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Biochemistry

तैयारी और सीरियल गुजरने क्रि लिए lipídic घन चरण में प्रोटीन microcrystals की डिलिवरी

Published: September 20, 2016 doi: 10.3791/54463
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3
1The Bridge Institute, University of Southern California, 2Department of Chemistry, University of Southern California, 3School of Molecular Sciences, Center for Applied Structural Discovery at the Biodesign Institute, Arizona State University

Abstract

झिल्ली प्रोटीन (सांसदों) सेलुलर झिल्ली और प्राथमिक दवा लक्ष्य का आवश्यक घटक हैं। वाजिब दवा डिजाइन सटीक जानकारी संरचनात्मक, आम तौर पर क्रि द्वारा प्राप्त किया पर निर्भर करता है; हालांकि सांसदों मणिभ करना मुश्किल है। सांसद संरचनात्मक निर्धारण में हाल ही में प्रगति lipídic घन चरण (LCP) क्रिस्टलीकरण तरीके हैं, जो आम तौर पर अच्छी तरह से diffracting उपज है, लेकिन अक्सर छोटे क्रिस्टल कि विकिरण स्रोतों में पारंपरिक क्रिस्टेलोग्राफिक डेटा संग्रह के दौरान विकिरण क्षति से पीड़ित के विकास से काफी लाभ हुआ है। नई पीढ़ी के एक्स-रे मुक्त इलेक्ट्रॉन लेजर (XFEL) के सूत्रों है कि अत्यंत उज्ज्वल femtosecond दालों का उत्पादन का विकास नहीं या नगण्य विकिरण क्षति के साथ microcrystals से कमरे के तापमान डेटा संग्रह के लिए सक्षम है। हमारे धारावाहिक femtosecond क्रि (LCP-SFX) के साथ LCP प्रौद्योगिकी के संयोजन में हाल के प्रयासों कई मानव जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स के उच्च संकल्प संरचनाओं में हुई है, which संरचना निर्धारण के लिए एक बेहद मुश्किल लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करते हैं। LCP-SFX तकनीक में, LCP क्रिस्टेलोग्राफिक डेटा संग्रह के लिए एक XFEL किरण के साथ इंजेक्टर धारा के चौराहे करने के लिए दोनों के विकास और सांसद microcrystals के वितरण के लिए एक मैट्रिक्स के रूप में भर्ती किया गया है। यह दिखा दिया है कि LCP-SFX काफी विवर्तन संकल्प में सुधार कर सकते हैं जब केवल उप-10 माइक्रोन क्रिस्टल उपलब्ध हैं, या जब कमरे के तापमान पर छोटे क्रिस्टल का उपयोग इस तरह के दोष के संचय के रूप में बड़ा cryocooled क्रिस्टल के साथ जुड़े विभिन्न समस्याओं को दूर कर सकते हैं, उच्च mosaicity और cryocooling कलाकृतियों। एक्स-रे स्रोतों और डिटेक्टर प्रौद्योगिकियों में भविष्य में प्रगति सीरियल क्रि अत्यधिक न केवल XFELs पर, लेकिन यह भी अधिक सुलभ सिंक्रोटॉन beamlines पर आकर्षक और कार्यान्वयन के लिए साध्य बनाना चाहिए। यहाँ हम तैयारी, सीरियल क्रि प्रयोगों के लिए LCP में लक्षण वर्णन और microcrystals के वितरण के लिए विस्तृत दृश्य प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।इन प्रोटोकॉल, सीरिंज में क्रिस्टलीकरण प्रयोगों का आयोजन पता लगाने और क्रिस्टल नमूने निस्र्पक, क्रिस्टल घनत्व के अनुकूलन, इंजेक्टर डिवाइस में microcrystal लादेन LCP लोड हो रहा है और डेटा संग्रह के लिए बीम के लिए नमूना देने के लिए तरीके शामिल हैं।

Introduction

एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी झिल्ली प्रोटीन (सांसद) के परमाणु संकल्प संरचनाओं को सुलझाने के लिए आज तक का सबसे सफल तकनीक है। Lipídic mesophases भी lipídic घन चरण (LCP) के रूप में जाना जाता है, या, मेसो क्रिस्टलीकरण में से क्रिस्टलीकरण सांसद क्रि में प्रमुख घटनाओं है कि इस तरह जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स के रूप में चुनौतीपूर्ण लक्ष्य का उच्च संकल्प संरचना निर्धारण के लिए सक्षम है में से एक (GPCRs का प्रतिनिधित्व करता है ) 1। LCP उपकरण और प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में हाल की प्रगति इस तकनीक विश्व 2 चारों ओर संरचनात्मक जीव के एक बड़े समुदाय के लिए उपलब्ध कराया गया है। हालांकि, कई मामलों में सांसद क्रिस्टल कि LCP में फार्म बहुत छोटा भी सबसे उन्नत microfocus सिंक्रोटॉन beamlines, जहां नमूने गंभीर विकिरण नुकसान और गिरावट से ग्रस्त होने से पहले उच्च संकल्प पर पर्याप्त संकेत 3 प्राप्त किया जा सकता इस्तेमाल हो रहे हैं।

क्रिस्टेलोग्राफिक डेटा संग्रह के लिए एक नया दृष्टिकोणपहले एक्स-रे मुक्त इलेक्ट्रॉन लेजर (XFEL) के कमीशन के साथ सक्षम था। विधि "विनाश से पहले विवर्तन 'के सिद्धांत, पहले सैद्धांतिक रूप से शुरू की 4 और फिर Linac सुसंगत प्रकाश स्रोत (LCLS) 3, कठिन XFELs में दुनिया के अग्रणी में जैविक नमूने पर प्रयोगात्मक पुष्टि की पर आधारित है। एक XFEL femtosecond अवधि के कुछ दसियों है कि एक प्राचीन क्रिस्टल से पहले प्रोटीन परमाणुओं विकिरण क्षति के जवाब में स्थानांतरित कर सकते हैं टुकड़े से भीतर उच्च चमक एक्स-रे दालों उत्पन्न करता है। प्रारंभिक प्रयोगों में, microcrystals लगातार एक तरल लगानेवाला 5 द्वारा उत्पादित एक जलीय धारा में XFEL किरण के साथ चौराहे को आपूर्ति की गई। इस प्रयोगात्मक सेटअप सीरियल femtosecond क्रि (SFX) के रूप में जाना जाता है। SFX के लिए तरल इंजेक्टर का उपयोग करने के मुख्य दोष अपने उच्च प्रवाह की दर, जिसके फलस्वरूप एक पूरा डाटासेट के संग्रह के लिए शुद्ध प्रोटीन की मिलीग्राम की सैकड़ों करने के लिए दसियों की आवश्यकता है। द्वारा ईएमपीएक विशेष इंजेक्टर कि जेल की तरह LCP नमूनों को संभाल कर सकते हैं (LCP microextrusion इंजेक्टर) 6 loying, हम सफलतापूर्वक एक LCP मैट्रिक्स में उगाया कई अलग अलग मानव GPCRs के microcrystals को जन्म दिया और उनके उच्च संकल्प संरचनाओं 6 प्राप्त - 9, एक काफी कम प्रोटीन के साथ डाटासेट प्रति मिलीग्राम 0.3 के तहत करने की खपत। इंजेक्टर एक जलाशय है कि क्रिस्टल से लदी LCP के लिए 20, 40 या 100 μl और एक संकीर्ण केशिका (व्यास में 10-50 माइक्रोन) के माध्यम से जो नमूने (10,000 तक एक उच्च दबाव के आवेदन के द्वारा निकाली जाती पकड़ कर सकते हैं के होते हैं एक दबाव परिलक्षित चरण के साथ एक हाइड्रोलिक सवार, एक एचपीएलसी (उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी) पंप से एक तरल द्वारा संचालित से साई)। केशिका नोक बाहर निकलने LCP की धारा nonreactive गैस (आमतौर पर हीलियम या नाइट्रोजन) के एक समानांतर प्रवाह से स्थिर है।

यहाँ हम तैयार है और नमूनों को चिह्नित करने के लिए आवश्यक कदम के दृश्य प्रदर्शनों प्रदानएक LCP-SFX प्रयोग के लिए। अतिरिक्त विवरण प्रकाशित प्रोटोकॉल 10 में पाया जा सकता है। एक उदाहरण के रूप में, हम एक्स-रे डेटा SFX दृष्टिकोण का उपयोग कर संग्रह के लिए LCP में एडेनोसाइन एक 2A रिसेप्टर 11 का उपयोग करें और इस प्रोटीन के क्रिस्टल तैयार करेंगे। जबकि हमारे प्रोटोकॉल किसी भी XFEL और विकिरण स्रोतों पर सीरियल क्रिस्टलोग्राफी द्वारा डेटा संग्रह के लिए LCP स्ट्रीमिंग के लिए सक्षम इंजेक्टर के साथ संगत कर रहे हैं, चित्रण प्रयोजनों के लिए, हम LCP इंजेक्टर रेफरी में वर्णित का प्रयोग करेंगे। 6. अनुकूलित तेज़ स्थिति है कि LCP में उच्च घनत्व microcrystals उत्पादन उच्च throughput क्रिस्टलीकरण इस प्रोटोकॉल के लिए आगे बढ़ने से पहले स्क्रीनिंग 12,13 द्वारा की पहचान की जानी चाहिए। इस प्रोटोकॉल के लिए एक विशिष्ट फ़्लोचार्ट चित्र 1 में दिखाया गया है।

Protocol

1. छनन समाधान और लिपिड

नोट: संभव के रूप में नमूनों में कण contaminants, जो LCP इंजेक्टर रोकना कर सकते हैं की शुरूआत से बचने के लिए सभी अभिकर्मकों और उपकरणों के इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल के रूप में साफ किया जाना चाहिए।

  1. सभी तेज़ समाधान और 5 माइक्रोन स्पिन नीचे फिल्टर के माध्यम से पिघला हुआ लिपिड फ़िल्टर। स्वच्छ सीरिंज अच्छी तरह से और सुखाने के लिए संपीड़ित हवा लागू होते हैं। वैकल्पिक रूप से, नमूना तैयार करने की प्रक्रिया के दौरान धूल कणों या फाइबर फँसाने को रोकने के लिए एक पोर्टेबल साफ कमरे हुड का उपयोग करें।

LCP में सांसद के पुनर्गठन 2.

नोट: क्रिस्टलीकरण के लिए अच्छी LCP मेजबान लिपिड के चुनाव को लक्ष्य सांसद पर निर्भर करता है, और आम तौर पर मेजबान लिपिड स्क्रीनिंग crystallization परीक्षण 14 के दौरान पहचान की है। Monoacylglycerols (mags) LCP क्रिस्टलीकरण 15 के लिए इस्तेमाल किया लिपिड का सबसे सामान्य वर्ग के प्रतिनिधित्व करते हैं। प्रोटोकॉल के रूप में 9.9 पत्रिका (monoolein) का उपयोग कर रहे हैं पर आधारितलिपिड की मेजबानी है, क्योंकि इस तिथि से 16 मेसो में क्रिस्टलीकरण के लिए सबसे सफल लिपिड है। 9.9 पत्रिका उनके चरण व्यवहार में खाते मतभेद में लेने के बाद अन्य LCP मेजबान लिपिड या लिपिड मिश्रण द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, GPCRs के मामले में, आम तौर पर monoolein रिसेप्टर स्थिरीकरण के लिए कोलेस्ट्रॉल के साथ डाल दिया गया है। इधर, का उपयोग 9: 1 (डब्ल्यू / डब्ल्यू) 9.9 पत्रिका: मेजबान लिपिड के रूप में कोलेस्ट्रॉल मिश्रण।

  1. के रूप में पहले 13 में वर्णित मिक्स, सांसद, जो डिटर्जेंट मिसेल समाधान में शुद्ध होता है, लक्ष्य उचित LCP मेजबान दो सीरिंज (# 1 और 2 #) और एक युग्मक का उपयोग कर लिपिड के साथ।
  2. संक्षेप में, पिघला हुआ लिपिड और # 2 सिरिंज सांसद समाधान के साथ साथ लोड सिरिंज # 1। 2 वी / वी लिपिड / 9.9 पत्रिका के लिए सांसद समाधान है, 1: 1 वी / वी लिपिड और जलीय सांसद समाधान के बीच एक अनुपात स्तर है कि सिर्फ इसी LCP मेजबान लिपिड की अधिकतम क्षमता हाइड्रेशन नीचे, जैसे, 3 करने के लिए इसी का प्रयोग करें अधिकांश अन्य छोटे श्रृंखला mags के लिए लिपिड / सांसद समाधान (7.9 पत्रिका9.7 पत्रिका, आदि)।
  3. एक सिरिंज युग्मक के माध्यम से सीरिंज कनेक्ट और आगे और पीछे सीरिंज के बीच मिश्रण स्थानांतरित करने के लिए जब तक नमूना सजातीय और पारदर्शी हो जाता है plungers निराशाजनक द्वारा पदार्थों के मिश्रण शुरू करते हैं। LCP-SFX द्वारा एक पूर्ण डाटासेट के संग्रह के लिए LCP नमूना के लगभग 50 μl तैयार करें। अंतिम नमूना मात्रा में आम तौर पर नमूना समेकन और लिपिड अनुमापन (धारा 5) के बाद दो (~ 100 μl करने के लिए) के लगभग एक पहलू से वृद्धि होगी।

3. सीरिंज में Crystallization स्थापना

  1. बाद एक पारदर्शी और सजातीय LCP का गठन किया है, सिरिंज # 2 में पूरे नमूना ले जाते हैं। सिरिंज # 1 को अलग करें, जबकि युग्मक सिरिंज # 2 से जुड़ा रखे हुए हैं।
  2. एक और 100 μl करने के लिए एक हटाने योग्य सुई (गेज 26s) कनेक्ट साफ सिरिंज (सिरिंज # 3) और इसे में तेज़ समाधान के महाप्राण लगभग 70 μl। तेज़ समाधान की संरचना है कि च चलाताउच्च घनत्व microcrystals के ormation प्रत्येक लक्ष्य के लिए सांसद अद्वितीय है और इन प्रोटोकॉल को आगे बढ़ने से पहले निर्धारित किया जाना चाहिए। इधर, एक अनुकूलित तेज़ समाधान संरचना है कि एक 2A रिसेप्टर (40 मिमी सोडियम thiocyanate, 100 मिमी सोडियम साइट्रेट पीएच 5, 26-28% PEG400) की microcrystals की वर्षा पैदावार का उपयोग करें।
  3. # 3 सिरिंज से सुई डिस्कनेक्ट जबकि सिरिंज के अंदर Teflon सामी रखे हुए हैं।
  4. युग्मक के माध्यम से सीरिंज # 2 और # 3 कनेक्ट करें, सुनिश्चित करें कि Teflon ferrules दोनों सीरिंज में जगह में सही ढंग से कर रहे हैं बना रही है। ध्यान की स्थिति में कसकर युग्मक पेंच।
  5. खड़ी सिरिंज # 2 तल पर साथ और धीरे धीरे और लगातार # 3 सिरिंज में सिरिंज # 2 से प्रोटीन से लदी LCP नमूना इंजेक्षन जब तक LCP स्ट्रिंग सिरिंज # 3 के सवार को छू लेती है ओरिएंट युग्मित सीरिंज। इंजेक्शन LCP मात्रा # सिरिंज 3 (~ 7 μl) में 1/10 के बारे में प्रारंभिक तेज़ मात्रा के लिए राशि होगी। दोनों syri पर पैमाने पढ़ने द्वारा मात्रा सत्यापित करेंnges (दोनों plungers के बारे में 7 μl से बढ़ना चाहिए)।
  6. डिस्कनेक्ट सिरिंज # 2। युग्मक अब केवल # 3 सिरिंज कि ​​नमूना तेज़ समाधान में डूबे शामिल करने के लिए जुड़ा हुआ है।
  7. Parafilm का प्रयोग पूरी तरह से सिरिंज # 3, सवार सिरिंज इंटरफेस, युग्मक के उद्घाटन के अंत और सुई अखरोट सहित सील करने के लिए। इस कदम के दौरान दो या दो से सील तेज़ की स्थिति बदलने के लिए और नमूना निर्जलीकरण के लिए पैदा कर सकता है।
  8. दोहराएँ कदम 3.3-3.7 अप ~ LCP नमूना के 50 μl 6 अतिरिक्त सीरिंज (# 4 # 9) के कुल उपयोग में क्रिस्टलीकरण स्थापित करने के लिए (~ प्रत्येक सिरिंज प्रति LCP के 7 μl)।
  9. स्टोर के लिए एक या दो फाइबर मुक्त सफाई ऊतकों नमूना निर्जलीकरण के खिलाफ की रक्षा करने के लिए पानी के साथ पहले से लथपथ के साथ एक प्लास्टिक sealable बैग में सीरिंज सील कर दिया। क्रिस्टल विकास के दौरान एक 20 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में बैग और दुकान सीरिंज सील।

4. क्रिस्टल जांच

  1. छवि की नियंत्रण रेखा को इनक्यूबेटर से सीरिंज निकालेंसीधे सीरिंज के अंदर पी नमूने (# 3 # 9) पार ध्रुवीकृत प्रकाश के साथ एक stereomicroscope के तहत हर 12-24 घंटा। LCP रेशा से एक समान चमक के रूप में छोटे क्रिस्टल आकार के मामले में कसकर बांध चमकदार कणों के रूप में क्रिस्टल की पहचान या।
  2. बैग के लिए सील सीरिंज लौटें, और भविष्य में उपयोग के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।

5. नमूना समेकन और 7.9 पत्रिका के साथ अनुमापन

ध्यान दें: एक) अतिरिक्त तेज़ समाधान अवशोषित करने के लिए और ख) XFEL बीम में इंजेक्शन पर ठंड लिपिड को रोकने के लिए: लिपिड अनुमापन यहाँ वर्णित कदम दो उद्देश्यों में कार्य करता है। जब एक LCP 9.9 पत्रिका से बना नमूना डेटा संग्रह के लिए एक निर्वात चैम्बर में इंजेक्ट किया जाता है, गहन वाष्पीकरण, संतुलन चरण संक्रमण तापमान (~ 18 डिग्री सेल्सियस) से नीचे तापमान के लिए नीचे नमूना शांत कर सकते हैं एक परतदार क्रिस्टलीय चरण में नमूना के कुछ हिस्सों में परिवर्तित (नियंत्रण रेखा)। नियंत्रण रेखा चरण के इन पैच, जब किरण ने टक्कर मार दी, तीव्र पाउडर का उत्पादन diffrकार्रवाई के छल्ले कि एक संवेदनशील डिटेक्टर 6 नुकसान पहुंचा सकता है, इस तरह के कॉर्नेल-SLAC पिक्सेल सरणी डिटेक्टर (CSPAD) के रूप में। एक छोटी श्रृंखला लिपिड (9.7 पत्रिका या 7.9 पत्रिका) के साथ 9.9 पत्रिका नमूने का अनुमापन इस समस्या को दूर करता है, के रूप में इस तरह के मिश्रण कम चरण संक्रमण तापमान है। यहाँ, हम एक 7.9 पत्रिका के साथ 9.9 पत्रिका से बना एक LCP के अनुमापन का वर्णन है। छोटे श्रृंखला mags (9.7 पत्रिका, 7.9 पत्रिका, आदि) के क्रिस्टलीकरण के लिए उपयोग किया जाता है या जब सीरियल क्रि डेटा परिवेश के दबाव में एकत्र कर रहे हैं कदम 5.11 में अनुमापन अभी भी आवश्यक है, लेकिन यह मूल LCP मेजबान के लिए कार्यरत लिपिड का उपयोग किया जा सकता है क्रिस्टलीकरण।

  1. डेटा संग्रह की शुरुआत से पहले के बारे में 1 घंटा, 20 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर से नमूनों के साथ सीरिंज को हटा दें।
  2. इसी तरह की एक क्रिस्टल उपस्थिति और क्रिस्टलीकरण की स्थिति की समानता पर आधारित नमूना समेकन के लिए 2-4 सीरिंज का चयन करें।
  3. ध्यान से चयनित Parafilm सीरिंज से सील हटा दें।
  4. हटानासिरिंज युग्मक और पहले से चयनित सिरिंज के लिए एक साफ हटाने योग्य सुई (गेज 26s) देते हैं। और धीरे धीरे सवार को आगे बढ़ाने के लिए एक microcentrifuge ट्यूब में सुई के माध्यम से तेज़ बाहर निचोड़ करने के लिए। इस कदम पर सावधानी बरत क्योंकि इस चरण में सवार पर एक उच्च दबाव लागू करने के तेज़ समाधान के साथ साथ क्रिस्टल लादेन LCP के कुछ बेदखल कर सकता है, नमूना के एक आंशिक या पूर्ण नुकसान के लिए अग्रणी।
  5. सवार बंद करो जब तेज़ की सबसे हटा दिया गया है और LCP सुई प्रवेश द्वार पर जमा हो गया है।
  6. अन्य चयनित सीरिंज के साथ दोहराएँ कदम 5.4-5.5।
  7. परिणामी LCP नमूनों को मजबूत करने के लिए, दो सीरिंज को एक साथ जोड़ने के लिए एक साफ युग्मक के माध्यम से।
  8. दूसरे के लिए सीरिंज से एक से पूरे नमूना हस्तांतरण करने के लिए एक सिरिंज पर सवार दबाना।
  9. खाली सिरिंज डिस्कनेक्ट।
  10. दोहराएँ कदम 5.7-5.9 दो को चार पूर्व से क्रिस्टल लादेन LCP सामग्री के सभी मजबूत करने के लिएएक सिरिंज में -Selected सीरिंज। जितना संभव हो उतना तेज़ निकालें।
  11. एक खाली सिरिंज के लिए 7.9 पत्रिका या मूल छोटे-श्रृंखला पत्रिका मेजबान लिपिड की ~ 5 μl जोड़ें। एक सिरिंज युग्मक के माध्यम से समेकित नमूने के साथ सिरिंज को यह सिरिंज कनेक्ट और वैकल्पिक रूप से सिरिंज plungers निराशाजनक द्वारा मिश्रण। दोहराएँ जब तक सभी अवशिष्ट समाधान अवशोषित कर लेता है और एक सजातीय और पारदर्शी LCP का गठन किया है। अनुमापन के बाद LCP की अंतिम राशि अतिरिक्त तेज़ और इसकी संरचना की मात्रा के आधार पर 20 से 35 μl करने के लिए भिन्न हो सकते हैं।
  12. एक सिरिंज में पूरे मिश्रित LCP नमूना ले जाएँ और खाली सिरिंज काट।

6. microcrystals की विशेषता

  1. एक LCP-इंजेक्टर लोडिंग सुई (बिंदु शैली 3, गेज 22, लंबाई में एक इंच) समेकित नमूने के साथ सिरिंज को देते हैं।
  2. ध्यान से एक गिलास स्लाइड पर LCP नमूने की ~ 1 μl बेदखल करना है और यह एक गिलास को कवर पर्ची के साथ कवर। धीरे पर प्रेससैंडविच को कवर पर्ची नमूना।
  3. उच्चतम संभव बढ़ाई (आम तौर पर 100x) एक उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी और पार polarizers का उपयोग करने पर एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत LCP नमूना की छवियों को ले लो। यदि संभव हो तो नमूने में प्रोटीन microcrystals के अस्तित्व की पुष्टि के लिए एक यूवी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप और एक SONICC (Chiral क्रिस्टल के दूसरे क्रम Nonlinear इमेजिंग) 17 इमेजर का उपयोग करते हुए अतिरिक्त छवियों ले।
  4. क्रिस्टल आकार और घनत्व 10 का अनुमान है। एक डाटा संग्रह के प्रयोग के लिए आदर्श क्रिस्टल घनत्व क्रिस्टल आकार, एक्स-रे किरण के व्यास और LCP धारा के व्यास पर निर्भर करेगा, और 10-40% के बारे में की एक क्रिस्टल हिट दर में परिणाम चाहिए।

7. क्रिस्टल घनत्व का समायोजन

नोट: क्रिस्टल घनत्व चरण में पाया तो 6.4, बहुत अधिक है कई क्रिस्टल हिट फिल्मों का एक बड़ा प्रतिशत है, जिसके परिणामस्वरूप क्रिस्टल नीचे उल्लिखित चरणों का अनुकूलन करने के लिए निम्नलिखित पतला होना चाहिएडेटा संग्रह के लिए नमूना। अगर क्रिस्टल घनत्व सभी तैयार नमूनों में कुशल डेटा संग्रह के लिए बहुत कम है, तो क्रिस्टल विकास की स्थिति को फिर से अनुकूलित किया जाना चाहिए, क्योंकि वहाँ LCP में सांसद क्रिस्टल ध्यान केंद्रित करने के लिए कोई विश्वसनीय तरीका है।

  1. साफ LCP के लिए आवश्यक राशि को तैयार क्रिस्टल पतला करने की जरूरत है कि के साथ मूल नमूना के LCP रचना (समान लिपिड और तेज़) नकल उतार द्वारा कमजोर पड़ने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
  2. एक सिरिंज में सब साफ LCP ले जाएँ। खाली सिरिंज अलग लेकिन युग्मक जुड़ा छोड़ दें।
  3. सिरिंज कि ​​microcrystals साथ LCP नमूना शामिल है से सुई निकालें। युग्मक के माध्यम से स्वच्छ LCP युक्त सिरिंज के लिए नमूना सिरिंज कनेक्ट।
  4. यह आगे और पीछे युग्मक के माध्यम से धक्का जब तक एकरूपता हासिल की है द्वारा सीरिंज की सामग्री मिक्स।
  5. दोहराएँ धारा 6 समायोजित नमूने में microcrystal घनत्व फिर से मूल्यांकन करने के लिए।

8. LCP इंजेक्टर लोड हो रहा है एकएन डी LCP-SFX डेटा संग्रह

  1. नमूने के साथ सिरिंज से युग्मक डिस्कनेक्ट और सिरिंज के लिए एक 1 "लोडिंग सुई देते हैं।
  2. एक LCP इंजेक्टर के जलाशय में नमूने के 20-40 μl स्थानांतरण।
  3. , नमूना कक्ष 18 में LCP इंजेक्टर डालें इंजेक्टर शुरू, प्रवाह दर को समायोजित करने और LCP-SFX डेटा इकट्ठा।

9. घुलनशील का निगमन LCP में प्रोटीन क्रिस्टल

नोट: इस तरह के LCP के रूप में अत्यधिक चिपचिपा मीडिया, का उपयोग घुलनशील प्रोटीन के क्रिस्टल के वितरण के लिए अनुमति देता है एक नाटकीय ढंग से एक धारावाहिक क्रि प्रयोग में प्रोटीन की खपत कम करने के लिए। इन चरणों में हम कैसे LCP में घुलनशील प्रोटीन के क्रिस्टल को शामिल करने का वर्णन है। क्रिस्टल किसी भी तकनीक के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, एक क्रिस्टल निलंबन के रूप में एक साथ समेकित और यदि आवश्यक हो तो फ़िल्टर्ड।

  1. लगभग 10-40% की क्रिस्टल हिट दरों को सुनिश्चित करने के निलंबन में क्रिस्टल घनत्व को समायोजित करें।
  2. टीस्था 7.9 पत्रिका, 9.7 पत्रिका या एक 1 का उपयोग LCP साथ तेज़ समाधान की अनुकूलता 7.9 पत्रिका के 1 मिश्रण और मेजबान लिपिड के रूप में 9.9 पत्रिका।
  3. मिक्स ~ के साथ क्रिस्टल निलंबन के 25 μl ~ एक सजातीय LCP रूपों तक एक सिरिंज मिक्सर का उपयोग कर मेजबान लिपिड के 25 μl।
  4. क्रिस्टल आकार और घनत्व का मूल्यांकन धारा 8 में वर्णित के रूप में LCP इंजेक्टर में नमूना धारा 6 लोड में वर्णित है और डेटा इकट्ठा के रूप में।

Representative Results

एक agonist एर्गोटेमाइन 8 (पीडीबी आईडी 4NC3 के साथ परिसर में सेरोटोनिन रिसेप्टर 5 हिंदुस्तान टाइम्स 2 बी: नीचे हम जो हमें SFX डेटा इकट्ठा करने और पांच मानव GPCRs के उच्च संकल्प संरचनाओं को हल करने की अनुमित दी जाएगी प्रोटोकॉल का पालन करके तैयार नमूने, के साथ प्राप्त प्रतिनिधि परिणामों का वर्णन ), एक प्रतिपक्षी cyclopamine 6 (पीडीबी आईडी 4O9R), δ-opioid एक साथ परिसर में एक द्वि-कार्यात्मक पेप्टाइड ligand डीआईपीपी-राष्ट्रीय राजमार्ग 2 से 7 (पी डी बी आईडी 4RWD), एंजियोटेनसिन रिसेप्टर के साथ परिसर में रिसेप्टर के साथ smoothened रिसेप्टर (एसएमओ) परिसर में अवरोधक ZD7155 9 (पीडीबी आईडी 4YAY), और rhodopsin और arrestin 19 (पीडीबी आईडी 4ZWJ) के बीच एक जटिल; और दो टेस्ट घुलनशील प्रोटीन: लाइसोजाइम (पी डी बी आईडी 4ZIX) और phycocyanin (पी डी बी आईडी 4ZIZ)।

5 हिंदुस्तान टाइम्स 2 बी न्यूरोट्रांसमीटर सेरोटोनिन के विभिन्न मध्य और परिधीय शारीरिक कार्यों मध्यस्थता करता है। इस रिसेप्टरस्थापित करने और LCP-SFX विधि मान्य, कमरे के तापमान संरचना उन्नत फोटॉन स्रोत (ए पी) पर पारंपरिक microcrystallography द्वारा हल cryocooled संरचना के साथ LCLS पर प्राप्त की तुलना द्वारा करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। ~ के प्रोटीन microcrystals के साथ 100 μl LCP नमूना (औसत आकार के बारे में 5 माइक्रोन) में कुल तैयार किया गया था और SFX डेटा संग्रह के लिए इस्तेमाल किया, और 2 बी 5HT की LCP-SFX संरचना को सफलतापूर्वक 2.8 एक (चित्रा 2) 8 पर हल किया गया था। नमूना तैयार करने और डेटा संग्रह पर अतिरिक्त उपयोगी विवरण तालिका 1 में प्रदान की जाती हैं।

Smoothened रिसेप्टर (एसएमओ) वर्ग एफ GPCRs के एक सदस्य और teratogen cyclopamine की आणविक लक्ष्य, भ्रूण के विकास और ट्यूमर के विकास में अच्छी तरह से प्रदर्शन किया कार्यों के साथ है। प्रारंभ में, 120 × 10 × 5 माइक्रोन के एक औसत आकार के साथ एसएमओ / cyclopamine के अपेक्षाकृत बड़े क्रिस्टल प्राप्त किया गया और फिर डेटा collecti के लिए इस्तेमाल कियाएक विकिरण स्रोत पर पर पारंपरिक गोनियोमीटर आधारित क्रि का उपयोग कर। हालांकि, इन बड़े क्रिस्टल एक माइक्रो फोकस beamline (व्यास में 10 माइक्रोन) बड़े mosaicity से पीड़ित (2-3 डिग्री से ऊपर), शायद क्रिस्टल विकास दोष के संचय के कारण, या cryocooling से संबंधित प्रभाव से गरीब विवर्तन का उत्पादन किया। LCP-SFX, हालांकि, हम में कमरे के तापमान पर 5 माइक्रोन आकार क्रिस्टल से LCLS पर गुणवत्ता विवर्तन डेटा एकत्र करने के लिए सक्षम होना चाहिए। संरचना एक anisotropic 3.4, 3.2 और तीन प्रमुख axes साथ 4.0 एक प्रस्ताव पर आणविक प्रतिस्थापन द्वारा हल किया गया था, स्पष्ट रूप से बाध्यकारी जेब 6 (चित्रा 3) में cyclopamine के स्थान की पहचान।

ऐसे अफ़ीम के रूप में उपक्षार opiates, μ-opioid रिसेप्टर (μ-OR) को लक्षित कर व्यापक रूप से गंभीर दर्द के प्रबंधन के लिए उपयोग किया जाता है। हालांकि, उनके व्यापक उपयोग का अधिग्रहण सहिष्णुता और नशे की लत की ओर जाता है। morphines के सह-प्रबंधδ-opioid रिसेप्टर (δ-OR) विरोधी के साथ उपरोक्त दुष्प्रभाव को रोकने के लिए, इस प्रकार एक मिश्रित δ या प्रतिपक्षी और μ या एगोनिस्ट समारोह के साथ यौगिकों के लिए खोज को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है। हम δ या एक द्वि-कार्यात्मक टेट्रा-पेप्टाइड डीआईपीपी-राष्ट्रीय राजमार्ग 2 के साथ एक परिसर में cryocooled क्रिस्टल कि एक सिंक्रोटॉन एक्स-रे स्रोत रोजगार पारंपरिक गोनियोमीटर आधारित डाटा संग्रह की रणनीति पर 3.3 ए में विवर्तित के प्रयोग पर प्रारंभिक विवर्तन डेटा प्राप्त की। इन आंकड़ों पेप्टाइड ligand के लिए एक आंशिक रूप से अस्पष्ट इलेक्ट्रॉन घनत्व का पता चला। इसके बाद, कमरे के तापमान पर XFEL विवर्तन डेटा प्राप्त किया गया और संरचना 2.7 एक ligand और रिसेप्टर 7 के लिए एक स्पष्ट घनत्व दिखा संकल्प पर निर्धारित किया गया था। इस संरचना के आगे समझने opioid रिसेप्टर समारोह और चयनात्मकता के लिए एक अवसर की पेशकश की है और नई दर्दनाशक दवाओं के विकास के लिए बहुमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान की है।

1 आर) एक GPCR रक्तचाप के एक प्राथमिक नियामक के रूप में सेवारत है। हम LCP में एक विरोधी ZD7155 के साथ परिसर में में 1 आर सघन। अनुकूलित क्रिस्टल सबसे अच्छा विवर्तन एक विकिरण स्रोत पर ही ~ 4 एक तक पहुँचने के साथ 40 × 4 × 4 माइक्रोन 3 की एक अधिकतम आकार पर पहुंच गया। क्रिस्टलीकरण स्थिति को बदलने की है, हम छोटे क्रिस्टल की बारिश (10 × 2 × 2 माइक्रोन 3) है, जो 2.9 Å XFEL विकिरण का उपयोग कर संकल्प पर कमरे के तापमान संरचना प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया प्राप्त की। 2,764,739 डिटेक्टर छवियों की कुल क्रिस्टल से लदी LCP के बारे में 65 μl प्रोटीन 9 के बारे में 0.29 मिलीग्राम के लिए इसी से एक पूरा डाटासेट बनाने के लिए एकत्र किए गए थे। तख्ते की कुल संख्या की, 457275, क्रिस्टल हिट के रूप में पहचान की गई 17% की दर मारा, जिनमें से 73,130 फ्रेम (हिट की 16%) सफलतापूर्वक अनुक्रमित और एकीकृत किया गया करने के लिए इसी।

जीPCRs दो मुख्य रास्ते या तो जी प्रोटीन या arrestins द्वारा मध्यस्थता के माध्यम से संकेत। Β 2 -adrenergic एक heterotrimeric जी प्रोटीन के लिए बाध्य रिसेप्टर की संरचना, कुछ साल पहले 20 सुलझ गया था जबकि arrestin के साथ परिसर में एक GPCR की संरचना मायावी बना रहा था। हम LCP में एक rhodopsin-arrestin संलयन प्रोटीन है कि लंबे समय तक आयाम में 25-30 माइक्रोन तक पहुँच के छोटे क्रिस्टल प्राप्त की, लेकिन व्यापक अनुकूलन के बावजूद, केवल विकिरण स्रोतों पर ~ 7 एक प्रस्ताव को विवर्तित। LCP-SFX पद्धति का उपयोग करके, XFEL beamtime के 12 घंटे के भीतर, हम 22,262 क्रिस्टल हिट, जिसमें से एकत्र 18,874 पैटर्न सफलतापूर्वक अनुक्रमित और 3.8 ए / 3.8 ए / 3.3 एक 19 का संकल्प सीमा anisotropic को एकीकृत किया गया। Rhodopsin-arrestin एक बहुत ही चुनौतीपूर्ण प्रोटीन जटिल है कि संरचना निर्धारण विरोध पारंपरिक तरीकों का उपयोग कर रहा है। इस संरचना के सफल दृढ़ संकल्प की विशाल क्षमता का प्रदर्शन किया हैकठिन समस्याओं से निपटने के लिए LCP-SFX विधि और GPCRs में arrestin पक्षपाती सिगनल की व्यवस्था की जांच के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान किया।

अंत में, इसके अलावा lipídic चरण में उगाया प्रोटीन क्रिस्टल झिल्ली के लिए में, हमारे नमूना तैयार करने और वितरण पद्धति को सफलतापूर्वक घुलनशील प्रोटीन क्रिस्टल, जहां LCP क्रिस्टल के वितरण के लिए एक वाहक माध्यम के रूप में प्रयोग किया जाता है के लिए अनुकूलित किया गया था, हमें की अनुमति नाटकीय रूप से प्रोटीन की खपत कम करने के लिए संरचना निर्धारण के लिए जरूरी है। दो मॉडल प्रोटीन, लाइसोजाइम और phycocyanin की संरचनाएं, इस विधि द्वारा क्रमश: 1.89 और 1.75 एक प्रस्ताव पर हल कर रहे थे, प्रत्येक प्रोटीन 21 वर्ष की कम से कम 0.1 मिलीग्राम का उपयोग कर।

सेरोटोनिन रिसेप्टर 2 बी smoothened रिसेप्टर Angiotensin द्वितीय रिसेप्टर टाइप 1 Rhodopsin-arrestin lysozyme Phycocyanin
PDB आईडी 4NC3 4O9R 4RWD 4YAY 4ZWJ 4ZIX 4ZIZ
कुल नमूना इस्तेमाल किया *, μl 100 83 50 65 75 10 10
कुल इस्तेमाल प्रोटीन, माइक्रोग्राम 300 500 300 290 340 100 100
औसत क्रिस्टल आकार, माइक्रोन 5 × 5 × 5 <5 5 × 2 × 2 10 × 2 × 2 5-10 5 × 2 × 2 10 × 10 × 5
प्राप्ति दर, % 3.6 7.8 5.9 17 0.45 40 6.5
कुल डेटा संग्रह समय, मानव संसाधन 10 8 4.6 6.4 12 0.75 0.67
अनुक्रमित पैटर्न की संख्या 32,819 61,964 36,083 73,130 18,874 54,544 6629
अंतरिक्ष समूह सी 2 2 2 1 पी 2 1 सी 2 सी 2 पी 2 1 2 1 2 1 पी 4 3 2 1 2 एच 3 2
संकल्प, एक 2.8 3.2 / 3.4 / 4.0 2.7 2.9 3.3 / 3.8 / 3.8 1.89 1.75

तालिका 1. प्रतिनिधि संरचनाओं के लिए नमूना तैयार करने और डेटा संग्रह के आँकड़ों का सारांश LCP-SFX विधि का उपयोग कर हल।

नमूने की राशि एक LCP-SFX प्रयोग के लिए आवश्यक क्रिस्टल विवर्तन गुणवत्ता, क्रिस्टल घनत्व, इंजेक्टर नोजल का व्यास, साथ ही XFEL किरण आकार, तीव्रता और नाड़ी पुनरावृत्ति दर पर निर्भर करता है।

आकृति 1
चित्रा 1. LCP-SFX। नमूना तैयार करने के लिए एक विशिष्ट नमूना तैयार करने की प्रक्रिया का फ़्लोचार्ट गैस तंग कांच सीरिंज में लक्ष्य प्रोटीन की LCP क्रिस्टलीकरण के साथ शुरू होता है। बाद क्रिस्टल प्राप्त कर रहे हैं, क्रिस्टल से लदी LCP एक सिरिंज में समेकित और अतिरिक्त लिपिड के साथ titrated है, absor के लिएअतिरिक्त तेज़ समाधान बी। क्रिस्टल तो XFEL डेटा संग्रह करने से पहले विभिन्न तरीकों का उपयोग कर माइक्रोस्कोपी विशेषता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2 एक प्रतिनिधि परिणाम, की संरचना 5 हिंदुस्तान टाइम्स 2 बी एर्गोटेमाइन के साथ परिसर में। (क) 5 हिंदुस्तान टाइम्स 2 बी / एर्गोटेमाइन की microcrystals एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप मोड 8 का उपयोग imaged। यह आंकड़ा 5 हिंदुस्तान टाइम्स 2 बी / एर्गोटेमाइन के विज्ञान से कॉपीराइट अनुमति के साथ संदर्भ 8 से पुन: उपयोग किया गया है। (ख) microcrystals एक पार ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोप मोड 8 का उपयोग imaged। यह आंकड़ा कॉपीराइट के साथ संदर्भ 8 से पुन: उपयोग किया गया हैविज्ञान से अनुमति। (ग) 5 हिंदुस्तान टाइम्स 2 बी / एर्गोटेमाइन संरचना LCP-SFX दृष्टिकोण के द्वारा प्राप्त की एक कार्टून प्रतिनिधित्व। लिपिड कि मॉडल में बनाया गया था छड़ी प्रतिनिधित्व में दिखाए जाते हैं। ligand एर्गोटेमाइन क्षेत्रों प्रतिनिधित्व में दिखाया गया है। ठोस लाइनों अनुमानित झिल्ली सीमाओं से संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. एक प्रतिनिधि परिणाम, cyclopamine के साथ परिसर में एसएमओ की संरचना। वाम पैनल, एसएमओ / cyclopamine की microcrystals एक पार ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोप मोड 6 का उपयोग imaged। यह आंकड़ा प्रकृति संचार से कॉपीराइट अनुमति के साथ संदर्भ 6 से पुन: उपयोग किया गया है। सही पैनल, एक कार्टून representatiएसएमओ / cyclopamine संरचना LCP-SFX दृष्टिकोण से प्राप्त की है। Ligand cyclopamine क्षेत्रों प्रतिनिधित्व में दिखाया गया है। ठोस लाइनों अनुमानित झिल्ली सीमाओं से संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित एक LCP इंजेक्टर के साथ एक मानक LCP-SFX प्रयोग के लिए नमूना तैयार करने की प्रक्रिया की एक सामान्य रूपरेखा प्रदान करते हैं। , Microcrystal आकार पर निर्भर करता है, हमारे अनुभव के आधार पर, अंतिम microcrystal से लदी LCP नमूना एक पूर्ण डाटासेट इकट्ठा करने के लिए आवश्यक की कुल राशि आम तौर पर 50-100 μl (प्रारंभिक प्रोटीन से लदी LCP नमूने के 25-50 μl तालिका 1) है , गुणवत्ता और घनत्व। चूंकि प्रत्येक 100 μl गैस तंग कांच सिरिंज एक पूरी तरह से बढ़ा स्ट्रिंग के रूप में LCP के बारे में 7 μl समायोजित उचित और LCP में तेज़ समाधान के भी प्रसार सुनिश्चित करने के लिए कर सकते हैं, सीरिंज में कम से कम चार को सात नमूने के लिए तैयार किया जाना चाहिए प्रत्येक LCP-SFX प्रयोग।

चूंकि नमूना व्यास केशिका में एक संकीर्ण 20-50 माइक्रोन के माध्यम से निकाली जाती है, यह नमूने में किसी भी विदेशी सामग्री कण से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। धूल और फाइबर है कि कभी कभी LCP में पेश किया जा सकता हैनमूना या तेज़ समाधान इंजेक्टर केशिका रोकना और प्रयोग के दौरान नीचे समय बढ़ सकता है। इसलिए, यह नमूने तैयार करने से पहले एक 5 माइक्रोन ताकना फिल्टर के माध्यम से लिपिड और सभी समाधान फिल्टर करने के लिए महत्वपूर्ण है। वैकल्पिक रूप से, एक साफ कमरे या एक पोर्टेबल साफ कमरे हुड नमूना तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

इन प्रोटोकॉल सांसद क्रिस्टलीकरण के लिए मेजबान लिपिड के रूप में 9.9 पत्रिका (monoolein) के प्रयोग पर आधारित हैं। उन्होंने, हालांकि, 9.9 पत्रिका तक सीमित नहीं हैं और आसानी से खाते में लिपिड चरण व्यवहार में मतभेद लेने के बाद किसी अन्य LCP मेजबान लिपिड या लिपिड मिश्रण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। LCP में सघन सांसदों की संरचनाओं के अधिकांश mags में से एक का उपयोग कर प्राप्त कर रहे थे, 9.9 पत्रिका सबसे सफल प्रतिनिधि अब तक 15 होने के साथ। SFX के लिए 9.9 पत्रिका का उपयोग करने का मुख्य दोष से नीचे 18 डिग्री सेल्सियस है, जो अक्सर तब होता है जब डाटा अधिग्रहण शून्य में किया जाता है ठंडा करने पर परतदार क्रिस्टल चरण के लिए अपने संक्रमण है। titrati7.9 पत्रिका के साथ इस प्रोटोकॉल की धारा 5 में वर्णित पर इस समस्या का एक अच्छा समाधान प्रदान करता है। हमारे अनुभव में, क्रिस्टल किसी भी प्रतिकूल प्रभाव के बिना इस तरह के एक अनुमापन का सामना। अगर, हालांकि, 7.9 पत्रिका या अन्य लघु-पत्रिका जंजीर के अलावा वांछनीय नहीं है, अनुमापन 9.9 पत्रिका के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है। इस मामले में, गैस है कि इंजेक्शन के दौरान LCP के प्रवाह निर्वात में स्थिर नाइट्रोजन के लिए हीलियम से बंद किया जाना चाहिए, जो सबसे अधिक नमूनों में एक क्रिस्टलीय लिपिड चरण के गठन को रोका जा सकता है, एक कम स्थिर नमूना प्रवाह होने की कीमत पर।

LCP की जेल की तरह स्थिरता के बाद से यह एक विस्तृत श्रृंखला में क्रिस्टल प्रवाह की दर, सीरियल क्रि डेटा संग्रह के लिए उपयुक्त आधुनिक XFEL और विकिरण स्रोतों पर के समायोजन की अनुमति देता है, एक क्रिस्टल वाहक माध्यम के रूप में इस्तेमाल के लिए एक महान लाभ है। परिमाण ग के आदेश से क्रिस्टल की खपत में नाटकीय कमी में XFEL नाड़ी पुनरावृत्ति दर परिणामों के साथ क्रिस्टल प्रवाह दर मिलानतरल इंजेक्शन के लिए ompared। LCP वितरण में यह वृद्धि हुई सांसद क्रिस्टल की न केवल के लिए एक उपयुक्त वाहक माध्यम है, लेकिन यह भी घुलनशील प्रोटीन 21 के क्रिस्टल के लिए। कई वैकल्पिक चिपचिपा क्रिस्टल वाहक मीडिया ने हाल ही में 22 पेश किया गया है - 24, सीरियल क्रि प्रयोगों के संचालन के लिए उपकरण और अभिकर्मकों के शस्त्रागार का विस्तार। इसके अलावा, एक क्रिस्टल वितरण माध्यम के रूप में LCP के साथ धारावाहिक क्रि कम से कम अच्छी तरह से diffracting क्रिस्टल 24,25 के लिए पारंपरिक विकिरण स्रोतों पर प्रदर्शन किया गया है। विकिरण स्रोतों के भविष्य उन्नयन है कि डिटेक्टर प्रौद्योगिकियों में एक्स-रे परिमाण के आदेश से तीव्रता, साथ ही सुधार को बढ़ावा देने, सीरियल क्रि एक और भी अधिक सुलभ और आकर्षक संरचना निर्धारण के लिए विधि कर देगा।

LCP-SFX सांसद संरचनात्मक निर्धारण के लिए अपनी शक्ति का प्रदर्शन किया है। जहां एल (जैसे GPCRs या macromolecular परिसर के रूप में) चुनौतीपूर्ण जैविक प्रणालियों के लिएARGE, विवर्तन गुणवत्ता क्रिस्टल विकसित करने के लिए मुश्किल हो जाता है, LCP-SFX, एक आकर्षक प्रदान कर सकता है अगर एक परमाणु संकल्प संरचना हल करने के लिए न केवल, व्यवहार्य विकल्प। सब अपने फायदे के साथ, यानी, LCP सांसद क्रिस्टलीकरण और क्रिस्टल वितरण, कम प्रोटीन की खपत, विकिरण क्षति के अभाव, कमरे के तापमान डेटा संग्रह, समय हल के अध्ययन 26,27 की संभावनाओं और कोई क्रिस्टल कटाई की आवश्यकता है, LCP- के लिए मैट्रिक्स के रूप में उपयोग करते हुए SFX संरचनात्मक जीव विज्ञान के भविष्य में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभानी चाहिए।

Acknowledgments

इस काम के अनुदान के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान द्वारा समर्थित किया गया R01 GM108635 और U54 GM094618, मेयो क्लीनिक Asu, सहयोगात्मक बीज अनुदान पुरस्कार और NSF एसटीसी पुरस्कार 1231306. हम पांडुलिपि तैयारी के साथ सहायता के लिए ए वाकर धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LCP host lipid monoolein (9.9 MAG) Nu Chek Prep M239 Hosting lipid for the protein to be crystallized
LCP host lipid monoolein (9.9 MAG) Sigma M7765  Hosting lipid for the protein to be crystallized
LCP host lipid monopalmitolein (9.7 MAG) Nu Chek Prep M219 Hosting lipid for the protein to be crystallized
LCP host lipid 7.9 MAG Avanti Polar Lipids 850534 Hosting lipid for tiration to avoid lamellar crystal phase (Lc) formation during sample injection
Purified protein solution concentrated to 20-50 mg/ml Target protein
Chloroform Fisher Scientific C606-1 Used to dissolve lipids
Methanol Sigma-Aldrich 179337-500ML Used to wash syringes
Eleven 100 μl Hamilton gas-tight syringes without needles Hamilton 7656-01 For LCP preparation
Eight syringe couplers Formulatrix SKU 209526 For LCP preparation
LCP-injector loading needle Hamilton 7804-01 point style 3, length 1 inch For LCP dispensing and injector loading
Removable needle Hamilton 7768-01 For removing precipitant solution
Parafilm M Parafilm PM992 Used for syringe sealing
Lint free lens cleaning tissues Fisher NC9592151
Centrifugal filter tubes, Ultrafree-MC, 0.5 ml, Durapore 5 µm Millipore UFC3 0SV 00 Used for filtering of precipitant solutions and lipids
Microscope slides, 1 inch x 3 inch  GoldSeal 3010
Two wash bottles with fine tips. One filled with milli-Q or distilled water, the other with methanol VWR 89094-640 These are used to clean the syringes, needles and coupler.  Methanol is used first, then water.
Gloves Microflex XC-310-L For blow drying syringes, needles, ferrules, and couplers
Safety glasses
Pressurized air cans Office Depot (Dust-Off) 527494 For syringe cleaning
Dry block heater with a digital temperature controller Fisher 11-720-10BQ  Used for thawing lipids
Benchtop Centrifuge Fisher 05-413-340 Spinning down solutions
Clean Room Mini - 12 inch Portable Positive Pressure Hood with HEPA filter Sentry Air Systems, Inc. SS-112-PCR Cleaning sample preparation
Stereo zoom microscope equipped with a linear polarizer and rotating analyzer  Nikon SMZ1500 Crystal density check
UV microscope JAN Scientific UVEX-P Optional, for crystal imaging purposes
SHG imager Formulatrix SONICC Optional, for crystal imaging purposes

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References

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तैयारी और सीरियल गुजरने क्रि लिए lipídic घन चरण में प्रोटीन microcrystals की डिलिवरी
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Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. J. Vis. Exp. (115), e54463, doi:10.3791/54463 (2016).

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