MyTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21107 | The kit Includes Buffer 5x |
References
- Zumla, A., et al. The WHO 2014 global tuberculosis report--further to go. Lancet Glob Health. 3 (1), e10-e12 (2015).
- Mangtani, P., et al. Protection by BCG vaccine against tuberculosis: a systematic review of randomized controlled trials. Clin Infect Dis. 58 (4), 470-480 (2014).
- Aguilo, N., et al. Pulmonary Mycobacterium bovis BCG vaccination confers dose-dependent superior protection compared to that of subcutaneous vaccination. Clin Vaccine Immunol. 21 (4), 594-597 (2014).
- Chen, L., Wang, J., Zganiacz, A., Xing, Z. Single intranasal mucosal Mycobacterium bovis BCG vaccination confers improved protection compared to subcutaneous vaccination against pulmonary tuberculosis. Infect Immun. 72 (1), 238-246 (2004).
- Giri, P. K., Verma, I., Khuller, G. K. Protective efficacy of intranasal vaccination with Mycobacterium bovis BCG against airway Mycobacterium tuberculosis challenge in mice. J Infect. 53 (5), 350-356 (2006).
- Lagranderie, M., et al. BCG-induced protection in guinea pigs vaccinated and challenged via the respiratory route. Tuber Lung Dis. 74 (1), 38-46 (1993).
- Gopal, R., et al. Interleukin-17-dependent CXCL13 mediates mucosal vaccine-induced immunity against tuberculosis. Mucosal Immunol. 6 (5), 972-984 (2013).
- Khader, S. A., et al. IL-23 and IL-17 in the establishment of protective pulmonary CD4+ T cell responses after vaccination and during Mycobacterium tuberculosis challenge. Nat Immunol. 8 (4), 369-377 (2007).
- Aguilo, N., et al. Pulmonary but Not Subcutaneous Delivery of BCG Vaccine Confers Protection to Tuberculosis-Susceptible Mice by an Interleukin 17-Dependent Mechanism. J Infect Dis. , (2015).
- Middlebrook, G., Cohn, M. L. Bacteriology of tuberculosis: laboratory methods. Am J Public Health Nations Health. 48 (7), 844-853 (1958).
- Brosch, R., et al. A new evolutionary scenario for the Mycobacterium tuberculosis complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (6), 3684-3689 (2002).
- Kaushal, D., et al. Mucosal vaccination with attenuated Mycobacterium tuberculosis induces strong central memory responses and protects against tuberculosis. Nat Commun. 6, 8533 (2015).
- Lochhead, J. J., Thorne, R. G. Intranasal delivery of biologics to the central nervous system. Adv Drug Deliv Rev. 64 (7), 614-628 (2012).
- Lochhead, J. J., Wolak, D. J., Pizzo, M. E., Thorne, R. G. Rapid transport within cerebral perivascular spaces underlies widespread tracer distribution in the brain after intranasal administration. J Cereb Blood Flow Metab. 35 (3), 371-381 (2015).
- Griffiths, K. L., et al. Cholera toxin enhances vaccine-induced protection against Mycobacterium tuberculosis challenge in mice. PLoS One. 8 (10), e78312 (2013).
- Hirota, K., et al. Plasticity of Th17 cells in Peyer's patches is responsible for the induction of T cell-dependent IgA responses. Nat Immunol. 14 (4), 372-379 (2013).
- Jaffar, Z., Ferrini, M. E., Herritt, L. A., Roberts, K. Cutting edge: lung mucosal Th17-mediated responses induce polymeric Ig receptor expression by the airway epithelium and elevate secretory IgA levels. J Immunol. 182 (8), 4507-4511 (2009).
