Introduction
La tuberculosis (TB) es una de las principales enfermedades infecciosas que causan más muertes asociadas que el VIH en el mundo y unida a la creciente aumento de cepas resistentes a múltiples fármacos TB hace un problema de salud mundial alarmante 1. Las nuevas herramientas de diagnóstico, medicamentos más eficaces y menos tóxicos, y nuevas vacunas contra la tuberculosis seguros y eficaces son una necesidad urgente, especialmente en el mundo en desarrollo.
En vivo atenuado bacilo de Calmette-Guerin (BCG) es actualmente la única vacuna autorizada contra la tuberculosis, que ha sido administrada por vía intradérmica en el nacimiento desde 1970 en todo el mundo. BCG se considera eficaz en la prevención de las formas graves de la enfermedad (meningitis y tuberculosis miliar) en niños, pero ha demostrado eficacia contra la TB pulmonar incompatible responsable de la transmisión de la enfermedad 2.
la vacunación pulmonar, que imita ruta natural de la infección tuberculosa, representa un enfoque atractivo para la imprimación de la respuesta inmune anfitrión locals. En este sentido, varios trabajos preclínicos en diferentes modelos animales pertinentes TB han demostrado una mayor eficacia de la vacuna después de la inmunización pulmonar en comparación con la vía subcutánea o intradérmica 3-6. Sin embargo, los mecanismos de protección provocados por la vacunación pulmonar no se conocen bien. En los últimos años, varios trabajos han señalado hacia respuesta mediada por IL17 como un factor importante de la respuesta inmune de la mucosa-TB específica, como en modelos de ratones deficientes para IL17 eficacia protectora inducida por la vacuna de la mucosa se vea obstaculizada 7,8.
Recientemente hemos demostrado por primera vez que la administración intranasal BCG protege ratones DBA / 2, una cepa de ratones que se caracteriza por la falta de protección después de la vacunación con BCG subcutáneo 9. Estos resultados sugieren que la vacunación contra la tuberculosis respiratoria podría ser más eficaz en la reducción de la tasa de tuberculosis en los países endémicos, donde se considera ineficaz contra pulmon BCG intradérmicaTB aria.
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Protocol
Todos los ratones se mantuvieron bajo condiciones controladas y se observó ningún signo de enfermedad. El trabajo experimental se llevó a cabo de acuerdo con las directivas europeas y nacionales para la protección de los animales de experimentación y con la aprobación de los comités de ética locales competentes.
1. Preparación de las poblaciones cuantificado de glicerol de BCG danesa y Mycobacterium tuberculosis H37Rv
NOTA: Todos los protocolos descritos se realizaron en condiciones BSL3.
- Descongelar las existencias de glicerol congeladas de BCG danés o cepas H37Rv e inocular 100 l en 10 ml de medio 7H9 10 suplementado con Tween-80 0,05% (v / v) y ADC (albúmina, dextrosa, catalasa) 10% (v / v).
- Incubar en condiciones estáticas durante una semana a 37 ° C hasta que el cultivo está en crecimiento en fase logarítmica.
- Ampliar la escala de cultivo bacteriano mediante la transferencia del cultivo de 10 ml a 200 ml de medio fresco. Incubar durante 20 adicionaldías bajo condiciones estáticas.
- Transferir a tubos de centrífuga de 50 ml y centrifugar durante 15 minutos a 2500 x g.
- Desechar los sobrenadantes y resuspender sedimento bacteriano en el volumen residual. Añadir a cada tubo de perlas de vidrio de 3 mm de diámetro estériles (10 - 15) por tubo.
- Vortex vigorosamente durante 1 min con el fin de disociar grupos bacterianas. Resuspender cada sedimento en 10 ml de PBS con Tween-80 0,05% (v / v).
- Deja tubos durante 10 minutos permitiendo que los grandes agregados bacterianos y perlas de vidrio para establecerse.
- Recuperar 9,5 ml de sobrenadante de cada uno de los 4 tubos que contenían pequeños grupos y bacterias individuales y volúmenes de transferencia a un solo tubo de centrífuga de 50 ml nuevo (volumen final recuperado 38 ml). Centrifugar durante 10 min a 400 x g.
- Recuperar 35 ml de sobrenadante (que contienen bacterias principalmente individuales) en un solo tubo de centrífuga de 50 ml fresco y añadir 15 ml de PBS con glicerol 50% (v / v), obteniéndose una concentración final de glicerol de 15% (v / v).
- mezclar suavementey distribuir en alícuotas de 1 ml en tubos adecuados para la congelación. Almacenar a -80 ° C (un lote proporciona aproximadamente 50 alícuotas de glicerol).
- Para cuantificar las existencias de glicerol, descongelar un glicerol el día después de la congelación y realizar siete diluciones en serie de diez veces en los tubos de 1,5 ml separados que contienen 900 l de PBS.
- Plate 100 l de cada dilución en medio sólido 7H10 agar-10 suplementado con ADC 10% (v / v) preparado en el diámetro platos 55 mm de Petri.
- Añadir con cuidado 3 perlas de vidrio mm de diámetro (aprox. 10 por plato) y agitar suavemente la placa para distribuir por igual volumen sobre la placa de agar. Desechar los granos y sellar placa de agar con parafilm.
- Incubar durante 21 días a 37 ° C y determinar la concentración bacteriana mediante el recuento de unidades formadoras de colonias (UFC) en la dilución donde las colonias individuales se pueden distinguir con precisión.
2. Ratón Vacunación
- Descongelar un pre-glicerol cuantificado BCG y diluirlo en PBS para la preparación deson dos suspensiones. Calcular volumen final teniendo en cuenta la dosis por animal es de 100 l para la administración subcutánea (10 7 UFC por ml para la vacunación subcutánea) y 40 l para la administración intranasal (2,5 x 10 7 UFC para la vacunación intranasal).
- Utilice una estación de trabajo de anestesia especializado para roedores para anestesiar a los ratones con una mezcla de isoflurano y oxígeno. Utilice isoflurano 5% para inducir la anestesia y 2% para mantener los ratones en la cámara de anestesia. (Otro método de anestesia aceptada se puede utilizar).
- Para la administración subcutánea de la vacuna llenar una jeringa de 1 ml con una aguja de 26 G con 1 ml de suspensión bacteriana (10 7 CFU / ml). Eliminar las burbujas de aire.
- Colocar un ratón anestesiado en una superficie plana en la posición propensa dentro de una campana de flujo laminar y inocular por vía subcutánea 100 l (10 6 UFC / dosis) de vacuna en un costado de la ratón de nuevo. Vuelva a colocar el puntero del ratón a la jaula y su seguimiento para asegurarse de que properly se recupera de la anestesia.
- Cambiar la aguja de la jeringa entre cada administración ratón. Eliminado las burbujas de aire como se describió anteriormente.
- Para la administración intranasal, colocar un ratón anestesiado en posición supina interior de la campana.
- Con una micropipeta tomar 20 l de la suspensión con 2,5 x 10 7 UFC / ml. Coloque la gota a gota inóculo entre las dos ventanas de la nariz hasta que todo el volumen se ha depositado, dejando tiempo entre gotas para permitir el ratón respirar el volumen. Nota: los ratones pueden sufrir de dificultad respiratoria durante este procedimiento por lo que debe dejarse en manos de asimilar cada gota antes de administrar la siguiente para evitar que tanto como sea posible.
- Volver a llenar la micropipeta con otro 20 l y repetir la operación. Si el ratón comienza a despertar de la anestesia después de la primera inoculación, colocarlo en la cámara de la anestesia antes de la segunda. Vuelva a colocar el puntero del ratón a la caja y asegúrese de que se recupere correctamentede la anestesia.
3. Ratón Desafío intranasal con la cepa H37Rv
- Descongelar un glicerol pre-cuantificado H37Rv y diluir en PBS para preparar una suspensión bacteriana de 2.500 CFU por ml. Calcular volumen final teniendo en cuenta la dosis por animal es de 40 l.
- H37Rv se inocula por vía intranasal como se describe en 2.5 a 2.7. Dosis desafío final por ratón es 10 2 UFC / 40 l.
4. Análisis de Inducida Respuesta Inmune en los pulmones
- Suspensión celular de pulmón
NOTA: Evaluación de la respuesta inmune adaptativa inducida por la vacuna en los pulmones requiere la generación de suspensión de células individuales. Para este fin, se utiliza un disociador de tejido, tal como gentleMACS.- Sacrificar el ratón por dislocación cervical (u otra metodología aceptada humana) y asegúrese de ratón está muerto tocar el globo ocular para confirmar la ausencia de reflejo de parpadeo.
- Dentro de una campana de flujo laminar, extraer el lUNGS usando tijeras y pinzas estériles y colocarlos sobre una superficie limpia. pulmones limpias eliminación de la tráquea y el tejido conectivo, y la transferencia de los pulmones a un tubo de 1,5 ml con PBS (mantener en hielo hasta el procesamiento).
- Para generar una suspensión celular, colocar los pulmones en un tubo adecuado para la disociación de órganos (tubo C-disociador) que contiene 5 ml de 10 mM HEPES-NaOH pH 7,4, NaCl 150 mM, KCl 5 mM, 1 mM MgCl 2 y 1,8 mM CaCl 2 buffer.
- Añadir 100 ml de colagenasa D 100 mg / ml (2 mg / ml de concentración final), y 40 l de DNasa I 20.000 UI / ml (160 IU / ml de concentración final.
NOTA: Las soluciones madre de colagenasa D o ADNasa I se preparan disolviendo enzimas liofilizadas en PBS o glicerol 50% (v / v), Tris-HCl 20 mM pH 7,5 y MgCl 2 1 mM, respectivamente. - Se coloca el tubo en el disociador de tejidos y utilizar el m_lung_01 programa predefinido para la fragmentación de pulmón. Incubar el tubo a 37 ° C en un baño de agua durante 30 minutos.
- º lugartubo de correo en el disociador y utilizar el m_lung_02 programa predefinido para la homogeneización de pulmón completa en la suspensión celular única.
- Pasar la suspensión celular a través de un filtro de células de nylon de 70 micras instalado en un tubo de centrífuga de 50 ml. Lavar el filtro con 10 ml de RPMI 1640 medio.
- Centrifugar las células durante 5 minutos a 400 xg y desechar el sobrenadante.
- Añadir 1 ml de tampón de lisis de eritrocitos, mezclar mediante agitación y se incuba durante 1 min a temperatura ambiente.
- Añadir 10 ml de RPMI 1640 células medianas y centrifugar durante 5 minutos a 400 x g.
- Resuspender las células en 0,5 ml de medio completo RPMI 1640 suplementado con inactivado por calor 10% suero de ternero fetal (FCS), 2 mM L-glutamina, 100 mg / ml de estreptomicina, 100 UI / ml de penicilina y 50 mM 2-mercaptoetanol.
NOTA: FCS se inactiva por incubación a 56 ° C durante 30 minutos. - Recuento de células y añadir completo RPMI 1640 medio para llegar a la densidad celular final de 10 7 células / ml.
NOTA: Para el recuento de células, se utiliza el contador de células automatizado. - Distribuir 100 l de suspensión celular en fondo en U placa de 96 pocillos estériles (10 6 células / pocillo).
- Añadir 50 l / pocillo de medio completo RPMI 1640 con 15 g / ml de H37Rv comercial derivado proteínico purificado (PPD) (5 mg / ml de concentración final).
- Colección sobrenadante para la determinación de citoquinas por ELISA
- Incubar la placa a partir 4.1.14 durante 48 horas a 37 ° C y 5% de CO2.
- placa Centrifugar durante 5 min a 400 xg y recuperar 100 l de sobrenadante.
- Almacenar a -80 ° C.
- Diluir sobrenadantes 1/10 y 1/2 en tampón de ensayo para IFN y determinación IL17A, respectivamente. Determinar las concentraciones de citoquinas con kits ELISA comerciales, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (kits de desarrollo de ELISA).
- Tinción intracelular para la determinación de citoquinas-producir células CD4 + por citometría de flujo
- Incubar la placa a partir 4.1.14 durante 18 horas a 37 ° C y 5% de CO2.
- Añadir 1,5 l de Brefeldina A 1 mg / ml (Stock disuelto en DMSO) a cada (concentración final 10 mg / ml) bien e incubar durante seis horas adicionales.
- Se centrifuga la placa de 4.3.2 durante 1 minuto a 3200 xg y desechar el sobrenadante.
- Resuspender las células en 50 l de anti-ratón CD4-FITC diluidas en RPMI 1640 con 10% de FCS (1/500) y se incuba durante 10 min a 4 ° C.
- Se centrifuga la placa de 4.3.4 durante 1 min a 3.200 xg, desechar el sobrenadante y añadir solución de 100 l / pocillo de fijación. Se incuba a 4 ° C durante 20 min.
- Lavar las células dos veces con 150 l / lavado de solución de permeabilización.
NOTA: 10x concentrado se diluye en agua desionizada para preparar la solución de trabajo 1x. - Resuspender las células en 50 l de anti-ratón IFN-APC y anti-ratón-IL17A APC.Cy7 diluyeron en permeabilsolución zación (1/250 ambos anticuerpos).
- Incubar durante 1 hora a RT.
- Lavar las células dos veces con 150 l / lavado de solución de permeabilización.
- Resuspender las células en 200 l de PBS para la adquisición de citometría de flujo.
5. Análisis de inmunoglobulinas en lavado broncoalveolar (BAL)
- Obtención de muestras de BAL
- Sacrificar el ratón por dislocación cervical (u otra metodología aceptada humana) y asegúrese de ratón está muerto tocar el globo ocular para confirmar la ausencia de reflejo de parpadeo.
- Exponer la tráquea utilizando adecuada precisión pinzas y tijeras estériles y realizar una pequeña incisión en la tráquea, asegurándose de no extirpar por completo. Tenga cuidado de no causar una hemorragia que podría contaminar la muestra BAL.
- Introducir en la tráquea una cánula conectada a una jeringa de 1 ml estéril con 800 l de PBS enfriado en hielo.
- Inocular lentamente el PBS en los pulmones y entonces rEcover volumen BAL tirando hacia atrás del pistón de la jeringa muy lentamente con el fin de evitar el colapso pulmonar.
NOTA: Recuperación de 500 a 600 l es satisfactoria. - Transferir el volumen BAL en un tubo de 1,5 ml y confirmar BAL permanece incolora, lo que indica que no está contaminada con sangre (mantener en hielo hasta su procesamiento).
- Centrifugar las muestras de BAL para 5 min a 400 xg, y la transferencia de sobrenadante a un nuevo tubo.
- sobrenadantes almacenar a -80 ° C.
- Determinación de IgA en BAL sobrenadantes
NOTA: Todos los reactivos utilizados son a TA.- Poliestireno de unión de alta proteína de la cubierta de fondo plano de placas de 96 pocillos con 100 l de PPD diluido en PBS (10 mg / ml) para M. la tuberculosis determinación de IgA específicos de, o con 100 l de sobrenadante BAL diluidas 10 veces en PBS para la determinación de IgA total.
- Incubar toda la noche a 4 ° C.
- Desechar el sobrenadante y toque la placa sobre una toalla de papel para dry. Se lava con 200 l / pocillo de PBS.
- Bloquear con 200 l / pocillo de una albúmina de suero bovino (BSA) al 1% (w / v) en PBS-Tween-80 0,05% (v / v) (tampón de bloqueo).
- Incubar 1 hora a RT.
- Lavar una vez con 200 l / pocillo de (v / v) (tampón de lavado) PBS-Tween-80 0,05%.
- Añadir 100 ml de sobrenadante de BAL sin diluir en los pocillos recubiertos con PPD. Incubar dos horas a temperatura ambiente.
NOTA: Si la determinación de IgA total se realiza en paralelo con el PPD-IgA específica, deje pozos totales de IgA con tampón de lavado 100 l durante esta incubación. - Lavar tres veces con 200 l / pocillo de lavado buffer.0170004
- Añadir 100 l de peroxidasa de rábano (HRP) conjugado con anti-ratón de IgA diluido en tampón de bloqueo (1 / 10.000).
- Incubar 1 hr RT.
- Lavar cinco veces con 200 l / pocillo de tampón de lavado.
- Añadir 100 l / pocillo de 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB). Incubar 20 min a temperatura ambiente en tque oscuro.
- Añadir 100 l / pocillo de H 2 SO 4 0,5 N. Leer la placa en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 450 nm.
6. determinación de carga bacteriana en los pulmones
- Homogeneización de pulmón y de las planchas
- Cuatro semanas después de la exposición, sacrificar el ratón por dislocación cervical (u otra metodología aceptada humana) y asegúrese de ratón está muerto tocar el globo ocular para confirmar la ausencia de reflejo de parpadeo.
- Coloque el ratón en la posición supina fija en una superficie plana y desinfectada dentro de una campana de flujo laminar.
- Hacer una incisión y quitar la piel de la región del pecho para dejar visible la zona torácica.
- Cortar las costillas y la cosecha de los pulmones y el corazón con unas tijeras y pinzas estériles. Colocar los órganos en una superficie limpia.
- Limpiar los pulmones mediante la eliminación del corazón, la tráquea y el tejido conectivo y la transferencia de los pulmones a un tubo de 1,5 ml con 1 ml de agua desionizada(Mantener en hielo hasta su procesamiento).
- El uso de fórceps estériles para transferir los pulmones de cada ratón en un tubo adecuado para la homogeneización de órganos (M - tubo disociador), que contiene 1 ml de agua desionizada.
- Colocar el tubo en el disociador de tejido y usar el RNA_1 programa predefinido para homogeneizar los pulmones.
- Hacer cinco diluciones seriadas de diez veces en tubos de 1,5 ml, comenzando con 100 l de homogeneizado de pulmón diluidos en 900 l.
- diluciones placa como se describe en 1.11 a 1.14.
- La diferenciación entre BCG y H37Rv por PCR
NOTA: En las placas de 6.1.6 correspondientes al grupo vacunado con BCG por vía intranasal, se analizó un número representativo de colonias por una PCR discernir entre BCG y H37Rv para asegurar que la CFU considerado para evaluar la eficacia protectora de la vacuna confiere correspondió única para H37Rv. Este objetivos amplificación por PCR de RD9, una región genómica diferente en BCG y M. tuberculosis, dando un fragmento de 2618 pb para H37Rv, y 465 pb para la BCG 11.- Preparar una mezcla maestra de stock para todas las muestras con volúmenes por ejemplo como se indica, y luego distribuir en tubos de PCR (9 l / muestra).
NOTA: tampón 5x: 2 l. Cebador directo 25 M (GTGTAGGTCAGCCCCATCC): 0,32 l, cebador inverso 25 M (GCCCAACAGCTCGACATC): 0,32 l, Taq polimerasa 5 unidades / l: 0,04 l, desionizada H2O: 6,32 l. - Toca una colonia con un palillo estéril y sumergir el palillo de dientes con la muestra en un tubo de PCR que contiene la mezcla maestra.
- Ejecutar la PCR con el siguiente programa: 10 min 95 ° C (este paso es para disparar la interrupción bacteriana), 10 min 95 ° C (este paso es para disparar la interrupción bacteriana), 35 ciclos (30 segundos a 95 ° C, 1 min a 58 ° C y 4 min a 72 ° C).
- Cargar las muestras de PCR en un gel de agarosa al 1% con bromuro de etidio y muestras de ejecución para visualizar los fragmentos.
- Preparar una mezcla maestra de stock para todas las muestras con volúmenes por ejemplo como se indica, y luego distribuir en tubos de PCR (9 l / muestra).
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Representative Results
Este trabajo describe la comparación de las dos vías de administración de BCG: subcutánea e intranasal. Vía subcutánea es comparable a la intradérmica, que es la ruta clínica actual para BCG en todo el mundo. Vía intranasal de la vacuna pretende imitar la ruta natural de la infección de M. la tuberculosis, con el objetivo de inducir la respuesta inmune directamente en los pulmones, el principal órgano afectado por este patógeno.
La Figura 1 describe el flujo de trabajo seguido. Ocho a diez semanas de edad, hembra DBA / 2 ratones son vacunados con 10 6 UFC de BCG danesa por vía subcutánea o intranasal de administración. Ocho semanas más tarde, un grupo de ratones se sacrifica para analizar pulmón respuesta inmune inducida por la vacunación. muestras de BAL se obtienen en primer lugar y luego cosechar los pulmones. Con el fin de estudiar la eficacia protectora de la vacuna-conferido, que inocular un different grupo de ratones con una exposición intranasal de dosis baja de M. cepa de tuberculosis H37Rv. Un mes más tarde, sacrificamos animales y los pulmones cosecha. En este caso, para cada animal se utiliza el pulmón izquierdo para determinar la carga bacteriana y el pulmón derecho para evaluar inducida por la vacuna respuesta inmune después de la estimulación. El objetivo es generar la carga bacteriana y los datos de la respuesta inmune en los pulmones de cada animal con el fin de estudiar posibles correlaciones de protección.
Como se muestra en la Figura 2, los pulmones fueron disociadas para obtener ya sea un homogeneizado de órganos o una suspensión celular. pulmones homogeneizados se sembraron en medio agar sólido para determinar la carga bacteriana cuatro semanas después de la exposición. Se obtuvo la suspensión celular para estudiar la respuesta inmune inducida por la vacuna después de la digestión enzimática de pulmón con colagenasa y ADNasa I D.
Nuestros resultados indican claramente que, cuando se compara to la vía subcutánea, la vía intranasal de la vacunación confiere una mayor eficacia protectora en los pulmones cuatro semanas después de la exposición (Figura 3A). Además, se confirmó que la carga bacteriana en los pulmones del grupo de BCG-vacuna intranasal corresponden a H37Rv y no a la vacuna BCG. Con este fin, se analizaron un número representativo de colonias de este grupo por PCR específica para la región del genoma RD9, que amplifica fragmentos de longitud diferente en BCG y M. tuberculosis (Figura 3B). La figura muestra claramente que todas las colonias analizadas proporcionaron un fragmento de 0,4 kpb, que correspondía a H37Rv.
Nuestros datos revelaron una correlación entre la eficacia protectora conferida por la vacunación con BCG intranasal y la respuesta inmune inducida por la vacuna en los pulmones antes de la exposición. Intranasal BCG activa claramente superior IL17 y la producción de IFN en los pulmones, medida por ELISA (Figura4A). Estos datos se confirmaron mediante tinción intracelular (ICS) y citometría de flujo (datos no mostrados). Además, también encontramos una mayor concentración de tanto la concentración total y PPD-IgA específica en muestras de BAL (Figura 4B), lo que indica que la vacunación con BCG pulmonar induce la producción de IgA y la translocación de las vías respiratorias.
Por último, se estudió la respuesta inmune inducida por BCG en los pulmones después de la estimulación (Figura 5). Nuestros datos revelaron diferencias entre IL17 y IFN; células productoras de IL17A CD4 + fueron detectados sólo en el grupo de BCG intranasal, mientras que se encontraron células IFN productoras en todos los grupos infectados con H37Rv independientemente de la vacunación. Representación de los datos de cada animal correspondiente a las células productoras de IL17 y carga bacteriana mostró una correlación significativa entre la presencia de IL17 y la reducción de la carga bacteriana de pulmón, que no se observó en el caso de IFN.
Figura 1. Flujo de trabajo para comparar la ruta intranasal y subcutánea de BCG La vacunación. Ocho semanas después de la inmunización con BCG, un conjunto de ratones (6 por grupo experimental) se utiliza para cosechar pulmones y realizar un BAL, y analizar la respuesta inmune pulmonar inducida por la vacunación. Otro grupo de ratones (6 / grupo), se inocula con un desafío intranasal de dosis baja de M. la tuberculosis cepa H37Rv (100 UFC). Un mes más tarde, los animales se sacrificaron y se analiza la carga bacteriana en el pulmón izquierdo y la respuesta inmune PPD-específica en el pulmón derecho. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. La eficacia protectora conferida por la vacunación con BCG. Grupos de 6 ratones DBA / 2 fueron vacunados por vía subcutánea (sc BCG), intranasal (BCG en) el itinerario, o no vacunado (Unvacc) con la vacuna BCG danesa 10 6 UFC. A los dos meses después de la vacunación, los ratones se inocularon por vía intranasal con una dosis baja (100se determinó CFU) desafío H37Rv, y un mes más tarde carga bacteriana en pulmones. Se muestra un experimento representativo de dos independientes. (A) de datos en los gráficos se representan como media + SD. De una vía ANOVA con análisis post Bonferroni se realizó para calcular la significación estadística. (B) un número representativo de fueron analizados por PCR específica para la región de RD9 (diferente en BCG y H37Rv genomas) colonias individuales del grupo intranasal BCG a discernir BCG y H37Rv colonias. (Anteriormente publicado el 9). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Vacunación específica pulmonar Respuesta Inmune Analizados antes de la estimulación con H37Rv. Grupos de / 2 ratones DBA 6 eranvacunados por vía subcutánea (BCG sc) o intranasal (BCG en) el itinerario, o no vacunado (Unvacc) con la vacuna BCG danesa 10 6 UFC. (A) A los dos meses posteriores a la vacunación, se obtuvo una suspensión celular de los pulmones cosechados. Las células fueron estimuladas con PPD como se describe en la sección de métodos y IL17A (panel izquierdo) y IFN (panel derecho) la producción se analizaron por ELISA. (B) total de IgA, y M. la tuberculosis (MTB) específicos de IgA fueron analizados a partir de muestras de BAL por ELISA. se muestran los datos agrupados de dos experimentos independientes. Los datos de los gráficos se representan como media + SD. (Anteriormente publicado el 9). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Vacuna-específicaRespuesta inmune pulmonar Analizados antes de la estimulación con H37Rv. Grupos de 6 ratones DBA / 2 fueron vacunados por vía subcutánea (sc BCG) o intranasal (BCG en) el itinerario, o no vacunados (NV) con la vacuna BCG danesa 10 6 UFC. Un grupo de control de ratones no vacunados, no infectado también se incluyó (NV / NI). A los dos meses después de la vacunación, los ratones se expusieron por vía intranasal con una dosis baja H37Rv (100 CFU), y un mes más tarde se sacrificaron los animales. Izquierda y se utilizaron los pulmones desde el mismo animal para determinar la carga bacteriana y IL17A- (A) o IFNγ- (B) la producción de células CD4 +, respectivamente. Los datos en paneles de la izquierda corresponden a porcentaje de células productoras de citoquinas medidos por citometría de flujo, y se representan como media + SD. paneles de la derecha representan los datos de la carga bacteriana y citoquinas la producción de células CD4 + obtenidos para cada ratón. La regresión lineal y se calculó el valor de p obtenido en cada caso se muestra en el caso de IL17A. agrupadaLos datos de dos experimentos independientes se muestran en la figura. (Anteriormente publicado el 9). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Middlebrook 7H9 broth | BD | 271310 | |
| Middlebrook ADC Enrichment | BD | 211887 | |
| Tween 80 | Scharlau | TW00800250 | |
| 3-mm diameter Glass Beads | Scharlau | 038-138003 | |
| Middlebrook 7H10 Agar | BD | 262710 | |
| 1-ml syringe 26GA 0.45 x 10 mm | BD | 301358 | |
| GentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| M tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | |
| Collagenase D | Roche | 11088882001 | |
| DNaseI | Applichem | A3778,0100 | |
| Falcon 70 µm Cell Strainer | Corning | 352350 | |
| RPMI 1640 | Sigma | R0883 | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer | Sigma | R7757 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | 100x concentrated |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sigma | P4333 | 100x concentrated |
| Fetal Calf Serum | Biological Industries | 04-001-1A | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148-25ML | |
| Scepter 2.0 Handheld Automated Cell Counter | Millipore | PHCC20040 | |
| Scepter Cell Counter Sensors, 40 µm | Millipore | PHCC40050 | |
| Mycobacterium Tuberculosis - Tuberculin PPD | Statens Serum Institut (SSI) | 2390 | |
| Mouse IFN-γ ELISA development kit | Mabtech | 3321-1H | |
| Mouse IL17A ELISA development kit | Mabtech | 3521-1H | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD4 | BD | 553047 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Kit | BD | 555028 | |
| APC-Cy7 Rat Anti-mouse IL-17A | BD | 560821 | |
| APC Mouse Anti-mouse IFNg | BD | 554413 | |
| LACHRYMAL OLIVE LUER LOCK 0.60 x 30 mm. 23G x 1 1/4” | UNIMED | 27.134 | Used as trachea cannula for BAL |
| high-protein binding polystyrene flat-bottom 96-well plates MAXISORP | NUNC | 430341 | |
| Albumin, from bovine serum | Sigma | A4503 | |
| Goat Anti-Mouse IgA (α-chain specific)−Peroxidase antibody | Sigma | A4789 | |
| 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) | Sigma | T0440 | |
| MyTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21107 | The kit Includes Buffer 5x |
References
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- Mangtani, P., et al. Protection by BCG vaccine against tuberculosis: a systematic review of randomized controlled trials. Clin Infect Dis. 58 (4), 470-480 (2014).
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