Abstract
Membranproteiner (parlamentsmedlemmer) er væsentlige elementer i cellemembraner og primære drug targets. Rationel drug design bygger på præcise strukturel information, typisk ved krystallografi; imidlertid MP'er er vanskelige at krystallisere. Nylige fremskridt i MP strukturel bestemmelse har nydt godt af udviklingen af lipide kubiske fase (LCP) krystallisering metoder, som typisk afkaster godt diffrakterende, men ofte små krystaller, der lider skade stråling under traditionel krystallografiske dataindsamling på synkrotron kilder. Udviklingen af nye generation af X-ray free-elektron laser (XFEL) kilder, der producerer meget lyse femtosekund pulser har aktiveret værelse indsamlingen temperaturdata fra mikrokrystaller med ingen eller ubetydelig stråleskader. Vores seneste bestræbelser på at kombinere LCP-teknologi med seriel femtosekund krystallografi (LCP-SFX) har resulteret i høj opløsning strukturer af adskillige humane G-protein-koblede receptorer, which repræsenterer en notorisk vanskeligt mål for strukturbestemmelse. I LCP-SFX teknik, er LCP ansat som matrix for både vækst og levering af MP mikrokrystaller til skæringspunktet injektoren strøm med en XFEL stråle for krystallografiske dataindsamling. Det er blevet påvist, at LCP-SFX væsentligt kan forbedre diffraktion opløsning, når der kun sub-10 um krystaller er til rådighed, eller når brugen af mindre krystaller ved stuetemperatur kan overvinde forskellige problemer, der er forbundet med større cryocooled krystaller, såsom ophobning af fejl, høj mosaicity og cryocooling artefakter. Fremtidige fremskridt i X-ray kilder og detektor teknologier bør gøre seriel krystallografi meget attraktivt og praktisk for gennemførelsen ikke kun på XFELs, men også på mere tilgængelige synkrotron beamlines. Her præsenterer vi detaljerede visuelle protokoller til forberedelse, karakterisering og levering af mikrokrystaller i LCP for serielle krystallografiundersøgelser eksperimenter.Disse protokoller omfatter metoder til udførelse krystallisationseksperimenter i sprøjter, opdage og karakterisere de krystal prøver, optimering krystal tæthed, lastning mikrokrystal lastet LCP i injektoren enhed og levere prøven til bjælken til dataindsamling.
Introduction
Røntgenkrystallografi er den mest succesfulde teknik til dato til løsning atomar opløsning strukturer af membranproteiner (MP). Krystallisation fra lipid mesofaser, også kendt som lipid kubiske fase (LCP), eller i meso krystallisering, repræsenterer en af de vigtigste udviklinger i MP krystallografi, der har gjort det muligt for høj opløsning struktur bestemmelse af udfordrende mål, såsom G-protein-koblede receptorer (GPCR ) 1. Nylige fremskridt i LCP værktøjer og teknologier har gjort denne teknik til rådighed for et stort fællesskab af strukturelle biologer verden over to. Men i mange tilfælde MP krystaller, der danner i LCP er for små til at blive brugt, selv ved mest avancerede microfocus synkrotron beamlines, hvor prøverne lider af svær stråling skader og forringelse, før der kan opnås tilstrækkelig signal ved høj opløsning 3.
En ny tilgang til krystallografisk dataindsamlingblev aktiveret med idriftsættelse af første X-ray free-elektron laser (XFEL). Metoden er baseret på princippet om "diffraktion før ødelæggelse", først introduceret teoretisk 4 og derefter bekræftet eksperimentelt på biologiske prøver på Linac Coherent Light Source (LCLS) 3, verdens pioner i hårde XFELs. En XFEL genererer høj lysstyrke X-ray pulser inden par snese femtosekund varighed, diffrakterer fra en uberørt krystal før protein atomerne kan bevæge sig som reaktion på skader stråling. I de indledende eksperimenter blev mikrokrystaller kontinuerligt til skæringspunktet med XFEL stråle i en vandig strøm produceret af en flydende injektor 5. Denne forsøgsopstilling er kendt som seriel femtosekund krystallografi (SFX). Den største ulempe ved anvendelse af flydende injektorer for SFX er deres høje strømningshastighed, som derfor kræver ti til hundrede milligram oprenset protein til opsamling af et komplet datasæt. Ved employing en speciel injektor, der kan håndtere de gel-lignende LCP prøver (LCP microextrusion injektor) 6, vi med succes leveret mikrokrystaller af flere forskellige menneskelige GPCR dyrket i en LCP matrix og fået deres høj opløsning strukturer 6-9, med en betydeligt reduceret protein forbrug til under 0,3 mg pr datasæt. Injektoren består af et reservoir, der kan indeholde op til 20, 40 eller 100 pi krystal-laden LCP og en smal kapillær (10-50 um i diameter), hvorigennem prøven ekstruderes ved anvendelse af et højt tryk (op til 10.000 psi) fra en hydraulisk stempel med et tryk amplificeret stadium, drevet af en væske fra en HPLC (højtydende væskekromatografi) pumpe. Strømmen af LCP forlader kapillardyse stabiliseres af en parallel strømning af ikke-reaktive gas (typisk helium eller nitrogen).
Her giver vi visuelle demonstrationer af de nødvendige skridt til at forberede og karakterisere prøverfor en LCP-SFX eksperiment. Yderligere detaljer kan findes i de offentliggjorte protokoller 10. Som et eksempel vil vi bruge adenosin A2A-receptor 11 og forberede krystaller af dette protein i LCP for X-ray dataindsamling hjælp SFX tilgang. Mens vores protokoller er kompatible med alle injektor stand til streaming LCP til indsamling af data ved seriel krystallografi på XFEL og synkrotron kilder, til illustration, vil vi bruge LCP injektor beskrevet i ref. 6. Optimerede fældningsmiddel betingelser, der producerer high-density mikrokrystaller i LCP skal identificeres ved high-throughput krystallisering screening 12,13 før du fortsætter til denne protokol. En typisk rutediagram for denne protokol er vist i figur 1.
Protocol
1. Filtrering Solutions og lipider
Bemærk: Alle reagenser og værktøjer, der anvendes i denne protokol skal være så rene som muligt for at undgå at indføre partikelkontaminanter i prøverne, som kan tilstoppe LCP injektor.
- Filter alle fældningsmiddel løsninger og smeltede lipider til 5 um spin-down filtre. Rene sprøjter grundigt og anvende trykluft til at tørre. Eventuelt bruge en bærbar clean-room hætte for at forhindre fældefangst støvpartikler eller fibre under procedurer for prøveforberedelse.
2. Rekonstituering af MP i LCP
Bemærk: Valget af den bedste LCP vært lipid til krystallisation afhænger af målet MP, og er typisk identificeret under host lipid screening krystallisations- forsøg 14. Monoacylglyceroler (mags) repræsenterer den mest almindelige klasse af lipider, der anvendes for LCP krystallisering 15. Protokollerne er baseret på brug 9,9 MAG (monoolein) somvært lipid, da dette er den mest succesfulde lipid i meso krystallisation til dato 16. 9.9 MAG kan erstattes af andre LCP vært lipider eller lipid blandinger når der tages hensyn til forskelle i deres fase adfærd. For eksempel i tilfælde af GPCR'er, monoolein typisk doteret med kolesterol for receptor stabilisering. Her, brug 9: 1 (vægt / vægt) 9.9 MAG: cholesterol-blanding som vært lipid.
- Mix målrette MP, som renses i vaskemiddel micelle opløsning, med den passende LCP host lipid under anvendelse af to sprøjter (# 1 og # 2) og en kobler, som tidligere 13 beskrevet.
- Kort beskrevet belastning sprøjte # 1 med det smeltede lipid og sprøjte # 2 med MP opløsning. Brug et forhold mellem lipid og vandig MP opløsning svarende til det niveau, der er lige under den maksimale hydrering kapacitet af det tilsvarende LCP vært lipid, fx 3: 2 volumen / volumen lipid / MP opløsning til 9,9 MAG, 1: 1 v / v lipid / MP til de fleste andre kortere kæder MAG'er (7,9 MAG, 9,7 MAG, etc.).
- Tilslut sprøjter gennem en sprøjte kobling og begynde at blande stofferne ved at trykke stemplerne til at bevæge blandingen frem og tilbage mellem sprøjterne, indtil prøven er homogen og transparent. Forbered ca. 50 ul af LCP prøve til indsamling af et komplet datasæt af LCP-SFX. Det endelige prøvevolumen vil typisk stige med ca. en faktor to (til ~ 100 pi) efter prøven konsolidering og lipid titrering (afsnit 5).
3. Opsætning af Krystallisation i Sprøjter
- Efter en gennemsigtig og ensartet LCP er dannet, flytte hele prøven i sprøjte # 2. Frigør sprøjte # 1, samtidig med at kobleren er forbundet til sprøjten # 2.
- Tilslut en aftagelig nål (gauge 26S) til en anden 100 pi ren sprøjte (sprøjte # 3) og Aspirer ca. 70 ul af fældningsmiddel løsning ind i det. Sammensætningen af den fældningsmiddel løsning, der udløser fsninger af high-density mikrokrystaller er unik for hvert mål MP og bør bestemmes før man går videre til disse protokoller. Her, brug en optimeret fældningsmiddel opløsning sammensætning, der giver byger af mikrokrystaller af den A2A-receptoren (40 mM natriumthiocyanat, 100 mM natriumcitrat, pH 5, 26-28% PEG 400).
- Afbryd kanylen fra sprøjten # 3 samtidig holde Teflon ferrule inde i sprøjten.
- Tilslut sprøjter # 2 og # 3 gennem koblingen, og sørg for, at Teflon tyller er korrekt på plads i begge sprøjter. Skru forsigtigt koblingen stramt på plads.
- Orient de koblede sprøjter lodret med sprøjte # 2 på bunden og injicerer protein-laden LCP prøve fra sprøjte # 2 i sprøjten # 3 langsomt og støt, indtil LCP strengen rører stemplet i sprøjten # 3. Den injicerede LCP volumen vil beløbe sig til omkring 1/10 af den oprindelige fældningsmiddel volumen i sprøjten # 3 (~ 7 pi). Kontroller lydstyrken ved skalaen-læsning på begge Syringes (begge stempler skal flytte med ca. 7 pi).
- Afbryd sprøjte # 2. Kobleren nu er kun forbundet til sprøjten # 3, som indeholder prøven neddyppet i fældningsmiddel opløsning.
- Brug Parafilm til helt at forsegle sprøjten # 3, herunder stemplet sprøjtemellemstykke, åbningsenden af koblingsanordningen og nålen møtrik. Ufuldstændig tætning i dette trin kan forårsage fældningsmiddel betingelser for at ændre og prøve at dehydrere.
- Gentag trin 3,3-3,7 at etablere krystallisation i 6 yderligere sprøjter (# 4- # 9) under anvendelse af i alt ~ 50 pi af LCP prøve (~ 7 pi af LCP per hver sprøjte).
- Opbevares forseglet sprøjter i en plast forseglelig pose med en eller to fiber-free rengøring væv dyppet med vand for at beskytte mod prøven dehydrering. Luk posen og gemme sprøjter i en 20 ° C inkubator under krystal vækst.
4. Crystal Detection
- Fjern sprøjter fra inkubatoren til billedet LCP prøver direkte inde sprøjterne (# 3 # 9) hver 12-24 timer under et stereomikroskop med cross-polariseret lys. Identificer krystaller som tætpakkede skinnende partikler eller, i tilfælde af mindre krystalstørrelse som en ensartet glød fra glødetråden LCP.
- Returnere de forseglede sprøjter til posen, og opbevar ved 20 ° C til fremtidig brug.
5. Prøve Konsolidering og titrering med 7,9 MAG
Bemærk: lipid titrering trin beskrives her tjener to formål: a) at absorbere den overskydende fældningsmiddel løsning og b) at forhindre lipid frysning ved injektion i XFEL stråle. Når en LCP prøve bestående af 9,9 MAG injiceres i et vakuumkammer til dataindsamling, kan intensiv fordampning afkøles dernæst ned til temperaturer under ligevægten faseovergangstemperatur (~ 18 ° C), omdannelse dele af prøven i en lamellar krystallinsk fase (Lc). Disse pletter af Lc fase, når de rammes af strålen, producere intens pulver diffraction ringe, der kan skade en følsom detektor 6, såsom Cornell-SLAC pixel array detektor (CSPAD). Titrering af 9,9 MAG prøve med en kortere kæde lipid (9,7 MAG eller 7,9 MAG) afbøder dette problem, da sådanne blandinger har lavere faseovergangstemperaturer. Her beskriver vi titrering af en LCP sammensat af 9,9 MAG med et 7,9 MAG. Når der anvendes kortere kæde MAG'er (9,7 MAG, 7,9 MAG, etc.) til krystallisering eller når serielle krystallografiundersøgelser data indsamles ved omgivende tryk titreringen i trin 5.11 er stadig behov, men det kan udføres ved hjælp af den oprindelige LCP vært lipid ansat til krystallisation.
- Omkring 1 time før begyndelsen af dataindsamling, fjerne sprøjter med prøver fra 20 ° C inkubator.
- Vælg 2-4 sprøjter for prøve konsolidering baseret på en lignende krystal udseende og lighed krystallisationsbetingelser.
- Fjern forsigtigt Parafilm forsegling fra de valgte sprøjter.
- Fjernesprøjten kobler og vedlægge en ren aftagelig nål (gauge 26S) til den første valgte sprøjte. Forsigtigt og langsomt skubbe stemplet fremad for at presse præcipitanten ud gennem nålen ind i et mikrocentrifugerør. Motion forsigtighed på dette trin, fordi påføring af et højt tryk på stemplet i dette trin kunne skubbe nogle af krystal belæsset LCP sammen med fældningsmiddel opløsning, hvilket fører til en delvis eller fuldstændig tab af prøven.
- Stop stemplet når det meste af fældningsmiddel er blevet fjernet, og LCP har akkumuleret på nålens indgangen.
- Gentag trin 5,4-5,5 med de andre udvalgte sprøjter.
- At konsolidere de resulterende LCP prøver, forbinde to sprøjter sammen gennem en ren kobler.
- Tryk stemplet på en sprøjte til at overføre hele prøven fra en af sprøjterne til en anden.
- Afbryd den tomme sprøjte.
- Gentag trin 5,7-5,9 for at konsolidere hele den krystal lastet LCP materiale fra de to til fire forvalgte-Valgte sprøjter i en sprøjte. Fjern så meget som muligt fældningsmiddel.
- Tilføj ~ 5 pi 7,9 MAG eller den originale kortere kæde MAG vært lipid til en tom sprøjte. Tilslut denne sprøjte til sprøjte med den konsoliderede prøven gennem en sprøjte kobling og bland ved skiftevis at trykke sprøjtestemplerne. Gentag, indtil alle resterende opløsning absorberes og en homogen og transparent LCP dannes. Det endelige beløb af LCP efter titrering kan variere fra 20 til 35 pi afhængigt af mængden af den overskydende fældningsmiddel og dens sammensætning.
- Flyt hele blandede LCP prøven i en sprøjte og afbryd den tomme sprøjte.
6. Karakterisering af mikrokrystaller
- Vedhæft en LCP-injektor lastning nål (punkt stil 3, gauge 22, en tomme i længden) på sprøjten med konsoliderede prøve.
- skubbe forsigtigt ~ 1 pi af LCP prøven på et objektglas og dække det med et glas cover slip. Tryk forsigtigt pådækglas til sandwich prøven.
- Tag billeder af LCP prøven under et stereomikroskop ved den højest mulige forstørrelse (typisk 100X) ved hjælp af en lys-felt belysning og cross-polarisatorer. Hvis det er muligt, tage yderligere billeder ved hjælp af en UV-fluorescens mikroskop og en SONICC (Anden Order Nonlinear Imaging af chirale krystaller) 17 imager at bekræfte eksistensen af protein mikrokrystaller i prøven.
- Estimere krystal størrelse og tæthed 10. Den ideelle krystal densitet for en dataindsamling eksperiment vil afhænge af krystalstørrelsen, diameteren af røntgenstrålen og diameteren af LCP strøm, og bør medføre en krystal hit på ca. 10-40%.
7. Justering af Crystal Density
Bemærk: Hvis krystalmassetæthed fundet i trin 6.4 er for høj, hvilket resulterer i en stor procentdel af multiple krystal hits, bør krystallerne fortyndes efter nedenstående trin for at optimereprøve til dataindsamling. Hvis krystalmassetæthed er for lav til effektiv indsamling af data i alle forberedte prøver, så betingelserne krystal vækst bør re-optimeret, da der ikke er nogen pålidelig metode til at koncentrere MP krystaller i LCP.
- Forbered den nødvendige mængde neat LCP skal anvendes til fortynding ved at efterligne LCP sammensætning (samme lipid og fældningsmiddel) af den oprindelige prøves med krystaller, der skal fortyndes.
- Flyt alle pæn LCP i en sprøjte. Tag tomme sprøjte men lad koblingen tilsluttet.
- Fjern nålen fra sprøjten, der indeholder den LCP prøven med mikrokrystaller. Slut prøven injektionssprøjte til injektionssprøjte indeholdende neat LCP gennem koblingen.
- Bland indholdet af sprøjterne ved at skubbe det frem og tilbage gennem kobleren indtil homogenitet opnås.
- Gentag afsnit 6 at revurdere mikrokrystallen tæthed i den justerede prøve.
8. LCP Injector Loading ennd LCP-SFX Dataindsamling
- Afbryd kobler fra sprøjten med prøven og vedlægge en 1 "belastning kanyle på sprøjten.
- Overfør 20-40 pi af prøven i reservoiret af en LCP injektor.
- Sæt LCP injektor i prøven kammer 18, start injektoren, justere flowhastigheden og indsamle LCP-SFX data.
9. Inddragelse af opløseligt protein Crystals i LCP
Bemærk: Brug af stærkt viskose medier, såsom LCP, til levering af krystaller af opløselige proteiner tillader en at dramatisk reducere proteiner i en seriel krystallografi eksperiment. I disse trin beskriver vi hvordan man kan indarbejde krystaller af opløselige proteiner i LCP. Krystaller kan opnås ved enhver teknik, konsolideres sammen i form af en krystal suspension og om nødvendigt filtreres.
- Juster krystal tæthed i suspension at sikre krystal hit rates på ca. 10-40%.
- Test foreneligheden af den fældningsmiddel løsning med LCP hjælp 7,9 MAG, 9,7 MAG eller en 1: 1 blanding af 7,9 MAG og 9,9 MAG som vært lipid.
- Bland ~ 25 pi af krystal suspension med ~ 25 pi værten lipid med en injektionssprøjte mixer, indtil en homogen LCP former.
- Vurdere krystal størrelse og tæthed som beskrevet i afsnit 6. Læg prøven i LCP injektor og indsamle data, som beskrevet i afsnit 8.
Representative Results
Nedenfor beskriver vi repræsentative resultater opnået med prøver fremstillet ved at følge ovenstående protokoller, som tillod os at indsamle SFX data og løse højopløselige strukturer af fem humane GPCR'er: serotoninreceptor 5-HT 2B i kompleks med en agonist ergotamin 8 (PDB ID 4NC3 ), smoothened receptor (SMO) i kompleks med en antagonist cyclopamin 6 (PDB ID 4O9R), δ-opioid receptor i kompleks med en bi-funktionel peptidligand DIPP-NH2 7 (PDB ID 4RWD), angiotensin receptor i kompleks med en blokker ZD7155 9 (PDB ID 4YAY), og et kompleks mellem rhodopsin og arrestin 19 (PDB ID 4ZWJ); og to test opløselige proteiner: lysozym (FBF ID 4ZIX) og phycocyanin (FBF ID 4ZIZ).
5-HT 2B medierer forskellige centrale og perifere fysiologiske funktioner af neurotransmitteren serotonin. denne receptorblev brugt til at etablere og validere LCP-SFX-metoden, ved at sammenligne rumtemperaturen struktur opnås ved LCLS med cryocooled struktur løst ved traditionel microcrystallography på Advanced Photon Source (APS). I alt ~ 100 pi LCP prøve med protein mikrokrystaller (gennemsnitlig størrelse omkring 5 pm) blev fremstillet og anvendt til SFX dataindsamling, og LCP-SFX struktur 5HT 2B blev succesfuldt løst på 2,8 Å (figur 2) 8. Yderligere nyttige oplysninger om prøveforberedelse og dataindsamling findes i tabel 1.
Smoothened receptor (SMO) er et medlem af klassen F GPCR'ere og det molekylære mål for teratogen cyclopamin, med godt demonstreret funktioner i fosterudviklingen og tumorvækst. Indledningsvis blev relativt store krystaller af SMO / cyclopamin med en gennemsnitlig størrelse på 120 × 10 × 5 um opnået og derefter anvendes til data Collectipå i en synkrotron kilde anvendelse af konventionel goniometer-baserede krystallografi. Men disse store krystaller produceret dårlig diffraktion ved en mikro-fokus beamline (10 um i diameter), der lider store mosaicity (over 2-3 grader), sandsynligvis på grund af ophobning af krystal vækstdefekter, eller fra virkninger relateret til cryocooling. LCP-SFX imidlertid gjort det muligt at indsamle kvalitet diffraktionsdata ved LCLS fra 5 um-størrelse krystaller ved stuetemperatur. Strukturen blev løst ved molekylær udskiftning på en anisotropisk 3,4, 3,2 og 4,0 Å opløsning langs de tre vigtigste akser, klart identificerer placeringen af cyclopamin i bindingen lommen 6 (figur 3).
Alkaloid opiater, såsom morfin, er målrettet μ-opioid receptor (μ-OR) er almindeligt brugt til svære smerter forvaltning. Men deres omfattende brug fører til erhvervet tolerance og afhængighed. Samtidig administration af morfinermed δ-opioid receptor (δ-OR) antagonister har vist sig at forhindre de ovennævnte bivirkninger, og dermed fremmes søgningen for forbindelser med en blandet δ-ELLER-antagonist og μ-ELLER-agonist funktion. Vi opnåede de indledende diffraktionsdata på δ-OR i et kompleks med en bi-funktionel tetra-peptid DIPP-NH2 under anvendelse cryocooled krystaller, diffrakterede til 3,3 Å på en synkrotron røntgenkilde anvendelse af traditionelle dataindsamlingsstrategien goniometer-baseret. Disse data viste en delvis tvetydig elektrontæthed til peptidliganden. Efterfølgende blev XFEL diffraktionsdata ved stuetemperatur opnås, og strukturen blev bestemt ved 2,7 Å opløsning viser en klar densitet for liganden og receptoren 7. Denne struktur gav mulighed for yderligere forståelse opioidreceptor funktion og selektivitet og forudsat værdifuld indsigt til udvikling af nye analgetika.
1 R) er en GPCR tjener som en primær regulator af blodtrykket. Vi krystalliseret AT 1 R i kompleks med en antagonist ZD7155 i LCP. Optimeret krystaller nåede en maksimal størrelse på 40 × 4 × 4 um 3 med den bedste diffraktion nåede kun ~ 4 Å på en synkrotron kilde. Ved at ændre krystallisationsbetingelser, vi opnåede byger af mindre krystaller (10 × 2 × 2 um 3), som blev brugt til at opnå temperaturen struktur værelse på 2,9 Å opløsning ved hjælp XFEL stråling. I alt 2,764,739 detektor billeder blev indsamlet for at gøre en komplet datasæt fra omkring 65 ul krystal-laden LCP svarende til omkring 0,29 mg protein 9. Af det samlede antal billeder, blev 457.275 identificeret som krystal hits, svarende til en hit-rate på 17%, hvoraf 73,130 frames (16% af hits) lykkedes indekseret og integreret.
GPCR'er signal gennem to veje medieret af enten G-proteiner eller arrestiner. Strukturen af β 2 adrenerg receptor bundet til et heterotrimert G s protein blev løst et par år siden 20, mens strukturen af en GPCR i kompleks med arrestin var forblevet undvigende. Vi opnåede små krystaller af en rhodopsin-arrestin fusionsprotein i LCP, der nåede 25-30 um i den længste dimension, men trods omfattende optimering, diffrakterede kun ~ 7 Å opløsning ved synkrotron kilder. Ved at bruge LCP-SFX-metoden, inden for 12 timer XFEL beamtime, vi indsamlede 22,262 krystal hits, hvoraf 18,874 mønstre lykkedes indekseret og integreret til anisotropisk grænser for 3,8 Å / 3,8 Å / 3,3 Å 19 opløsning. Rhodopsin-arrestin er en meget udfordrende proteinkompleks der modstod struktur bestemmelse ved hjælp af traditionelle metoder. Den vellykkede bestemmelse af denne struktur har vist det enorme potentiale påLCP-SFX metode til at tackle vanskelige problemer og en enestående mulighed for at undersøge den mekanisme af arrestin-partisk signalering i GPCRs.
Endelig, i tillæg til membran proteinkrystaller dyrket i lipide fase, vores prøveforberedelse og leveringsmetode blev succesfuldt tilpasset til opløselige proteinkrystaller, hvor LCP anvendes som et bæremedium til afgivelse af krystaller, tillader os at dramatisk reducere forbruget protein kræves til strukturbestemmelse. Strukturer af to model proteiner, lysozym og phycocyanin, blev løst ved 1,89 Å og 1,75 Å opløsning henholdsvis ved denne metode, bruger mindre end 0,1 mg hvert protein 21.
| Serotoninreceptoren 2B | smoothened receptor | | Angiotensin II receptor type 1 | Rhodopsin-arrestin | lysozym | phycocyanin | | |
| FBF-id | 4NC3 | 4O9R | 4RWD | 4YAY | 4ZWJ | 4ZIX | 4ZIZ |
| Samlet anvendte prøve *, pl | 100 | 83 | 50 | 65 | 75 | 10 | 10 |
| Totalt anvendte protein, ug | 300 | 500 | 300 | 290 | 340 | 100 | 100 |
| Gennemsnitlig krystalstørrelse, um | 5 × 5 × 5 | <5 | 5 × 2 × 2 | 10 × 2 × 2 | 5-10 | 5 × 2 × 2 | 10 × 10 × 5 |
| Hit rate,% | 3.6 | 7.8 | 5.9 | 17 | 0.45 | 40 | 6.5 |
| Total dataindsamling tid, HR | 10 | 8 | 4.6 | 6.4 | 12 | 0,75 | 0,67 |
| Antallet af indekserede mønstre | 32.819 | 61.964 | 36.083 | 73.130 | 18.874 | 54.544 | 6629 |
| rumgruppe | C 2 2 2 1 | P 2 1 | C2 | C2 | P 2 1 2 1 2 1 | P 4 3 2 1 2 | H 3 2 |
| Resolution, Å | 2.8 | 3,2 / 3,4 / 4,0 | 2.7 | 2.9 | 3.3 / 3.8 / 3.8 | 1,89 | 1,75 |
Tabel 1. Oversigt over statistikken prøveforberedelse og dataindsamling for repræsentative strukturer løses ved hjælp af LCP-SFX-metoden.
Mængden af prøve kræves for en LCP-SFX eksperiment afhænger af krystal diffraktion kvalitet, krystal densitet, diameteren af indsprøjtningsdysen, samt XFEL strålestørrelse, intensitet og pulsrepetitionshastigheden.
Figur 1. rutediagram over en typisk prøve procedure forberedelse til LCP-SFX. Prøvefremstilling starter med LCP krystallisation af målproteinet i gastætte glassprøjter. Efter opnås krystaller, er krystal-laden LCP konsolideret i en sprøjte og titreres med ekstra lipid, at absorb overskydende fældningsmiddel opløsning. Krystaller derefter karakteriseret ved hjælp af forskellige mikroskopi metoder før XFEL dataindsamling. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Et repræsentativt resultat, strukturen af 5-HT 2B i kompleks med ergotamin. (a) mikrokrystaller af 5-HT 2B / ergotamin afbildes under anvendelse af en lys-felt mikroskop tilstand 8. Dette tal er blevet genbrugt fra henvisning 8 med copyright tilladelse fra Science. (B) Mikrokrystaller af 5-HT 2B / ergotamin filmede med en cross-polariseret mikroskop tilstand 8. Dette tal er blevet genbrugt fra henvisning 8 med ophavsrettilladelse fra Science. (c) En tegneserie repræsentation af 5-HT 2B / ergotamin struktur opnået ved LCP-SFX tilgang. Lipider, der blev bygget i modellen er vist i stick repræsentation. Liganden ergotamin er vist i sfærer repræsentation. Solid linjer angiver de omtrentlige membran grænser. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Et repræsentativt resultat, strukturen af SMO i kompleks med cyclopamin. Venstre panel, mikrokrystaller af SMO / cyclopamin filmede med en cross-polariseret mikroskop tilstand 6. Dette tal er blevet genbrugt fra henvisning 6 med copyright tilladelse fra Nature Communications. Right panel, en tegneserie representatipå af SMO / cyclopamin struktur opnået ved LCP-SFX tilgang. Ligand cyclopamin vises i sfærer repræsentation. Solid linjer angiver de omtrentlige membran grænser. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
De her beskrevne protokoller giver en generel oversigt over proceduren prøveforberedelse for en standard LCP-SFX eksperiment med en LCP injektor. Baseret på vores erfaringer, det samlede beløb for den endelige mikrokrystal-laden LCP prøve kræves til opsamling af en fuld datasæt er typisk 50-100 pi (tabel 1; 25-50 pi af indledende protein-laden LCP prøve), afhængigt af mikrokrystallen størrelse , kvalitet og tæthed. Da hver 100 pi gastæt glassprøjte kan rumme ca. 7 pi LCP i form af en fuldt udstrakt streng for at sikre korrekt og jævn fordeling af fældningsmiddel opløsningen i LCP, bør mindst fire til syv prøver i sprøjter forberedes hver LCP-SFX eksperiment.
Da prøven ekstruderes gennem en smal 20-50 um i kapillær diameter, er det afgørende at undgå enhver fremmede partikler materiale i prøven. Støv og fibre, der kan lejlighedsvis indført i LCPprøve eller fældningsmiddel opløsninger kan tilstoppe injektoren kapillar og øge stilstandstid under eksperimentet. Derfor er det vigtigt at foretage lipid og alle opløsninger gennem et 5 um pore filter før forberedelse prøver. Eventuelt kan et rent rum eller en bærbar clean room hætte anvendes til prøvefremstilling.
Disse protokoller er baseret på brug 9,9 MAG (monoolein) som vært lipid for MP krystallisering. De er imidlertid ikke begrænset til 9,9 MAG og kan nemt tilpasses til andre LCP vært lipider eller lipid blandinger efter at have taget hensyn til forskellene i lipidfasen adfærd. De fleste af strukturerne af MP'er krystalliseret i LCP blev opnået under anvendelse af en af blade, med 9,9 MAG er den mest succesfulde repræsentant hidtil 15. Den største ulempe ved anvendelse af 9,9 MAG for SFX er dens overgang til lamellar krystal fase ved afkøling under 18 ° C, hvilket ofte sker, når erhvervelsen af data foretages i vakuum. Den titratipå med 7,9 MAG beskrevet i afsnit 5 i denne protokol giver en god løsning på dette problem. Det er vores erfaring, krystaller modstå sådan titrering uden nogen bivirkninger. Men hvis tilsætningen af 7,9 MAG eller anden kort-kædet MAG er ikke ønskeligt, kan titreringen udføres med 9,9 MAG. I dette tilfælde bør den gas, der stabiliserer strømningen af LCP under injektion i vakuum ændres fra helium til nitrogen, som kan forhindre dannelsen af en krystallinsk lipidfase i de fleste prøver, på bekostning af at have en mindre stabil prøvestrømmen.
Den gelagtige konsistens af LCP har en stor fordel til anvendelse som en krystal bæremedium, da det giver mulighed for justering af krystal strømningshastighed over et bredt område, der er egnet til seriel krystallografi dataindsamling på moderne XFEL og synkrotron kilder. Matchende krystal strømningshastigheden med XFEL puls gentagelse sats resulterer i dramatisk reduktion i krystal forbrug størrelsesordener compared til flydende injektion. LCP er en egnet bæremedium til afgivelse af ikke blot MP krystaller dyrkes i det, men også for krystaller af opløselige proteiner 21. Flere alternative tyktflydende krystal databærere er for nylig blevet indført 22-24, udvide arsenal af værktøjer og reagenser til udførelse af serielle krystallografiundersøgelser eksperimenter. Desuden har seriel krystallografi med LCP som en krystal leveringsmedium blevet demonstreret ved konventionelle synkrotron kilder, i det mindste for well-afbøjende krystaller 24,25. Fremtidige opgraderinger af synkrotron kilder, øge røntgen intensitet af størrelsesordener, samt forbedringer i detektor teknologi, vil gøre seriel krystallografi en endnu mere tilgængelig og attraktiv metode til struktur bestemmelse.
LCP-SFX har vist sin styrke til MP strukturel bestemmelse. For udfordrende biologiske systemer (såsom GPCR eller makromolekylære komplekser) hvor Large, diffraktion kvalitet krystaller er vanskelige at dyrke, kan LCP-SFX tilvejebringe et attraktivt, hvis ikke den eneste, realistisk mulighed for at løse en atomar opløsning struktur. Med alle sine fordele, dvs. ved brug LCP som matrix for MP krystallisering og krystal levering, lavt forbrug protein, fravær af skader stråling, temperatur dataindsamling værelse, mulighederne for tid-løst undersøgelser 26,27 og ingen krav krystal høst, LCP SFX bør spille en vigtig rolle i den fremtidige strukturelle biologi.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health giver R01 GM108635 og U54 GM094618, Mayo Clinic-ASU Collaborative Seed Grant Award og NSF STC award 1231306. Vi takker A. Walker for hjælp med manuskriptet forberedelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LCP host lipid monoolein (9.9 MAG) | Nu Chek Prep | M239 | Hosting lipid for the protein to be crystallized |
| LCP host lipid monoolein (9.9 MAG) | Sigma | M7765 | Hosting lipid for the protein to be crystallized |
| LCP host lipid monopalmitolein (9.7 MAG) | Nu Chek Prep | M219 | Hosting lipid for the protein to be crystallized |
| LCP host lipid 7.9 MAG | Avanti Polar Lipids | 850534 | Hosting lipid for tiration to avoid lamellar crystal phase (Lc) formation during sample injection |
| Purified protein solution concentrated to 20-50 mg/ml | Target protein | ||
| Chloroform | Fisher Scientific | C606-1 | Used to dissolve lipids |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-500ML | Used to wash syringes |
| Eleven 100 μl Hamilton gas-tight syringes without needles | Hamilton | 7656-01 | For LCP preparation |
| Eight syringe couplers | Formulatrix | SKU 209526 | For LCP preparation |
| LCP-injector loading needle | Hamilton | 7804-01 point style 3, length 1 inch | For LCP dispensing and injector loading |
| Removable needle | Hamilton | 7768-01 | For removing precipitant solution |
| Parafilm M | Parafilm | PM992 | Used for syringe sealing |
| Lint free lens cleaning tissues | Fisher | NC9592151 | |
| Centrifugal filter tubes, Ultrafree-MC, 0.5 ml, Durapore 5 µm | Millipore | UFC3 0SV 00 | Used for filtering of precipitant solutions and lipids |
| Microscope slides, 1 inch x 3 inch | GoldSeal | 3010 | |
| Two wash bottles with fine tips. One filled with milli-Q or distilled water, the other with methanol | VWR | 89094-640 | These are used to clean the syringes, needles and coupler. Methanol is used first, then water. |
| Gloves | Microflex | XC-310-L | For blow drying syringes, needles, ferrules, and couplers |
| Safety glasses | |||
| Pressurized air cans | Office Depot (Dust-Off) | 527494 | For syringe cleaning |
| Dry block heater with a digital temperature controller | Fisher | 11-720-10BQ | Used for thawing lipids |
| Benchtop Centrifuge | Fisher | 05-413-340 | Spinning down solutions |
| Clean Room Mini - 12 inch Portable Positive Pressure Hood with HEPA filter | Sentry Air Systems, Inc. | SS-112-PCR | Cleaning sample preparation |
| Stereo zoom microscope equipped with a linear polarizer and rotating analyzer | Nikon | SMZ1500 | Crystal density check |
| UV microscope | JAN Scientific | UVEX-P | Optional, for crystal imaging purposes |
| SHG imager | Formulatrix | SONICC | Optional, for crystal imaging purposes |
References
- Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318 (5854), 1258-1265 (2007).
- Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Curr Opin Struc Biol. 21 (4), 559-566 (2011).
- Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
- Neutze, R., Wouts, R., van der Spoel, D., Weckert, E., Hajdu, J. Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses. Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).
- DePonte, D. P., et al. Gas dynamic virtual nozzle for generation of microscopic droplet streams. J Phys D Appl Phys. 41 (19), 195505 (2008).
- Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nat Commun. 5, 3309 (2014).
- Fenalti, G., et al. Structural basis for bifunctional peptide recognition at human δ-opioid receptor. Nat Strcut Mol Biol. 22 (3), 265-268 (2015).
- Liu, W., et al. Serial femtosecond crystallography of G protein-coupled receptors. Science. 342 (6165), 1521-1524 (2013).
- Zhang, H., et al. Structure of the Angiotensin Receptor Revealed by Serial Femtosecond Crystallography. Cell. 161 (4), 833-844 (2015).
- Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Nat Protoc. 9 (9), 2123-2134 (2014).
- Liu, W., et al. Structural basis for allosteric regulation of GPCRs by sodium ions. Science. 337 (6091), 232-236 (2012).
- Caffrey, M., Cherezov, V. Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases. Nat Protoc. 4 (5), 706-731 (2009).
- Liu, W., Cherezov, V. Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. J Vis Exp. (49), (2011).
- Li, D., Shah, S. T. A., Caffrey, M. Host Lipid and Temperature as Important Screening Variables for Crystallizing Integral Membrane Proteins in Lipidic Mesophases. Trials with Diacylglycerol Kinase. Cryst Growth Des. 13 (7), 2846-2857 (2013).
- Caffrey, M., Lyons, J., Smyth, T., Hart, D. J. Monoacylglycerols: The Workhorse Lipids for Crystallizing Membrane Proteins in Mesophases. Current Topics in Membranes. 63, Elsevier. (2009).
- Kulkarni, C. V., Wachter, W., Iglesias-Salto, G., Engelskirchen, S., Ahualli, S. Monoolein: a magic lipid? Phys Chem Chem Phys. 13 (8), 3004-3021 (2011).
- Kissick, D. J., Gualtieri, E. J., Simpson, G. J., Cherezov, V. Nonlinear optical imaging of integral membrane protein crystals in lipidic mesophases. Anal Chem. 82 (2), 491-497 (2010).
- James, D. Injection Methods and Instrumentation for Serial X-ray Free Electron Laser Experiments. , Arizona State University. 1-126 (2015).
- Kang, Y., et al. Crystal structure of rhodopsin bound to arrestin by femtosecond X-ray laser. Nature. 523 (7562), 561-567 (2015).
- Rasmussen, S. G. F., et al. Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477 (7366), 549-555 (2011).
- Fromme, R., et al. Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase. IUCrJ. 2 (Pt 5), 545-551 (2015).
- Sugahara, M., et al. Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography. Nat Meth. 12 (1), 61-63 (2014).
- Conrad, C. E., et al. A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography. IUCrJ. 2 (Pt 4), 421-430 (2015).
- Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallogr Sct D. 71 (Pt 2), 387-397 (2015).
- Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 2, 168-176 (2015).
- Tenboer, J., et al. Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein. Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).
- Kupitz, C., Basu, S., Grotjohann, I., Fromme, R. Serial time-resolved crystallography of photosystem II using a femtosecond X-ray laser. Nature. 513, 261-265 (2014).
