Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

הסינתזה של RGD פונקציונלית הידרוג ככלי יישומים טיפוליים

Published: October 7, 2016 doi: 10.3791/54445
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemistry, Materials and Chemical Engineering "Giulio Natta", Politecnico di Milano

Introduction

הידרוג הן רשתות תלת מימדי נוצר על ידי פולימרים צולבים הידרופילי, אשר הם טבעיים או סינתטיים, ואת המאופיינת במבנה תלת מימדי ייחודי. מכשירים אלו אטרקטיביים יותר ויותר בתחומי הביו-הרפואיים של אספקת סמים, הנדסת רקמות, נושאות גנים 1,2 חיישנים חכמים. אכן, תכולת המים הגבוהה שלהם, כמו גם המאפיינים rheological המכאניים שלהם להפוך אותם מועמדים מתאימים לחקות microenvironments רקמות רך ולגרום להם כלים יעילים ציטוקינים מסיסים במים או מסירת גורם גדילה. אחד לשימוש המבטיח ביותר הוא בתור ביולוגי בזריקות נושאת תאי תרכובות ביו. הידרוג עשוי לשפר הישרדות תא ואת גורלו תאי גזע מלא על ידי החזקה ודווקא מתן אותות רגולטוריות תאי גזע באופן רלוונטי פיסיולוגי, כפי שנצפה במבחנה בניסויי vivo 3,4. היתרון המוביל של זה הוא האפשרותכדי לשמור על תאים מוזרקים בתוך האזור של חיסון (in situ), הפחתת כמות התאים שמשאירה את שטח extravasates לתוך מבול הדם, נודד בכל רחבי הגוף ואיבוד יעד המטרה 5. היציבות של רשתות הידרוג'ל תלת ממדי נובעת מאתרי cross-linking שלה, שהוקמו על ידי קשרים קוולנטיים או כוחות משיכה בין שרשרות הפולימר 6.

במסגרת זו, כימיה סלקטיבית מאונכת להחיל שרשרות פולימר הוא כלי תכליתי מסוגל לשפר את הביצועים הידרוג'ל 7. ואכן, השינוי של פולימרים עם קבוצות כימיות מתאימות יכול לעזור לספק כימי מתאים, פיזי תכונות מכאניות לשפר כדאיויות תא והשימוש בם היווצרות רקמה. באותו אופן, בין הטכניקות לטעון תאים או גורמי גדילה בתוך מטריצת ג'ל, השימוש של פפטיד RGD מאפשר שיפורי הידבקות תא והישרדות. RGD הוא tripeptide מורכבשל ארגינין, גליצין וחומצה אספרטית, שהוא בלי ספק היעיל ביותר, ולעתים קרובות מועסקי tripeptide בשל יכולתה לטפל יותר קולטן הידבקות תא אחד וההשפעה הביולוגית שלה על עיגון תא, התנהגות והישרדות 8,9. בעבודה זו, הסינתזה של הידרוג הפונקציונלית RGD נלמדת במטרה בעיצוב הרשתות מאופיינות תכונות הביוכימיות מספיק עבור microenvironment תא מסבירי פנים.

שימוש קרינת מיקרוגל בסינתזה הידרוג'ל מציע הליך פשוט כדי למזער תגובות לוואי ולקבל שיעורי תגובה גבוהים ותשואות בתוך פרק זמן קצר יותר לעומת התהליכים התרמיים הקונבנציונליים 10. שיטה זו אינה דורשת צעדים טיהור והתשואות הידרוג'ל סטרילית בשל אינטראקציות של פולימרים והיעדר ממיס אורגני במערכת התגובה 11. לכן, היא מבטיחה באחוזים גבוהים של RGD צמוד רשת הפולימרים כי אף modifications נדרש הקבוצות הכימיות פולימר המעורבים ביצירת ג'ל. קבוצות carboxyl, מן PAA ו carbomer, וקבוצות הידרוקסיל, מ PEG ו agarose, להצמיח את המבנה התלת-ממדי הידרוג'ל באמצעות תגובה polycondensation. הפולימרים ציינו משמשים לסינתזה של הידרוג בטיפולים תיקון פגיעה בחוט השדרה 12. התקנים אלה, כפי שדווח קודם עובד 13,14, להראות התאמה ביולוגית גבוהה, כמו גם תכונות מכניות physicochemical הדומים לאלו של רקמות חיות רבות בטבע thixotropic. יתר על כן, הם נשארים מקומי באתרו, על אזור ההזרקה.

בעבודה זו, קבוצות carboxyl PAA הם שונים עם מחצית אלקין (איור 1), וכן תרכובת RGD-יזיד הוא מסונתזת ניצול תגובתיות של קבוצת מסוף tripeptide -NH 2 עם תרכובת כימית מוכנה עם מבנה (CH 2) n - N 3 (<strong> איור 2). כתוצאה מכך, PAA השונה מגיב עם נגזר RGD-יזיד הקלקה CuAAC התגובה 15-17 (איור 3). שימוש זרז נחושת (I) מוביל לשיפורים משמעותיים בשני קצב התגובה ואת רגיוסלקטיביות. התגובה CuAAC נעשה שימוש נרחב סינתזה אורגנית ב מדע הפולימרים. הוא משלב יעילות גבוהה וסובלנות גבוהה הקבוצות הפונקציונליות, וזה מושפע שימוש בממסים אורגניים. סלקטיביות גבוהה, זמן תגובה מהיר הליך טיהור פשוט לאפשר הקניית פולימרי כוכב, קופולימרים לחסום או שרשרות השתלת moieties רצוי 18. האסטרטגיה לחץ זה מאפשר לשנות פולימרים לאחר פילמור להתאים אישית את מאפייני physicochemical בהתאם ליישום ביוכימיים הסופי. תנאי ניסוי CuAAC הם לשחזור בקלות (התגובה היא לא רגישה למים, ואילו חמצון נחושת עלול להתרחש מינימאלי), והמהותtriazole נוצר מבטיח יציבות של המוצר. השימוש מתכת נחושת יכול להיחשב נקודה קריטית, עקב השפעה רעילה הפוטנציאל שלה נגד תאים והן במיקרו-סביבה ביולוגית, אבל דיאליזה משמש כשיטה טיהור כדי לאפשר פינוי מוחלט של שאריות קטליטי. לבסוף, PAA שונה RGD משמש סינתזה הידרוג'ל (איור 4) ואת מאפייני physicochemical של רשתות וכתוצאה נחקרות, על מנת לבדוק את הפונקציונליות הפוטנציאל של מערכות אלה כנשאים תאים או סמים.

איור 1
איור 1: PAA שונה סינתזה אלקין סכימה של functionalization PAA עם קבוצת אלקין;. "n" מציין את מונומרים עם קבוצת carboxyl מגיבים עם propargylamine. אנא לחץ כאן לצפייהגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2:.. סינתזה-יזיד RGD הסינתזה של נגזרי RGD-יזידו אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: לחץ תגובת תכנית תגובה קליק בין נגזרת RGD-יזיד ו-PAA אלקין.. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: הידרוג'ל synthesis. הליך סינתזת הידרוג'ל פונקציונלי RGD. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: כימיקלים המשמשים כפי שהתקבלו. לינארית RGD נרכש, אבל זה יכול להיות מוכן על ידי סינתזה פפטיד שלב מוצק רגיל Fmoc 16,19. ממסים של כיתת אנליטי. הדיאליזה מחייבת שימוש קרום עם M w חתוך שווה 3,500 Da. התרכובות המסונתזות מאופייני 1 ספקטרום NMR H ונרשם על כלורופורם באמצעות ספקטרומטר 400 MHz (CDCl 3) או תחמוצת דאוטריום (D 2 O) כמו ממסים, משמרות כימיות מדווחות כערכים δ חלקים למ'. יתר על כן, הידרוג חשוף ניתוח FT-IR באמצעות טכניקה גלולה KBR והאפיון הפיזי שלהם כרוך מחקרי gelation הוערכו באמצעות המבחנה ההפוכה ב 37 ° C.

1. סינתזה של 4-Azidobutanoyl כלוריד 1

  1. ממיסים 500 מ"ג של 4-azidobutanoic חומצה (3.90 מילימול) ב 10 מ"ל של dichloromethane ו -0.5 מ"ל של dimethylformamide.
  2. מצננים את הפתרון ב 0 ° C, באמצעות אמבט קרח.
  3. להוסיף 505 μl של כלוריד oxalyl (5.85 מילימול) עד ​​5 מ"ל של dichloromethane ולאט לאט מוסיפים dropwise למערכת התגובה, תוך ערבוב.
  4. אחרי שעה 1 ב 0 ° C באמצעות באמבט קרח, לחזור לטמפרטורת החדר.
  5. הסר את הממס בלחץ מופחת באמצעות המאייד רוטרי.
  6. לאפיין את המוצר הנרכש על ידי 1 ספקטרוסקופיה H-NMR, המסת המדגם ב CDCl 3 16.

2. סינתזה של-אזיד RGD נגזרים 2

  1. ממיסים 50 מ"ג של RGD (0.145 mmol) ב 1 מ"ל של 1 M NaOH.
  2. ממיסים 24 מ"ג 1 (0.16 מילימול) ב 2 מ"ל של tetrahydrofuran.
  3. להוסיף את כל הפתרון RGD כדי dropwise פתרון 1 ב 0 ° C באמצעות אמבט קרח.
  4. לחזור לטמפרטורת החדר ומערבבים לילה.
  5. הוסף 1 מ"ל של 1 M HCl.
  6. הסר את הממס בלחץ מופחת באמצעות המאייד רוטרי.
  7. לאפיין את OBTained המוצר על ידי 1 ספקטרוסקופיה H-NMR, המסת מדגם D 2 O 16.

3. PAA אלקין שינוי 3

  1. ממיסים 200 מ"ג של 35% w / w פתרון PAA (2.8 מילימול) ב 15 מ"ל מים מזוקקים.
  2. הוסף 15.4 מ"ג הידרוכלוריד propargylamine (0.20 מילימול).
  3. ממיסים 42.8 מ"ג של מימה 1-hydroxybenzotriazole (HOBt, 0.28 מילימול) ב 14 מ"ל של 1: פתרון מים מזוקקים על ידי חימום עד 50 מעלות צלזיוס: 1 v / v אצטוניטריל.
  4. להוסיף את כל הפתרון HOBt לפתרון PAA בטמפרטורת החדר.
  5. הוסף 53.6 מ"ג של ethyldimethylaminopropylcarbodiimide (EDC, 0.28 מילימול) לתערובת התגובה.
  6. השתמש 1 M HCl כדי להתאים את ה- pH ל 5.5 ומערבבים מערכת התגובה הלילה בטמפרטורת החדר.
  7. Dialyze הפתרון. ממיסים 11.2 גרם של נתרן כלורי ב 2 ליטר של מים מזוקקים ולאחר מכן להוסיף 0.2 מ"ל של 37% w / w HCl. Dialyze הפתרון באמצעות קרום עם M w החתוך של 3.5 kDa.
  8. perform דיאליזה במשך שלושה ימים. שנה את הפתרון דיאליזה יומי עם 2 ליטר של מים מזוקקים מוכן טרי המכיל 0.2 מ"ל של 37% w / w HCl.
  9. אחסן את הפתרון הסופי ב -80 מעלות צלזיוס. Lyophilize אותו lyophilizer על פי הפרוטוקולים של היצרן.
  10. לאפיין את הפולימר הפונקציונלי ידי 1 ספקטרוסקופיה H-NMR, המסת מדגם D 2 O 16.

4. סינתזה של PAA-RGD פולימר 4

  1. ממיסים 78 מ"ג של PAA שונה אלקין 3 (1.083 mmol) ב 10 מ"ל מים מזוקקים.
  2. ממיסים 25 מ"ג של הנגזר אזיד 2 RGD (0.0722 מילימול) ב 5 מ"ל של tetrahydrofuran.
  3. להוסיף את כל הפתרון RGD לפתרון פולימריים.
  4. להוסיף 2.2 מ"ג של יודיד נחושת (0.0116 מילימול) ו -2.2 מ"ג של ascorbate נתרן (0.0111 מילימול).
  5. ריפלוקס את התערובת וכתוצאה מכך לילה בשעה 60 ° C, עם ערבוב.
  6. מצננים את התערובת עד 25 מעלות צלזיוס.
  7. Dialyzדואר הפתרון. ממיסים 11.2 גרם של נתרן כלורי ב 2 ליטר של מים מזוקקים ולאחר מכן להוסיף 0.2 מ"ל של 37% w / w HCl. Dialyze הפתרון באמצעות קרום עם M w החתוך של 3.5 kDa.
  8. בצע דיאליזה במשך שלושה ימים. שנה את הפתרון דיאליזה יומי עם 2 ליטר של מים מזוקקים מוכן טרי המכיל 0.2 מ"ל של 37% w / w HCl.
  9. אחסן את הפתרון הסופי ב -80 מעלות צלזיוס. Lyophilize אותו lyophilizer על פי הפרוטוקולים של היצרן.
  10. לאפיין את המוצר הנרכש על ידי 1 ספקטרוסקופיה H-NMR, המסת מדגם D 2 O 16.

5. פונקציונליות RGD סינתזה הידרוג'ל

  1. הכן את PBS. ממיסים 645 מ"ג מלח PBS ב 50 מ"ל מים מזוקקים.
  2. ערבבו 40 מ"ג של carbomer ו -10 מ"ג של פונקציונליות PAA 4 ב 9 מ"ל של PBS (שלב 5.1), בטמפרטורת החדר, עד המסה מלאה (30 דק ').
  3. הוספת 400 מ"ג של PEG לפתרון ולשמור ערבוב במשך 45 דקות.
  4. עצור את הערבוב ולאפשר למערכת להתיישב למשך 30 דקות.
  5. השתמש 1 N NaOH כדי להתאים את pH 7.4.
  6. עד 5 מ"ל של תערובת שהושג, להוסיף 25 מ"ג של אבקת agarose.
  7. מקרין את המערכת עם קרינת מיקרוגל ב -500 W עד רתיחה, במשך זמן בדרך כלל בין 30 שניות ו 1 דקות, ולאחר אלקטרומגנטית לחמם עד 80 מעלות צלזיוס.
  8. השאירו את התערובת חשופים בטמפרטורת החדר עד לטמפרטורה יורדת ל -50 מעלות צלזיוס, להוסיף 5 מ"ל של PBS (שלב 5.1), על מנת לקבל פתרון ביחס של 1: יחס נפח 1.
  9. כן 12 גלילי פלדה המכילה multiwell צלחת בקוטר של 1.1 סנטימטר.
  10. קח 500 aliquots μl מהפתרון ומניח אותם לכל גלילי פלדה.
  11. השאר במנוחה במשך 45 דקות עד gelification מלא במערכת.
  12. הסר את הבלונים באמצעות מלקחי נירוסטה להשיג את הידרוג.

6. טוען של כלי טיפולי (Drug או תאים)

  1. חזור steps 5.1-5.7.
  2. כשהתערובת (כבר מדינת סול) מגיעה 37 ° C, להוסיף 5 מיליליטר של התמיסה המכילה פתרון תרופה הרצוי או תרבית תאים, כדי לקבל מערכת סופית ביחס של 1: יחס נפח 1.
  3. חזור על שלבי 5.9-5.12 להשיג ברשתות פולימריות עם biocompounds בפח פיזי בתוך הג'ל.

7. אפיון הידרוג'ל

  1. ניתוח FT-IR
    1. לאחר היווצרות קריש, להשרות אחד הידרוג synthetized ב 2.5 מ"ל של מים מזוקקים למשך 24 שעות.
    2. הסר את המדיה מימית שבו הידרוג'ל הוא שקוע ולהקפיא-יבש עם נוזלי N 2.
    3. לרבד המדגם הידרוג'ל פי טכניקה גלולה KBR.
      1. הוספת מרית מלאה KBR לתוך מרגמה אגת. קח כמות קטנה של מדגם הידרוג'ל (כ 0.1-2% מסכום KBR, או רק מספיק כדי לכסות את קצה מרית) ומערבבים עם אבקת KBR.
      2. טוחנים את התערובת עד שהאבקה בסדר והומוגני. </ Li>
      3. השתמש בערכת גלולת KBR ליצירת גלולת IR. לחץ על האבקה באמצעות עיתונות מעבדה ידנית: 3 דקות ב קיבולת לחץ שווה ל 5 טון ולאחר מכן במשך 3 דקות בתפוקת לחץ של 10 טון.
      4. שחרר את הלחץ להשגת הגלולה הסופית כפי הומוגנית ושקופה במראה. הכנס גלולה לתוך מחזיק מדגם IR ולהפעיל את ספקטרום 16.
  2. מחקרים gelation
    1. מלאו 2 מ"ל צינור microcentrifuge עם 900 μl של PBS לאזן ל -37 מעלות צלזיוס.
    2. הוספת 100 μl של פתרון פולימר מוכן ליצור את הידרוג'ל לדגור על 37 מעלות צלזיוס.
    3. להפוך את הצינור ולבחון אם הג'ל זורם בבית 1, 2, 5, 10 ו -20 דקות. רשום את המועד שבו הג'ל אינו זורם כמו בפעם gelation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

נגזר אלקין PAA הוא מסונתז ביעילות מחומצת polyacrylic ו propargylamine, כפי הראה באיור 1 כאשר n תוויות את מונומרים אשר קבוצות carboxyl מגיבים עם אמין. זהות המוצר אושר על ידי 1 ספקטרוסקופיה H-NMR. איור 5 מראה 1 ספקטרום H-NMR של PAA שונה עם אג"ח משולש.

איור 5
איור 5: 1 H-NMR ספקטרום של PAA שונה אלקין האות הקשורים מחצית אלקין מודגש.. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

האותות של שרשרת הפולימר ניתן לצפות בטווח 2.75-1.50 ppm; ואילו לשיא ב 2.8 0 ppm, נציג של H של אלקין, ואת לשיא ב 4.20 ppm, הקשורים 2 H של -CH 2, לאפיין את מחצית propargyl. זו מאשרת כי PAA שונתה כראוי. הערכת מידת functionalization אלקין בוצע על ידי שילוב השטח מתחת פסגות PAA (מוגדר 3.00, בהתאם למספר של מימנים לכל מונומר) ואת מחצית propargyl, כפי שמודגם באיור 5. מידת f functionalization הוא מחושב:

משוואה

משוואה מייצגת את האזור הנפרד שאריות propargyl, הסכום של שטח H של אלקין (שכותרתו משוואה ) ואזור -CH 2 (מסומן כמו משוואה ), ואילויון "src =" / files / ftp_upload / 54,445 / 54445eq5.jpg "/> מתייחס לאזור נפרד אותות פולימר. מידת functionalization מחושב כ- 10% וזה לשקול משביע רצון על פי סינתזה הידרוג'ל, שם יש PAA להגיב באמצעות קבוצות carboxyl השייר שלו כדי ליצור את רשת 3D. תשואה כמותית מתקבלת עבור הפולימר השונה 16.

באופן דומה, איור 6 מציג את ספקטרום 1 H-NMR של המוצר לאחר תגובת לחץ CuAAC בין PAA השונה אלקין ו-יזיד RGD. שיאם של triazole נוצר 8.15 ppm מאשר כי התגובה מתרחשת תשואת כמותיים RGD הוא מקושר חזק רשתות PAA. איור 6 מציגים את כל אותות המאפיין של שרשרת PAA ואת RGD.

איור 6
איור 6:הספקטרום 1 H-NMR של RGD צמוד PAA. האות של triazole מותווה (שכותרתו "A"). Functionalization פולימר RGD דרך התגובה לחץ CuAAC מתבצע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

הידרוג פונקציונליות RGD ערוכים דרך cross-linking הכימי של ארבעה פולימרים (PAA, carbomer, agarose ו PEG) על ידי פילמור רדיקלים חופשיים בסיוע מיקרוגל. חימום עד 80 מעלות צלזיוס מוביל ניידות macromer גבוהה, ובכך משפר את קשרים קצר טווח בין קבוצות carboxyl ו הידרוקסיל של הפולימרים. תגובת esterification מתקיימת בין קבוצות הפונקציונליות אלה ומייצרת רשתות מקומיות בשם "microgels".

ככל שמתקדם polycondensation, העליות צמיגות המערכת באופן רציף, wHile ההסתברות של אינטראקציה בין תגובתי אתרי macromer פוחתת. אף על פי כן, הקבוצות הפונקציונליות הקרוב עדיין אינטראקציה יעילה בשל ניידות איטית. תנאי physicochemical וכתוצאה מכך מאופיין "ריתוך" בין משטחי microgel שמייצר את macrostructure 3D הסופי של הידרוג'ל. Esterification, מליטה מימן carboxylation להביא שרשראות הפולימר סטטיסטית קרוב, ובכך יצרו מבנה הטרוגני יציבה. המערכת וכתוצאה מפגין סול / התנהגות ג'ל וזה מעבר מדינת ג'ל בתוך 5 דקות. מרווח הזמן הזה הוא כפי שדווח זמן gelation.

האופי הכימי של הידרוג הפונקציונלית RGD נלמד באמצעות ניתוח FT-IR. איור 7 מציג את ההשוואה בין ספקטרה FT-IR של מתחם RGD-יזיד (קו ירוק), הידרוג המסונתז ללא functionalization RGD (קו שחור), ו הידרוג עם שינוי פפטיד (קו כחול). המפרט הידרוג'לtra הן מאופיינות אות רחבה 3,600-3,200 -1 ס"מ טווח, נציג רטט מתיחה של אג"ח שיורית אה ודרך לשיא סביב 2,940 -1 ס"מ של מתיחה CH. התיקוף כי esterification מתרחשת בין קבוצות פולימר carboxyl ו הידרוקסיל ניתן על ידי הפסגות סביב 1,600 -1 סנטימטר ו -1,400 -1 סנטימטר, מתאים, בהתאמה, על סימטריות סימטרי מתיחה של מחצית 2 CO. פסגות אלה גלויות יותר בספקטרום של הידרוג'ל הלא הפונקציונלי, ואילו בספקטרום RGD-הידרוג'ל הם מכוסים חלקית על ידי האותות הצביעו כפסים אמידים I ו- II.

איור 7
איור 7:. השוואה של ספקטרה FT-IR ספקטרה FT-IR של RGD (קו ירוק), הידרוג'ל ללא functionalization RGD (קו שחור) ו RGD הידרוג'ל הפונקציונלי (קו כחול). האות קשור האמיד RGD מותווה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

מתיחה של C = O, שכותרתו כלהקה אמיד לי ( "אמיד אני" באיור 7), מציגה שיא 1,650 -1 ס"מ בספקטרום tripeptide והוא עבר על 1,670 -1 ס"מ במדגם RGD-הידרוג'ל . התעקמות NH, הקשורים הלהקה אמיד השנייה ( "אמיד השנייה" באיור 7), ניתן להקליט עם האות סביב 1,550 -1 ס"מ בספקטרום RGD וזה גם לזיהוי במדגם הידרוג'ל, בסביבות 1,600 ס"מ - 1. מכיוון שאין כאן שום רכיבים אמידים בניסוח הידרוג'ל הרגיל, הנוכחות של פסגות בעלות אופי amidic עולה כי PAA הוא פונקציונלי באמת עם RGD והוא מסוגל לגבש הידרוג'ל עם אתרי פפטיד בתוך הרשת פולימריים.

הספקטרום הידרוג'ל FT-IR גם מראה הפסגות הקשורים רטט מתיחה של COC של קשר גליקוזידי (900-1,000 ס"מ -1 טווח) בין היחידות monosaccharide של agarose ואת קבוצות אסתר.

כדי לקבל תובנה על המבנה 3D ותכונות פיזיקליות ומכניות של הידרוג אלה, ניתוח SEM, gelation, קינטיקה נפיחות מחקרים rheological מבוצעות, כפי שפורט קודם עובד 13,20. תוצאות SEM (איור 8) מראות כי הידרוג'ל מאופיין מבנה מיקרוסקופי מורכב עם כמה נקבובי גדולות המכילים נקבוביים קטנה ובחלק מרשתות סיביות על הקירות הנקבוביים. בנוסף, רוב הנקבוביות קשורים זה בזה. המבנה הסבוך דומה לרשת 3D של הידרוג שהוכן באותו אופן אבל בלי functionalization RGD. מכך ניתן להסיק כי RGD אינו משנה את רשת פולימר. באמצעות הבדיקה ניתן מבחנה ההפוכה, של הידרוג'למתמצק בשפע בתוך 5 דקות, כפי שנצפה במדגם הידרוג'ל ללא functionalization RGD 21. זמן gelation קצר זה מדגיש את התאמתה יישומים ביו.

הספרה 8
איור 8:.. ניתוח SEM SEM תמונות להראות את המורפולוגיה של מדגם הידרוג'ל פונקציונלי RGD (א) ו הידרוג'ל ללא functionalization (B) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

יחס שיווי משקל הנפיחות מציין את היכולת לספוג ולשמור כמות גדולה של מים וזה אחד המאפיינים המובילים של מערכות הידרוג'ל 20,22. הדגימות נותחו מהר תפגין נפיחות קינטיקה והם מגיעים נפיחות שיווי משקל במהלך השעה הראשונה. להתנפח שלהםQ ערך שיווי משקל ing מדווח העבודה הקודמת שלנו 16 וזה דומה הערך המתקבל על ידי ניתוח של הידרוג ללא RGD, המאשר כי tripeptide משולב עם רשת הפולימרים ואינו יוצר מכשול גבוה לתהליך gelation.

עם מחקרים rheological, מודולוס אחסון ג'ל (G') יימצא כ הזמנה אחת של גודל גבוה יותר מודולוס הפסד (G''), מה שמעיד על אלסטי ולא חומר צמיג 23 ושניהם הינם בלתי תלויים בעיקרם מתדר. ערכים דומים של G'ו G'' נרשמים עם המדגם ג'ל ללא שינוי פפטיד 16. מכך ניתן להסיק כי הנוכחות של RGD בתוך הרשת פולימריים אינה משפיעה על מאפייני rheological של החומר, שמירה על התכונות המשונות מתחרות למערכת להזרקה עבור יישומים ביו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות פרופ 'מאוריציו Masi לדיון פורה מיס קיארה Allegretti לעריכה השפה. מחקר 'מחברים נתמך על ידי Bando Giovani Ricercatori 2010 (Ministero דלה הצדעה GR-2010- 2,312,573).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly(acrylic acid) solution average Mw ~100,000, 35 wt% in H2O Sigma Aldrich 523925 CAS 9003-01-4
Poly(ethylene glycol) 2,000 Sigma Aldrich 84797 CAS 25322-68-3
Carbomeer 974P Fagron 1387083
Agarose  Invitrogen Corp. 16500-500 UltraPure Agarose
RGD peptide abcam ab142698
4-azidobutanoic acid Aurum Pharmatech Z-2421  CAS 54447-68-6
Oxalyl chloride Sigma Aldrich O8801 CAS 79-37-8
Propargylamine hydrochloride 95% Sigma Aldrich P50919 CAS 15430-52-1
Copper(I) iodide Sigma Aldrich 3140 CAS 7681-65-4
Sodium ascorbate Sigma Aldrich Y0000039 CAS 134-03-2
Phosphate buffered saline Sigma Aldrich P4417
Dialysis Membrane Spectrum Laboratories, Inc. 132725 Spectra/Por 3 Dialysis Membrane  Standard RC Tubing
MWCO: 3.5 kD

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Slaughter, B. V., Khurshid, S. S., Fisher, O. Z., Khademhosseini, A., Peppas, N. A. Hydrogels in Regenerative Medicine. Adv. Mater. 21 (32-33), 3307-3329 (2009).
  2. Rossi, F., Perale, G., Papa, S., Forloni, G., Veglianese, P. Current options for drug delivery to the spinal cord. Expert Opin. Drug Deliv. 10 (3), 385-396 (2013).
  3. Huebsch, N., et al. Harnessing traction-mediated manipulation of the cell/matrix interface to control stem-cell fate. Nat. Mater. 9 (6), 518-526 (2010).
  4. Mothe, A. J., Tam, R. Y., Zahir, T., Tator, C. H., Shoichet, M. S. Repair of the injured spinal cord by transplantation of neural stem cells in a hyaluronan-based hydrogel. Biomaterials. 34 (15), 3775-3783 (2013).
  5. Khetan, S., et al. Degradation-mediated cellular traction directs stem cell fate in covalently crosslinked three-dimensional hydrogels. Nat. Mater. 12 (5), 458-465 (2013).
  6. Ashley, G. W., Henise, J., Reid, R., Santi, D. V. Hydrogel drug delivery system with predictable and tunable drug release and degradation rates. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110 (6), 2318-2323 (2013).
  7. Rossi, F., van Griensven, M. Polymer Functionalization as a Powerful Tool to Improve Scaffold Performances. Tissue Eng. Part A. 20 (15-16), 2043-2051 (2014).
  8. Gould, S. T., Darling, N. J., Anseth, K. S. Small peptide functionalized thiol-ene hydrogels as culture substrates for understanding valvular interstitial cell activation and de novo tissue deposition. Acta Biomater. 8 (9), 3201-3209 (2012).
  9. Azagarsamy, M. A., Anseth, K. S. Wavelength-Controlled Photocleavage for the Orthogonal and Sequential Release of Multiple Proteins. Angew. Chem. Int. Edit. 52 (51), 13803-13807 (2013).
  10. Larrañeta, E., et al. Microwave-Assisted Preparation of Hydrogel-Forming Microneedle Arrays for Transdermal Drug Delivery Applications. Macromol. Mater. Eng. 300 (6), 586-595 (2015).
  11. Cook, J. P., Goodall, G. W., Khutoryanskaya, O. V., Khutoryanskiy, V. V. Microwave-Assisted Hydrogel Synthesis: A New Method for Crosslinking Polymers in Aqueous Solutions. Macromol. Rapid Comm. 33 (4), 332-336 (2012).
  12. Perale, G., et al. Multiple drug delivery hydrogel system for spinal cord injury repair strategies. J. Control. Release. 159 (2), 271-280 (2012).
  13. Rossi, F., Perale, G., Storti, G., Masi, M. A Library of Tunable Agarose Carbomer-Based Hydrogels for Tissue Engineering Applications: The Role of Cross-Linkers. J. Appl. Polym. Sci. 123 (4), 2211-2221 (2012).
  14. Frith, J. E., et al. An injectable hydrogel incorporating mesenchymal precursor cells and pentosan polysulphate for intervertebral disc regeneration. Biomaterials. 34 (37), 9430-9440 (2013).
  15. Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. Click chemistry: Diverse chemical function from a few good reactions. Angew. Chem. Int. Edit. 40 (11), (2001).
  16. Sacchetti, A., Mauri, E., Sani, M., Masi, M., Rossi, F. Microwave-assisted synthesis and click chemistry as simple and efficient strategy for RGD functionalized hydrogels. Tetrahedron Lett. 55 (50), 6817-6820 (2014).
  17. Ossipov, D. A., Hilborn, J. Poly(vinyl alcohol)-based hydrogels formed by "click chemistry". Macromolecules. 39 (5), 1709-1718 (2006).
  18. Truong, V., Blakey, I., Whittaker, A. K. Hydrophilic and Amphiphilic Polyethylene Glycol-Based Hydrogels with Tunable Degradability Prepared by "Click" Chemistry. Biomacromolecules. 13 (12), 4012-4021 (2012).
  19. Hou, R. Z., et al. New synthetic route for RGD tripeptide. Prep. Biochem. Biotechnol. 36 (3), 243-252 (2006).
  20. Rossi, F., Chatzistavrou, X., Perale, G., Boccaccini, A. R. Synthesis and Degradation of Agar-Carbomer Based Hydrogels for Tissue Engineering Applications. J. Appl. Polym. Sci. 123 (1), 398-408 (2012).
  21. Mauri, E., Rossi, F., Sacchetti, A. Tunable drug delivery using chemoselective functionalization of hydrogels. Mater. Sci. Eng. C. 61, 851-857 (2016).
  22. Joaquin, A., Peppas, N. A., Zoldan, J. Hydrogel Polymer Library for Developing Induced Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Patches. Tissue Eng. Part A. 20, S55-S55 (2014).
  23. Rossi, F., et al. Tunable hydrogel-Nanoparticles release system for sustained combination therapies in the spinal cord. Colloids Surf. B Biointerfaces. 108, 169-177 (2013).
  24. Kolb, H. C., Sharpless, K. B. The growing impact of click chemistry on drug discovery. Drug Discov. Today. 8 (24), 1128-1137 (2003).
  25. Ossipov, D. A., Yang, X., Varghese, O., Kootala, S., Hilborn, J. Modular approach to functional hyaluronic acid hydrogels using orthogonal chemical reactions. Chem. Commun. 46 (44), 8368-8370 (2010).
  26. Anderson, S. B., Lin, C. C., Kuntzler, D. V., Anseth, K. S. The performance of human mesenchymal stem cells encapsulated in cell-degradable polymer-peptide hydrogels. Biomaterials. 32 (14), 3564-3574 (2011).
  27. Caron, I., et al. A new three dimensional biomimetic hydrogel to deliver factors secreted by human mesenchymal stem cells in spinal cord injury. Biomaterials. 75, 135-147 (2016).
  28. Lee, J. W., Kim, H., Lee, K. Y. Effect of spacer arm length between adhesion ligand and alginate hydrogel on stem cell differentiation. Carbohyd. Polym. 139, 82-89 (2016).
  29. Liu, Y., Fan, Z., Wang, Y., Yu, L. Controlled Release of Low Molecular Protein Insulin-like Growth Factor-1 through Self-Assembling Peptide Hydrogel with Biotin Sandwich Approach. J.Biomed. Eng. 32 (2), 387-392 (2015).

Tags

Bioengineering גיליון 116 הידרוג'ל חומצה polyacrylic RGD לחץ כימיה סינתזה בסיוע מיקרוגל functionalization הנדסת רקמות
הסינתזה של RGD פונקציונלית הידרוג ככלי יישומים טיפוליים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mauri, E., Sacchetti, A., Rossi, F.… More

Mauri, E., Sacchetti, A., Rossi, F. The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications. J. Vis. Exp. (116), e54445, doi:10.3791/54445 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter