אנו מתארים assay השתלת כרית תחביב השחלות מתאים מחקרים של אפיתלים נורמלי טרנספורמציה של מערכת הרבייה הנשית. כרית שומן העכבר מאפשרת השתלה של שברי רקמות גדולים, נגיש בקלות לניתוח והדמיה, ומספקת את הסביבה הטבעית הטובה ביותר עבור רקמות ממוצא Müllerian.
Orthotopic transplantation assays in mice are invaluable for studies of cell regeneration and neoplastic transformation. Common approaches for orthotopic transplantation of ovarian surface and tubal epithelia include intraperitoneal and intrabursal administration of cells. The respective limitations of these methods include poorly defined location of injected cells and limited space volume. Furthermore, they are poorly suited for long-term structural preservation of transplanted organs. To address these challenges, we have developed an alternative approach, which is based on the introduction of cells and tissue fragments into the mouse fat pad. The mouse ovarian fat pad is located in the immediate vicinity of the ovary and uterine tube (aka oviduct, fallopian tube), and provides a familiar microenvironment for cells and tissues of these organs. In our approach fluorescence-labeled mouse and human cells, and fragments of the uterine tube are engrafted by using minimally traumatic dorsal incision surgery. Transplanted cells and their outgrowths are easily located in the ovarian fat pad for over 40 days. Long-term transplantation of the entire uterine tube allows correct preservation of all principle tissue components, and does not result in adverse side effects, such as fibrosis and inflammation. Our approach should be uniquely applicable for answering important biological questions such as differentiation, regenerative and neoplastic potential of specific cell populations. Furthermore, it should be suitable for studies of microenvironmental factors in normal development and cancer.
מבחני השתלה, אשר כרוך המבוא של תאים ורקמות למתחמי גוף ספציפיים בעכברים, מייצגים גישה חיונית ללימודים של התחדשות רקמות סרטן. השתלות orthotopic של תאים, כלומר, המיקום שלהם לתוך סביבה מקומית, חשובים במיוחד לאפיון של תאי גזע בוגרים. קיומו של בתאי גזע חלב הוצע לראשונה על ידי ההשתלה של שברי בלוטת חלב אפיתל לתוך רפידות שומן חלב ללא בלוטה של עכברי 1. מבחני engraftment לרפד שומן העכבר האנושי 2 שימשו לשחזר את פיתוח הפוטנציאל ונורמלי ההתחדשות של תאי אפיתל שד ראשוני האדם. יתר על כן, השתלות דילול סדרתי והגבלה של סוגי תאים מובחנים phenotypically לתוך כרית שומן חלב הפינה היו מכריעות על מנת לבחון את יכולת התחדשות העצמית והבחנת multilineage של תאי גזע חלב 3-5. מבחני השתלה ב הקומבינאטיון עם שושלת גנטית איתור ספק עדויות של התא מוצא חלב סרטן 5. השתלות כליה הקפסולה משמשות לבדיקת תכונות של תאי גזע הערמונית המשוערת 6. השתלת orthotopic של עכבר רגיל ו אנטינאופלסטיים organoids לבלב אנושיים גילה גנים ושבילים שינו בהתקדמות סרטן 7. חשיבותה של סביבת היליד גם כבר נתמכה על ידי הפגנת ההתחדשות מגוונת לאחר engraftments של בלוטות זיעה לתוך במקומות שונים, כגון רפידות שומן חלב, רפידות שומן כתף, ו -8 עור בחזרה.
חלל הצפק ואת בורסת השחלות בדרך כלל משמשים כמקומות להשתלת orthotopic של תאי אפיתל של דרכי הנשית רביית 9-12. שתי שיטות אלה יש מספר מגבלות. הזרקת Intraperitoneal של תאים מובילות ההשתלות שלהם בתחומים שונים של חלל הצפק, ובכך complicating מעקב גדילה הסלולר. יתר על כן, שינויים במיקרו-סביבה, כגון היקף כלי הדם, עצבוב וייצוג תא החיסון, עשוי להיות משמעותי למדי באזורים שונים של חלל הצפק. בורסת ההשחלות יש נפח מוגבל מאוד, המאפשר הזרקה לא יותר מ -10 μl של נוזל. זה משמעותי מגביל את כמות תאים שיכולים להינתן. יתר על כן, זריקות לתוך בורסת ההשחלות יכולות להיות מאתגרות למדי מבחינה טכנית ואת ההליך דורש כמות משמעותית של זמן.
כדי לטפל במגבלות אלה, נקטנו מיתרונות החומרים כרית שומן השחלות. כרית שומן עכבר השחלות יש גודל גדול, צמוד השחלה ואת צינור הרחם, והוא נגיש בקלות על ידי ניתוח. זה כבר דווח כי trophoblast סוסים ניתן להשתיל לתוך כרית שומן עכבר שחלות 13. עם זאת הפרטים של שיטה זו לא תוארו. זה גם לא דווח אם לי זהthod ניתן ליישם תאים בוגרים ורקמות. כאן, אנו מתארים גישה אמינה עבור ההשתלה של עכבר תאים אנושיים של מערכת הרבייה הנשית ולהראות כי שיטה זו תופסת גם לגבי השתלת איבר לטווח ארוכה.
הקמנו assay השתלת כרית שומן השחלות המאפשרת משלוח וזיהוי מדויק של תאים ורקמות האפיתל. הליך השתלת assay כרית שומן השחלות הוא פחות מאתגר מבחינה טכנית מאשר זריקת intrabursal 10-12 ומאפשר אחידים יותר ומיקום מדויק של תאים מושתלים לעומת הזרקת intraperitoneal 9. כמו כן הוא מתאים היטב להשתלה לטווח ארוך של איבר שלם, כגון צינור הרחם.
חשוב לציין, כרית שומן השחלות מספק microenvironment מוכר epithelia של מערכת הרבייה הנשית. זה צריך להיות מתאים במיוחד עבור מחקרים של המאפיינים המולקולריים התאיים של שחלות אדם ועכבר ותאים אפיתל תובל במהלך רגנרציה, שינוי ממאיר. בניגוד לאיברים אחרים, כמה מחקרים התמקדו זיהוי ואפיון של תאי גזע האפיטל של r הנקבהeproductive בדרך 18,19. מחקרים כאלה הם בעלי חשיבות מיוחדת בגלל סרטן רבים הם האמינו מקורן בתאי גזע בוגרים 20. עם זאת מקור תאי של סרטן שחלות אפיתל להישאר מאוד במחלוקת 18. סרטן השחלות אפיתל להסביר את רוב מקרי סרטן השחלות והיא נמצאת במקום ה -5 בין כל מקרי המוות הקשורים לסרטן של נשים בארצות הברית 21. לכן פיתוח של assay orthotopic עם מספר יתרונות על פני שיטות ההשתלה קיימת 9-12 אמור להקל מאוד מחקרים בתחום זה.
בהתחשב במיקום השטחי של כרית שומן שחלות, מערכות הדמית חיה קטנות שניתן להשתמש בם כדי לעקוב אחר engraftments שכותרתו עם פלורסנט החזק או כתבי bioluminescent. זה גם צריך להיות אפשרי להקים מבחני הדמיה לחיות פולשנית ברזולוציה גבוהה, כגון מיקרוסקופיה שאינו ליניארי 22. כרית שומן השחלות יכול גם להיות כל הזמן בתרבויות איברים, ובכך לאפשרing תרבות תלת מימדי של אפיתלים נורמלי נאופלסטיות בתנאים מקרוב משחזרת הארגון של תאים הבין-תאי. מחקרים עתידיים צריכים להתייחס האפשרויות המבטיחות הללו.
יש שלבים קריטיים כמה שיש לקחת בחשבון. מתן כרית חימום ושמירת מכרסמים חמים במהלך הניתוח משפרת את שיעור ההישרדות מאוד. עקרות של מכשירי טיפול כרית השומן מבטיחות כי מערכות engrafted נשמרות סטרילי. מניסיוננו, תוצאות דימום משמעותי בגדילה של השתלות. חשוב לציין, חתך כרית השומן צריך להיעשות דווקא משום קורע כרית השומן או תיקבו אותו דרך גורמי דימום. יש להשתמש מקריש כדי לעצור את הדימום לפי הצורך. אם engraftments אינם מפתחים, ריכוז גבוה יותר של התאים מוזרקים צריך להיחשב. בצמחים המוצלחים הראשונים ניתן להבחין מוקדם ככל שבוע לאחר ההשתלה ורוב engraftments צריך להיות אחד גלויחודש לאחר ההליך. להשתלה, מחטים עם קוטר גדול יותר (23-25 G) יכולות לשמש כדי למנוע מריחה של תאים גדולים (מעל 10 מיקרומטר קוטר). עם זאת, מחטים כאלה עשויות להיות יותר טראומטיות כרית השומן והשימוש בם צריך להיבדק מראש. בניסויים שלנו השתמשנו עכברים תורמים ומקבל ישנים 6 עד 8 בשבוע. עבור שתי המטרות עכברים צעירים או מבוגרים יכולים לשמש. עם זאת, מספר תאים המוזרקים ייתכן שיהיה צורך מותאם. הגודל הקטן יותר של רפידות שומן השחלות תורמות צעיר גם צריך להיחשב.
כמו עם כל שיטות, ישנן מספר מגבלות של assay השתלת כרית שומן עכבר שחלות. למרות עכברים חיסוניים מוסמכת syngeneic יכולים לשמש תאים / רקמות עיקריות בעכברים, הטכניקה שלנו דורשת NSG או עכברי SCID להשתלה של חומר אנושי. סביר להניח שאפשר להאניש את כרית השומן כדי לתמוך בצמיחה של תאי אפיתל אנושיים. עם זאת, אנחנו עדיין לא נבחנו גישה זו עדיין. שימוש צעיר Feזכרים עשויים להוביל לעלויות גידול נמוכות; יש עם זאת, עכברות שלא הרו בוגרות (גיל 8 עד 10 שבועות) כרית שומן גדולה יותר, ובכך לאפשר השתלה של דגימות גדולות. לבסוף, אנשי מעבדה צריכים להיות מיושמים על בכירורגיה חי כדי להבטיח את ביצוע בזמן והמוצלח של ההליך.
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להודות לד"ר אנדרו ק גודווין, מהמרכז הרפואי של אוניברסיטת קנזס, למתן תאים אנושיים HIO118. מחקרים אלה נתמכו על ידי תרומות של תוכנית תא גזע ניו יורק (NYSTEM; T028095) ו המכונים הלאומיים מכון בריאות / הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם (P50HD076210) כדי AFN, ועל ידי מענקי NYSTEM (C028125, C024174 ו T028095), National Institutes of מכון הסרטן בריאות / לאומי (CA182413) וקרן מחקר סרטן השחלות (327,516) כדי AYN.
25 gauge needle | BD Becton Dickinson | 305122 | |
28 gauge needle (hypodermic syringe with attached needle) | Kendall | 30339 | Part Number: 8881500014 |
basic fibroblast growth factor-2 | Sigma-Aldrich | F9786 | |
basement membrane matrix (Geltrex) | Invitrogen | A1413202 | |
β-actin-DsRed mice | The Jackson Laboratory | 6051 | B6.Cg-Tg(CAG-DsRed*MST)1Nagy/J |
β-actin-EGFP mice | The Jackson Laboratory | 3291 | C57BL/6-Tg(CAG-eGFP)1Osb/J |
β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
bovine albumin | Sigma-Aldrich | A3311 | |
chloroform | VWR | EM-CX1058-1 | |
collagenase/hyaluronidase | Stem Cell Technologies | 7912 | |
cryogenic vials | Thermo Scientific Nunc | 377267 | |
dispase II | Worthington | NPRO2 | |
DMEM F12 (HAM's) | Corning | 10-092-CV | |
DNaseI (Deoxyribonuclease I) | Stem Cell Technologies | 7900 | |
embedding medium for frozen tissue specimens (O. C. T.) | Sakura Finetek | 4583 | |
epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E4127 | |
ethanol 200 proof | Koptec | V1001 | to prepare 70% |
fetal bovine serum | Sigma | F4135 | |
filter tip 0.1-10/20µlXL | USA Scientific | 1120-3810 | |
FOXJ1 antibody | eBioscience | E10109-1632 | used at concentration 1:1000 (no unmasking) |
hydrocortisone | Sigma | H0135 | |
laboratory film (Parafilm M) | American National Can | PM-999 | |
L-Glutamine | Corning | 25-005-Cl | |
insulin-transferin-sodium selenite | Sigma-Aldrich | I884 | |
isoflurane, 250 ml | Santa Cruz Animal Health | sc-363629Rx | |
low attachment plate 24-well | Costar | 3473 | |
MEM non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | |
metal histology molds | Electron Microscopy Sciences | 62527-22 | |
microscope, inverted | Nikon | Eclipse TS 100 | |
microscope, stereo | Nikon | SMZ800 | |
Nod/SCID/gamma (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 05557 | NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ |
paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
paraffin (Paraplast, X-TRA) | Fisher Thermo Scientific | 23-021-401 | |
PAX8 antibody | Proteintech | 10336-1-AP | used at concentration 1:1000 (no unmasking) |
PBS (Phosphate-Buffered Saline) | Corning | 21-030-CV | |
penicillin streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
severe combined immunodeficiency (SCID/NCr) mice, BALB/C background) | NCI-Frederick Animal Production Program | 01S11 | |
sodium pyruvate | Corning | 25-000-Cl | |
specimen processing gel (HISTOGEL) | Richard-Allan Scientific | HG-4000-012 | |
sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
Trypsin-EDTA, 25% | Corning | 25-053-Cl |