Introduction
Tuberkulos (tbc) är en av de ledande infektionssjukdomar orsakar mer associerade dödsfall än hiv i världen och i kombination med stigande ökning av multiresistenta stammar gör TB en oroande globalt hälsoproblem 1. Nya diagnostiska verktyg, effektivare och mindre giftiga droger och nya säkra och effektiva TB vacciner är ett akut behov, särskilt i utvecklingsländerna.
Levande försvagade Bacille Calmette-Guerin (BCG) är för närvarande den enda licensierade vaccin mot tuberkulos, som har administrerats intradermalt vid födseln sedan 1970-talet runt om i världen. BCG anses effektivt för att förhindra allvarliga former av sjukdomen (meningit och miliär tuberkulos) hos barn, men har visat inkonsekvent effektivitet mot lungtuberkulos ansvarig för överföring av sjukdomar 2.
Lung vaccination, som efterliknar naturlig väg av TB-infektion, utgör en attraktiv metod för priming lokal värd immunsvars. I detta avseende har olika prekliniska verk i olika relevanta TB djurmodeller visat större effekt av vaccinet efter lung immunisering jämfört med subkutan eller intradermal väg 3-6. Ändå är de skyddsmekanismer som utlöses av pulmonell vaccination inte förstått. Under de senaste åren har flera verk pekade mot IL17-medierat svar som en viktig faktor för TB-specifik mukosalt immunsvar, som i musmodeller med brist för IL17 mucosal vaccin-inducerad skyddande effekt försämras 7,8.
Nyligen visade vi för första gången att intranasal BCG administration skyddade DBA / 2-möss, en musstam som kännetecknas av bristen på skydd efter subkutan BCG vaccination 9. Dessa resultat tyder på att andnings TB vaccination skulle kunna vara mer effektiva för att minska graden av TB i endemiska länder, där intradermal BCG anses ineffektiva mot pulmonAry TB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Samtliga möss hölls under kontrollerade förhållanden och observerades för tecken på sjukdom. Experimentellt arbete har utförts i överensstämmelse med europeiska och nationella direktiv för skydd av försöksdjur och med godkännande från de behöriga lokala etikkommittéer.
1. Framställning av Kvantifierad Glycerol Lagren av BCG danska och H37Rv Mycobacterium tuberculosis
OBS: Alla protokollen utfördes under BSL3 förhållanden.
- Tina frysta glycerollager av BCG danska eller H37Rv-stammar och inokulera 100 ^ i 10 ml 7H9-medium 10 kompletterat med Tween-80 0,05% (volym / volym) och ADC (Albumin, Dextrose, Katalas) 10% (volym / volym).
- Inkubera under statiska betingelser under en vecka vid 37 ° C tills odlingen är i log-fas tillväxt.
- Skala upp bakteriekultur genom att överföra 10-ml kultur till 200 ml färskt medium. Inkubera i 20 ytterligaredagar under statiska förhållanden.
- Överföra till 50-ml centrifugrör och centrifugera i 15 min vid 2500 x g.
- Kasta supernatanterna och resuspendera bakteriella pelleten i den återstående volymen. Lägg till varje rör sterila glaspärlor 3-mm diameter (10 - 15 per rör).
- Skaka kraftigt under en minut för att dissociera bakteriella klumpar. Återsuspendera varje pellet i 10 ml PBS med Tween-80 0,05% (volym / volym).
- Låt rören under 10 minuter tillåter de största bakterie aggregat och glaspärlor för att bosätta sig.
- Återvinna 9,5 ml av supernatanten från varje av de 4 rören innehållande små klumpar och enskilda bakterier och överföringsvolymer till en enda frisk 50-ml centrifugrör (slutlig tagna volymen 38 ml). Centrifugera i 10 min vid 400 x g.
- Återvinna 35 ml av supernatanten (innehållande huvudsakligen enkel bakterier) i en enda frisk 50-ml centrifugrör och tillsätt 15 ml PBS med glycerol 50% (v / v), att erhålla en slutlig glycerolkoncentration av 15% (volym / volym).
- blanda försiktigtoch distribuera en-ml portioner i lämpliga rör för frysning. Förvaras vid -80 ° C (ett parti ger cirka 50 portioner glycerol lager).
- För att kvantifiera glycerolstam, tina en glycerol dagen efter frysning och utföra sju tiofaldiga serieutspädningar i separata 1,5 ml rör innehållande 900 pl PBS.
- Plattan 100 | il av varje spädning i 7H10 solid-agarmedium 10 kompletterat med ADC 10% (vol / vol), framställd i 55-mm diameter petriskålar.
- Försiktigt 3 mm diameter glaspärlor (ca. 10 per platta) och försiktigt skaka plattan jämnt fördela volym över agarplatta. Kasta pärlor och försegla agarplatta med parafilm.
- Inkubera under 21 dagar vid 37 ° C och bestämma bakteriekoncentrationen genom att räkna kolonibildande enheter (CFU) i utspädningar där enstaka kolonier kan exakt särskiljas.
2. Mus Vaccination
- Tina en pre-kvantifieras BCG glycerol och späd det i PBS till prepär två suspensioner. Beräkna slutlig volym med tanke på dos per djur är 100 pl för subkutan administrering (10 7 CFU per ml för subkutan vaccination) och 40 pl för intranasal administrering (2,5 x 10 7 CFU för intranasal vaccination).
- Använda en specialiserad anestesi arbetsstation för gnagare att söva möss med en blandning av isofluran och syre. Använd isofluran 5% för att inducera anestesi och 2% för att bibehålla mössen i anestesi kammaren. (Annan vedertagen anestesi metod kan användas).
- För subkutan vaccinadministrering fylla en 1-ml spruta med en 26 G nål med 1 ml bakteriesuspension (10 7 CFU / ml). Ta bort luftbubblor.
- Placera en sövd mus på en plan yta i liggande position i en huv med laminärt flöde och inokulera subkutant 100 ^ (10 6 CFU / dos) vaccin i en flanken av musen tillbaka. Återgå musen till buren och övervaka det att se till att det properly återhämtar sig från anestesi.
- Ändra sprutnål mellan varje administrering mus. Avlägsnas luftbubblor, såsom beskrivits ovan.
- För intranasal administration, placera en sövd mus i liggande ställning i huven.
- Med en mikropipett ta 20 ul av suspensionen med 2,5 x 10 7 CFU / ml. Placera inokulatet droppe för droppe mellan de två näsborrarna tills hela volymen har deponerats, lämnar tid mellan droppar att låta musen andas volymen i. OBS: möss kan drabbas av andnöd under denna procedur så att de bör överlåtas till assimilera varje droppe före administrera nästa för att förhindra det så mycket som möjligt.
- Åter fylla mikropipett med ytterligare 20 pl och upprepa operationen. Om musen börjar vakna upp ur narkosen efter den första inokuleringen placera den i anestesi kammaren före den andra. Återgå musen till buren och se till att det på rätt sätt återfrån anestesi.
3. Mus Intranasal Challenge med H37Rv Strain
- Tina en pre-kvantifieras H37Rv glycerol och späd det i PBS för att förbereda en bakteriell suspension av 2500 CFU per ml. Beräkna slutlig volym med tanke på den dos per djur är 40 | il.
- H37Rv ympas intranasalt såsom beskrivits i 2,5-2,7. Sista utmaningen dos per mus är 10 2 CFU / 40 il.
4. Analys av inducerad immunsvar i lungorna
- Lung cellulär suspension
OBS: Bedömning av vaccin-inducerad adaptiva immunsvaret i lungorna kräver generering av en enda cell suspension. För detta ändamål använder vi en vävnad dissociator såsom gentleMACS.- Offra musen genom halsdislokation (eller annan vedertagen human metod) och se till att musen är död röra ögongloben för att bekräfta frånvarande av blinkreflex.
- Inne i en huv med laminärt flöde, extrahera lungs använder steril sax och pincett och placera dem på en ren yta. Rena lungor ta bort luftstrupen och bindväv, och överföra lungorna till en 1,5-ml rör med PBS (behålla på is tills bearbetning).
- För att generera en cellulär suspension, placera lungorna på ett korrekt rör för organ dissociation (C-dissociator rör) innehållande 5 ml 10 mM HEPES-NaOH pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2 och 1,8 mM CaCl2 buffert.
- Tillsätt 100 pl av kollagenas D 100 mg / ml (2 mg / ml slutkoncentration) och 40 pl DNAse I 20.000 lU / ml (160 lU / ml slutkoncentration.
OBS: Förrådslösningar av kollagenas D eller DNasI framställs upplösning av lyofiliserade enzymer i PBS eller glycerol 50% (v / v), 20 mM Tris-HCl pH 7,5 y MgCl2 1 mM, respektive. - Placera röret i vävnaden dissociator och använder den fördefinierade program m_lung_01 för lung fragmentering. Inkubera röret vid 37 ° C i ett vattenbad under 30 min.
- place the röret i dissociator och använda fördefinierade program m_lung_02 för fullständig lung homogenisering till en enda cell suspension.
- Passera den cellulära suspensionen genom ett 70 | im nyloncellfilter monteras på en 50-ml centrifugrör. Tvätta silen med 10 ml RPMI 1640-medium.
- Centrifugera cellerna i 5 minuter vid 400 xg och kassera supernatanten.
- Tillsätt 1 ml erytrocyter lyserande buffert, blanda genom att vortexa och inkubera i 1 min vid rumstemperatur.
- Tillsätt 10 ml RPMI 1640-medium och centrifugera cellerna i 5 minuter vid 400 x g.
- Resuspendera cellerna i 0,5 ml fullständigt RPMI 1640-medium kompletterat med 10% värmeinaktiverat fetalt kalvserum (FCS), 2 mM L-Glutamin, 100 | ig / ml streptomycin, 100 lU / ml penicillin och 50 ^ M 2-merkaptoetanol.
OBS: FCS inaktiveras genom inkubering vid 56 ° C under 30 minuter. - Räkna celler och tillsätt fullständigt RPMI 1640 medium för att nå en slutlig cellulär densitet av 10 7 celler / ml.
OBS! Celltal, använder vi automatiserad cellräknare. - Distribuerar 100 | il av cellsuspension i U-bottnad 96-brunnars steril platta (10 6 celler / brunn).
- Tillsätt 50 | il / brunn av fullständigt RPMI 1640-medium med 15 | j, g / ml av kommersiell H37Rv renat proteinderivat (PPD) (5 ^ g / ml slutkoncentration).
- Supernatant kollektion för cytokin bestämning av ELISA
- Inkubera plattan från 4.1.14 till 48 h vid 37 ° C och 5% CO2.
- Centrifug plattan under 5 minuter vid 400 xg och återhämta 100 pl av supernatanten.
- Förvara vid -80 ° C.
- Späd supernatanter 1/10 och 1/2 i analysbuffert för IFNy och IL17A beslutsamhet, respektive. Bestäm cytokin koncentrationer med kommersiella ELISA kit, enligt tillverkarens instruktioner (ELISA Development Kits).
- Intracellulär färgning för bestämning av cytokin-producerande CD4 + -celler genom flödescytometri
- Inkubera plattan från 4.1.14 till 18 h vid 37 ° C och 5% CO2.
- Tillsätt 1,5 pl av Brefeldin A 1 mg / ml (lager löst i DMSO) till varje brunn (10 | ig / ml slutlig koncentration) och inkubera under ytterligare sex timmar.
- Centrifugera plattan från 4.3.2 under 1 minut vid 3200 xg och kassera supernatanten.
- Resuspendera cellerna i 50 ul av anti-mus-CD4-FITC utspädda i RPMI 1640 med 10% FCS (1/500) och inkubera i 10 min vid 4 ° C.
- Centrifugera plattan från 4.3.4 under 1 minut vid 3200 xg, kassera supernatanten och tillsätt 100 pl / brunn av fixeringslösning. Inkubera vid 4 ° C under 20 min.
- Tvätta cellerna två gånger med 150 pl / tvätt av permeabilization lösning.
OBS: 10x koncentrerad stam späds i avjoniserat vatten för att framställa 1x arbetslösning. - Resuspendera cellerna i 50 ul av anti-mus IFNy-APC och anti-mus IL17A-APC.Cy7 utspädd i permeabilsering lösning (1/250 båda antikropparna).
- Inkubera under 1 h vid RT.
- Tvätta cellerna två gånger med 150 pl / tvätt av permeabilization lösning.
- Resuspendera cellerna i 200 pl PBS för flödescytometri förvärvet.
5. Analys av immunoglobuliner i bronkoalveolär tvätt (BAL)
- Erhållande av BAL-prover
- Offra musen genom halsdislokation (eller annan vedertagen human metod) och se till att musen är död röra ögongloben för att bekräfta frånvarande av blinkreflex.
- Exponera luftstrupen använder rätt precision steril pincett och sax och utför en liten minskning i luftstrupen, se till att inte skära den helt. Se till att inte orsaka blödningar som kan förorena BAL prov.
- Introducera in i luftstrupen en kanyl ansluten till en steril 1-ml spruta med 800 | il iskall PBS.
- Ympa långsamt PBS i lungorna och sedan reCover BAL volym dra tillbaka sprutans kolv mycket långsamt för att undvika lungkollaps.
OBS: Återvinning av 500 till 600 | il är tillfredsställande. - Överför BAL volym i en 1,5-ml rör och bekräfta BAL förblir ofärgad, vilket tyder på att inte är förorenad med blod (behålla på is tills bearbetning).
- Centrifugera BAL-prover för 5 min vid 400 xg, och överföra supernatanten till ett nytt rör.
- Butiks supernatanter vid -80 ° C.
- Fastställande av IgA i BAL supernatanter
NOTERA: Alla reagens som används är vid RT.- Coat hög proteinbindning polystyren flatbottnade 96-brunnsplattor med 100 pl av PPD utspädda i PBS (10 pg / ml) för M. tuberkulos specifik IgA bestämning, eller med 100 pl av BAL supernatant utspädda 10 gånger i PBS för total IgA bestämning.
- Inkubera över natten vid 4 ° C.
- Kassera supernatanten och knacka plattan mot en pappershandduk för att dry. Tvätta med 200 | il / brunn av PBS.
- Blockera med 200 | il / brunn av en bovint serumalbumin (BSA) 1% (vikt / volym) i PBS-Tween-80 0,05% (volym / volym) (blockerande buffert).
- Inkubera 1 h vid RT.
- Tvätta en gång med 200 | il / brunn av PBS-Tween-80 0,05% (volym / volym) (Tvättbuffert).
- Tillsätt 100 pl outspädd BAL supernatant i PPD-belagda brunnar. Inkubera två timmar vid rumstemperatur.
OBS: Om den totala IgA bestämningen sker parallellt med PPD-specifika IgA, lämna totala IgA brunnar med 100 ul tvättbuffert under denna inkubation. - Tvätta tre gånger med 200 pl / brunn av tvätt buffer.0170004
- Tillsätt 100 | il pepparrotsperoxidas (HRP) -konjugerad anti-mus-IgA utspätt i blockeringsbuffert (1/10000).
- Inkubera 1 h RT.
- Tvätta fem gånger med 200 pl / brunn av tvättbuffert.
- Tillsätt 100 | il / brunn av 3,3 ', 5,5'-tetrametylbensidin (TMB). Inkubera 20 minuter vid rumstemperatur i than mörk.
- Tillsätt 100 | il / brunn av H 2 SO 4 0,5N. Läs plattan i en spektrofotometer vid en våglängd av 450 nm.
6. bakteriehalten bestämning i lungorna
- Lung homogenisering och plätering
- Fyra veckor efter utmaning, offra musen genom halsdislokation (eller annan vedertagen human metod) och se till att musen är död röra ögongloben för att bekräfta frånvarande av blinkreflex.
- Placera musen i liggande ställning på en plan och desinficeras för ytan inuti en huv med laminärt flöde.
- Gör ett snitt och ta bort huden från bröstregionen att lämna synliga bröstområdet.
- Klipp ut revbenen och skörda lungor och hjärta med hjälp av steril sax och pincett. Placera organ på en ren yta.
- Rensa ut lungor genom avlägsnande av hjärta, luftstrupe och bindväv och överföra lungorna till en 1,5-ml rör med 1 ml avjoniserat vatten(Behålla på is tills bearbetning).
- Använda steril pincett för att överföra lungorna hos varje mus i en korrekt rör för organ homogenisering (M - dissociator rör), som innehöll 1 ml avjoniserat vatten.
- Placera röret i vävnaden dissociator och använder den fördefinierade program RNA_1 att homogenisera lungorna.
- Göra fem tiofaldiga seriespädningar i 1,5-ml rör, med början med 100 pl av lunghomogenat utspädda i 900 | j, l.
- Plattspädningar såsom beskrivits i 1,11-1,14.
- Differentieringen mellan BCG och H37Rv genom PCR
OBS: I plattorna från 6.1.6 motsvarar den grupp som vaccinerats med BCG genom intranasal väg, analyserade vi ett representativt antal kolonier av en kräsna PCR mellan BCG och H37Rv att se till att CFU anses bedöma vaccin tilldelats skyddseffekten motsvarade unikt till H37Rv. Detta PCR mål förstärkning av RD9, en genomregion annorlunda i BCG och M. tuberculosis, vilket ger ett fragment av 2618 bp för H37Rv, och 465 bp för BCG 11.- Förbered en Master Mix lager för alla prover med volymer per prov som är aktuella, och sedan distribuera PCR-rör (9 l / prov).
OBS: Buffert 5x: 2 | j, l. Framåt primer 25 nm (GTGTAGGTCAGCCCCATCC): 0,32 l, Omvänd primer 25 nm (GCCCAACAGCTCGACATC): 0,32 pl, Taq-polymeras 5 enheter / pl: 0,04 l, avjoniserat H2O: 6,32 l. - Tryck på en koloni med en steril tandpetare och doppa den tandpetare med provet i en PCR-rör innehållande Master Mix.
- Kör PCR med följande program: 10 min 95 ° C (detta steg är att utlösa bakteriella störningar), 10 min 95 ° C (detta steg är att utlösa bakteriella störningar), 35 cykler (30 sekunder vid 95 ° C, 1 min vid 58 ° C och 4 minuter vid 72 ° C).
- Ladda de PCR-prover i en 1% agarosgel med etidiumbromid och köra prover för att visualisera fragmenten.
- Förbered en Master Mix lager för alla prover med volymer per prov som är aktuella, och sedan distribuera PCR-rör (9 l / prov).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta arbete beskriver jämförelsen av två vägar för administrering av BCG: subkutan och intranasal. Subkutant är jämförbar med intradermal, vilket är den nuvarande klinisk väg för BCG hela världen. Intranasala vägen vaccinations syftar till att efterlikna den naturliga vägen av infektion av M. tuberkulos, med målet att inducera immunsvar direkt i lungorna, det primära målorganet för denna patogen.
Figur 1 beskriver arbetsflödet följas. Åtta till tio veckor gamla kvinnliga DBA / 2-möss vaccineras med 10 6 CFU av BCG dansk genom subkutan eller intranasal administreringsväg. Åtta veckor senare, är en grupp av mössen att analysera lungimmunsvar som induceras genom vaccination. BAL-prover först erhållits och sedan skörda vi lungor. För att studera vaccin tilldelats skyddseffekt, ympa vi en different grupp av möss med en låg dos intranasal utmaning av M. tuberculosis H37Rv-stam. En månad senare, vi offra djur och skörd lungor. I detta fall, för varje djur som vi använder den vänstra lungan för att bestämma bakteriehalten och höger lunga att bedöma vaccin-inducerad immunsvar efter provokation. Målet är att skapa bakteriehalten och immunsvarsdata i lungorna för varje djur för att studera eventuella korrelat till skydd.
Såsom visas i figur 2, var lungor dissocierades för att erhålla antingen en organhomogenat eller en cellulär suspension. Homogeniserade lungor ströks på fast agarmedium för att bestämma bakteriehalten fyra veckor efter utmaning. Cellular fjädring för att studera vaccin-inducerad immunsvar erhölls efter lung enzymatisk spjälkning med kollagenas D och DNasI.
Våra resultat visar tydligt att jämfört to subkutant, intranasal rutt vaccination ger en mycket större skyddande effekt i lungorna fyra veckor efter utmaning (figur 3A). Dessutom bekräftade vi att bakteriehalten i lungor från intranasal BCG-vaccingruppen motsvarar H37Rv och inte BCG-vaccin. För detta ändamål, analyserade vi ett representativt antal kolonier från denna grupp genom specifik PCR för RD9 genomet regionen, som förstärker olika längd fragment i BCG och M. tuberkulos (figur 3B). Figur visade tydligt att alla kolonierna analyserade tillhandahålls ett fragment av 0,4 kbp, vilket motsvarade H37Rv.
Våra data visar sambandet mellan skyddseffekt ges genom intranasal BCG-vaccination och vaccin-inducerad immunsvar i lungorna före utmana. Intranasal BCG utlöste klart högre IL17 och IFNy-produktion i lungorna, mätt med ELISA (Figur4A). Dessa data bekräftades med (ICS) intracellulär färgning och flödescytometri (data ej visade). Dessutom fann vi också en högre koncentration av både den totala och PPD-specifik IgA koncentration i BAL-prover (Figur 4B), vilket indikerar att lung BCG-vaccination inducerar produktion av IgA och translokation till andningsvägarna.
Slutligen, vi studerade BCG-inducerad immunsvar i lungorna efter utmaning (Figur 5). Våra data visar skillnader mellan IL17 och IFNy; IL17A-producerande CD4 + celler var endast påvisats i intranasal BCG-gruppen, medan IFNy-producerande celler hittades i alla grupper som infekterats med H37Rv oavsett vaccination. Representation av data från varje djur som motsvarar IL17-producerande celler och bakteriehalten visade en signifikant korrelation mellan närvaron av IL17 och lunga bakteriehalten minskning, som inte observerades i fallet med IFNy.
Figur 1. Arbetsflöde till jämförelse Intranasal och subkutant i BCG-vaccination. Åtta veckor efter BCG-immunisering, en uppsättning av möss (6 per experimentgrupp) används för att skörda lungor och utföra en BAL och analysera lungimmunsvar som induceras genom vaccination. En annan uppsättning möss (6 / grupp), ympas med en låg dos intranasal utmaning av M. tuberculosis H37Rv-stam (100 CFU). En månad senare avlivas djuren och bakteriehalten analyseras i vänster lunga och PPD-specifikt immunsvar i höger lunga. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Skyddande effekt som följer av BCG immunisering. Grupper av 6 DBA / 2-möss vaccinerades med den subkutana (BCG sc), intranasal (BCG i) rutt, eller icke-vaccinerade (Unvacc) med BCG danska vaccin 10 6 CFU. Två månader efter vaccinering, inokulerades möss intranasalt med en låg dos (100CFU) H37Rv utmaning, och en månad senare bakteriell belastning i lungorna bestämdes. Ett representativt experiment av två oberoende visas. (A) Data i diagrammen representeras som medelvärde + SD. Envägs ANOVA-test med Bonferroni post analys utfördes för att beräkna statistisk signifikans. (B) Ett representativt urval av enskilda kolonier från BCG intranasal gruppen analyserades med PCR specifik för RD9 region (annorlunda i BCG och H37Rv genom) att urskilja BCG och H37Rv kolonier. (Tidigare publicerad 9). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Vaccin specifika Pulmonary immunsvar analyseras innan Utmaning med H37Rv. Grupper av sex DBA / 2 mössvaccinerade av subkutana (BCG sc) eller intranasal (BCG i) rutt, eller icke-vaccinerade (Unvacc) med BCG danska vaccin 10 6 CFU. (A) Vid två månader efter vaccination, var en cellulär suspension från skördade lungor erhålls. Celler stimulerades med PPD som beskrivs i metoder avsnittet och IL17A (till vänster) och IFNy (högra panelen) produktion analyserades med ELISA. (B) Total IgA, och M. tuberkulos (MTB) specifik IgA analyserades från BAL prover genom ELISA. Poolade data från två oberoende experiment visas. Data i diagrammen representeras som medelvärde + SD. (Tidigare publicerad 9). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Vaccin specifikaPulmonell immunsvar analyseras innan Utmaning med H37Rv. Grupper av sex DBA / 2-möss vaccinerades med den subkutana (BCG sc) eller intranasal (BCG i) rutt, eller icke-vaccinerade (NV) med BCG danska vaccin 10 6 CFU. En kontrollgrupp av icke-vaccinerade, icke-infekterade möss ingick också (NV / NI). Två månader efter vaccination, var möss utmanades intranasalt med en låg H37Rv dos (100 CFU), och en månad senare djuren avlivades. Vänster och höger lungor från samma djur användes för att bestämma bakteriehalten och IL17A- (A) eller IFNγ- (B) som producerar CD4 + celler, respektive. Data i vänstra panelen motsvarar procentandelen av cytokin-producerande celler, mätt med flödescytometri, och representeras som medelvärde + SD. Höger sida representerar data från bakteriehalten och cytokin- producera CD4 + celler som erhållits för varje mus. Linjär regression beräknades och p-värdet som erhållits i varje fall visas i fallet med IL17A. pooladedata från två oberoende experiment visas i figuren. (Tidigare publicerad 9). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Middlebrook 7H9 broth | BD | 271310 | |
| Middlebrook ADC Enrichment | BD | 211887 | |
| Tween 80 | Scharlau | TW00800250 | |
| 3-mm diameter Glass Beads | Scharlau | 038-138003 | |
| Middlebrook 7H10 Agar | BD | 262710 | |
| 1-ml syringe 26GA 0.45 x 10 mm | BD | 301358 | |
| GentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| M tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | |
| Collagenase D | Roche | 11088882001 | |
| DNaseI | Applichem | A3778,0100 | |
| Falcon 70 µm Cell Strainer | Corning | 352350 | |
| RPMI 1640 | Sigma | R0883 | |
| Red Blood Cell Lysing Buffer | Sigma | R7757 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | 100x concentrated |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sigma | P4333 | 100x concentrated |
| Fetal Calf Serum | Biological Industries | 04-001-1A | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M3148-25ML | |
| Scepter 2.0 Handheld Automated Cell Counter | Millipore | PHCC20040 | |
| Scepter Cell Counter Sensors, 40 µm | Millipore | PHCC40050 | |
| Mycobacterium Tuberculosis - Tuberculin PPD | Statens Serum Institut (SSI) | 2390 | |
| Mouse IFN-γ ELISA development kit | Mabtech | 3321-1H | |
| Mouse IL17A ELISA development kit | Mabtech | 3521-1H | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD4 | BD | 553047 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Kit | BD | 555028 | |
| APC-Cy7 Rat Anti-mouse IL-17A | BD | 560821 | |
| APC Mouse Anti-mouse IFNg | BD | 554413 | |
| LACHRYMAL OLIVE LUER LOCK 0.60 x 30 mm. 23G x 1 1/4” | UNIMED | 27.134 | Used as trachea cannula for BAL |
| high-protein binding polystyrene flat-bottom 96-well plates MAXISORP | NUNC | 430341 | |
| Albumin, from bovine serum | Sigma | A4503 | |
| Goat Anti-Mouse IgA (α-chain specific)−Peroxidase antibody | Sigma | A4789 | |
| 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) | Sigma | T0440 | |
| MyTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21107 | The kit Includes Buffer 5x |
References
- Zumla, A., et al. The WHO 2014 global tuberculosis report--further to go. Lancet Glob Health. 3 (1), e10-e12 (2015).
- Mangtani, P., et al. Protection by BCG vaccine against tuberculosis: a systematic review of randomized controlled trials. Clin Infect Dis. 58 (4), 470-480 (2014).
- Aguilo, N., et al. Pulmonary Mycobacterium bovis BCG vaccination confers dose-dependent superior protection compared to that of subcutaneous vaccination. Clin Vaccine Immunol. 21 (4), 594-597 (2014).
- Chen, L., Wang, J., Zganiacz, A., Xing, Z. Single intranasal mucosal Mycobacterium bovis BCG vaccination confers improved protection compared to subcutaneous vaccination against pulmonary tuberculosis. Infect Immun. 72 (1), 238-246 (2004).
- Giri, P. K., Verma, I., Khuller, G. K. Protective efficacy of intranasal vaccination with Mycobacterium bovis BCG against airway Mycobacterium tuberculosis challenge in mice. J Infect. 53 (5), 350-356 (2006).
- Lagranderie, M., et al. BCG-induced protection in guinea pigs vaccinated and challenged via the respiratory route. Tuber Lung Dis. 74 (1), 38-46 (1993).
- Gopal, R., et al. Interleukin-17-dependent CXCL13 mediates mucosal vaccine-induced immunity against tuberculosis. Mucosal Immunol. 6 (5), 972-984 (2013).
- Khader, S. A., et al. IL-23 and IL-17 in the establishment of protective pulmonary CD4+ T cell responses after vaccination and during Mycobacterium tuberculosis challenge. Nat Immunol. 8 (4), 369-377 (2007).
- Aguilo, N., et al. Pulmonary but Not Subcutaneous Delivery of BCG Vaccine Confers Protection to Tuberculosis-Susceptible Mice by an Interleukin 17-Dependent Mechanism. J Infect Dis. , (2015).
- Middlebrook, G., Cohn, M. L. Bacteriology of tuberculosis: laboratory methods. Am J Public Health Nations Health. 48 (7), 844-853 (1958).
- Brosch, R., et al. A new evolutionary scenario for the Mycobacterium tuberculosis complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (6), 3684-3689 (2002).
- Kaushal, D., et al. Mucosal vaccination with attenuated Mycobacterium tuberculosis induces strong central memory responses and protects against tuberculosis. Nat Commun. 6, 8533 (2015).
- Lochhead, J. J., Thorne, R. G. Intranasal delivery of biologics to the central nervous system. Adv Drug Deliv Rev. 64 (7), 614-628 (2012).
- Lochhead, J. J., Wolak, D. J., Pizzo, M. E., Thorne, R. G. Rapid transport within cerebral perivascular spaces underlies widespread tracer distribution in the brain after intranasal administration. J Cereb Blood Flow Metab. 35 (3), 371-381 (2015).
- Griffiths, K. L., et al. Cholera toxin enhances vaccine-induced protection against Mycobacterium tuberculosis challenge in mice. PLoS One. 8 (10), e78312 (2013).
- Hirota, K., et al. Plasticity of Th17 cells in Peyer's patches is responsible for the induction of T cell-dependent IgA responses. Nat Immunol. 14 (4), 372-379 (2013).
- Jaffar, Z., Ferrini, M. E., Herritt, L. A., Roberts, K. Cutting edge: lung mucosal Th17-mediated responses induce polymeric Ig receptor expression by the airway epithelium and elevate secretory IgA levels. J Immunol. 182 (8), 4507-4511 (2009).
