Vi beskriver en æggestokkene fad pad transplantation assay egnet til studier af normale og transformerede epitel af den kvindelige reproduktive tarmkanalen. Musen fedtpude tillader transplantation af store vævsfragmenter, er let tilgængelige for kirurgi og billedbehandling, og giver den gunstigste native miljø for væv af mullerian oprindelse.
Orthotopic transplantation assays in mice are invaluable for studies of cell regeneration and neoplastic transformation. Common approaches for orthotopic transplantation of ovarian surface and tubal epithelia include intraperitoneal and intrabursal administration of cells. The respective limitations of these methods include poorly defined location of injected cells and limited space volume. Furthermore, they are poorly suited for long-term structural preservation of transplanted organs. To address these challenges, we have developed an alternative approach, which is based on the introduction of cells and tissue fragments into the mouse fat pad. The mouse ovarian fat pad is located in the immediate vicinity of the ovary and uterine tube (aka oviduct, fallopian tube), and provides a familiar microenvironment for cells and tissues of these organs. In our approach fluorescence-labeled mouse and human cells, and fragments of the uterine tube are engrafted by using minimally traumatic dorsal incision surgery. Transplanted cells and their outgrowths are easily located in the ovarian fat pad for over 40 days. Long-term transplantation of the entire uterine tube allows correct preservation of all principle tissue components, and does not result in adverse side effects, such as fibrosis and inflammation. Our approach should be uniquely applicable for answering important biological questions such as differentiation, regenerative and neoplastic potential of specific cell populations. Furthermore, it should be suitable for studies of microenvironmental factors in normal development and cancer.
Transplantationskirurger assays, som involverer indførelse af celler og væv i specifikke steder på kroppen hos mus, udgør en væsentlig tilgang til studier af vævsregeneration og carcinogenese. Orthotopisk transplantationer af celler, det vil sige deres placering i en nativ miljø, er særligt vigtige for karakterisering af voksne stamceller. Eksistensen af mamma stamceller blev først foreslået af transplantation af epitelial brystkirtel fragmenter i kirtel-fri yverfedt puder af mus 1. Indpodning assays til humaniseret muse fedtpude 2 blev anvendt til at rekapitulere den regenerative potentiale og normal udvikling af humane primære bryst epitelceller. Desuden serielle og begrænsende udvanding transplantationer af fænotypisk distinkte celletyper i det ryddet brystfedtpuden var afgørende for at teste selvfornyelse kapacitet og multilineage differentiering af mamma stamceller 3-5 den. Transplantation analyser i combination med genetisk afstamning sporing fremlagt dokumentation af cellen af oprindelse i brystkirtler carcinogenese fem. Nyre kapsel transplantationer er almindeligt anvendt til afprøvning egenskaber af formodede prostata stamceller 6. Ortotopisk transplantation af normalt og neoplastisk mus og human pancreas organoids afslørede gener og pathways ændret i kræft progression 7. Betydningen af det oprindelige miljø er også blevet støttet af demonstration af forskellige regenerering efter indpodninger af svedkirtler i forskellige steder, såsom yverfedt puder, skulder fedtpuder og tilbage hud 8.
Bughulen og ovarie bursa anvendes sædvanligvis som steder for ortotopisk transplantation af epitelceller i kvindelige reproduktive tarmkanalen 9-12. Begge disse metoder har en række begrænsninger. Intraperitoneal injektion af celler fører til deres implantationer i forskellige områder af bughulen, hvorved complicating overvågning cellulær vækst. Endvidere variationer i mikromiljøet, såsom omfanget af vaskularisering, innervation og immun celle repræsentation, kan være ganske betydelig i forskellige områder af bughulen. Den æggestokkene bursa har en meget begrænset mængde, hvilket muliggør injektion af højst 10 pi væske. Dette begrænser i væsentlig grad mængden af celler, der kan indgives. Desuden kan injektioner i æggestokkene bursa være ganske teknisk udfordrende og proceduren kræver en betydelig mængde tid.
For at løse disse begrænsninger, har vi udnyttet de æggestokkene fedt pad egenskaber. Musen æggestokkene fedtpude har en stor størrelse, er tilstødende til ovariet og æggelederen, og er let tilgængeligt med kirurgi. Det er blevet rapporteret, at equin trofoblasten kan transplanteres i musen æggestokkene fedtpude 13. detaljerne i denne metode blev imidlertid ikke beskrevet. Det blev heller ikke rapporteret om dette migThOD kan påføres voksne celler og væv. Her beskriver vi en pålidelig fremgangsmåde til transplantation af muse og humane celler i den kvindelige reproduktive tarmkanalen og viser, at denne metode også kan anvendes til langsigtet organtransplantation.
Vi har etableret en æggestokkene fedtpude transplantation assay, som giver mulighed for præcis levering og detektion af epiteliale celler og væv. Den æggestokkene fedtpude assay transplantation procedure er mindre teknisk udfordrende end intrabursal injektion 10-12 og giver mulighed for mere ensartet og præcis placering af transplanterede celler sammenlignet med intraperitoneal injektion 9. Det er også velegnet til langsigtet transplantation af et helt organ, såsom æggelederen.
Vigtigere er det, æggestokkene fedt pad giver en velkendt mikromiljø for epitel af den kvindelige reproduktive system. Det bør være særligt velegnet til studier af de molekylære og cellulære egenskaber af mennesker og mus æggestokkene og æggelederne epitel celler under regenerering og malign transformation. I modsætning til andre organer, har kun få undersøgelser fokuseret på identifikation og karakterisering af stamceller i epiteler af den kvindelige reproductive tarmkanalen 18,19. Sådanne undersøgelser er af særlig betydning, fordi mange kræftformer menes at stamme fra voksne stamceller 20. Alligevel cellulære oprindelse af epitelial ovariecancer forblive yderst diskutabel 18. Epiteliale ovariecancer tegner sig for størstedelen af ovariecancer og er i 5. plads blandt alle kræftrelaterede dødsfald blandt kvinder i USA 21. Således udvikling af en ortotopisk assay med flere fordele i forhold de eksisterende transplantationsteknikker 9-12 bør i høj grad lette undersøgelser på dette område.
I betragtning af den overfladiske placering af æggestokkene fedt pad, kan små dyr billeddannende systemer bruges til at følge op på indpodninger mærket med stærk fluorescerende eller bioluminiscerende journalister. Det bør også være muligt at etablere minimalt invasive høj opløsning levende imaging assays, såsom ikke-lineær mikroskopi 22. Den ovarie fedtpude kan også opbevares i organkulturer, derved tilladeing tredimensionel kultur af normalt og neoplastisk epitel under forhold nøje den gentog organisering af celler og den ekstracellulære matrix. Fremtidige undersøgelser bør tage disse lovende muligheder.
Flere kritiske trin skal overvejes. Giver en varmepude og holde gnavere varm under kirurgi forbedrer i høj grad overlevelsen. Sterilitet instrumenter håndterer fedtpuden sikrer, at inkorporerede systemer holdes sterile. Det er vores erfaring, signifikant blødning resulterer i væksthæmning af transplantationer. Vigtigt er, bør fedtpuden snittet blive lagt netop fordi rive fedtpuden eller punktere det gennem forårsager blødninger. Koaguleringsmidler bør anvendes til at stoppe blødningen som nødvendigt. Hvis indpodninger ikke udvikler, bør betragtes som en højere koncentration af injicerede celler. De første succesfulde udvækster kan observeres så tidligt som en uge efter transplantationen og mest indpodninger skal være synlig énmåned efter indgrebet. Til transplantation, kan nåle med større diameter (23-25 G) anvendes til at forhindre forskydning af store celler (over 10 um i diameter). Dog kan sådanne nåle være mere traumatisk for fedt pad og deres anvendelse bør testes på forhånd. For vores eksperimenter har vi anvendt 6 til 8 uger gamle donor- og recipientmus. For begge formål kan anvendes yngre eller ældre mus. Imidlertid skal antallet af injicerede celler, der skal justeres. Den mindre størrelse af æggestokkene fedtpuder hos yngre donorer skal også overvejes.
Som med alle metoder, der er nogle begrænsninger af muse æggestokkene fedtpude transplantation assay. Selvom syngene immunkompetente mus kan anvendes til murine primære celler / væv, vores teknik kræver NSG eller SCID-mus til transplantation af humant materiale. Det er sandsynligt muligt at humanisere fedtpuden at understøtte væksten af humane epitelceller. Vi har dog ikke testet denne fremgangsmåde endnu. Anvendelse af yngre fehanner kan føre til lavere omkostninger avl; imidlertid modne jomfruelige hunmus (alder 8 til 10 uger) har en større fedtpude, hvorved transplantation af større emner. Endelig bør laboratoriepersonale uddannes i dyr operation for at sikre en rettidig og vellykket gennemførelse af proceduren.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Dr. Andrew K. Godwin, University of Kansas Medical Center, for at sikre de menneskelige celler HIO118. Disse undersøgelser blev støttet af tilskud fra New York Stem Cell Program (NYSTEM, T028095) og National Institutes of Health / National Institute of Child Health and Human Development (P50HD076210) til AFN, og af tilskud fra NYSTEM (C028125, C024174 og T028095), National Institutes of Health / National Cancer Institute (CA182413) og æggestokkene Cancer Research Fund (327.516) til Ayn.
25 gauge needle | BD Becton Dickinson | 305122 | |
28 gauge needle (hypodermic syringe with attached needle) | Kendall | 30339 | Part Number: 8881500014 |
basic fibroblast growth factor-2 | Sigma-Aldrich | F9786 | |
basement membrane matrix (Geltrex) | Invitrogen | A1413202 | |
β-actin-DsRed mice | The Jackson Laboratory | 6051 | B6.Cg-Tg(CAG-DsRed*MST)1Nagy/J |
β-actin-EGFP mice | The Jackson Laboratory | 3291 | C57BL/6-Tg(CAG-eGFP)1Osb/J |
β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
bovine albumin | Sigma-Aldrich | A3311 | |
chloroform | VWR | EM-CX1058-1 | |
collagenase/hyaluronidase | Stem Cell Technologies | 7912 | |
cryogenic vials | Thermo Scientific Nunc | 377267 | |
dispase II | Worthington | NPRO2 | |
DMEM F12 (HAM's) | Corning | 10-092-CV | |
DNaseI (Deoxyribonuclease I) | Stem Cell Technologies | 7900 | |
embedding medium for frozen tissue specimens (O. C. T.) | Sakura Finetek | 4583 | |
epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E4127 | |
ethanol 200 proof | Koptec | V1001 | to prepare 70% |
fetal bovine serum | Sigma | F4135 | |
filter tip 0.1-10/20µlXL | USA Scientific | 1120-3810 | |
FOXJ1 antibody | eBioscience | E10109-1632 | used at concentration 1:1000 (no unmasking) |
hydrocortisone | Sigma | H0135 | |
laboratory film (Parafilm M) | American National Can | PM-999 | |
L-Glutamine | Corning | 25-005-Cl | |
insulin-transferin-sodium selenite | Sigma-Aldrich | I884 | |
isoflurane, 250 ml | Santa Cruz Animal Health | sc-363629Rx | |
low attachment plate 24-well | Costar | 3473 | |
MEM non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | |
metal histology molds | Electron Microscopy Sciences | 62527-22 | |
microscope, inverted | Nikon | Eclipse TS 100 | |
microscope, stereo | Nikon | SMZ800 | |
Nod/SCID/gamma (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 05557 | NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ |
paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
paraffin (Paraplast, X-TRA) | Fisher Thermo Scientific | 23-021-401 | |
PAX8 antibody | Proteintech | 10336-1-AP | used at concentration 1:1000 (no unmasking) |
PBS (Phosphate-Buffered Saline) | Corning | 21-030-CV | |
penicillin streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
severe combined immunodeficiency (SCID/NCr) mice, BALB/C background) | NCI-Frederick Animal Production Program | 01S11 | |
sodium pyruvate | Corning | 25-000-Cl | |
specimen processing gel (HISTOGEL) | Richard-Allan Scientific | HG-4000-012 | |
sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
Trypsin-EDTA, 25% | Corning | 25-053-Cl |